Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота"

□□3484493

на правах рукописи

ФОМИЧЕВ Кирилл Александрович

сравнительный анализ регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота

Специальность 03.00.15 - генетика

2 6 НОЯ 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003484493

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации генома Государственного научного учреждения Всероссийский научно исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук А. А. Сазанов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.П.Терлецкий (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН) кандидат биологических наук Е.Г.Неронова (Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России)

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины (СПбГАВМ)

Защита состоится «41.» г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 006.012.01 по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии по адресу: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс: (812) 465 99 89 е.таП: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан 009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор (3,

Г.Н.Сердюк

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что крупный рогатый скот является ведущим видом-продуцентом молока, молекулярные механизмы регуляции экспрессии казеиновых генов крупного рогатого скота остаются малоизученными. Только 5'-фланкирующий район гена р-казеина исследован достаточно детально (Schmidhausen et al.,1990; Schmidhausen et al., 1992; Myers et al., 1998). Некоторые фланкирующие районы генов aSl- (Platenberg et al., 1996), aS2- (Groenen, 1992) и к-казеина (Adachi et al., 1996) клонированы и секвенированы, но их вклад в изменение уровня экспрессии казеиновых генов в настоящее время не оценен.

Принимая во внимание высокий уровень эволюционного консерватизма геномов крупного рогатого скота, человека и домовой мыши (http://wvAV.ncbi.nlm.nih.gov), данные полного секвенирования геномов двух последних видов могут быть использованы для выявления участков эволюционного консерватизма в пределах 5'-фланкирующих областей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.

Регуляция экспрессии большинства генов осуществляется преимущественно на уровне транскрипции. Регуляция имеет комплексный характер, в ней принимает участие целый ряд регуляторных последовательностей - промоторы, энхансеры, MAR/SAR (matrix/scaffold attaching regions), инсуляторы, LCR (locus control regions). Наибольший интерес вызывают последние, способные поддерживать высокий уровень экспрессии трансгена независимо от точки интеграции (Li, 2002; Mullins Mullins, 2004). Гены белков молока в силу своих биологических особенностей представляют собой удачную модель для изучения тканеспецифической и стадиеспецифической экспрессии. Эпителиальные клетки молочной железы специализированы для синтеза ограниченного числа белков в периоды беременности и лактации. Уровень транскрипции этих белков очень высок, например, матричная РНК генов казеинов

составляет до 80 % общего содержания мРНК в клетке (Hobbs at al., 1982). Варьирование уровня экспрессии от 0 до 80 % свидетельствует о значительном влиянии регуляторных элементов на экспрессию генов казеинов. По этой причине регуляторные элементы кластера казеиновых генов могут найти свое применение для создания векторов, обеспечивающих эффективный синтез белковых продуктов биофармацевтического назначения. Кроме того, данные о регуляторных районах могут быть использованы в практическом животноводстве для селекции с помощью молекулярных маркеров (marker assisted selection, MAS) (Tankey, 1993; Georges et al., 1995; Phillips, 1999).

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является выявление новых регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов.

Поставлены следующие задачи:

-— выявление районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих на глубину до 15 т.п.н. от стартового кодона гена CSN1S1

— клонирование кластера казеиновых генов крупного рогатого скота в форме контига протяженных геномных клонов

— выявление полиморфных вариантов эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота методом SSCP

— выявление SNP путем прямого секвенирования эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота

— анализ сайтов связывания транскрипционных факторов включающих выявленные SNP

— сравнение частот аллелей SNP эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений

Научная новизна работы. Путем анализа нуклеотидных последовательностей ¡п бШсо выявлено 10 районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих. Клонирован кластер казеиновых генов крупного рогатого скота в форме контига шести протяженных геномных клонов. Методом 8БСР выявлено семь полиморфных вариантов эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота. Выявлено пять новых БЫР в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота путем прямого секвенирования. Четыре сайта связывания транскрипционных факторов, включающих выявленные БМ*, обнаружены в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов. По частотам аллелей двух БЫР у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений обнаружены достоверные различия, что свидетельствует о возможной связи этих маркеров с признаками молочной продуктивности.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом крупного рогатого скота и сравнительным картам человека, мыши и 1фупного рогатого скота (www.thearkdb.org) и банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания Ленинградского государственного университета в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной конференции «Современные методы в генетике и селекции животных» (Санкт-Петербург, 2007), XVI международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2008), конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их

реализация в АПК России" (Санкт-Петербург, 2008), на второй международной научно-практической конференции "Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность" (Санкт-Петербург, 2008), на XIII царскосельских чтениях «Высшая школа — инновационному развитию России» (Санкт-Петербург, 2009). Результаты периодически докладывались на семинарах лаборатории молекулярной организации генома ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции

сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).

Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации были опубликованы в научных журналах "Цитология" и "Сельскохозяйственная биология". Всего по теме работы опубликовано 9 печатных работ, из них 2 статьи и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц, 4 рисунка и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литературы насчитывает 134 названия, 122 работы - на английском языке, 10 - на русском, 1 - на французском, 1 - на немецком.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Эволюционный консерватизм районов в 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих.

2. Результаты клонирования кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.

3. Полиморфизм конформации однонитевой ДНК районов эволюционного консерватизма кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.

4. Полиморфизм новых мононуклеотидных сайтов в эволюционно-консервативных районах кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.

5. Связывание транскрипционных факторов в сайтах, включающих выявленные мононуклеотидные полиморфные сайты.

6. Различия частот аллелей мононуклеотидных полиморфных сайтов у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материал и методы

Материал. В работе использован сегмент 1 библиотеки протяженных геномных клонов крупного рогатого скота СНОМ-240 (bacpac.chori.org/bovine240.htm). В качестве зондов для скрининга геномной библиотеки крупного рогатого скота были использованы фрагменты последовательностей ДНК, содержащих 5'-фланкирующий район и экзон 1 гена CSN1SJ крупного рогатого скота (идентификационный номер Х03590), экзон 4 и интрон 4 гена С3№ крупного рогатого скота (идентификационный номер А1841946).

Последовательности праймеров: СБШБ1 (, 5'-ОААОААОСАССААССТСО-3' СБИ1 в 1г, 5'-ТССАТСТТСТСАТААТААСС-З' СБЮ^ 5'-ОАААТСССТАССАТСААТАСС-3' СБЮг, 5'-ССАТСТАСССТАСПТАОАТО-3'. В работе были использованы 32 образца ДНК коров пород: шароле, лимузин, джерси, симментальской, голштино-фризской любезно предоставленные профессором Станиславом Каминским (университет Вармии и Мазурии в Ольштине, Польша). Для генотипирования использованы биологические

образцы крови от 50-ти особей крупного рогатого скота молочного направления голштинизированной черно-пестрой породы (университет Вармии и Мазурии в Ольштине, Польша) и 50-ти особей крупного рогатого скота мясного направления абердино-ангусской породы (ЗАО «Спутник», Ленинградская область).

Методы. Олигонуклеотидное мечение ДНК-зондов для скринирования геномных библиотек проводили при помощи набора «Рандом-прайм» («Ферментас», Вильнюс, Литва). Предгибридизацию реплик гридированных библиотек проводили инкубированием при 65° С в растворе Church Buffer в течение 1 часа. Затем в раствор добавляли по 25 мкл меченого ДНК-зонда на библиотеку и инкубировали при той же температуре в течение 16 часов. Отмывки проводили по следующей схеме;

• 2 х SSC, 0.1 % SDS при температуре 65° С в течение 7 минут

• 2 х SSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут

• 0,5 х SSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут

• 0,1 % SSC, 0.1 % SDS при комнатной температуре в течение 7 минут Затем фильтры заворачивали в полиэтиленовую пленку Sarah Wrap и помещали в кассеты. Анализ результатов гибридизации проводили методом авторадиографии на рентгеновской пленке Kodak или прямым сканированием на приборе FX-Scan. Полученные изображения обрабатывали при помощи пакета компьютерных программ Quantity-One. Проверку клонов на предмет содержания нуклеотидных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота проводили при помощи ПЦР с использованием в качестве матрицы последовательности геномных клонов. Трансформацию клеток Е. coli и выделение плазмидной ДНК проводили согласно общепринятым методикам. Выявление полиморфных продуктов ПЦР проводили методом SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism -полиморфизм конформации однонитевой ДНК) в 10% полиакриламидном геле (ETC Elektrophotese-Technik, Kirchentellinsfurt, Германия). Секвенирование фрагментов ДНК проводили в соответствии с

рекомендациями производителя (Applied Biosystems, США). Сайты связывания транскрипционных факторов выявляли при помощи программы TESS (http://www.cbil.upenn.edu) с условием полной комплиментарности исследуемой и представленной в базе TES S последовательностей. Учитывались сайты связывания, исчезающие в полиморфных вариантах.

2.2. Результаты

В ходе выполнения работы нами получены данные по организации кластера казеиновых генов крупного рогатого скота и новым регуляторным последовательностям. Построен контиг кластера казеиновых генов крупного рогатого скота в форме перекрывающихся ВАС-клонов (Рисунок 1). Методом ПЦР с использованием праймеров, специфических для генов, входящих в состав кластера, нами установлено, что клоны CH240-130F23 и СН240-035012 содержат гены CSN1S1, CSN1S2, CSN2, STATH и CSN3, и еще четыре ВАС-клона содержат гены CSN2, STATH, CSN1S2 и CSN3. Таким образом, все известные гены кластера представлены в контиге из семи полученных геномных клонов.

Методом сравнения нуклеотидных последовательностей выявлено 10 консервативных элементов фланкирующей области кластера казеиновых генов человека и крупного рогатого скота, которые имеют высокую степень гомологии в геномах свиньи, собаки, кошки, верблюда, шимпанзе и макаки-резус.

СЖМ ;

18,748 т.п.н,

СЯК!

ЯТЛТН

35,505 т.п.н.

СЭЫЗ

12 3 4 5 6

Рисунок 1. Контиг ВАС-клонов из библиотеки СН(Ж1-240, включающий гены СЖ2, БТАТН, СЗЫ1Б2 и СБМЗ. Цифрами обозначены геномные

ВАС-клоны: 1 - СН240-035012,2 - СН240-130Р23, 3 - СН240-115019,4 -СН240-200Ш1, 5 - СН240-274Р22, 6 — СН240-250М04.

Проведен дизайн олигонуклеотидов-праймеров для 9-ти эволюдионно консервативных элементов кластера казеиновых генов и оптимизированы условия ПЦР-амгогафикации этих последовательностей. На предмет конформационного полиморфизма (БЗСР) в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов нами было проанализировано двадцать восемь особей крупного рогатого скота. Полиморфные варианты последовательностей ДНК были выявлены с использованием 7 пар праймеров (Таблица 1).

Таблица 1. Результаты исследования ДНК крупного рогатого скота на

предмет наличия конформационного полиморфизма (ББСР).

№ Животного ВТА1 ВТЛ2 ВТАЗ ВТА4 ВТА5 ВТА6 ВТА7 ВТА8 ВТА9

2 Ш П + + + + п + П +

144с? + + + + + п + + +

540с? + + + + + + + + +

549с? + + + + + + + + +

2Ш + + + + П + + + +

550с? + + + + + + + + +

545с? + + + + + + + + +

546<? + + + + + + + + +

277]* + + + + + + + + П

224й + + + + + + + + +

548с? + + + + + + + + +

+ + + + + + + + +

216с1 + + + + + + + + +

5483 + + + + + + + + +

270}п + + п + + + + + +

89ср + • + + + + + п + +

220с1 + + + + п + + + +

И7ср + + + + + + + + +

547 + + + + + + + + +

22 Ы + + + + + + + + +

177 + + + + + + + • + +

542с? + + + + + + + + +

425 + + п + + + + + +

гшв + + + + + + + + +

543 + + 4- + + + + п +

116 + + + + + + + + +

223а + + + + + + + +

464 + + + + + + + + +

«П» - полиморфный, «+» - дикий тип

Секвенирование эволюционно-консервативных районов позволило выявить пять мононуклеотидных полиморфных сайтов (БЫР) (Таблица 2). Компьютерный анализ баз данных позволил выявить 4 новых сайта связывания известных транскрипционных факторов, включающих сайты БИР, в эволюционно консервативных районах кластера (Таблица 3).

Таблица 2. БОТ в консервативных последовательностях в 15 т.п.н. апстрим

от СБШБ! у крупного рогатого скота.

№ вИРэ в консервативных последовательностях у крупного рогатого скота Расстояние от С8Ш81 крупного рогатого скота (п.н.)

1 АаААТП'СТТССаАСАСаААСТаААСАОААСАТТСАТТТССТАТаТа АСАОААТТСТГАОААТТТАААТАААССТОТТООТТАААСТОАААССА СААААТТАОСАТПТ 1486

2 ТГАСАТГССАААТСССАТАТООАТТТСТАОАОАААААСАОАААТАТС ТГТСАСАТТТСТСАСТААСТТТССТТСТССААООТТОАСТСТТТОТТАТ АТААТТААОСААСАСТТТССТАОААСАСТААТСА 5862

3 ТТТТААААООТОАААТАААТААТОААТТСГГСТСАТОСТСТТаТАТСТ ТААТАААААТТСАААААТПТСААОАССССАТПТОТСССААСААТТ ТССТТТАСАСОТАТТОААТТТТТСААА 5929

4 ТТТСССАТАТТГ|ААГГГГТТСТГГАОАТАТТАТСТТССТТАСТ(Л/С)ТСТ СТТТСАСАТСААТТТСААСААОАТАСТААТСГПТСТАТТСАСТАТАА ТТТАТТСААССАОСТСАС 2660

5 ТСТТАТТСАГПТТААААЛТТСТОТАСАТАПТАСТСАСТАААСССАА АА(С/Т>ТАСААСТСТТСТАСААТААОТАААОСТТСТСАСТСАААССТТ ТТОССТСАТТТТАТААОТТААА Больше 15 т.п.н.

6 АТТСТТАААОАСАААСТТТАСААТААТТСТССАСААОТСТОСАСАСТ ТТСАСАСАТС 9645

7 АС1ААА0АС(Мг)ТАСААТ0ТАОТССТТССААСАСААТССТТСАА(30 ТСАААТТаТААСТТТААТТТСТСС 6224

£ АСГААААСАСТССТТАТТАААСГТТААГСТСТТТАГОААТСССТААО АТАТСАТСТТАААААТСАОАТТСАСЛТСТАСТАОАТСТСАСаТАТАТ ССТСТСТПСТССЛТТПТААСАААТТСТСААаТСАТАТСАСТССТОО СААТСТАТСТаАСАСАСТТТСА(С/С)ТАССТАССААСТСАСАСАТТТ ОААТАТСТААОСТОТАСТССТСТСТТТТАААСТ 6767

9 ТТССТСААСААТТАТАОТАССТОТСААТАТАТААААТТТА(Т/С)ТААТ АТАТАОСТГГСТТСССССААСАОААТТАТГТТАОТТТТАТТТТСАТСС ТТСТАСАТАСТТОССАТТААСАСТТ 1955

10 ТТТТСАСТСТСТСТОСАААААТТТАТТСАСАГГОССАОТААСТССТТТ САТСТССТТТАСТТССААСАААО 10273

Проведено генотипирование 50 особей крупного рогатого скота молочного направления (голштинизированный скот черно-пестрой породы) и 50 особей мясного направления абердино-ангусской породы при помощи аллелеспецифических праймеров (температура отжига 60°С) (Табл. 4)

Была установлена встречаемость аллелей 8№ в эволюционно консервативных районах регуляторной области кластера казеиновых генов у абердино-ангусской и голштинизированной черно-пестрой пород (Таблица5).

Таблица 3. Сайты связывания транскрипционных факторов в

консервативных последовательностях в 15 п.н. апстрим от CSN1S1 у КРС

№ SNPs в консервативных последовательностях у КРС сайты связывания транскрипционных факторов (указаны те сайты, которые исчезают в полиморфных вариантах) Расстоян иеот CSN1SI КРС (п.н.)

BTACSN _СЕ_4 TTTCCCATATTGAAGTTTTCTTTAGATATTAT CTTCCTTACT(A/G)TCTGTTTCACATCAATTT CAACAAGATACTAATGTTTTCTATTCACTAT AATTTATTCAAGGAGCTGAG 1.NF-E, 41-45, CTGTC (только G-вариант) HSA 2660

BTA_CSN _СЕ_5 TCTTATTGATTTTTAAAAATTGTGTACATATT TAGTCACTAAACCCAAAA(Ç/T)TACAACTCT TCTACAATAAGTAAAGCTTGTGACTCAAACC TnTGCCTCATTTTATAAGTTAAA - Больше 15 т.п.н.

BTACSN _СЕ_7 AGTAAAGAG(A/G)TAGAATGTAGTGGTTGCA AGACAATGCTTCAAGGTCAAATTGTAAGTTT AATTTCTGG 1. GATA, 8-13, WGATAR (только А-вариант) HSA, MMU 2. NIT2, 7-13, GAGATA, (только А-вариант),fungi 6224

BTA_CSN _СЕ_8 ACTAAAACAGTGCTTATTAAACTTTAATGTG TTTATGAATCGCTAAGATATCATGTTAAAAA TCAGATTCAGATCTAGTAGATCTGAGGTATA TCCTCTGTTTCTGCATTTTTAACAAATTCTCA AGTGATATCACTGCTGGGAATCTATGTGACA CACTTTGACG/CITAGCTAGGAACTGAGAGAT TTGAATATGTAAGGTGTAGTCCTCTCTTTTA AACT 1.АР-1, 162-165, TGAC (только С-вариант) HSA, MMU все млекопитающие (регулируется глюколкортикоидами) 2. GCN4, 162-167, TGACTA (только С-вариант) дрожжи 6767

BTA_CSN _СЕ_9 TTCCTCAACAATTATAGTACCTGTCAATATA TAAAATTTA(T/Ç)TAATATATaGGTTTGTTCC CCCAACAGAATTATTTTAGTTTTATTTTGAT GCTTCTACATACTTGCCATTAACACTT 1. unc-86,38-46, ТТАТТААТ (только Т-вариант) С. elegans 2. POU3F2, 37-43, ATTWATK (только Т-вариаит) фактор HSA, MMU, RRA 1955

Таблица. 4. Аллелеспецифические праймеры для генотипирования.

№ п/п Праймер Последовательность праймера длина фрагмента

1 ВТА_С81Ч_СЕ4_ирА ТТТТСТТТАОАТАТТАТСТТССТТАСТА 664 п.н.

ВТА_С8Ы_СЕ4_ирО ТТТТСТТТАСАТА'ГТАТСТТССТТАСТО

ВТА_С5Ы_СЕ4_Оп ОАСООООАОААООТООААаТАО

2 ВТА_СБМ_СЕ7_ирА ОТОАаСАТТОТТТААОТАААОАОА 641 п.н.

ВТА_СЗМ_СЕ7_ирС ОТОАОСАТТСПТААОТАААОАСО

ВТА_С8М_СЕ7_Оп: ТТССАОСТГОТОСТТСТТСС

3 ВТА_С5Н_СЕ8_ирО ОААТСТАТСТСАСАСАСТТТОАО 576 п.н.

ВТА_С8М_СЕВ_ИрС СААТСТАТаТОАСАСАСТТТСАС

ВТА_С5Ы_СЕ8_Оп ТСТТАААСАТаОАСААССААТСА

4 ВТА_С8Ы_СЕ9_ир САОАОТСССАСАССАСТОААО 453 п.н.

ВТА_С8>1_СЕ9_ОпА АТАОТАССТСТСААТАТАТААААТТТАТ

ВТА_С8^СЕ9_ОпС АТАОТАССТОТСААТАТАТААААТТТАС

Таблица 5. Встречаемость аллелей БЫР в эволюциоино консервативных районах регуляторной области кластера казеиновых генов у абердино-ангусской и голштинизированной черно-пестрой пород.

ВТА СвИ СЕ4 ВТА СвЫ СЕ7* ВТА СЭЫ СЕ8 ВТА СвЫ СЕ9

Аллели Абердино-ангусская Черно-пестрая Абердино-ангусская Черно-пестрая Абердино-ангусская Черно-пестрая Абердино-ангусская 1 Черно-пестрая

А 58 36 43 61 - - 36 31

в 42 64 55 37 64 68 64 69

С - - - - 36 32 - -

* В случае с участком ВТА_СБМ_СЕ7 бшо использовано по 49 животных каждой породы.

Статистическую обработку результатов проводили путем сравнения частот аллелей четырех 8МР в группах мясного и молочного направлений при помощи критерия %2 (Таблица 6).

Таблица 6. Результаты сравнения частот аллелей.

Участок Значение х* Уровень значимости

ВТА_С81Ч_СЕ_4 20,9 р< 0,001

ВТА_С81Ч_СЕ_7 14,1 р< 0,001

ВТА_С8Н_СЕ_8 0,7 р > 0,05

ВТА_С8Ы_СЕ_9 1,2 р > 0,05

2.3. Обсуждение

Нами показано, что геномные клоны CH240-130F23 и СН240-035012 содержат гены CSN1S1, CSN1S2, CSN2, STATH и CSN3. По данным Rijnkels et al. расстояние между генами CSN1S1 и CSN3 у крупного рогатого скота -примерно 250 т.п.н. Размер вставки ВАС-клонов в геномной библиотеке крупного рогатого скота CHORI-240 Сегмент I составляет в среднем 180 т.п.н. и варьирует от 100 т.п.н. до 270 т.п.н. (http://bacpac.chori.org/bovme240.htm). Проведенная нами рестрикция ДНК клонов CH240-130F23 и СН240-035012 позволила установить размеры вставки - 263 т.п.н. и 265 т.п.н., соответственно. Таким образом, клоны CH240-130F23 и СН240-035012 включают все кодирующие последовательности кластера, и около 15 т.п.н. 5'-фланкирующей области. Вероятно, предполагаемый локус-контролирующий район (LCR) кластера может быть обнаружен в пределах клона CH240-130F23, поскольку такого рода последовательности обычно расположены в 5'-фланкирующих районах на расстоянии до 35 т.п.н. от стартового кодона дистального гена [8]. Последовательности пяти ВАС-клонов содержат гены CSN2, STATH, CSN1S2 и CSN3. Следовательно, полученный контиг содержит не только все известные гены казеинового кластера крупного рогатого скота, но и значительную часть 3'-фланкирующей области. По данным геномной базы данных крупного рогатого скота

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/index.html) гены STATH и CSN1S2 расположены в пределах контига NW_936323 в положениях 8211.090 п.н. и 26.595-38.541 п.н. соответственно, в то время как гены CSN2 и CSN1S1 находятся в положениях 418.544-426.774 п.н. и 445.522-463.059 п.н. контига NW_973412. Информация о локализации гена CSN3 отсутствует (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/index.html). Таким образом, расстояние между генами STATH и CSN1S2 составляет 25.505 п.н., а между генами CSN2 и CSN1S1 - 18.748 п.н. На основании известного размера

вставки в клонах библиотеки СНОШ-240 и приблизительной оценки расстояния между генами СБЫ181 и CSNЗ в 200 т.п.н., можно заключить, что представленный в работе контиг содержит до 70 т.п.н. 3'-фланкирующей области. Максимальное покрытие контига (х 7) наблюдается в центральной и З'-дистальной части кластера (Рисунок 1).

Проведены эксперименты по выявлению полиморфных вариантов регуляторных районов кластера казеиновых генов методом ресеквенирования. Выявлено 4 сайта однонуклеотидного полиморфизма (БЫР), причем все они выявлены, внутри сайтов связывания транскрипционных факторов. Генотипирование 50 особей крупного рогатого скота молочного направления (голштинизированный скот черно-пестрой породы) и 50 особей мясного направления абердино-ангусской породы при помощи сайт-специфических праймеров позволило провести сравнение частот аллелей четырех БЫР в группах мясного и молочного направлений. Достоверные различия выявлены по сайтам БИР ВТА_С8М_СЕ_4 и ВТА_С8Ы_СЕ_7, что дает основания предположить их возможную связь с признаками молочной продуктивности.

На основе полученных данных предполагается создать систему мононуклеотидных полиморфных маркеров (8ИР) для селекции крупного рогатого скота по молочной продуктивности. Система маркеров будет представлять собой набор олигонуклеотидов-праймеров для выявления полиморфных вариантов регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов, оказывающих существенное благотворное влияние на признаки молочной продуктивности. По сравнению с традиционными системами селекции крупного рогатого скота ожидается многократное преимущество в скорости селекционного процесса.

Выводы

1. Выявлено 10 районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих.

2. Кластер казеиновых генов крупного рогатого скота клонирован в форме контига шести взаимно перекрывающихся ВАС-клонов.

3. В пределах семи районов эволюционного консерватизма кластера казеиновых генов крупного рогатого скота были обнаружены случаи полиморфизма конформации однонитевой ДНК.

4. Выявлено пять новых БЫР в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота.

5. Четыре сайта связывания транскрипционных факторов, включающих выявленные БОТ, обнаружены в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов.

6. Обнаружены достоверные различия по частотам аллелей двух БОТ у крупного рогатого скота мясного и молочного направлений.

Практические предложения

Результаты представленной к защите работы рекомендуется использовать при создании систем молекулярных маркеров для маркерной селекции крупного рогатого скота по признакам качества молока. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе в высших учебных заведениях биологического, сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

Список публикаций по теме диссертации

1. Фомичев, К.А. Построение контига геномных клонов кластера казеиновых генов крупного рогатого скота/ К.А. Фомичев, Т. Малевски, С. Камински, А.Л. Сазанова, A.A. Сазанов// Сельскохозяйственная биология -2008 -№ 2 -С. 26-30.

2. Фомичев, К.А. Построение контига геномных клонов кластера казеиновых генов Bos taurus/ К.А. Фомичев, Т. Малевски, А.Л. Сазанова, A.A. Сазанов// Цитология - 2007 - Т. 49 - № 9 - С. 802-803.

3. Сазанов, А А. Создание систем полиморфных маркеров доя селекции животных методом позиционного клонирования/ A.A. Сазанов, А.Л. Сазанова, К.А. Фомичев, В.А. Химанина, В.А. Стекольникова, Т. Малевски// Материалы международной конференции «Современные методы в генетике и селекции животных» ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии - 2007 - С. 278280.

4. Сазанов, A.A. Поиск регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота и возможность применения их в селекции/ A.A. Сазанов, А.Л. Сазанова, К.А. Фомичев, В.А. Химанина, В.А. Стекольникова, Т. Малевски, С. Камински // Материалы международной конференции «Современные методы в генетике и селекции животных» ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии - 2007 - С. 287-291.

5. Sazanova, A.L Cytogenetic localization of avian Z- and W-linked genes using laige-insert ВАС clones/ A.L. Sazanova, M.N. Romanov, I.Y. Blagoveshenski, K.A. Fomichev, V.A. Stekol'nikova, M. Nefedov, PJ. de Jong, W.S. Моей, O.A. Ryder, J.B. Dodgson, A.A. Sazanov // Plant, Animal and Microbe Genome XVI. San Diego. CA. -2008 - P. 257.

6. Благовещенский, И.Ю. Цитогенетическая локализация генов на Z- и W-хромосомах птиц при помощи протяженных геномных клонов/ И.Ю. Благовещенский, А.Л. Сазанова, М.Н. Романов, К.А. Фомичев, В.А. Стекольникова, A.A. Сазанов // Материалы второй международной научно-

практической конференции "Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность" - Санкт-Петербург - 2008 - С. 61-62.

7. Фомичев, К.А. Построение контига геномных клонов кластера казеиновых генов Bos Taurus/ К.А. Фомичев, Т. Малевски, A.JI. Сазанова, A.A. Сазанов // Материалы второй международной научно-практической конференции "Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность" - Санкт-Петербург - 2008 - С. 144-145.

8. Сазанов, A.A. Разработка системы однонуклеотидных полиморфных маркеров (SNP) для селекции кур по аллелям генов, влияющих на признаки качества скорлупы яйца/ A.A. Сазанов, A.JI. Сазанова, В.А. Стекольникова, К.А. Фомичев, Ю.А. Химанина// Материалы конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России" - Санкт-Петербург 2008 - С. 65-66.

9. Благовещенский, И.Ю. Современный взгляд на эпигенетику/ И.Ю. Благовещенский, К.А. Фомичев, A.A. Сазанов// XIII Царскосельские чтения «Высшая школа — инновационному развитию России» ЛГУ им. A.C. Пушкина - СПб. - 2009 - Т. 3 - С. 66-69.

10. Благовещенский, И.Ю. Изучение накопления абдоминального жира у домашней курицы/ И.Ю. Благовещенский, О.Ю. Баркова, A.JI. Сазанова, К.А. Фомичев, A.C. Миттоков, A.A. Сазанов// Материалы научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». ЯрНИИЖК - Ярославль - 2009 - С. 5457.

Подписано в печать 1£>, {О. -2009 г. Формат 60X84 1/16 Бумага офсетная. Объем 1 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ №3/5

Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фомичев, Кирилл Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гены протеинов молока млекопитающих.

1.2. Регуляция экспрессии генов протеинов молока.

1.3. Эволюционный консерватизм геномов животных.

1.4. Библиотеки протяженных геномных клонов.

1.5. Позиционное клонирование локусов количественных признаков (QTL).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1 Материал.

2.2. Скринировдяие геномных вделиотек.

2.2.1. Олигонуклеотидное меченые ДНК-зондов.

2.2.2. Гибридизация меченых ДНК- зондов с геномными клонами.

2.2.3. Верификация аутентичности ВАС-клонов.

2.3. Трансформация клеток Е. сои и выделение плазмидной ДНК.

2.3.1. Трансформация клеток К Coli.

2.3.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.3.3. Очистка плазмидной ДНК.

2.4. Анализ последовательностей ДНК регуляторной и кодирующей областей кнастера генов казеинов крупного рогатого скота.

2.4.1. Анализ in silico последовательностей ДНК и дизайн олигонуклеотидов-праймеров для амплификации регуляторной и кодирующей областей кластера генов казенное крупного рогатого скота

2.4.2. Выявление сайтов связывания транскрипционных факторов.

2.4.3. Амплификация ДНК при помощи ПЦР.

2.4.4. Анализ полиморфизма амплифицированных фрагментов.

2.4.5. Секвенирование фрагментов ДНК.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Использование методаполиморфизмаконформации одноцепочечной ДНК (SSCP).

4.2. Построение контига геномных клонов.

4.3. Выявление сайтов связывания транскрипционных факторов.

4.4. Полиморфизм генов молочной продуктивности.

4.5. Перспективы и практическое применение результатов исследования кластера казеиновых генов КРС.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов крупного рогатого скота"

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что КРС является ведущим видом-продуцентом молока, молекулярные механизмы регуляции экспрессии казеиновых генов Bos taunts остаются малоизученными. Только 5'-фланкирующий район гена р-казеина исследован достаточно детально (Schmidhauser et al.,1990; Schmidhauser et al., 1992; Myers et al., 1998). Некоторые фланкирующие районы генов aSl- (Platenburg et al., 1996), aS2-(Groenen, 1992) и к-казеина (Adachi et al., 1996) клонированы и секвенированы, но их вклад в изменение уровня экспрессии казеиновых генов в настоящее время не оценен.

Принимая во внимание высокий уровень эволюционного консерватизма геномов КРС, человека и домовой мыши (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), данные полного секвенирования геномов двух последних видов могут быть использованы для выявления участков эволюционного консерватизма в пределах 5'-фланкирующих областей кластера казеиновых генов КРС.

Регуляция экспрессии большинства генов осуществляется преимущественно на уровне транскрипции. Регуляция имеет комплексный характер, в ней принимает участие целый ряд регуляторных последовательностей - промоторы, энхансеры, MAR/SAR (matrix/scaffold attaching regions), инсуляторы, LCR (locus control regions). Наибольший интерес вызывают последние, способные поддерживать высокий уровень экспрессии трансгена независимо от точки интеграции (Li, 2002; Mullins, Mullins, 2004). Гены белков молока в силу своих биологических особенностей представляют собой удачную модель для изучения тканеспецифической и стадиеспецифической экспрессии. Эпителиальные клетки молочной железы специализированы для синтеза ограниченного числа белков в периоды беременности и лактации. Уровень транскрипции этих белков очень высок, например, матричная РНК генов казеинов составляет до 80 % общего содержания мРНК в клетке (Hobbs at al., 1982). Варьирование уровня экспрессии от 0 до 80 % свидетельствует о значительном влиянии регуляторных элементов на экспрессию генов казеинов. По этой причине регуляторные элементы кластера казеиновых генов могут найти свое применение для создания векторов, обеспечивающих эффективный синтез белковых продуктов биофармацевтического назначения. Кроме того, данные о регуляторных районах могут быть использованы в практическом животноводстве для селекции с помощью молекулярных маркеров (marker assisted selection, MAS) (Tankey, 1993; Georges et al., 1995; Phillips, 1999; Зиновьева, 2009).

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является выявление новых регуляторных последовательностей кластера казеиновых генов.

Поставлены следующие задачи:

•выявление районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих на глубину до 15 т.п.н. от стартового ко дона гена CSN1S1

•клонирование кластера казеиновых генов КРС в форме контига протяженных геномных клонов

•выявление полиморфных вариантов эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов КРС методом SSCP

•выявление SNP путем прямого секвенирования эволюционноконсервативных районов кластера казеиновых генов КРС

•анализ сайтов связывания транскрипционных факторов вблизи выявленных

SNP сравнение частот аллелей SNP эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов у КРС мясного и молочного направлений

Научная новизна работы. Путем анализа нуклеотидных последовательностей in silico выявлено 10 районов эволюционного консерватизма 5-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих. Клонирован кластер казеиновых генов КРС в форме контига шести протяженных геномных клонов. Методом SSCP выявлено семь полиморфных вариантов эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов КРС. Выявлено пять новых SNP в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов КРС путем прямого секвенирования. Четыре сайта связывания транскрипционных факторов обнаружены вблизи SNP в пределах эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов. По частотам аллелей двух SNP у КРС мясного и молочного направлений обнаружены достоверные различия, что свидетельствует о возможной связи этих маркеров с признаками молочной продуктивности.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по генетическим и физическим картам хромосом КРС и сравнительным картам человека, мыши и КРС (www.thearkdb.org) и банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания и географии Ленинградского государственного университета им. A.C. Пушкина в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной конференции «Современные методы в генетике и селекции животных» (Санкт-Петербург, 2007), XVI международной конференции по геномам животных, растений и микроорганизмов (Сан-Диего, США, 2008), конференции

Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России" (Санкт-Петербург, 2008), на второй международной научно-практической конференции "Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность" (Санкт-Петербург, 2008), на XIII царскосельских чтениях «Высшая школа — инновационному развитию России» (Санкт-Петербург, 2009). Результаты периодически докладывались на семинарах лаборатории молекулярной организации генома ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Фомичев, Кирилл Александрович

выводы

1. Выявлено 10 районов эволюционного консерватизма 5'-фланкирующей области кластера казеиновых генов млекопитающих.

2. Кластер казеиновых генов КРС клонирован в форме контига шести взаимно перекрывающихся ВАС-клонов.

О и л ✓Ч'Ж «ТТ лтт/чт » /Ч »л Г» » ж Г/ЧТТ * « Л1ГЛЛ1ЛТ»П'П ТО"» ГЛ Т»ТТЛ ЛГПЛ**» г» и п[/ид1-лал с>Ъ1У1п уагилгилз апилшцииппШ и лип^роахноша ги1а1> казеиновых генов крупного рогатого скота были обнаружены случаи полиморфизма конформации однонитевой ДНК.

Л ТЭ. — С "К ТО ~ ---, „„„„„„

Ч-. иишолши илю пиошл О-14 А О 11|Л/Д1>ЛаЛ. лоилплдиип районов кластера казеиновых генов КРС.

5. Вблизи 8М3 эволюционно-консервативных районов кластера казеиновых генов обнаружены четыре сайта связывания транскрипционных факторов.

6. Обнаружены достоверные различия по частотам аллелей двух БЫР у КРС мясного и молочного направлений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты представленной к защите работы рекомендуется использовать при создании систем молекулярных маркеров для маркерной селекции КРС по признакам качества молока. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе в высших учебных заведениях биологического, сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фомичев, Кирилл Александрович, Санкт-Петербург

1. 1 иридсцшШ) V/>jri« и^опчпол vipjfMjpa R/Jxxiv iviai\puiiviiiUAa л-nao^uha

2. Bos taurus/ Городецкий С.И., Кершулите Д. Р.// Биоорганическая химия -1983.-Т. 12 № 9 - С. 1693-1695.

3. Городецкий, С. И. Анализ нуклеотидной последовательности кДНКкаппа-казеина коровы/ С. И. Городецкий, А. С. Каледин// Генетика. -1987. Т. 23, N 4. - С. 596-604.

4. Калашникова, JI.A. Влияние генотипа k-казеина на молочнуюпродуктивность коров черно-пестрой породы/ JI.A. Калашникова, Е.А. Денисенко, А.Ш. Тинаев// Зоотехническая наука Беларуси: сб. науч. тр. к 55-летию Института Гродно - 2004 - Т. 39 - С. 50-56.

5. Прохоренко, П.Н. Прошлое, настоящее и будущее генетики и селекции вживотноводстве/ П.Н. Прохоренко // Зоотехния. 2008. - № 1. - С. 8 - 10.

6. Сулимова, Г.Е. Аллельный полиморфизм гена k-казеина у Российскихпород крупного рогатого скота и его информативность как генетического маркера/ Г.Е. Сулимова, Ахани Азари М., Ростамзадех Д.// Генетика -2007 № 1-С. 11-19.

7. Фомичев, К.А. Построение контига геномных клонов кластераказеиновых генов крупного рогатого скота/ К.А. Фомичев, Т. Малевски, С. Камински, А.Л. Сазанова, A.A. Сазанов// Сельскохозяйственная биология 2008 - № 2 - С. 26-30.

8. Эрнст, JI.K. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственныхживотных/ JI.K. Эрнст// Москва 1995 - 359 С.

9. Adachi, Т. Characterization of the bovine kappa-casein gene promoter/ T. Adachi, J.Y. Ahn, K. Yamamoto, N. Aoki, R. Nakamura, T. Matsuda// Biosci Biotechnol Biochem 1996 - V. 60(12) - P. 1937-40.

10. Aleandri, R. The effects of milk protein polimorphisms on milk components and cheese-producing ability/ R. Aleandri, L.G. Buttazzoni, J.C. Schneider// J. Dairy Sci. 1990 - V. 73 - P. 241-255.

11. Alexander, L.J. The sequence of porcine (3-casein cDNA /L.J. Alexander, C.W. Beattie //Animal Genet. 1992. - V. 23 - P. 369-371.

12. Alexander, L. J. /L.J. Alexander, A. F. Stewart, A. G. Mackinlay, Т. V. Kapelinskaya, Т. M. Tkach, S. I. Gorodetsky //Eur. J. Biochem. 1988. - V. 178-P. 395-401.

13. Altiok, S. P-casein mRNA sequesters a single-stranded nucleic acid-binding protein which negatively regulates the 3-casein gene promoter /S. Altiok, B. Groner /¡Mol Cell. Biol. 1994 - V. 14 (9) - P. 6004-6012.

14. Ashwell, M. S. Detection of putative loci affecting milk, health, and type traits in aUS Holstein population using 70 microsatellite markers in a genome scan /М. S. Ashwell, van Tassel C. P.// J. Dairy Sci. 1999 - V. 82 - P. 2497-2502.

15. Bodmer-Glavas, M. RNApolymerase П and Ш transcription factors can stimulate DNA replication by modifying origin chromatin structures /М. Bodmer-Glavas, K. Edler, A. Barberis //Nucleic Acids Res. 2001 - V. 29 - P. 4570-4580.

16. Bovenhuis, H. Mapping and analysis of dairy cattle quantitative trait loci by maximum likelihood methodology using milk protein genes as genetic markers /H. Bovenhuis, J. I. Weller// Genetics 1994 - V. 137 - P. 267-280.

17. Bovenhuis, H. Associations between milk protein polymorphisms and milk production traits/ H. Bovenhuis, J.A. Van Arendonk, S. Korver// J Dairy Sci. -1992-V. 75(9)-P. 2549-59.

18. Bowring, F. J. Recombinational lanscape across a 650-kb contig on the right arm of linkage group V in Neurospora crassal F. J. Bowring, Catcheside D. E. A. // Curr. Genetics 1999 - V. 36 - P. 270-274.

19. Dayhoff, M.O. Atlas of protein sequence and structure/ Dayhoff, M.O.// National Biomedical Research Foundation, MD. 1978 - 5 - Suppl. 3. In: Dayhoff, M.O. (Ed.).

20. Devinoy, E. Sequence of the rabbit whey acidic protein cDNA/ E. Devinoy, Ch. Hubert, E. Schaerer, L.-M. Houdebine, J.-P. Kraehenbuhl// Nucleic Acids Res. 1988-V. 16(16)-P. 8180-8181.

21. DeWan, A. T. The map problem: A comparison of genetic and sequence-based physical maps/ A. T. DeWan, A. R. Parrado, T. C. Matise, S. M. Leal// Am. J. Hum. Genet. 2002 - V. 70 - P. 101-107:

22. Doppler, W. CCAAT/enhancer-binding protein isoforms fi and <5 are expressedin mammary epithelial cells and bind to multiple sites in the p-casein gene89promoter/ W. Doppler, T. Welte, S. Philipp// J. Biol. Chem. 1995 - V. 270 (30) - 17962-17969.

23. Ehrmann, S. Quantification of single gene effects on milk proteins in selected groups of dairy cows/ S. Ehrmann, H. Bartenschlager, H. Geldermann// J. Anim. Breed. Genet. 1997 - V. 114 - P. 121-132.

24. Erhardt, G. Allele frequencies of milk proteins in German Cattle breeds and demonstration of as2-casein variants by isoelectric focusing/ Erhardt, G.// Arch. Tierz. Dummerstorf- 1993 V. 36 - P. 145-152.

25. Erhardt, G. A new alpha SI-casein allele in bovine milk and its occurrence in different breeds/ G. Erhardt// Anim Genet 1993 - P. 24(1) - V. 65-6.

26. Ferretti, L. Long range restriction analysis of the bovine casein genes/ L.Ferretti, P.Leone, V.Sgaramella// Nucleic Acids Res. 1990 - V. 11;18(23) -P. 6829-33.

27. Fitch, W.M. Distinguishing homologous from analogous proteins/ W.M. Fitch// Syst. Zool. 1970 - V. 19. - P. 99-113.

28. Folch, J.M. Complete sequence of the caprine ß-lactoglobulin gene/ J.M. Folch, A. Coll, A. Sanches// J. Dairy Sei. 1994 - V. 77 - P. 3493-3497.

29. Freyer, G. Casein polymorphism and relation between milk production traits/ G. Freyer, Z. Liu, G. Erhardt, L. Panicke// J. Anim. Breed. Genet. 1999 - V. 116-P. 87-97.

30. Freyer, G. Multiple QTL on chromosome six in dairy cattle affecting yield and content traits/ G. Freyer, C. Kuhn, R. Weikard, Q. Zhang, M. Mayer et al.// J. Anim. Breed. Genet. 2002 - V. 119 - P. 69-82.

31. Geldermann, H. DNAvariants within the 5' flanking region of bovine milk protein encoding genes/ H. Geldermann, J. Gogol, M. Kock, G. Tacea// J. Anim. Breed. Genet. 1996 - V. 113 - P. 261-267

32. Ghost, D. A relational database of transcriptional factors/ D. Ghost// Nucleic Acids Res. 1990 - V. 18 - P. 1749-1756

33. Gogarten J.P. Orthologs, paralogs and genome comparisons/ Gogaiten J.P., Olendzenski L.// Curr. Opin. Genet 1999 - V. 9 - P. 630-636.

34. Groenen, M.A.M. Regulation of expression of milk protein genes/ M.A.M. Groenen// 43rd Annual Meeting of the EAAP 1992 - 14-17, September, pp. 1-18.

35. Groenen, M.A.M. Multiple octamer binding sites in the promoter redion of the bovine aS2-casein gene/ M.A.M. Groenen, R.J.M. Dijnhof, R. van der Poel Diggelen, E. Verstege// Nucleic Acids Res. 1992 -20 (16) - P. 4311-4318.

36. Grosclaude, F. J. De'terminisme ge'ne'tique des case'ines k du lait de vache; e'troite liaison du locus k-Cn avec les loci as-Cn et ß-CnJ F. J. Grosclaude, J. Pujolle, Gamier, B. Ribadeau-Dumas// C. R. Acad. Sei. (Paris) 1965 - V. 261 -P. 5229-5232.

37. Hayashi, K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA/ K. Hayashi// Genome Res. 1991 - V. 1 - P. 34-38.

38. Hayes, H. Localization of the -S2-casein gene (CASAS2) to the homoeologous cattle, sheep, and goat chromosomes 4 by in situ hybridization/ H. Hayes, E. Petit, C. Bouniol, P. Popescu// Cytogenet. Cell Genet. 1993 - V. 64 - 281285.

39. Hennighausen. L.G. Comparative sequence analysis of the mRNAs coding for mouse and rat whey protein/ L.G. Hennighausen, A.E. Soppel, A.A. Hobbs, J.M. Rosen// Nucleic Acid Res. 1982 - 10, 3733-3744.

40. T., Kaufman J., Salomonsen J., Skjoedt K., Wong G.K., Wang J., Liu B., Wang92

41. Hillier, S. The respective roles of gonadotropins on follicular growth and oocyte maturation/ S. Hillier// J Gynecol Obstet Biol Reprod (Paris) 2004 - V. 33(6 Pt 2)-P. 11-14

42. Hines, H, C. Linkage relationships among loci of polymorphisms in blood and milk of cattle/, H. C Hines, J. P. Zikakis, G. F. W. Haenlein, C. A. Kiddy, C. L. Trowbridge// J. Dairy Sei. 1981 - V. 64 - P. 71-76.

43. Hines, H.C. Blood antigen, serum protein, and milk protein gene frequencies and genetic interrelationships in Holstein cattle/ Hines H.C., Haenlein G.F., Zikakis J.P., Dickey H.C.//J Dairy Sei. 1977 - 60(7) - 1143-51.

44. Hobbs, A.A. Sequence of rat alpha- and gamma-casein mRNAs: evolutionary comparison of the calcium-dependent rat casein multigene family/ A.A. Hobbs, J.M. Rosen// Nucleic Acids Res 1982 - V. 10(24) - P. 8079-98.

45. Ikonen, T. Associations between milk protein polymorphism and first lactation milk production traits in Finnish Ayrshire cows/ T. Ikonen, M. Ojala, O. Ruottinen// J. Dairy Sei. 1999 - V. 82 - P. 1026-1033.

46. Jann, O. Intragenic haplotypes at the bovine CSN1SJ locus/ O. Jann, E.-M. Prinzenberg, H. Brandt, J. L. Williams, P. Ajmone- Marsan, P. Zaragoza, C. O'zbeyaz, G. Erhardt// Arch. Tierz. Dummerstorf- 2002 V. 45 - P. 11-19.

47. Kanazawa, H. Analysis of Escherichia coli mutants of the H+-transporting ATPase: Determination of altered sites of the structural gene/ H. Kanazawa, T. Noumi, M. Futai// Methods Enzymol. 1986 - V. 126 - P. 595-603.

48. Kappes, S. M. A second-generation linkage map of the bovine genome/ S. Kappes, M., J. W. Keele, R. T. Stone, R. A. McGraw, T. S. Sonstegard, T. P. L. Smith, N. L. Lopez-Corrales, C. W. Beattie// Genome Res 1997 - V. 7 - P. 235-249.

49. Karin, M. AP-1 function and regulation/ M. Karin, Z.-G. Lin, E. Zandi// Curr. Opin. Cell Biol.- 1997 V. 9 - P. 240-246.

50. Koczan, D. Genomic organization of the bovine alpha si casein gene/ D. Koczan, G. Hobom, H.-M. Seyfert// Nucleic Acids Res 1991 - V. 19 - P. 5591-5596.

51. Kuss, A. W. Polymorphic AP-1 Binding Site in Bovine CSNISI Shows Quantitative Differences in Protein Binding Associated with Milk Protein Expression/ A. W. Kuss, J. Gogol, H. Bartenschlager, H. Geldermann// J. Dairy Sei. 2005 - V. 88 - P. 2246-2252.

52. Kuss, A. W. Associations of a polymorphic AP-2 binding site in the 5'-flanking region of the bovine beta-lactoglobulin gene with milk proteins/ A. W. Kuss, J. Gogol, H. Geldermann// J. Dairy Sei. 2003 - V. 86 - P. 2213-2218.

53. Laird, J.E. Structure and expression of the guinea-pig a -lactalbumin gene/ J.E. Laird, L. Jack, L. Hall, A. Boulton, D. Parker, R.K. Craig// Biochem J. 1988 -V. 254-P. 85-94.

54. Lascano, M. How long did it take for life to evolve to cyanobacteria?/ M. Lascano, S. Miller// J. Mol. Evol. 1994 - V. 39 - P. 545 - 554.

55. Lee, Ch.S. A pregnancy-specific mammary nuclear factor involved in the repression of the mouse/ Ch.S. Lee, T. Oka//1992

56. Li, S. Glucocorticoid regulation of rat whey acidic protein gene expression involves hormone-induced alterations of chromatin structure in the distal promoter region/ S. Li, J.M. Rosen// Mol. Endocrinol. 1995 - V. 8 - P. 1328 1335.

57. Li, Q. Locus control regions/ Q. Li, K.R. Peterson, X. Fang, G. Stamatoyannopoulos// Blood 2002 - 100(9) - 3077-86. Review.

58. Lien, S. Comparison of milk protein allele frequencies in Nordic cattle breeds/ S. Lien, J. Katanen, I. Olsaker, L.-E. Holm, E. Eythorsdottir, K. Sandberg, B. Dalsgaard. S. Adalsteinsson// Aniin. Genet. 1999 - V. 30 - P. 85-91.

59. Lien, S. Bovine casein haplotypes: Number, frequencies and applicability as genetic markers/ S. Lien, S. Rogne// Anim. Genet. 1993 - V. 24 - P. 373376.

60. Lin, C. Y. Effects of milk protein loci on first lactation production in dairy cattle/ C. Y. Lin, A. J. McAllister, K. F. Ng-Kwai-Hang, J. F. Hayes// J. Dairy Sci. 1986 - V. 69 -P. 704-712.

61. Lum, L. S. Polymorphisms of bovine beta-lactoglobulin promoter and4 —differences in the binding affinity of activator protein-2 transcription factor/ L. S. Lum, P. Dove, J. F. Medrano// J. Dairy Sci. 1997 - V. 80 - P. 1389-1397.

62. Lundin, L.G. Evolutionary conservation of large chromosomal segments reflected in mammalian gene maps/ L.G. Lundin// Clin. Genet. 1979 - V. 16. -P. 72-81.

63. Lundin, L.G. Evolution of the vertebrate genome as reflected in paralogous chromosomal regions in man and the house mouse/ L.G. Lundin// Genomics. -1993-V. 16.-P. 1-19.

64. Malewsky, T. Computer analysis of distribution of putative cis- and trans-regulatory elements in milk protein gene promoters/ T. Malewsky// BioSystems 1998 - V. 45-P. 29-44.

65. Martin, P. Improvement of milk protein-qualityby gene technology / P. Martin, F. Grosclaude// Livestock Prod. Sci. 1993 - V. 35 - P. 95-115.

66. Martin, P. The impact of genetic polymorphisms on the protein composition of ruminant milks/ P. Martin, M. Szymanowska, L. Zwierzchowski, C. Leroux// Reprod. Nutr. Dev. 2002 - V. 42 - P. 433-459.

67. Mullins, L.J. Insights from the rat genome sequence/ L.J. Mullins, Mullins J.J.// Molecular Physiology Laboratory, Wilkie Building, Teviot Place, University of Edinburgh Medical School, Edinburgh EH8 9AG, UK 2004 -V. 5(5)-P. 221.

68. C., Jalali M., Johns D., Kline L., Ma D.S., MacCawley S., Magoon A., Mann97

69. G. Monardes, J. F. Hayes// J. Dairy Sei. 1990 - V. 73 - P. 3414-3420.

70. Persuy, M. High expression of the caprine beta-casein gene in transgenic mice / M. A. Persuy, M. G. Stinnakre, C. Printz, M. F. Mahe, J. C. Mercier// Eur. J. Biochem. 1992 - V. 205 - P. 887-893.

71. Popovici, C. Coparalogy: physical and functional clusterings in the human genome/ C. Popovici, M. Leveugle, D. Birnbaum, F. Coulier// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 - V. 288. - P. 362 - 370.

72. Puissant, C. Cortisol induces rapid accumulation of whey acid protein mRNA but not of aSl and p-casein mRNA in rabbit mammary explants/ C. Puissant, L.-M. Houdebine// Cell Biol. Int. Rep. 1991 - V. 15 (2) - P. 121-129.

73. Raught. B. YY1 represses J3 -casein gene expression by preventing the formation of a lactation-associated complex/ B. Raught, B. Kursheed, A. Kazansky, J. Rosen// Mol. Cell. Biol. 1994 - V. 14 (3) - P. 1752-1763.

74. Raught, B. Developmental and hormonally regulated CCAAT/enhancer-binding protein isoforms influence P-casein gene expression/ B. Raught, W.S.L. Liao, J.M. Rosen// Mol. Endocrinol. 1995 - V. 9 - P. 1223-1232.

75. Rensing, S. New total merit indexRZGfor Holsteins in Germany with more emphasis on herd life/ S. Rensing, E. Pasman, F. Reinhardt, F. Feddersen// Interbull Bull. 2002 - V. 29 - P. 147-149.

76. Rijnkels, M. Multispecies comparative sequence analysis of the casein gene cluster region/ M. Rijnkels, L. Elnitskji, W. Miller, J. Rosen// Genomics 2003 -V. 82.-P. 417-432.

77. Rijnkels, M. Organization of the bovine casein gene locus/ M. Rijnkels, P. M. Kooiman, H. A. de Boer, F. R. Pieper// Mamm. Genome 1997 - V. 8 - P. 148-152.

78. Rijnkels, M. Expression analysis of the individual bovine ß- , as2- and k-casein genes in transgenic mice/ M. Rijnkels, P. M. Kooiman, P. J. A. Krimpenfort, H. A. de Boer, F. R. Pieper// Biochem. J. 1995 - V. 311 - P. 929-937.

79. Rijnkels M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells/ M. Rijnkels, M. J. Rosen// Journal of Cell Science-2001-V. 114-P. 3147-3153.

80. Ron, M. Multiple quantitative trait locus analysis of bovine chromosome 6 in the Israeli Holstein population by a daughter design/ M. Ron, D. Kliger, E. Feldmesser, E. Seroussi, E. Ezra, J. I. Weiler// Genetics 2001 - V. 159 - P. 727-735.

81. Rosen, J. M. Regulation of milk protein gene expression/ J. M. Rosen, S. L. Wyszomierski, D. Hadsell// Annu. Rev. Nutr. 1999 - V. 19 - P. 407-436 SAS/STAT User's Guide, Version 6, Edition 1989. SAS Institute Inc., Caiy, NC.

82. Sacchi, P. Casein haplotype structure in five Italian goat breeds/ P. Sacchi, S. Chessa, E. Budelli, P. Bolla, G. Ceriotti, D: Soglia, R. Rasero, E. Cauvin, A. Caroli// J Dairy Sei 2005 - V. 88(4) - P. 1561-8.

83. Sanders, K. Characterization of the DGAT1 Mutations and the CSN1S1

84. Promoter in the German Angeln Dairy Cattle Population/ K. Sanders, J.100

85. Bennewitz,l N. Reinsch, G. Thaller, E.-M. Prinzenberg, C. Ku'hn, E. Kalm// J. Dairy Sci. 2006 - V. 89 - P. 3164-3174

86. Schild, T. A. Variants within the 5'- flanking regions of bovine milk protein encoding genes. Ill genes encoding the Ca-sensitive caseins asl, asl and fil T. A. Schild, H. Geldermann// Theor. Appl. Genet. 1996 - V. 93 - P. 887-893.

87. Shaulian, E. AP-1 in cell proliferation and survival/ E. Shaulian, M. Karin// Oncogene 2001 - V. 20 - P. 2390-2400.

88. Stewart, A.F. Nucleotide sequences of bovine asl- and k -casein cDNAs/ A.F. Stewart, I.M. Willis, A.G. Mackinlay// Nucleic Acids Res 1984 - V. 12 (9)-P. 3895-3907.

89. Stocklin, E. Functional interaction between STATS and. glucocorticoid receptor/ E. Stocklin, M. Wissler, F. Gouilleux, B. Groner//Nature 1996 - V. 383 - P. 726-728.

90. Szymanowska, M. Transcription factor binding to variable nucleotide sequences in 5'flanking regions of bovine casein genes/ M. Szymanowska, T. Malewski, L. Zwierzchowski// Int. Dairy J. 2004 - V. 14 - P. 103- 115.

91. Velmala, R. J. A search for quatitative trait loci for milk production traits on chromosome 6 in Finish Hairy cattle/ R. J. Velmala. FL J. Vilkkv. K. T. Bio. D. J. deKoning, A. V. Maki-Tanila// Anim. Genet 1999 - V. 30 - P. 136-143.

92. Vilotte, J.-L. Isolation and characterisation of the mouse a-lactalbumin-encoding gene: interspecies comparison, tissue-and stage-specific expression/ J.-L. Vilotte, S. Soulier// Gene 1992 - V. 119 - P. 287 292.

93. Vonderhaar, B.K. Hormonal regulation of milk protein gene expression/ B.K. Vonderhaar. S.E. Ziska//Ann. Rev. Physiol. 1989 - V. 51 - P. 641-649.

94. Wakao, H. Mammary gland factor (MGF) is a novel member of the cytokine regulated transcription factor gene family and confers the prolactin response/ H. Wakao. F. Gouilleux, B. Groner// EMBO J. 1994 - V. 13 (9) -P. 2182-2191.

95. Watson, J.W. Interaction of DNA-binding proteins with a milk protein gene promoter in vitro: identification of a mammary gland-specific factor/ J.W. Watson, K. E. Gordon, M. Robertson, A.J. Clark// Nucleic Acids Res. — 1991 — V. 19-P. 6603-6610.

96. Welte, T. Involvement of Ets-related proteins in hormone-independent mammary cell-specific gene expression/ T. Welte, K. Garimorth, S. Philipp, P. Jennewein, A. C. B. Huck Cato, T. Doppler// Eur. J. Biochem. 1994a - V. 223 -P. 997-1006.

97. Welte, T Glucocorticoid receptor binding sites in the promoter region of milk protein genes/ T. Welte, S. Philipp, C. Cairns, J.-A. Gustafson, T. Doppler// J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1993 - V. 47 - P. 75-81.

98. White, R. Linkage mapping of human chromosomes./ R. White, J. M. Lalouel, M. Leppert, M. Lathrop, Y. Nakamura, P. O'Connel// Genome. 1989 -V. 31-P: 1066-1072.

99. Wiener, P. Testing for the presence of previously identified QTL for milkproduction traits in new populations/ P. Wiener, I.Maclean, J.L. Williams,

100. J.A.Woolliams// Anim Genet 2000 - V. 31(6) - P. 385-95.103

101. Wingender, E. Gene Regulation in Eucaryotes./ E. Wingender// VCH Verlagsgesellschaft mbH (Ed,)- Weinheim. 1993.

102. Wingender, E. Recognition of regulatory regions in genomic sequences./ E. Wingender// Biotechnol. J. 1994 - V. 35 - P. 273-280.

103. Yoshimura. M. Isolation and structural analysis of mouse B-casein gene./ M. Yoshimura, T.Oka// Gene. 1989 - P. 78 - V. 267-275.

104. Yu-Lee, L. Evolution of the casein multigene family: conserved sequences in the flanking and exon regions./ L. Yu-Lee. L. Richter-Mann. C.H. Couch, A.F. Stewart, A.G. Mackinlay, J.M. Rosen//Nucleic Acids Res. 1986 - V. 14 -P. 1883-1902.

105. Zhou, X. F. Ligand-activated retinoic acid receptor inhibits AP-1 transactivation by disrupting c-Jurt/c-Fos dimerization./ X. F. Zhou, X. Q. Shen, L. Shemshedini// Mol. Endocrinol. 1999 - V. 13 - P. 276-285.