Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальное моделирование расстройств аутистического спектра и депрессии: поиск путей пептидергической коррекции

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное моделирование расстройств аутистического спектра и депрессии: поиск путей пептидергической коррекции"

На правах рукописи

Малышев Антон Викторович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ РАССТРОЙСТВ АУТИСТИЧЕСКОГО СПЕКТРА И ДЕПРЕССИИ; ПОИСК ПУТЕЙ ПЕПТИДЕРГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ

03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2014

71 ОКТ 2014

005553705

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета (зав. кафедрой - д.б.н., проф. A.A. Каменский) Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Дубынин Вячеслав Альбертович

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Официальные оппоненты: Соколов Олег Юрьевич

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук.

Крупина Наталия Александровна

доктор биологических наук, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии».

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится 17 ноября 2014 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, стр. 12, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте http://www.bio.msu.ru/.

Автореферат разослан 14 октября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Расстройства аутистического спектра (РАС) являются одной из наиболее часто встречающихся форм нарушения нервно-психического развития ребенка. Более чем в 80% случаев они приводят к тяжелой инвалидности. По данным Всемирной организации аутизма, в 2008 году 1 случай аутизма приходился на 150 детей, при этом за последние 10 лет количество детей с аутизмом выросло в 10 раз. Существенную роль в развитии аутизма играет наследственный фактор; серьёзное влияние оказывают патологии развития центральной нервной системы в пренатальном периоде и раннем детстве. Депрессивные расстройства характеризуются анормально сниженным настроением с негативной оценкой себя и своего будущего. В настоящее время именно депрессия - наиболее распространённое психическое заболевание (Cardemil et al., 2014). Коморбидность аутизма, депрессии и эпилепсии вызывает все нарастающий интерес исследователей. Известно, что у четверти аутичных лиц встречаются эпилептические припадки (Levisohn et al., 2007); выявлены генные мутации, ассоциированные как с РАС, так и с эпилепсией (D'Adamo et al., 2011). Депрессивные симптомы не связаны с возрастом, но значимо коррелируют с клиническим диагнозом РАС (Gotham et al., 2014; Matson et al., 2014).

Для полноценного изучения любого заболевания, механизмов патогенеза и способов коррекции, необходимы достоверные экспериментальные модели на лабораторных животных. В целях исследования аутизма в представленной работе использована модель дисфункции нервной системы при пренатальном введении высокой дозы вальпроевой кислоты. Данное воздействие приводит к появлению фетального вальпроатного синдрома, который характеризуется комплексом признаков схожим с РАС, в том числе нарушениями в социальном взаимодействии. Модель фетального вальпроатного синдрома является относительно новой и дает перспективные результаты на уровне нейроанатомии и поведения (Chomiak et al., 2013). В свете взаимосвязи РАС с эпилептическими и депрессивными нарушениями большой интерес представляет генетическая линия крыс WAG/Rij. Характерной особенностью крыс этой линии является наличие неконвульсивной формы эпилепсии (абсанс-эпилепсии), а также коморбидные депрессивноподобные особенности поведения, неассоциированные с повышенной тревожностью (Sarkisova et al., 2011). В рамках представленной работы проверялась гипотеза о наличии у детенышей WAG/Rij симптомов РАС. Наконец, в последние годы все большее внимание уделяется связи депрессивных расстройств с когнитивными нарушениями, а также вовлеченности в генез депрессии дофаминергической системы мозга (Kennedy et al., 2014). С учетом этого, нами было продолжено изучение депрессивноподобных изменений поведения крыс, возникающих в

результате хронического постнатального введения блокатора Б2-рецепторов клебоприда.

Традиционные методы лечения аутизма включают применение медикаментов различных фармакологических групп — антидепрессантов, транквилизаторов, нейролептиков. Однако, по клиническим данным, у перечисленных препаратов отмечена лишь частичная эффективность, а также имеются противопоказания и существенное побочное действие (КоЬапе, 2014). Таким образом, разработка новых способов коррекции расстройств аутистического спектра является актуальной и важной задачей, первые этапы решения которой проводятся на экспериментальных моделях патологических состояний. Кафедра физиологии человека и животных в этой области традиционно концентрирует внимание на пептидных биорегуляторах. Исследуются препараты, которые потенциально обладают высокоспецифичным положительным влиянием на состояние и созревание ЦНС. Для оценки возможностей коррекции последствий пренатального введения высокой дозы вальпроевой кислоты мы использовали: синтетический фрагмент адренокортикотропного гормона (семакс); опиоидный фрагмент бета-казеина материнского молока (бета-казоморфин-7); аналог фрагмента аргинин-вазопрессина (Ас-О-МРГШ).

Цель и задачи исследования. Основной целью представленной диссертационной работы стало сравнительное исследование поведения детенышей крыс с фетальным вальпроатным синдромом, детенышей крыс линии \¥АО/11у и крыс после хронического постнатального введения клебоприда, а также изучение корректирующего влияния пептидных регуляторов.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать наличие патологических особенностей в поведении детенышей крыс на модели пренатального введения высокой дозы вальпроевой кислоты и детенышей крыс линии \УАОЛ1у.

2. Провести сравнительный анализ зоосоциального поведения крысят с фетальным вальпроатным синдромом и крысят линии WAG/Rij, а также оценить вклад дофаминергической системы мозга при помощи селективного 02-антагониста клебоприда.

3. Исследовать влияние пептидов семакс, бета-казоморфин-7 и Ас-0-МР1Ш на поведение крыс на модели фетального вальпроатного синдрома.

4. Исследовать влияние хронического введения 02-аитагониста клебоприда в малых дозах на поведенческие показатели и гедонический статус крыс.

Научная новизна. По итогам работы получено большое количество новых данных об экспериментальных моделях расстройств аутистического спектра и депрессии на животных. Нами была успешно воспроизведена модель фетального вальпроатного синдрома у потомства крыс после

пренатального воздействия высокой дозы вальпроевой кислоты. Обнаружены значимые нарушения психомоторного развития детенышей (1-2 недели жизни); позже наблюдаются изменения в ориентировочно-исследовательской деятельности, рост уровня тревожности и депрессивности, изменение болевой чувствительности. Использована оригинальная методика оценки внутривидового взаимодействия, направленная на анализ стремления к расширению социальной активности и новым контактам, выходящим за рамки «своей семьи». Обнаружено, что показатель «социальной новизны» в группе крыс, получавших вальпроевую кислоту, достоверно ниже, чем в контроле, что указывает на избыточную привязанность подопытных животных к матери и согласуется с клиническим наблюдениям за детьми с проявлениями аутизма (Моу с1 а1., 2004).

Впервые показана способность регуляторных пептидов различных групп (фрагмент АКТГ, опиоидный пептид, фрагмент АВП) корректировать проявления фетального вальпроатного синдрома. Вероятно, это связано с известной способностью нейроактивных пептидов модулировать работу многих нейромедиаторных систем, а также изменять уровень нейротрофических факторов.

В экспериментах с крысами линии \VAGZRij впервые показано, что изменения их поведения регистрируются уже в течение 1-го месяца жизни, задолго до проявления признаков эпилепсии, которые традиционно считают причиной депрессивноподобного состояния. Серия экспериментов с использованием обучения и переучивания с положительным пищевым подкреплением позволила выявить и исследовать когнитивные нарушения в поведении крыс \\'АО/Ку.

Впервые показано, что хроническое введение блокатора 02-рецепторов клебоприда взрослым крысам способно привести к появлению некоторых признаков депрессивноподобного состояния, в частности ангедонии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют значительно расширить представления о поведенческих отклонениях на моделях расстройств аутистического спектра и депрессии. Теоретическая значимость работы состоит в расширении данных о нейробиологических и нейрохимических основах социально значимых заболеваний ЦНС. Показано, что пренатальное введение высокой дозы вальпроевой кислоты обладает негативным воздействием на формирование внутривидовых реакций, в частности снижает стремление к социальной новизне. Также на модели фетального вальпроатного синдрома продемонстрированы отклонения в зависимом от матери поведении крысят. Сходные с моделью РАС поведенческие нарушения были выявлены у крыс линии \\'АО/11у в раннем возрасте, что свидетельствует о некой общности механизмов дезорганизации работы ЦНС. Применение фармакологического

подхода позволило установить вовлеченность дофаминергической системы в наблюдаемые состояния.

С практической точки зрения полученные результаты позволяют значительно расширить представления о физиологической роли исследованных пептидов ряда групп. Для фрагментов АКТГ, АВП и бета-казоморфина-7 показано влияние на эмоциональные реакции и болевую чувствительность животных. Для БКМ-7 и семакса продемонстрировано анксиолитическое, антидепрессантное и ноотропное действие; Ас-В-МР1Ю по результатам нашей работы нормализует ноцицепцию и оказывает антидепрессантный эффект. Также показано, что пептидные регуляторы способны оказывать значимое влияние на параметры социального взаимодействия животных, а также на их когнитивные функции. Сравнительный анализ активности регуляторных пептидов различных групп позволяет предложить их совместное применение. Представляется перспективным тестирование смеси изученных пептидов для коррекции мозговых дисфункций различного генеза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пренатальное введение вальпроевой кислоты в дозе 600 мг/кг вызывает у потомства крыс ряд аутистическиподобных изменений в поведении, а также изменения в структуре головного мозга, в частности уменьшение объема гиппокампа.

2. У крысят на модели фетального вальпроатного синдрома зарегистрированы изменения зоосоциального взаимодействия, в частности снижение стремления к социальной новизне, а также изменения зависимого от матери поведения (повышение стремления находиться в контакте с матерью, не зависящее от 02-антагониста клебоприда).

3. Выявленные на экспериментальной модели фетального вальпроатного синдром изменения в значительной мере могут быть скорректированы хроническим постнатальным введением регуляторных пептидов.

4. У генетической линии крыс \¥АС/Ку в возрасте 1-2 месяцев наблюдается комплекс поведенческих нарушений, многие из которых схожи с таковыми при введение высокой дозы вальпроевой кислоты.

5. У крысят линии \\^АО/11ц зарегистрированы изменения зоосоциального взаимодействия, в частности снижение стремления к социальной новизне, а также изменения зависимого от матери поведения; последние заключаются в снижении стремления находиться в контакте с матерью и зависят от 02-антагониста клебоприда.

6. Хроническое постнатальное введение В2-антагониста клебоприда в дозе 0,4 мг/кг взрослым самцам белых крыс способно вызвать некоторые признаки депрессивноподобного состояния, в частности ангедонию.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, и 17 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Апробация работы. Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на Всероссийских молодежных школах-конференциях «БиоН нейтротехнологии» 2010 и 2011 гг., XIV и XV конференциях молодых учёных по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2010 и 2011 гг.), VII международной медицинской студенческой конференции LIMSC (Нидерланды, 2011 г.), XVI, XVII и XVIII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012, 2013, 2014 гг.), международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2012 г.), конференции "Физиология висцеральных систем в норме и патологии" (Киев, 2012 г.), международной конференции среди молодых ученых ECNP (Франция, 2012 г.), XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013 г.), VI российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г.), ежегодном съезде American Epilepsy Society (США, 2013 г.), конференции IUPS (Великобритания, 2013 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014 г.), а также на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах, содержит 28 рисунков и 21 таблицу. Список литературы включает 204 источника, из них 23 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы беспородные белые крысы и их потомство, а также крысы линий Wistar и WAG/Rij и их потомство. Работа выполнена на базе Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и Института ВНД и НФ РАН. Всех животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Взрослых животных содержали по 68 в одной клетке, детенышей — по одному выводку в клетке.

Для формирования у потомства фетального вальпроатного синдрома самкам на 12 день беременности вводили вальпроевую кислоту (Sigma-Aldrich, США) в дозе 600 мг/кг. В тестах на «детское» поведение использовали антагонист 02-рецепторов клебоприд (Sigma-Aldrich, США).

Препарат в дозе 0,1 мг/кг вводили детенышам в возрасте 15 дней внутрибрюшинно за 20 мин до поведенческого тестирования. Хроническое постнатальное введение клебоприда в дозе 0,4 мг/кг использовали в качестве модели депрессивнподобного состояния. Гептапептид семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro; ООО «ИНПЦ Пептоген») вводили интраназально в дозе 0,05 мг/кг. Гептапептид бета-казоморфин-7 женского молока (Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-Pro-Ile; синтезирован на химическом факультете СПбГУ в группе В.Н. Калихевича) вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг. Тетрапептид Ac-D-MPRG (Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly; синтезирован в Институте биоорганической химии HAH Белоруссии в группе В.Н. Голубовича) вводили интраназально в дозе 0,01 мг/кг. Все пептиды вводили с 1-го по 14-й день жизни крысят.

Всего работа состояла из 9 экспериментальных серий, суммарно было использовано 751 животное.

Список экспериментальных серий:

1. Оценка специфики фетального вальпроатного синдрома (ФВС) у детенышей белых беспородных крыс (п=127).

2. Изучение параметров зависимого от матери (детского) поведения крыс с ФВС, в т.ч. после введения клебоприда (п=82).

3. Оценка влияния гептапептида семакс на проявления ФВС (п=57).

4. Оценка влияния бета-казоморфина-7 на проявления ФВС (п=63).

5. Оценка влияния модифицированного С-концевого фрагмента аргинин-вазопрессина (Ac-D-MPRG) на проявления ФВС (п=69).

6. Изучение поведения крыс линии WAG/Rij в возрасте 1-2 месяцев (п=140).

7. Изучение параметров зависимого от матери (детского) поведения крыс линии WAG/Rij, в т.ч. после введения клебоприда (п=132).

8. Изучение когнитивных особенностей взрослых крыс линии WAG/Rij в тесте с положительным подкреплением (п=34).

9. Модель депрессивноподобного состояния с использованием хронического введения клебоприда (п=47).

Схема проведения тестов:

В сериях №№ 1, 3, 4, 5, 6 использовалась следующая последовательность тестов:

6 день - рефлекс переворота со спины на лапы («righting reflex»);

10 день - двигательная активность («gait reflex»);

11 день - «ольфакторная дискриминация»;

12 день - «отрицательный геотаксис»;

12-16 дни - определение момента открытия глаз; 16 день — чувствительность к тактильной стимуляции; 21 день — «открытое поле со сменой освещенности»; 26 день — «приподнятый крестообразный лабиринт»; 29 день — «социальное поведение с матерью»; 36 день - «социальное поведение с сибсом»;

38 день — «принудительное плавание»; 42 день - «горячая пластина»;

48-50 дни - условный рефлекс пассивного избегания.

В сериях 2 и 7 применяли оригинальную методику оценки зависимого от матери поведения в возрасте 10 и 15 дней (Стоволосов с соавт., 2010). В серии 8 использовали «сложный пищевой лабиринт», тест на пищевую мотивацию «novelty suppressed feeding», «принудительное плавание» и «горячую пластину»; в серии 9 - тест на потребление сахарозы.

Параметры установок и протоколы экспериментов:

Тест «righting reflex». Крысенка переворачивали на спину, а затем отмечали время, когда он встанет на все 4 лапы.

Тест «gait reflex». Крысенка помещали в центр круга (d=15 см), а затем отмечали время, когда он всеми 4-мя лапами пересечет границу круга.

Тест «ольфакторная дискриминация». Тестирование проводили в боксе 25*8 см, содержащем на одном конце опилки из домашней клетки, на противоположном - чистые опилки. Регистрировали время, за которое крысенок из центра бокса доберется до опилок, и то, какие опилки он предпочтет.

Тест «отрицательный геотаксис». Крысенка помещали вниз головой в центр наклонной поверхности (длина 25 см, угол наклона 20°, а затем 45°); отмечали латентный период поворота и время, за которое он достигал конца поверхности.

Тест «чувствительность к тактильной стимуляции». Отмечали реакцию крысенка на прикосновение ватным тампоном к уху, используя балльную шкалу: 0 - нет реакции, 1 - избегание стимуляции с помощью поворота головы, 2 — активное избегание стимуляции.

Тест «открытое поле со сменой освещенности» (ОП). Проводился на круглой арене (d=100 см) с отверстиями («норками»). Эксперимент длился 5 минут: 1-3 минуты при ярком свете, 4-я при красном, 5-я при ярком. Регистрировали латентный период выхода из центра арены, горизонтальную и вертикальную активность, перемещения к центру арены, груминг, заглядывания в «норки».

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). Длина лучей лабиринта равна 50 см, ширина 15 см, высота стенок закрытых рукавов 30 см; открытые рукава ярко освещены. Эксперимент длился 5 минут. Регистрировали латентный период входа в закрытый рукав, время пребывания в разных участках лабиринта, стойки, груминг, выглядывания на свет, выходы на свет, выходы на края открытых рукавов, свешивания с краев, переходы через центр «свет-свет» и «темнота-темнота»

Тесты «социальное поведение с мамой/сибсом». Использовали Т-образную камеру, разделенную на 6 квадратов со стороной 14 см, высота стенок - 30 см. В крайних квадратах правого и левого отсеков за решетчатыми перегородками располагала маму или чужую самку, сибса или

крысенка из другого выводка. Эксперименты проводили в условиях красного освещения в течение 5 минут. Регистрировали время, проведенное исследуемым животным в различных квадратах, количество подходов к другим крысам, горизонтальную и вертикальную активность, подъемы на решетчатые перегородки, обнюхивания, груминг.

Тест «принудительное плавание». Использовали пластиковый цилиндр высотой 39 см, диаметром 20 см с водой температурой 28°С. Регистрировали число и время эпизодов активного плавания, пассивного плавания и иммобилизации. Время наблюдения составляло 5 минут.

Тест «горячая пластина». Использовали анальгезиметр фирмы Ugo Basile (Италия). Животное помещали на металлическую поверхность, разогретую до 53°С. Регистрировали латентный период первого облизывания задней лапы. Время тестирования ограничивали 30 секундами. Проводили 4 измерения болевой чувствительности с интервалом 15 минут.

Тест «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ). Выработка УРПИ проводилась в светло-темной камере (50x25x40 см), пол которой подключен к электростимулятору ЭСЛ-1. В первый день проводили обучение животных. Когда крыса заходила в темный отсек, использовали удар током (50 Гц, 10 мс) напряжением 80-100 В. Через 72 часа проводили проверку выработки УРПИ, помещая крысу в ту же камеру, но без удара током, и измеряли латентный период захода в темный отсек.

Тест «детское поведение». Использовали квадратную арену размером 60x60 см. В центр арены помещали спящую самку (использовали ветеринарный наркоз). Каждого детеныша 3 раза помещали на 1 мин к спине самки и регистрировали: латентные периоды полуобхода тела самки и присасывания к соску, число подталкиваний самки детенышем, число попыток влезания на тело матери.

Тест «сложный лабиринт с пищевым подкреплением». Лабиринт представляет собой камеру размером 60x60x25 см, разделенную пятью прозрачными перегородками с отверстиями на 6 коридоров. На фоне пищевой депривации проводилась выработка у крыс пищедобывательного навыка: 5 попыток не более 3-х минут ежедневно. Регистрировали латентный период выхода из стартового коридора, латентный период взятия пищи, ошибки, стойки. После достижения критерия обученное™ перегородки лабиринта переворачивали зеркальным образом и переучивали крыс.

Тест «novelty suppressed feeding». Животных подвергали 24-часовой пищевой депривации, после чего помещали на 10 мин в новую обстановку, где находилась 1 гранула корма, измеряли латентный период нахождения корма. После этого крысу возвращали в домашнюю клетку и измеряли количество корма в граммах, съеденное в течение 10 минут.

Тест на потребление сахарозы. Крысу помещали на 15 мин в камеру, где регистрировали количество выпитой жидкости (20% раствор сахарозы).

Животных не подвергали специальной процедуре пищевой или питьевой депривации.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программ «Statistica V8.0» (Statsoft, США) и «MS Office Excel 2013» (Microsoft, США). Для сравнения контрольных и опытных групп использовали параметрические и непараметрические критерии: тест Стьюдента, ANOVA, критерий хи-квадрат, критерий Манна-Уитни, корреляционные методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Оценка поведения крыс в модели фетального вальпроатного синдрома

Показано, что после пренатального введения вальпроевой кислоты у детенышей крыс отмечаются нарушения психомоторного развития, в частности время переворота со спины на лапы составило 2,4 ± 0,2 с (в контроле - 1,8 ± 0,2 с, р<0,05). Результаты тестов ОП и ПКЛ указывают на достоверное снижение вертикальной двигательной активности и рост ряда показателей «поведения риска» у крыс с ФВС, что означает снижение у них ориентировочно-исследовательской активности и рост уровня тревожности. В тесте «принудительное плавание» у опытной группы по сравнению с контрольной суммарная длительность активного плавания снижена на 22%, тогда как суммарное время иммобилизации увеличено на 19% (р<0,05), что свидетельствует о повышении уровня депрессивности. Также у крыс с ФВС отмечены изменения болевой чувствительности, в частности увеличение среднего ЛП рефлекса облизывания задней лапы относительно контрольной группы на 20% (р<0,05).

Особый интерес представляют изменения в зоосоциальном взаимодействии, изучение которого проводилось по оригинальной методике, позволяющей оценить стремление к социальной новизне. Данный параметр определяется как время, проведенное рядом с чужой крысой, деленное на время, проведенное с матерью или сибсом. Показано, что у крыс с ФВС достоверно снижен целый ряд показателей активности в отсеке рядом с чужой самкой и повышен рядом с матерью. Схожие изменения на уровне тенденции наблюдаются и в ситуации выбора между сибсом и чужаком (рис. 1). Также в группе опытных животных в отсеке с чужой самкой значимо снижено количество стоек (опыт — 3,0 ± 0,3, контроль - 5,6 ± 0,6, р<0,01); число подходов (опыт - 2,4 ±0,1, контроль — 3,1 ± 0,2, р<0,01; число актов груминга (опыт - 0,7 ±0,1, контроль - 3,0 ± 0,6, р<0,01).

Наблюдаемый комплекс поведенческих изменений позволяет отнести моделируемый фетальный вальпроатный синдром к расстройствам аутистического спектра и подтверждает состоятельность гипотезы о том, что введение высокой дозы ВПК в пренатальном периоде является экспериментальной моделью РАС.

100 80 60 ■ 40 20 -0

**

I i

p=0,09

tAA

Рис. 1. Результаты тестов «социальное поведение с мамой» и «социальное поведение с сибсом» после пренатальной инъекции ВПК. А -время в отсеке рядом с чужой самкой; Б - время в отсеке рядом с матерью; В — социальная новизна в тесте «социальное поведение с мамой»; Г — социальная новизна в тесте «социальное поведение с сибсом». По оси ординат: А и Б - время, е.; В и Г - усл. ед. Возраст 29 и 36 дней. Условные обозначения: белый цвет - контрольная группы (п=56), черный цвет — опытная группа (п=71). * и ** - отличия от контрольной группы с р<0,05 и р<0,01 соответственно по t-критерию Стьюдента. Планки погрешностей -стандартная ошибка среднего (SEM).

В рамках представленного исследования была проведена дополнительная серия на модели с использованием мальков Danio rerio. Мальков содержали в чашках Петри в 30 мл подготовленной воды (Egg Water). Вальпроевую кислоту использовали в дозах 125цМ и 150 цМ. Было показано, что 10-12% мальков в каждой опытной группе погибали после суточной инкубации в ВПК, в контроле все 100% рыб оставались живы (р<0,05). К тому же после инкубации в растворе ВПК у мальков опытной группы отсутствует плавательный пузырь в 76%-80% случаев. Также у мальков опытной группы развивается осевая аномалия изгиба тела (рис. 2). После суточной инкубации икры в растворе ВПК у мальков опытной группы достоверно развивается отек желточного мешка, его объем увеличивается на 11% относительно контроля (р<0,05).

Рис. 2. Измерение морфологических параметров мальков Оашо гепо.

A) - контрольный малек; Б) - искривление оси тела;

B) - отек сердца и желточного мешка, отсутствие плавательного пузыря.

Изучение зависимого от матери («детского») поведения детенышей крыс на модели фетального вальпроатного синдрома

При тестировании на 10-й день жизни значимых межгрупповых различий обнаружено не было. Однако на 15 день происходит значительное и, по-видимому, патологическое повышение детской привязанности у ВПК-крысят. В опытной группе средний из 3-х попыток латентный период полуобхода тела матери снижен на 40%, средний ЛП присасывания к соску матери - на 43%, средний ЛП перелезания тела матери - на 47%, суммарное по 3-м попыткам время пассивного контакта с матерью - на 67,5% (во всех случаях р<0,05). Вероятно, в ситуации стрессогенного внешнего воздействия и общего ухудшения состояния ЦНС становится критически важным сохранять именно контакт с матерью, т.к. это основной способ поддержания жизнедеятельности крысенка. Можно также предположить, что на фоне фетального вальпроатного синдрома происходит компенсаторное усиление активности дофаминергической системы, которое приводит к гиперактивации детской мотивации. С целью установления вовлеченности дофаминергической системы мозга в изменения детского поведения у ВПК-крыс нами был проведен фармакологический тест с введением 02-антагониста клебоприда в дозе 0,1 мг/кг. При оценке параметров детского поведения контрольных животных отмечается существенное ухудшение детской мотивации той половины группы, которая получала клебоприд. При этом введение клебоприда не оказало влияния на крыс, подвергнутых пренатальному воздействию ВПК (рис. 3). Из этого следует, что функционирование дофаминергической системы действительно изменено в результате пренатальной инъекции ВПК (например, снижена чувствительность рецепторной составляющей дофаминовой системы).

60 50 -40 -30 -20 -10

-10 -15 -20

А " Б

Рис. 3. Средний латентный период полуобхода тела матери в тесте «детское поведение» на 15-й день жизни. А - абсолютные значения до и после введения клебоприда (ОД мг/кг). Б — изменение (дельта) «до-после» введения препарата. По оси ординат — время, с. Условные обозначения: пунктирная линия и белый цвет - подгруппа контрольных животных, получавших клебоприд (п=18); сплошная линия и черный цвет - подгруппа ВПК-животных, получавших клебоприд (п=19). Остальные обозначения, как на рис. 1.

Изучение корректирующего воздействия гептапептидов семакс, бета-казоморфин-7 (БКМ-7) и тетрапептида Ас-О-МРИв

При иитраназальиом введении препарата семакс в 1-14 дни жизни в дозе 0,05 мг/кг на фоне предварительного пренатального воздействия ВПК были зарегистрированы: частичная нормализация психомоторного развития крысят; повышение стремления к социальной новизне; снижение уровня их депрессивности; нормализация ноцицепции. Так, практически во всех «ранних» тестах можно отметить тенденции к улучшению параметров психомоторного развития. При тестировании зоосоциального взаимодействия в группе животных, получавших препарат, достоверно увеличено общее время контакта с чужой крысой (и самкой, и детенышем) и стремление к социальной новизне (р<0,05). Также у животных, получавших пептид, увеличена длительность 1 -ого эпизода активного плавания, увеличен латентный период иммобилизации и суммарное время иммобилизации (р<0,05). В тесте «горячая пластина» средний латентный период облизывания лапы среди крыс опытной группы составил 11,3 ± 1,2 с, а в контроле - 8,2 ± 0,9 с (р<0,05).

Корректирующие эффекты семакса на модели РАС могут быть связаны с его влиянием на систему нейротрофических факторов. Активируя меланокортиновые рецепторы, гептапептид повышает уровень экспрессии, прежде всего, ВОМ7 (ОоЫоу й а1., 2006). Также введение семакса приводит к повышению активности системы серотонина, что может обеспечивать улучшение внимания, стимулировать социальное поведение и улучшать эмоциональное состояние животных.

При внутрибрюшинном введении бета-казоморфина-7 в 1-14 дни жизни в дозе 1 мг/кг на фоне предварительного пренатального воздействия ВПК были зарегистрированы: смещение баланса между тревожностью и ориентировочно-исследовательской активностью в сторону последней; снижение поведенческих проявлений депрессивности; нормализация ноцицепции; улучшение обучения с отрицательным подкреплением. Так, значимое отличие в тесте ОП было найдено в количестве обследованных норок на 4-й минуте измерений (при красном свете): в группе с введением пептида, величина показателя составила 1,4 ± 0,3, в контроле - 0,7 ± 0,2 (р<0,05); также значимое отличие в тесте ПКЛ зарегистрировано по числу выходов на открытые рукава лабиринта: в опытной группе 6 крыс совершили более одного выхода, тогда как в контроле такое животное было всего 1 (р<0,05 по критерию хи-квадрат). При оценке зоосоциального взаимодействия крыс, получавших БКМ-7, удалось выявить тенденцию к усилению стремления к новым социальным контактам по ряду параметров. Под влиянием пептида длительность первого периода иммобилизации в тесте «принудительное плавание» уменьшилась на 64%. Также у крыс группы «ВПК+БКМ-7» ЛП рефлекса облизывания задней лапы в первой посадке снизился на 39%, средний по 4-м посадкам ЛП - на 32%, а также

максимальный из 4-х проб ЛП - на 34%. Наконец, значимо увеличилась разница между ЛП входа в темный отсек при обучении и проверке (дельта ЛП): в группе «ВПК+БКМ-7» этот показатель составил 111,1 ± 18,7 с, в группе отрицательного контроля - 50,5 ± 18,7 с (р<0,05).

К возможным механизмам эффектов корректирующего влияния БКМ-7 на модели РАС можно отнести: хроническое воздействие на опиоидные рецепторы и внутриклеточные эффекторы; влияние на нейротрофические факторы; собственное подкрепляющее действие и модуляцию активности мезолимбической части дофаминергической системы и системы моноаминов в целом (Lutz et al., 2013).

При интраназальном введении тетрапептида Ac-D-MPRG в 1-14 дни жизни в дозе 0,01 мг/кг на фоне предварительного пренатального воздействия ВПК были зарегистрированы: сдвиг параметров зоосоциального взаимодействия от привязанности к сибсу в сторону взаимодействия с чужим детенышем; снижение поведенческих проявлений депрессивности; нормализация ноцицепции. Так, у крысят, получавших препарат, интегральный показатель активности рядом с детенышем из чужого выводка оказался выше на 21% (вычислялся как сумма таких поведенческих реакций, как обнюхивания, залезания на решетку, подходы и стойки в отсеке рядом с чужаком). Также под влиянием пептида наблюдалось увеличение количества эпизодов активного плавания на 20% и снижение среднего времени иммобилизации 26% по сравнению с контролем (р<0,05). В тесте «горячая пластина» средний ЛП рефлекса облизывания задней лапы в отрицательном контроле составил 8,6 ± 0,4 с, а в группе с введением пептида — 7,6 ± 0,3 с (р<0,05 по критерию Манна-Уитни).

Корректирующие действие тетрапептида может быть связано с непосредственным влиянием на рецепторы АВП (Kormos et al., 2013). С другой стороны, известно, что при стрессе секрецию вазопрессина активирует норадреналин. Поскольку катехоламины участвуют в регуляции неспецифических механизмов памяти, реакции активации, оценки значимости стимула и силы подкрепления (Brandl et al., 2014), можно предположить, что активация катехоламинергической системы способна оказывать влияние на модификацию процессов ЦНС под действием АВП и его аналогов.

Все статистически значимые результаты экспериментов с введением пептидов детенышам крыс обобщены в таблице 1. Можно отметить, что все пептиды в той или иной степени оказали корректирующее влияние на стремление к социальной новизне. Из протестированных соединений наиболее выраженное воздействие на этот параметр оказал гептапептид семакс, который уже используется в клинике (в том числе, в педиарии) для коррекции задержек в развитии. По результатам проведенного исследования можно рекомендовать расширение применения по терапевтическому эффекту семакса на область расстройств аутистического спектра.

Таблица 1. Выявленные в различных тестах эффекты хронического введения регуляторных пептидов.

Условные обозначения: - повышение/снижение параметра

относительно интактного контроля; = - значимого эффекта при введении пептида не обнаружено.

Группа/ Параметр ВПК ВПК+ семакс ВПК+ БКМ-7 ВПК+ Ac-D-MPRG

Тревожность Î = 1 =

Депрессивность т 1 1

Болевая чувствительность i Î Г î

Социальное поведение i Г î т

Магнитно-резонансная томография (МРТ)

Проведено исследование структур головного мозга крыс с помощью магнитно-резонансной томографии. Использовали томограф для малых животных Bruker BioSpec 70/30 (постоянное магнитное поле ВО = 7 Тл, максимальное разрешение 200 мкм) с программным обеспечением Para Vision 5.0. Исследование проводилось в возрасте 2 месяцев после окончания поведенческих экспериментов в двух режимах: T2-RARE для получения Т2-взвешенных изображений (Т2ВИ) с высоким разрешением и Т2-тар (Т2-карта) для проведения количественного МРТ-исследования. Для Т2ВИ производили подсчет объема левой и правой сторон гиппокампа. Для исследования в режиме Т2-карты были выбраны: зоны гиппокампа CAI и САЗ, таламус (thalamus), стриатум (caudate, putamen), латеральная часть бледного шара (lateral globus pallidus), миндалина (amygdalohippocampal area).

Т2-карты

Анализ Т2-карт позволяет выявить отличия в структуре мозговой ткани между контролем и опытом. Показано, что в группе после пренатальной инъекции ВПК происходит значимое усиление Т2-сигнала на 19,5% в таламусе, на 10% в миндалине, на 12% в стриатуме и на 10,5% в базальных ганглиях. Результаты представлены на рисунке 4. Повышение уровня Т2-сигнала свидетельствует, как правило, о нейродегенеративных процессах, гибели нейронов и обводнении мозговой ткани.

Caud. put.

Gl.p.

Рис. 4. Изменение величины Т2-сигнала в различных отделах мозга крыс. ТЬ - таламус; Amg - миндалина; Саис1.ри1. - стриатум; 01 .р. -бледный шар. По оси ординат - мс. Условные обозначения: белый цвет — группа контрольных животных (п=9), черный цвет - группа опытных животных, получавших ВПК (п=8). Остальные обозначения, как на рис. 1.

Измерение объема гиппокампа Тестирование проводилось с контрольными животными, с крысами после пренатальной инъекции ВПК, а также в сериях с введением БКМ-7 и Ac-D-MPRG (рис. 5). Пренатальное введение ВПК вызывает у крыс достоверную редукцию гиппокампа на 19% по сравнению с контролем. Уменьшение объема гиппокампа связывают с различными морфологическими нарушениями (склерозом, гибелью нейронов). Оно может привести к дефициту рабочей памяти, нарушению обработки сигналов, изменениям в эмоциональной сфере. С учетом этого методика МРТ позволила нам выявить нейропротекторное действие БКМ-7 и Ac-D-MPRG на фоне развития фетального вальпроатного синдрома. У крыс, получавших БКМ-7, отмечается значимое увеличение объема левого гиппокампа на 10,5%; у крыс, получавших Ac-D-MPRG произошло увеличение объема левого гиппокампа на 20% и правого гиппокампа на 19% относительно ВПК-группы. Под влиянием пептидов происходит возврат объема гиппокампа к уровню здоровых животных.

Рис. 5. Изменение объема гиппокампа у крыс. По оси абсцисс: К - здоровый контроль (п=20); ВПК - крысы, получившие пренатальную инъекцию ВПК (п=17); БКМ-7 -крысы, получившие ВПК и в/б инъекции пептида бета-

казоморфина-7 в 1-14 дни жизни (n=6); Ac-D-MPRG - крысы, получившие ВПК и и/н инъекции аналога фрагмента АВП в 1-14 дни жизни (п=5). По оси ординат - объем, мм3. Условные обозначения: вертикальный штрих - объем левого гиппокампа; горизонтальный штрих - объем правого гиппокампа. * - отличие от контроля с р<0,05; # - отличие от группы ВПК с р<0,05 по t-критерию Стьюдента.

БКМ-7 Ac D-MPRG

Изучение особенностей поведения крыс линии \VAGZRij в раннем возрасте (1-2 месяцы жизни)

Показано, что у детенышей крыс линии \УАО/Ш] замедлено психомоторное развитие, повышены тревожность и депрессивность, изменено социальное взаимодействие, нарушена ноцицепция и ухудшено обучение с отрицательным подкреплением. Так, у крыс \УАС/11у время переворота со спины на лапы составило 4,3 ± 1,0 с, а в контроле — 1,8 ± 0,2 с (р<0,05). При неизменном уровне двигательной активности у детенышей \УАО/11у достоверно снижены показатели, характеризующие уровень исследовательской мотивации: в тесте ОП число стоек у них уменьшено на 18%, число обследованных норок на 30%, число отходов от стенок арены на 60% относительно контроля; в тесте ГЖЛ у них на 25% увеличено время в закрытых рукавах лабиринта, на 78% снижено время на открытых лучах лабиринта, на 77% - число выходов на светлые рукава, на 68% - количество свешиваний с открытых рукавов лабиринта. Также у крыс линии ХУЛв/Яу выявлено уменьшение на 28% длительности активного плавания и увеличение на 48% длительности иммобилизации (р<0,01). Средний латентный период рефлекса облизывания лапы у них составил 15,8 ± 0,8 с, а в контроле — 9,2 ± 0,7 с (р<0,01). При проверке выработки УРПИ латентный период захода в темный отсек в опытной группе составил 23,1 ± 4,0 с, тогда как в контроле - 146,0 ± 9,6 с (р<0,01). Особый интерес представляют данные тестов на социальное взаимодействие в ситуациях выбора «мама-чужая самка» и «сибс-чужак», позволяющие оценить стремление крысят к социальной новизне (рис. 6 и 7). Нами обнаружены значимые результаты, схожие с аналогичными в случае ВПК-крыс, что позволяет проводить параллели между мозговыми дисфункциями ВПК-крыс и животных линии

ХУАв/Яц, а также предполагать аутистических расстройств.

коморбидность депрессивных и

Рис. 6. Результаты теста «социальное поведение с мамой» при изучении крыс линии \УАО/Ш]'. А - время в отсеке рядом с чужой самкой; Б - время в отсеке рядом с мамой; В - социальная новизна. По оси ординат: А и Б — время, е.; В - усл. ед. Условные обозначения: белый цвет - группа «\Vistar» (п=56), черный цвет - группа «ХУАО/Яу» (п=84). Остальные обозначения, как на рис. 1

Рис. 7. Параметры зоосоциального взаимодействия в тесте «социальное поведение с сибсом» при изучении поведения крыс линии \УАО/11у. По оси абсцисс: А - время в отсеке рядом с сибсом; Б — время в свободном отсеке Т-камеры. По оси ординат: А и Б - время, с. Условные обозначения как на Рис. 6.

Все статистически значимые результаты экспериментов с введением пептидов детенышам крыс обобщены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение особенностей поведения крыс линии \¥АО/Яу и крыс с фетальным вальпроатным синдромом.

Условные обозначения: - повышение/снижение параметра по сравнению с контрольными группами; = — значимых отличий не обнаружено.

Группа/ Параметр ВПК \VAGZRij

Психомоторное развитие 4 4

Тревожность Т Т

Депрессивность т Т

Болевая чувствительность 4

Обучение (УРПИ) = 4

Социальное поведение 4 4

Изучение зависимого от матери («детского») поведения крыс линии

Полученные результаты указывают на снижение детской мотивации детенышей крыс линии \УАО/11ц. При тестировании ориентированного на мать поведения на 10-й день жизни среди детенышей \¥АО/11у 31 крысенок из 75 присосался к соску, среди контрольных - только 15 из 58 (р<0,05 по точному критерию Фишера). При этом у потомства крыс \УАО/11у на 73% меньше время контакта с матерью, на 52% - число стоек, на 45% - число актов груминга (р<0,05). При тестировании ориентированного на мать поведения на 15-й день жизни обнаружено, что у крысят \¥АО/11ц

80 -60 40 -20 -0

*

ш!

относительно контрольных животных достоверно меньше латентный период присасывания к соску. Лишь 1 из 74 детенышей из группы \УАО/11у провел рядом с матерью более 40 с, в то время как в контроле таких крыс было 9 из 58 (р<0,01 по точному критерию Фишера).

Полученные результаты можно трактовать так, что крысята Х^АС/Яу четко ассоциируют родное гнездо с пищей и безопасностью, но мотивация находиться в контакте с матерью и стремление к социальному взаимодействию с ней у них снижены. Уменьшение привязанности к матери у детенышей WAG/Rij, вероятно, может быть следствием нарушений материнского поведения и ослабленной материнской заботы (Загклэоуа е1; а1., 2011). Кроме того, пониженная привязанность к матери у детенышей \УАОЛ1у может быть ранним маркером депрессивной патологии, проявляющейся в полной мере существенно позже.

Для того, чтобы оценить функциональное состояние дофаминергической системы у детенышей крыс \\^АО/11у, был проведен тест с введением антагониста Э2-рецепторов клебоприда в дозе 0,1 мг/кг. Показано, что введение препарата увеличивает латентные периоды полуобхода тела матери и присасывания к соску, уменьшает число подталкиваний, т.е. оказывает угнетающее влияние на зависимое от матери поведение. Клебоприд оказывает более сильное угнетающее влияние на поведение детенышей крыс линии \¥АС/11у, чем на реакции контрольных животных (рис. 8). Полученные результаты указывают на то, что дофаминергическая система мозга крысят линии \¥АО/11у характеризуется повышенной чувствительностью к клебоприду (в отличии от ВПК-крыс).

п

7 J **

Б

Рис. 8. Средний латентный период полуобхода тела матери в тесте «детское поведение» на 15-й день жизни. А - абсолютные значения до и после введения клебоприда (0,1 мг/кг). Б - изменение (дельта) «до-после» введения препарата. По оси ординат - время, с. Условные обозначения: пунктирная линия и белый цвет — подгруппа контрольных животных, получавших клебоприд (п=35); сплошная линия и черный цвет - подгруппа крыс линии \¥АО/11у, получавших клебоприд (п=39). Остальные обозначения как, на рис. 1.

Изучение когнитивных функций у крыс линии WAG/Rij

Полученные при проведении экспериментов в «сложном лабиринте» данные свидетельствуют об ухудшении способности к обучению и переучиванию (выполнению обратной задачи) у крыс линии WAG/Rij. Принимая во внимание тот факт, что выбранная нами методика способна оценить функциональное состояние гиппокампа и префронтальной коры (Sarkisova et al., 2011), можно заключить, что при генетически обусловленных депрессивных состояниях у крыс линии WAG/Rij функционирование данных отделов головного мозга нарушено.

При выполнении прямой задачи в «сложном лабиринте» скорость достижения критерия обученности была разной у крыс опытной (WAG/Rij) и контрольной (Wistar) групп. 100% крыс Wistar обучились к 5-му дню тестирования, в группе WAG/Rij таких животных не было. В среднем крысы WAG/Rij достигли критерия обученности при выполнении прямой задачи на 7-8 день; 4 крысы WAG/Rij так и не достигли критерия обученности и были исключены из эксперимента при проведении переучивания. Средняя величина латентного периода выхода из 1 -го отсека в опыте была увеличена на 56%, а время выполнения реакции - на 58% относительно контроля (р<0,05). При проведении переучивания с выполнением обратной задачи животные WAG/Rij справились лучше, чем с выполнением прямой: 16 из 19 крыс переучились на 2-й день. Все 11 крыс Wistar также справились с задачей на 2-й день тестирования; при этом величина латентного периода выхода из 1-го отсека в группе WAG/Rij была повышена на 67%, а время реакции - на 65% относительно контроля.

Таким образом, нами впервые получены данные, свидетельствующие о когнитивном дефиците у крыс WAG/Rij при выполнении прямой и обратной задач в сложном (пищевом) лабиринте. Показано, что у людей с исходно повышенным уровнем дофамина в стриатуме реверсивное обучение с положительным подкреплением происходит лучше, чем у людей с исходно пониженным содержанием дофамина (Cools et al., 2009). Следовательно, пониженная способность крыс WAG/Rij к реверсивному обучению может быть связана с дофаминергической недостаточностью стриатума, что подтверждается биохимическими данными (Sarkisova, 2011).

Модель депрессивноподобного состояния с использованием хронического введения клебоприда

Был проведен тест на потребление раствора сахарозы, который позволяет выявить такой симптом депрессивных изменений, как ангедонию. Показано, что достоверные различия обнаруживаются после 6-й инъекции клебоприда, т.е. на 7-й день проведения теста: в опытной группе было 7 животных, которые выпили не более 3,6 г раствора сахарозы, в то время как в контроле таких животных было только 2 (р=0,03 по критерию хи-квадрат). На 9-й день тестирования в опытной группе остается 6 животных, которые

потребляют не более 20% среднего уровня потребления раствора сахарозы в контроле, тогда как среди контрольных животных таких уже нет (р=0,01 по критерию хи-квадрат). На следующий день среднее потребление раствора сахарозы среди животных опытной группы было в 2 раза ниже по сравнению с контролем. Аналогичные различия были зарегистрированы на 12-й день: потребление сахарозы опытными животными было ниже на 43% (рис. 9).

По результатам теста «принудительное плавание» у крыс, получавших инъекции блокатора, время иммобилизации составило 61,1 ± 9,2 с, а в контроле - 37,9 ± 8,1 с (р=0,09). Различий в тесте «novelty suppressed feeding» обнаружено не было: опытные животные потребляли 2,4 ± 0,2 г корма, а контрольные - 2,6 ± 0,3. В динамике изменения массы тела животных нами был обнаружен некоторый продепрессантный эффект. Достоверные различия проявились на 7-й день серии, т.е. после 6-го укола препарата, и сохранялись, практически, до конца экспериментов. На протяжении этого периода в контрольной группе было 5 крыс, которые весили не менее 290 г, тогда как в опыте таких животных не было.

Рис. 9. Динамика потребления раствора сахарозы в эксперименте с хроническим введением клебоприда. По оси абсцисс: дни проведения теста. По оси ординат - количество выпитого раствора сахарозы, г. Условные обозначения: пунктирная линия — группа контрольных крыс линии Wistar (п=24), сплошная линия - группа опытных крыс линии Wistar, получавших инъекции клебоприда (п=23). * - отличие от контрольной группы с р<0,05 по t-критерию Стьюдента. $ - отличие от контрольной группы с р<0,05 по критерию хи-квадрат. Данные пронормированы по значениям в контрольной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным ВОЗ на 2013 год более 7,6 миллионов людей страдало РАС по всему миру, а по данным американской организации CDC аутистические расстройства в 2011-2012 годах имелись в США у каждого 50-го школьника. В свете описанной взаимосвязи РАС с эпилептическими и депрессивными нарушениями представляется крайне актуальным и интересным

сравнительный анализ животных моделей с пре- и постнатальным введением фармакологических препаратов, а также генетических линий животных с целью выявления коморбидности патологий.

Полученные нами результаты подтверждают способность высокой дозы ВПК вызывать развитие фетального вальпроатного синдрома у детенышей, а также дополняют и расширяют данные о нарушениях в работе мозга потомства. Особенно важно отметить новые данные о зоосоциальном взаимодействии экспериментальных животных. Во-первых, нами была использована методика, позволяющая оценить стремление к социальной новизне, т.е. стремление к расширению социальной активности, к новым контактам, выходящим за рамки «своей семьи». Снижение данной мотивации было выявлено нами у крысят как в ситуации выбора между матерью и незнакомой самкой, так и между сибсом и чужаком. Во-вторых, нами продемонстрированы нарушения зависимого от матери поведения крыс с ФВС. Вероятно, сочетание нарушений ЦНС при фетальном вальпроатном синдроме приводит к компенсаторному усилению привязанности к матери.

Также наше исследование расширяет представление о поведенческих особенностях крыс линии WAG/Rij в раннем возрасте и коморбидности РАС, эпилепсии и депрессии. Полученные результаты указывают, что развитие патологических процессов у крыс линии WAG/Rij начинается уже в течение первого месяца жизни. Показано, что у детенышей крыс линии WAG/Rij замедлено психомоторное развитие, повышены тревожность и депрессивность, изменено социальное взаимодействие, нарушена ноцицепция и ухудшено обучение с отрицательным подкреплением. При этом впервые показаны изменения зоосоциального поведения у крыс WAG/Rij, проявляющиеся как в стремлении к социальной новизне, так и в «детских», направленных на мать, реакциях. Сравнение с ВПК-крысами показывает, что у крыс WAG/Rij мозговая дисфункция выражена еще ярче, хотя эти две патологические модели во многом сонаправлены. Вероятно, в основе соответствующих поведенческих изменений лежат (хотя бы отчасти) сходные механизмы. Например, в одной из недавних работ показано, что нарушения деацетилирования гистонов и посттрансляционных модификаций (в частности, ацетилирования) имеют место и в случае животных моделей депрессии (Liu et al., 2014).

Третьей исследованной моделью стало постнатальное фармакологическое воздействие хронически вводимого клебоприда. Инъекции 02-антагониста вызвали продепрессантный эффект. Ранее в нашей лаборатории было показано, что В2-антагонист, вводимый самкам после родов, увеличивает уровень тревожности потомства (Добрякова, 2009). Кроме того, происходит изменение привязанности к матери (Стоволосов, 2011). Следовательно, с одной стороны, блокада рецепторов к дофамину способна привести к появлению симптомов депрессивноподобных и тревожных расстройств, а с другой - необходима дальнейшая

исследовательская работа по подбору оптимальной дозы и сроков введения соответствующих агонистов и антагонистов.

Описанные экспериментальные модели могут использоваться в дальнейшем для тестирования потенциальных фармацевтических препаратов, направленных на лечение нейропатологий. На текущем этапе нами исследовано влияние регуляторных пептидов разных групп на проявления ФВС. Можно отметить, что все исследованные пептиды обладают сходным паттерном активности и изменяют схожие, но не полностью совпадающие, комплексы параметров поведения. Все они влияют на эмоциональные реакции и болевую чувствительность животных. Для БКМ-7 и семакса продемонстрировано анксиолитическое, антидепрессантное и ноотропное действие; Ас-Б-МИШ по результатам нашей работы нормализует ноцицепцию и оказывает антидепрессантный эффект. Представляется перспективным тестирование смеси изученных пептидов в целях коррекции мозговых дисфункций различного генеза. Вероятно, объединяющим механизмом эффектов пептидов различных групп является их нейтротрофическое воздействие и способность потенциировать развитие систем мозговых факторов роста и биогенных аминов.

ВЫВОДЫ

1. У детенышей крыс, получавших пренатальную инъекцию высокой дозы вальпроевой кислоты, отмечаются замедление психомоторного развития, снижение исследовательской активности, рост тревожности, нарушение зоосоциального взаимодействия, повышение уровня депрессивности, снижение болевой чувствительности. Наблюдаемый комплекс поведенческих изменений («фетальный вальпроатный синдром»; ФВС) позволяет отнести изучаемую ситуацию к экспериментальным моделям расстройств аутистического спектра.

2. Показано, что пептиды семакс, бета-казоморфин-7 и Ас-Б-МИШ способны корректировать проявления ФВС и обладают сходным спектром активности, влияя на эмоциональные реакции и болевую чувствительность животных. Для бета-казоморфина-7 и семакса, кроме того, продемонстрировано анксиолитическое, антидепрессантное и ноотропное действие. Наиболее выраженное влияние на зоосоциальное взаимодействие оказал гептапептид семакс.

3. У детенышей крыс линии \VAGZRij замедлено психомоторное развитие, повышены тревожность и депрессивность, нарушены ноцицепция и социальное взаимодействие, ухудшено обучение с отрицательным подкреплением. При обучении и переучивании в «сложном лабиринте» с пищевым подкреплением обнаружены когнитивные нарушения у взрослых крыс \УАС/11у, что, вероятно, связано с депрессивноподобными изменениями их поведения.

4. Оценка зависимых от матери («детских») реакций показывает, что у крысят с ФВС (по сравнению с контролем) на 15-й день жизни значительно повышена привязанность к матери, тогда как у потомства крыс WAG/Rij установлено снижение стремления находиться в контакте с самкой. Инъекция 02-антагониста клебоприда не оказала влияния на крысят, подвергнутых пренатальному воздействию вальпроевой кислоты, и вызвала ухудшение «детского» поведения у потомства WAG/Rij.

5. Показано, что хроническое введение низкой дозы клебоприда взрослым белым крысам вызывает снижение потребления сахарозы, что можно расценить как продепрессантный эффект, проявляющийся в развитии ангедонии.

6. Сравнительный анализ нарушений поведения животных в случае ФВС и крыс линии WAG/Rij показывает, что эти патологические модели во многом сонаправлены. В обоих случаях обнаружены нарушения психомоторного развития, рост уровня тревожности и депрессивности, изменения в зоосоциальном взаимодействии (прежде всего, снижение стремления к социальной новизне). При этом отмечаются различия в ранних «детских» реакциях и способности к обучению.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Малышев A.B.. Захаров A.M., Саркисова К.Ю., Дубынин В.А. Реверсивное обучение у крыс линии WAG/Rij с депрессивноподобным поведением. // Журнал высшей нервной деятельности - 2012 - Т. 62(5). - С. 580-590.

2. Малышев A.B.. Захаров A.M., Саркисова К.Ю., Дубынин В.А. Влияние хронического введения малых доз клебоприда на поведение белых крыс. // Вестник Московского Университета, серия 16 «Биология» — 2013 - №4. - С. 3-8.

3. Малышев A.B.. Разумкина Е.В., Дубынин В.А., Мясоедов Н.Ф. Семакс ослабляет проявления мозговой дисфункции, вызванной пренатальным введением вальпроевой кислоты. // Доклады Академии наук. — 2013 — Т. 450(3).-С. 361-365.

4. Малышев A.B.. Разумкина Е.В., Рогозинская Э.Я., Саркисова К.Ю., Дубынин В.А. Поведение и функциональное состояние дофаминергической системы мозга у детенышей депрессивных крыс линии WAG/Rij. // Журнал высшей нервной деятельности. — 2014 —Т. 64(3). - С. 334-346.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Малышев A.B.. Захаров A.M., Дубынин В.А. Новый фармакологический способ моделирования депрессивноподобного состояния у экспериментальных животных. // Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «БиоН нейтротехнологии 2010. Биоэкономика, основанная на знаниях: политика инновационного пути развития биотехнологии», Московская область. - 2010 - С. 16-17.

2. Малышев A.B.. Захаров A.M., Дубинин В.А., Саркисова К.Ю. Блокатор D2-peuemopoB дофамина как агент, формирующий депрессивноподобное состояние у экспериментальных животных. // Тезисы XIV школы-конференции молодых учёных по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, Москва. - 2010 - С. 34.

3. Малышев A.B.. Разумкина Е.В., Дубынин В.А. Использование солей вальпроевой кислоты для моделирования минимальной мозговой дисфункции потомства. // Тезисы XV школы-конференции молодых учёных по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, Москва. -

2011 -С. 18-19.

4. Малышев A.B.. Захаров A.M., Дубынин В.А. Пренатальное введение высокой дозы вальпроевой кислоты как новая модель дисфункции нервной системы потомства. // Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Бион нейротехнологии 2011. На пути к нейроморфному интеллекту: эксперименты, модели и технологии», Нижний Новгород. - 2011 -С. 16-17.

5. Malvshev A.V. New pharmacological method of modeling the depressive-like state in experimental animals // Abstract of 7th Leiden International Medical Student Conference (LIMSC), Netherlands. - 2011 - P. 160.

6. Разумкина E. В., Малышев А. В. Использование препарата «семакс» для коррекции мозговой дисфункции, вызванной пренатальным введением высоких доз вальпроевой кислоты // Тезисы конференции "Физиология висцеральных систем в норме и патологии", Киев. - 2012 - С. 67.

7. Малышев A.B.. Разумкина Е.В., Дубынин В.А. Поведенческие нарушения у крыс, подвергнутых пренатальному воздействию вальпроевой кислоты: экспериментальная модель аутизма. // Тезисы III международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине", Санкт-Петербург. -

2012 - Т. 1.-С.81.

8. Разумкина Е.В., Малышев A.B.. Дубынин В.А. Нарушения болевой чувствительности у крыс, подвергнутых пренатальному воздействию высокой дозы вальпроевой кислоты // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2012», Москва. - 2012 -С. 325.

9. Malvshev A.V.. Razumkina E.V., Dubynin V.A. Prenatal exposure to valproic acid as a model for neurologic and behavior dysfunctions in rats. // Abstract of ECNP Workshop on Neuropsychopharmacology for Young Scientists in Europe, France.-2012-P. 113.

10. Дубынин B.A., Малышев A.B.. Разумкина Е.В., Рогозинская Э.Я. Корректирующее влияние гептапептида семакс на параметры социального взаимодействия у крыс, подвергнутых пренатальному воздействию высокой дозы вальпроевой кислоты. // Тезисы VI российского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа. - 2013 - С. 440.

11. Малышев А.В.. Разумкина Е.В., Рогозинская Э.Я., Дубынин В.А. Особенности поведения крыс линии WAG/Rij на протяжении первых двух месяцев жизни. // Тезисы XXII Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Волгоград. - 2013 - С. 46.

12. Рогозинская Э.Я., Разумкина Е.В., Малышев А.В. Исследование детско-материнского взаимодействия крыс линии WAG/Rij. // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013», Москва. - 2013 - С. 344.

13. Разумкина Е.В., Рогозинская Э.Я., Малышев А.В. Исследование поведенческих особенностей крыс линии WAG/Rij на протяжении первого месяца постнатального развития. // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013», Москва. - 2013 -С. 345.

14. Tanaeva К.К., Malvshev A.V.. Dubynin V.A. Prenatal exposure to valproic acid weakens the maternal behavior in rats. // Abstract of IUPS Conference, UK. -2013-P. 189.

15. Rogozinskaya E.Ya., Malvshev A.V.. Razumkina E.V., Dubynin V.A., Sarkisova K. Yu. Research of WAG/Rij rat offspring behavior during first month of life. // Abstract of American Epilepsy Society Annual Meeting. - 2013 - P. 323.

16. Рогозинская Э.Я., Гедзун B.P., Малышев А.В. Исследование «детского» поведения крыс с фетальным вальпроатным синдромом. // Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014», Москва. - 2014 - С. 356.

17. Рогозинская Э.Я., Гедзун В.Р., Малышев А.В.. Голубович В.П., Дубынин В.А. Фетапьный вальпроатный синдром и его корректировка с помощью оригинального аналога фрагмента аргинин-вазопрессина. // Тезисы всероссийской конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Санкт-Петербург. - 2014 - С. 234-235.

Заказ № 66-Р/09/2014 Подписано в печать 15.09.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5 — тел. (495)649-83-30

! www. cfr. ru; e-mail: zakpark@cfr. ru