Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ стресс-протекторного действия пирацетама на функциональное нарушение условно-рефлекторной деятельности у крыс линий Wistar, Fisher-344 и WAG

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ стресс-протекторного действия пирацетама на функциональное нарушение условно-рефлекторной деятельности у крыс линий Wistar, Fisher-344 и WAG"

Московский ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

КАЛЮЖНЫЙ Андрей Леонардович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРЕСС-ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПИРАЦЕТАМА НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ НАРУШЕНИЕ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ У КРЫС ЛИНИЙ WISTAR, FISHER—344 И WAG

03.00.13- физиология человека и животных

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. Шульговский В.В. Научный консультант: член-корреспондент РАМН, проф. Раевский К.С.

Москва — 1998

Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (зав.кафедрой - д.б.н.,профессор Шульшвски{гВ.В.) и в лаборатории функциональной нейрохимии института Фармакологии РАМН (зав .лабораторией - член-корр. РАМН, профессор Раевский К.С.)

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Шульговский В.В.

Научный консультант:

член-корр. РАМН, профессор Раевский К.С.

Официальные оппоненты:

Т.П. Семенова — доктор биологических наук, ведущий

научный сотрудник С.А. Чепурнов — доктор биологических наук, профессор

Ведущее учреждение: Институт Мозга РАМН

Защита состоится 11 мая 1998 г. в 15 час. 30 мин. На заседании Специализированного Совета Д.053.05.35 при Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адрес}7: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан апреля 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Одной из задач современной науки является разработка фундаментальных физиологических и нейрохимических механизмов формирования эмоциональных стрессов с целью профилактшш последствий его воздействия на организм. К настоящему времени на основании многих исследований было сделано заключение, что эмоциональный стресс приводит к формированию нового, отличного от нормального, состояния мозга, характеризующегося измененными взаимоотношениями коры и подкорковых образований. Известно, что изучение общих механизмов стресса осложняется индивидуальными особенностями адапгащш к стресс-воздействию. В работах М.Г.Айрапетянца (1992), С.К.С\дакова (1995) и др. имеются данные о том. что у животных раз ной типологической принадлежности имеется индивидуальный набор антистрессовых защитных механизмов и индивидуальные особенности развития стресса. Но эти механизмы индивидуальной чувствительности и их роль в устойчивости к стресс-воздействию во многом остаются невыясненными.

При исследовашш нейрохимических механизмов возникновения стресса были отмечены изменения взаимодействия нейромедиаторных систем, зависящие от характера стресс-воздействия. Показано, что при стрессе возникает комплекс взаимодействия моноаминергическнх систем, нейропептидов, АКТГ ГАМК-ерпгческой системы и, возможно, других факторов (Richardson, 1984; Stone. 1987),. Но несмотря на обилие проведенных работ, четких данных о механизмах взаимодействия нейромедиаторных систем в эмоциональном стрессе до сих пор нет. В настоящее время ведется постоянный поиск и изучение новых фармакологических веществ, которые могут предотвратить заболевания, вызванные стрессом. Одним из таких веществ является пирацетам, улучшающий обучение и память при их нарушениях, как за счет изменений

биоэнергетического баланса нервной клетки так и за счет влияния на нейро.медиаторные системы. Однако, данных о механизмах действия пирацетама в условиях эмоционального стресса имеется крайне недостаточно. Цели Ii задачи исследования Целыо данной работы явилось изучение поведенческих и биохимических изменений мозга крыс различных генетических линий, обладающих различной стрессоустойчивостью при обучении и стресс-воздействии, а также выявление и оценка действия пирацетама для возможности купирования последствий стресса на модели функционально-обратимого нарушения ("сбоя") условнорефлекторной деятельности. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить в сравнении изменения параметров выработки условной реакции активного избегания (УРАИ) (т. е. динамику прочности, латентного периода и межсигнальных реакций) у крыс линий Wistar, WAG и Fisher — 344.

2. Изучить в сравнешш изменения содержания серотонина и его метаболита — 50ИУК, норадреналина, дофамина и его метаболитов — ДОФУК и ГВК в результате выработки УРАИ у крыс линий Wistar, WAG и Fisher — 344.

3. Изучить в сравнении влияние "сбоя" УРАИ на изменения параметров выработки УРАИ и концентрации вышеуказанных медиаторов

4. Изучить в сравнении эффекты введения пирацетама на параметры выработки УРАИ у крыс линий Wistar, WAG и Fisher — 344.

5. Изучить в сравнении эффекты введения пирацетама на содержание исследуемых моноаминов мозга данных линий крыс при выработке УРАИ

6. Изучить в сравнении эффекты введения пирацетама на проведение "сбоя" УРАИ крыс данных линий.

Научная новизна работы Впервые проведено сравнительное изучение поведенческих реакций (параметров выработки УРАИ) и коррелирующих с

ними нейрохимических изменений у крыс, разных генетических линий, характеризующихся различной устойчивостью к стресс-воздействию, а также различной чувствительностью к действию морфина с целью анализа взаимодействия моноамино и опиоидергической систем на модели выработки УРАИ; впервые проведено изучение аналогичных параметров на модели "сбоя" УРАИ; впервые показана зависимость эффектов действия пирацетама от генетически обусловленных индивидуальных особенностей на моделях выработки и "сбоя" УРАИ; впервые показано преимущественное участие серотонино-норадренергического механизма при стрессе, вызванном "сбоем" УРАИ; сформулирована гипотеза реализации действия пирацетама через взаимодействие серотонин -, норадрен - и опиоидергических систем. Научно-практическое значение работы Полученные в данной работе результаты позволяют расширить наши представления об участии и взаимодействии нейромедиаторных систем мозга в механизмах памяти, обучения и стресса, а также проясняют роль индивидуальных, генетически обусловленных различий в этих процессах. Полученные данные также определяют зависимость действия пирацетама от таких различий и выявляют механизм проявления его стресспротекторного эффекта через взаимодействие серотонинергической, норадренергической и опиоидергической систем, что в конечном irrere ведет к повышению эффективности его использования при нарушениях данных процессов.

Апробация работы Результаты исследования были представлены на: Всесоюзной конференции "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств (Новгород, 1991), 2-ой конференции Российской Ассоциации по изучению боли (СпБ, 1995), Международной конференции Pain in Europe (Verona,Italy, 1995), Российско-Германском симпозиуме "Pathology of the visceral regulation and tissue growth"

(Москва, 1995), Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 1996), Международной конференции "Neurochemistry and pharmacology of drug addiction and alcoholism" (СпБ, 1996), II Congress of the European federation of IASP Chapters (Барселона, 1997), Конференции "Изменчивость поведения животных : описание, классификация, анализ" (Борок, 1997), Форуме Европейских Нейронаук (Берлин, 1998), заседании кафедры ВНД Биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова (Москва, 1998).

Структура диссертации Диссертация изложена на 179 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 301 наименование, в том числе 160 на иностранных языках, иллюстрирована 17 рисунками и 34 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 244 крысах — самцах, массой 180-250 г, расположенных вне опыта в просторных клетках при естественном освещении и комнатной температуре со свободным доступом к воде и пище. Из них 90 составили крысы линии Wistar, 78— крысы линии WAG и 76— линии Fisher — 344. В работе было выполнено 6 серий экспериментов. В каждую серию входили 3 группы крыс различных линий. Групп)' 1 составили крысы линии Wistar, которые предварительно тестировались на морфин-чувствительность, группу 2 — крысы линии WAG и группу 3 — крысы линии Fisher — 344. Таким образом исследования были выполнены на 18 группах животных. В серии 1 исследовали содержание моноаминов мозга интактных крыс линии Wistar (группа 1), WAG (группа 2) и Fisher—344 (группа 3). Группу 1 составило 15 животных, групп}- 2 — 12 н групп}' 3 —12 животных. Во 2-ой серии изучали

содержание моноаминов мозга обученных крыс, которые получали на всем протяжении выработки УРАИ физиологический раствор и были забиты для биохимических исследований сразу после выработки УРАИ. В этой серии в каждую из трех групп входило по 15 животных. Серию 3 составили животные, у которых исследовались изменения концентрации моноаминов мозга под влиянием хронического введения пирацегама. У крыс этой серии не проводилась выработка УРАИ, но животные получали пирацетам на протяжении всех дней опытов выработки УРАИ у животных серии 2 и 4 и были забиты для биохимических исследований одновременно с ними. Группу 1 составили 15 животных, группу 2 — 12 и группу 3 — 12 животных. В 4 -оп серии опытов проводили изучение выработки УРАИ и изменения в распределении моноаминов мозга крыс изучаемых линий при введении пирацетама. Крысы этой серии получали шграцетам на всем протяжении выработки УРАИ. В 1-ю группу входило 15, во 2-ю— 12 ив 3-ю —12 животных. У животных 5-ой серии изучали влияние "сбоя" УРАИ на изменения в содержании моноаминов мозга обученных крыс. Животные этой серии в период выработки УРАИ получали физиологический раствор и были забиты для биохимических исследований сразу после проведения "сбоя". В каждую групщ- этой серии входило по 15 животных. В б-ой серии опытов изучали эффекты пирацетама на распределение моноаминов мозга обученных крыс после "сбоя" УРАИ. Крысам этой серии на всем протяжении выработки УРАИ вводили пирацетам и забивали для биохимических исследований сразу после проведения "сбоя". В каждую группу этой серш! входило также по 15 животных изучаемых линий.

Экспериментальная установка. Выработка УРАИ проводилась на установке размером 50X30X35 мм позволяющей подавать и прекращать электростимуляцию через определенный интервал. Пол камеры выполнен из

металлической решетки с параллельными прутьями диаметром 2 мм при расстоянии 15 мм между ними.

Выработка УРАИ Выработка УРАИ осуществлялась следующим образом: в 4-ой и 6-ой сериях крысам вводился пирацетам дозой 300 мг/кг, а во 2-ой и 5-ой сериях — физиологический раствор в эквивалентном объеме. Затем через 30 минут после введения крыс помещали в камеру. Через 25-40 секунд после помещения крысы в камеру включали звук (400 Гц, мощность динамика 0,5Вт). Если крыса за 10 секунд действия звука не перебегала в другой отсек камеры, отделенный перегородкой в которой имелся проход, включали ток (силой 1,6мА, 110В, длительностью 50 мс, частотой 7 имп/сек). Ток выключали одновременно со звуком либо в момент перехода крысы в другой отсек камеры, либо через 10 секунд после включения. За выключением звука (или звука совместно с током в случае реакции избавления) следовал межеигналыгый период 25-40 секунд, затем начинали следующее предъявление раздражителей. Каждому животному за 1 опыт давалось 20 сочетаний условного ( в случае выполнения УРАИ) или условного и безусловного раздражителей (в случае выполнения реакции избавления). В первом опыте ятя каждого животного подбирали оптимальную силу тока (т.е. находили пороговые значения силы тока при которой животное отвечало заметной двигательной реакцией) и с которой начинали следующий опыт. Если животное перебегало в противоположную часть камеры до включения тока (т.е. с ЛП менее 10 сек.), то в этом случае имело место выполнение реакции избегания (УРАИ). Если перебежка совершалась после включения тока ( ЛП от 10 до 20 секунд), то фиксировали выполнение реакции избавления. Наконец, если перебежки не происходило, то регистрировали отсутствие реакции. Межсигнальной реакцией считали перемещение животного из одного отсека камеры в другой в течение межеигнального периода. Опыты по

выработке УРАИ проводились с интервалом не менее 1 дня. В опытах регистрировались следующие показатели: количество реакций избегания (УРАИ), количество реакций избавления, число межсигнальных реакций за 1 опыт н латентные периоды реакций. После достижения 80% выполнения УРАИ животное считали обученным и проводили пятикратный "сбой" на крысах всех линий.

Проведение "сбоя" УРАИ "Сбой" реакции избегания проводился по методике, разработанной А.Н.Иноземцевым и заключался во внезапной для животного смене условий эксперимента, приводящей к нарушению причинно-следственных отношении в экспериментальной среде и вызывающей стресс у животных. (Иноземцев, 1988). "Сбой" осуществлялся следующим образом: после того, как было проведено 20 предъявлений по стандартной схеме, через 25-40 секунд (т. е. с таким же межсигнальным интервалом, что и в стандартной схеме) включался на 10 секу нд звук. Если животное перебегало за этот период в другой отсек камеры, то звук продолжал звучать и одновременно с перебежкой включался ток Если животное не перебегало за 10 секунд звука, то также включался ток, который, как и звук не выключался после перебежки. И звук и ток выключались после того, как животное совершало 5 перебежек из одного отсека камеры в другой, причем после 5-ой перебежки сначала выключался ток, а потом-через 2-4 секунды-звук. Эта процедура повторялась 5 раз, после чего проводилось тестирование по стандартной схеме с 20 предъявлениями.

Введение препаратов Пирацетамвдозе 300 мг/кг вводили внутрибргошинно за полчаса до опыта. В качестве контроля вводили физиологический раствор в том же объеме.

Биохимическое определение содержания моноаминов мозга крыс.

Содержание моноаминов: норадреналина, серотонина и его метаболита.

дофамина и его метаболитов иследовались в структурах фронтальной коры, гиппокампа и полосатого тела. Исследование содержания серотонина (50Т) и его метаболита 5-оксииндолуксусной кислоты (50ИУК), норадреналина (НА) и дофамина (ДА) в коре, гиппокампе и стриатуме, а также метаболитов дофамина - 3-4 диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и З-метокси-4-фенилуксусной кислоты (гомованилиновая кислота - ГВК) в стриатуме крыс проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) после извлечения мозга при декапитации у одних групп животных данных линий до "сбоя" У РА И, а у других групп животных тех же линий сразу после сбоя УРАИ при предварительном введешш либо физиологического раствора или пирацетама. Применяли хроматографию в обращенных фазах с ионопарным реагентом октилсульфатом натрия (ОСН). Фронтальную кору, гиппокамп и стриатум выделяли на холоде. Выделенные струюуры размельчали в гомогенизаторе стекло-тефлон (0,2 мм) при скорости вращения пестика 3000 оборотов в мин. Гомогенизацию осуществляли в 0.1нНСЬ04 с добавлением внутреннего стандарта диоксибензиламина (ДОБА) 100 нг/мл. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали и фильтровали центрофугированием через целлюлезные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм в течение 1 мин на низкооборотной центрфуге. 20 мкл фильтрата наносили на аналитическую колонку методом прямой инъекции. НА, ДА, ДОФУК, ГВК, SOT и 5-ОИУК разделяли на хроматографе LC 304Т (BAS, США), снабженном инжектором 7125 фирмы "Rheodyne" с петлей объемом 20 мкл. для нанесения образцов. Использовали колонку "Biophasa"RP-18 марки ODS 5 мкм 4,6x250 мм, защищенную предколонкой RP -18 ODS 10 мкм 4,6x30 мм. Колонет термостатировали при 45 градусов С. Использовали двойной амперометричесиш детектор LC-4B с ячейкой LC-17D и двумя параллельными

стеклоуглеродными элетродами TL-5 при потенциале +0.8 В против Ag/AgCl электрода сравнения RE-I. Скорость потока подвижной фазы составила 0.7 мл/мин. Подвижную фазу готовили следующим образом: маточные растворы 0,02 М лимонной кислоты и 0,02 М NaH2P04 буфера, содержащего 0,27 мМ ЭДТА, смешивали в пропорции 2,4:1, затем добавляли 0,3 мМ ОСН и 4% ацетонитрила. Подвижную фазу фильтровали, используя вакуумный насос, через целлюлозные фильтры (0.25 мкм). (Мирошниченко, 1988). Статистическая обработка данных При статистической обработке результатов использовали t-критерий Стьюдснта и Манна-Уитшг-Вилкоксона. Обработка экспериментальных данных проводилась на IBM486dx4-l 00 с использованием программ Harvard Graphics фирмы "Soihvare Publishing" , а также WinWord v. 6.0 nExcel v.5.0 фирмы "Microsoft".

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВА1ПШ 1.Особенности выработки УРАИ и содержания моноаминов мозга крыс различных генетических линий Как показали проведенные нами опыты, у крыс линии Wistar по сравнению с WAG и Fisher-344 на начальных этапах выработка УРАИ проходила медленнее, что коррелировало с увеличенным содержанием серогонина в гиппокампе и коре по сравнению с линиями WAG и Fisher-344. При этом у крыс линии Wistar в процессе выработки УРАИ наблюдалось наименьшее количество межсигнальных реакций по сравненшо с WAG и Fisher-344.

2. Особенности выработки УРАИ и содержания моноамниов мозга крыс разл1гпп,1хгенстичесьт1хл1п11щ,па1учапщихпиранет,гм У крыс линииWistar, получавших пирацетам, также как и у крыс, получавших физиологический раствор, выработка УРАИ проходила медленнее по сравненшо с WAG и Fisher-344, и в то же время у крыс линии Wistar отмечено меньшее количество

межсигнальных реакций. Эти результаты у крыс линии Wistar коррелировали с уменьшением содержания серотонина, а у крыс линий Fisher-344 и WAG с увеличением концентрации дофамина и норадреналина в стриатуме. З.Влпяние пнрацетама на цыработкуУРАИ крыс различных генетических линий.

Как показали полученные нами результаты, крысы линии Wistar, получавшие пирацетам, имели большую скорость выработки УРАИ по сравнению с контрольными животными (рис 1а). Пирацетам играет позитивную роль особенно на начальных стадиях обучения. В то же время, количество межсигнальных реакций у крыс, получавших пирацетам так же было достоверно выше по сравнению с контролем, что коррелировало с повышением содержания дофамина в стриатуме. У крыс линии Fisher-344, получавших пирацетам (рис. 1 б) также наблюдалось облегчение выработки УРАИ с увеличением числа межсигнальных реакций, что сопровождалось изменениями во взаимодействии серотонин и норадренергической систем за счет ускорения кругооборота серотонина и увеличения содержания норадреналина. В отличие от крыс линии Fisher-344 и Wistar, введение пнрацетама крысам линии WAG не вызывало достоверных изменений в выработке УРАИ (рис. 1 в), хотя и увеличивало число межсигнальных реакций. Отличия имелись и в нейрохимических механизмах. В частности, наблюдалось уменьшение метаболита серотонина — 50ИУК и норадреналина, с одновременным увеличением дофамина. Таким образом, под влиянием пнрацетама изменения главным образом затрагивают соотношение серотонин/норадреналин, что существенным образом сказывается на характере обучения у крыс линий Wistar и Fisher — 344 и практически не изменяет его у крыс линии WAG.

□ физ. р-р □ пирацетам

□ физ. р-р □ пирацетам

□ физ. р-р ЁЗ пирацетам

Рис.1 Динамика выработки УРАИ серий крыс линий Wistar (А), Fisher-344 (Б) и WAG (В) с введением пирацетама и физиологического раствора. *Р<0,05, **Р<0,01 ***Р<0,001

4. Особенности провсзешм "сбоя"УРАИ и его влияния на неиромедиагорние

системы мозга крыс различных генетических линий Как следует из

представленных графиков (рис.2), после "сбоя" у крыс линии \Vistar,

получавших физиологический раствор было отмечено падение правильных

выполнений реакций УРАИ с 90 до 61 %. При сравнении процента правильных

выполнений УРАИ последних 5 предъявлений до "сбоя" с первыми 5

предъявлениями после "сбоя" также отмечено уменьшение выполнения УРАИ

с 90 до 47% . Таким образом, у крыс линии \Vistar "сбой" УРАИ вызывал

значительное падение процента выполнения УРАИ. Также были отмечены и

коррелирующие с этим изменения распределения моноаминов мозга. В

частности, у крыс линии \Vistar наблюдалось достоверное увеличение

13

серотонинаво фронтальной коре, гиппокампе и стриатуме, а также снижение 5-ОИУК в коре без изменений его уровня в стриатуме. Также в наших опытах не было выявлено повышения или падения уровня норадреналина в коре, но наблюдалось достоверное его снижение в стриатуме. У крыс линии WAG в результате "сбоя" условной реакции активного избегания наблюдалось достоверное увеличение серотонина в коре и гиппокампе, но не отмечалось изменений в стриатуме; содержание 5-ОИУК достоверно уменьшалось в коре и полосатом теле и увеличивалось в гиппокампе. Это может свидетельствовать о накоплении серотонина в стриатуме и об увеличении его метаболизма в гиппокампе. Содержание норадреналина достоверно увеличивалось также в коре, но уменьшалось в полосатом теле, и не изменялось в гиппокампе. Примечательно, что после "сбоя" при уменьшении уровня дофамина в стриатуме наблюдалось достоверное увеличение ДОФУК, что указывает на активацию метаболизма дофамина. У крыс линии Fischer-344 (рис.2) применение пятикратного "сбоя" также вызывало поведенческие реакции стресса (вокализацию, прыжки, дефекацияит.п.), что сопровождалось достоверным снижением прочности УРАИ и увеличением межсигнальных реакций в то время как показатели латентного периода УРАИ достоверно не изменялись. Таким образом, "сбой" у крыс линии Fischer-344 также, как и у крыс линии WAG, вызывал стрессовое состояние с резкими нарушениями условнорефлекторной деятельности.

5. Влияние нипапегача на "cfioii" УРАИ крыс различных генепмескнхлшпш

Как показали наши опыты, у крыс, получавших пирацетам "сбой" также вызывал некоторое уменьшение правильных выполнений УРАИ, но в меньшей степени, чем у контрольных животных. В частности, у крыс линии Wistar

Рис.2 Влияние"сбоя"УРАИ на cepini крыс с введением пирацетама и физ. р-ра. Знаком* и л обозначена разница между крысами, получавшими физ.р-р и пирацетам до и после "сбоя" УРАИ. *Р<0,05,**Р<0,01,***Р<0,001, -T^OS^P^Ol.^P^OOl

процент УРАИ уменьшился с 90 до 82% (рис.2), а у крыс лишги Fisher-3 44 с 88 до 81%. В отличие от вышеуказанных линий у крыс линии WAG "сбой" приводил куменынению УРАИ с 80 до 61%, что практически не отличалось от контрольных животных. Таким образом, стресс-протекторный эффект пирацетама был выражен у крыс линий Wistar и Fisher-344, и не проявлялся у крыс линии WAG. Эти данные также коррелировали с биохимическими изменениями в исследуемых структурах мозга данных линий. В частности, у крыс всех линий под влиянием пирацетама увеличивается содержание серсггонина в коре и стриатуме с тенденцией его уменьшения в гиппокампе по сравнению с контрольными животными (табл. 1 -3). Также отмечаается повышение содержания норадреналина под влиянием

пирацетама у всех трех линий крыс, но при этом в гиппокампе и стриатуме количество норадреналина было наибольшим у крыс линии WAG. Как показали настоящие опыты, у крыс всех линий после введения пирацетама и последующего "сбоя" наблюдалось достоверное увеличение уровня не только серотонина, но и дофамина в стриатуме, а также еще большее увеличение уровня его метаболита - ДОФУК у крыс линии WAG и только ГВК у крыс линии Fischer — 344.

Таким образом, введение пирацетама не имеющее эффекта после "сбоя" УРАИ у крыс линии WAG, вызывало сохранение нормальной условнорефлекторной деятельности у крыс линии Fisher-344 и Wistar. При этом у последних двух линий крыс наблюдался достоверно меньший, чем у крыс линии WAG, уровень ДОФУК в стриатуме, норадреналина в гиппокампе и стриатуме и достоверно большее содержание серотонина в стриатуме у крыс линии Wistar.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показали наши опыты, под влиянием пирацетама произошло выравнивание скорости выработки УРАИ уже к 3 -ему дню опытов вместо 6-ого у животных, получавших физиологический раствор. Причиной этого могут быть изменения в соотношении 50Т/НА за счет уменьшения серотонина и увеличения норадреналина, в результате чего происходит более быстрое формирование и извлечение памятного следа на отрицательное подкрепление. Можно также предполагать, что отсутствие эффектов пирацетама на крыс линии WAG связано с недостатком у них эндогенных опиоидов, так как они являются морфин-резистентными. Вероятно, что пирацетам влияет на уровень моноаминов мозга, которые в свою очередь, связаны с опиоидергической системой через систему дАМФ, так как, как показали опыты Stefano (1981), бета-эндорфин и мет-энкефалин подавляли уровень цАМФ, и как показали наши опыты эффект пирацетама не проявлялся именно у крыс линии WAG.

Кроме того, известны данные (Чиченков, 1990) об антагонистических свойствах пирацетама к некоторым эффектам морфина. Вероятно, одним из таких свойств может быть увеличение цАМФ. Исходя из предположения о генетически детерминированном недостатке эндогенных опиоидов у крыс линии WAG по сравнению с линиями Wistar и Fisher-344, этим, видимо, можно объяснить невыраженносгьу них эффектов пирацетама. Это предположение согласуется с данными, полученными Н.А.Тушмаловой (1991, 1994) о возможной реализации эффектов действия пирацетама через геном-зависимые механизмы.

Как показали полученные нами данные, при "сбое" УРАИ, также как и при выработке УРАИ изменения уровня моноаминов мозга затрагивают преимущественно серотонино-норадренергический механизм. Однако, наряд}' с исследуемыми в данной работе системами нейромедиаторов необходимо учитывать влияние ГАМК и опиоидергической систем, которые активируются при эмоционально-болевом стрессе (Заец с соавт.,1986; Андреев, 1986).Можно предполагать, что при электроболевом стрессе большую роль в "нормализации" соотношений моноаминов играет опиоидергическая система, по крайней мере у крыс линии Wistar и Fisher-344, так как, крысы линии WAG имели меньшее увеличение серотонина по сравнению с другими линиями. Как известно (Вальдман, 1983), серогонин— миметические вещества, прямо или косвенно активирующие С1 рецепторы или блокаторы С2 рецепторов оказывают положительное влияние на дефицит поведения в ситуации острого стресса. Таким образом, увеличение содержания серотонина в наших опытах может быть адаптивной реакцией, направленной на уменьшение последствий стресс-воздействия. В то же время проявления стрессовых реакций прн "сбое" УРАИ, несмотря на увеличение содержания серотонина, указывает на недостаточность его

стресспротскторного действия при данной модели стресса - модели "сбоя" УРАИ.

Также в наших опытах наблюдалось уменьшение содержания норадреналина, что является характерным признаком эмоционального стресса.Усиленный расход медиатора может вызывать активацию синтеза норадреналина, который, однако, не всегда может полностью компенсировать его уменьшение. Другим механизмом, направленным на компенсацию дефицита норадреналина может быть снижение нейронального захвата. Как уже было сказано, нарушение поведения, обусловленные острым эмоциональным стрессом, устраняются воздействиями, усиливающими синтез или ингибирующими обратный захват серотонина, а также блокирующими пресинаптические серотониновые рецепторы (Вальдман, 1984). Вероятно в результате протекторного действия пирацетама изменяется соотношение серотонин\норадреналин в сторону серотонина. Видимо, при "сбое" у животных, получавших физиологический раствор концентрация серотонина выходит на новый уровень, но все же недостаточный, чтобы оградить от последствий стресс-воздействия. Пирацетам же, повышая уровень серотонина оказывает, таким образом защитный эффект. В то же время, так как по нашему предположению у крыс линии WAG имеется недостаток эндогенных опиоидов, эффект пирацетама у них не проявляется. Учитывая, что увеличение серотонина имеет защитный характер, а увеличение норадреналина связано с проявлениями страха можно думать что такое изменение и является основой позитивного действия пирацетама при "сбое" УРАИ, так как оно воздействует как на компонент памяти при амнезии, которая возникает при действии сильного электрического тока, так и на стрессовый компонент "сбоя" УРАИ.

выводы

1. Скорость выработки условной реакции активного избегания у к рыс линии Wistar была ниже, чем у крыс линии WAG и Fisher—344. Это коррелировало с изменениями в соотношении концентраций серотонина и норадреналина в мозге в сторону увеличения серотонина, что и явилось причиной замедленной выработки УРАИ у крыс линии Wistar.

2. Пирацетам облегчал выработку условной реакции активного избегания у крыс линий Wistar и Fisher — 344, что коррелировало с уменьшением содержания в мозге серотонина и увеличением норадреналина и не оказывал влияние на крыс линии WAG.

3. Функционально-обратимое нарушение условнорефлекторной деятельности ("сбой") у крыс линий Wistar, WAG и Fisher — 344, получавших физиологичесикй раствор проявлялось в значительном падении выполнения условной реакции активного избегания и в уменьшении количества межсигнальных реакций.

4. Нарушения УРАИ коррелировали с изменениями взаимодействия серотонин-и норадренергической систем. При этом повышение уровня серотонина в мозге является адаптивной, но недостаточной реакцией для компенсации последствий стресс - воздействия.

5. Пирацетам оказывал протекторное действие при функционально-обратимом нарушении условнорефлекторной деятельности у крыс линий Wistar и Fisher — 344 и не оказывал влияния на крыс линии WAG.

6. Протекторное действие пирацетама проявляется в большем изменении соотношения 5 ОТ/НА в сторону серотонина, по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. Такое изменение является основой позитивного действия пирацетама при функционально-обратимом нарушении условнорефлекторной деятельности, так как оно возденет влет как на компонент

19

Влияние пирацетама на распределение биогенных аминов в структурах моэга крыс линии Wistar после сбоя УРАИ

(нг/мг ткани); (К±ш)

Влияние пирадетана на распределение биогенных аминов в структурах моэга крыс линии WAS после сбоя УРАИ

(нг/мг ткани); (М±ш)

Влияние пирадетама на распределение биогенных амосов в структурах мозга крыс линии Е1вЬег-344 после сбоя УРАИ

(нг/мг ткани); (М±т)

контроль* опигние*

5-ОТ 5-ОТ

Кора 1,99±0,16 3,36+0,12***

ГИППОКАЛЛЗ 1, 94±0,31 1,53±0,28

Схркатум 0,72±0,07 2, 03±0, 26* * *

5-ОИУК 5-ОИУК

Кора 0,2210,03 0,55±0,04***

Гитзокаьжз 0, 64±0, 12 0,69±0,12

Стриатум 0,4010,05 1,24±0,08** *

КА НА

Кора 0,6610,12 0,51±0,09

Гиппокаьв 0.51±0,02 0,30±0,06

Стркатуы 0,28±0,05 0, 42±0,02*

ДА ДА

Стриатум 9,9+0,86 12,1+0,39*

ДОФУК ДОФУК

Стриатуы 0,96±0,04 0,73 + 0,08

гвк ГВК

Стриатуы 0,94±0,06 1,08±0,09

контроль* опытные*

5-ОТ 5-ОТ

Кора 1,52±0,02 2,65±0,27***

Гиппохазжт 1,87±0,35 1,31±0,24

Стриатум 0,43±0,02 1,42+0, 14***

5-СИУК 5-ОИУК

Кора 0,19±0,05 0,22±0,04

Vuimoieatai 0, 61±0,08 0,75+0,11

Стриатум 0,22±0,03 1,2310,9***

НА НА

Кора 0, 69±0,04 0,4710,16

Гштохалж] 0,47±0,02 0, 62±0,07

Стршлатуы 0,26±0,02 0,4810,03* * *

ДА ДА

Стриатуи 9,6±0,4 14,1+0,4***

ДОФУК ДОФУК

Стриатуы 1,19+0,03 1,42+0, 05**»

ГВК ГВК

Стряатуы 0, 92±0, 03 0,98+0,08

контроль* OHiZTHÜC *

5-ОТ 5-ОТ

Кора 1,76±0,08 3,35±0,49**

Пишохлш 1,62±0,28 1,8710,42

Стриатуы 0,6410,05 1,41±0,12** *

5-ОИУК 5-ОИУК

Кора 0, 29±0,03 0,52+0,11

Пшиожадез 0,61+0,19 0,5610,14

Стриатуы 0,35+0,05 0,84+0, 17*

НА КА

Кора 0,6310,03 0,7710,16

ГкппоказлI 0,48±0,04 0,410,06

Ст^татуы 0,1710,01 0,3910,02***

ДА ДА

Стрялатуы 10,210,16 12,5+1,06*

ДОФУК ДОФУК

Стриатуы 0,83+0,08 0,9310,18

ГВК ГВК

Схрнн}« 0,9210,06 1,3910,03***

Знаком* обозначена достоверная разница ыевду интактными и опытными крысами *-Р<0,05; **-Р<0,01; ***-Р<0, 001 (по Ь-критерию Стькдента)

табл.1 табл. 2 табл. 3

* "контрольными" обозначены крысы после "сбоя" УРАИ, получавшие физраствор

* "опытными" обо-зяачены крысы, после "сбоя" УРАИ, получавшие Пирацетам

памяти при амнезии, возникающей при действии электрического тока, так и на стрессовый компонент "сбоя" УРАИ. СПИ СОК РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Kaluzhnyi L., Aristova V., Konishi К., Kaliouzhnyi A., Litvinova S., Motin V.,Shulgovsky V., Yumia Y Opposite selective effects of neurotropin and beta-endorplùn antiserum on pain of various origin in rats. Comptes Rendus Accosiation des physiologistes. Reunion Commune. Prague, 1990, p.78 (in engl)

2. Лгггвинова C.B. Аристова B.B. Калюжный А. Л, Шульговский В.В., Калюжный J1.B. Антигипералгетический и избирательный аналгетический эффекты нейрогропина. Фармакология итоксикол., 1991, т.54, с. 13-15

3. Иноземцев А.Н., Литвинова C.B., Калюжный А.Л. Протекторное действие неиротропина на процессы обучения при эмоционально-болевом стрессе у крыс. Всссоюзн.Конф. "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых обезболивающих средств. Новгород. 1991. с43-45

4. Литвинова C.B., Иноземцев А.Н., Аристова В.В., Калюжный Л.В., Калюжный А.Л. Позитивное действие нейротропина на процессы выработки и рассогласования условной реакции избегания у крыс. Журн. ВНД, 1993, т. 43,2, с. 371-377

5.Калюжный Л.В., Грудень М.А.,Козлов А.Ю., Федосеева О.В.,Шумова Е.А.,ТорговановаГ.В.,Литвинова C.B., Аристова В.В., Калюжный А.Л., Пакченко Л.Ф., Теребилина H.H., Баронец В.Ю. К механизму морфинной резистентности и антагонистического действия налоксона: биохимические и иммунные корреляты. 2-ая конференция Российской Ассоциации по изучению боли. СпБ, 1995, с 224-227

6.Калюжный А.Л. Особенности формирования реакции избавления и избегания на ноцицептивньш раздражитель у крыс линий Wistar и WAG. 2-ая конференция PocciriicKoro общества по изучению боли.СпБ, 1995, с.218-220

7.Иноземцев А.Н., Калюжный А.Л., Литвинова С.В. Протекторное действие пирацетама на "сбой" условной реакции избегания, вызванного ноцицептивнм раздражителем у крыс. 2-ая конф. Российской Ассоциации по изучению боли. СпБ, 1995, с. 227-228

8.Kaluzhnyi L.V., Litvinova S.V., Gruden М.А., Sliumova E.A., Kozlov A.Y., Kalyuzlmyi A.L, Fedoseeva О. V. Antimorphine antibodies sera level in response to chronic morphine administration and naloxone application in rats //Internat, Conferen Pain in Europe Verona, Italy, 1995, p. 88

9.Kaluzhnyi L., Litvinova S., Gruden M., Shumova E., Kozlov A., Kaliouzhnyi A.,Torgovanova G., Fedoseeva O. Immune correlates of different naloxone effects in various ages rats.//Russ.-German Symp. "Pathology of the visceral regulation and tissue growth" Moscow, 1995, p.33—35

10.Kaluzlinyi L.V., Sliulgovski V.V., Litvinova S.V., Gruden M.A., Kozlov A.U.,Torgovanova G.V., Kaliouzhnyi A.L. Immune correlation of morphine insen-sitivityand morphine tolerance in rats. // Behav.Pharmacology 1996 N7, Suppl I, p.55-56

11. KaliuzlinyiA.L. Differences in avoidance conditioning and pyracetam effects in two indred rat strains: WAG/GSTO and Fisher-344 // Behav.Pharmacology 1996 vol.7 suppl. l,p.55

12. Иноземцев A.H., Калюжный А.Л., Литвинова C.B., Шульговский В.В. Протекторный ноотропный механизм при "сбое" условной реакции избегания //1 Российский конгресс по патофизиологии с международным участием. Москва, 17-19 окт 1996, с 211.

13. Калюжный Л.В., Груцень М. А., Козлов А.Ю., Федосеева О.В., ШумоваЕ.А., ТорговановаГ.В., Литвинова С.В., АристоваВ.В., Калюжный А.Л., Панченко Л.Ф., Теребилина Н.Н., БаронецВ.Ю. Биохимические и иммунные корреляты морфинной резистентности и антагонистического действия налоксона у крыс/

/ 1 Российский конгресс по патофизиологии с международным участием^ Тезисы докладов, Москва, 17-19 окг. 1996 с. 47

14.Panchenko L.F., Terebilir.a N.N., Baronec V.Y., Litvinova S.V., Aristova V.V.Torgovanova G.V., Kozlov A.Y., Kalyuzhnyi A.L., Gruden M.A., Fedoseeva О. V, Shumova E. A., Kalyuzhnyi L. V. Role of enkephalinase in mechanisms of morphine tolerance, morphine insensitivity and naloxone effects in rats.// Intern.Conf'Neurochemistry and pharmacology of drug addiction and alcoholism".St.Petersburg, 1996, p. 16.

15. Litvinova S.V, Kaliouzhnyi A.L., Aristova W, Grnden M.A., TerebilinaN.N. Complex study of neurochemical and immunological mechanisms of tolerance to morphine analgetic effect; effects of naloxone.//II Congress of the European federation of IASP Chapters. State of the Art in Intratecal therapy and Consideration for the future. Barselona, Spain 22-23 sept. 1997

16.Калюжный A.JI., Литвинова C.B. Изменчивость поведения живот-ных:описание, класификация, анализ. Борок, 1997г. Тезисы докладов.

17. Калюжный Л.В., Литвинова С.В., Калюжный А.Л., АристоваВ.В., Груцень М.А., Козлов А.Ю., ТорговановаГ.В., Федосеева О.В. Антитела к морфину в механизмах морфинной резистентности, морфинной толерантности и действия антагониста // Журнал экспериментальной и клинической фармакологии, т61, N1,1997, с 21-24

18.Kaluzhnyi A, Litvinova S, InozemtsevA, ShulgovskyV. Monoamine changes in brain structures during stress in rats of different strains. Forum of European Neuroscience. 1998 Berlin (принято в печать)