Сравнительный анализ повреждения нейронов в разных линиях инбредных и генетически модифицированных мышей

Шиханов, Николай Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ повреждения нейронов в разных линиях инбредных и генетически модифицированных мышей
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ повреждения нейронов в разных линиях инбредных и генетически модифицированных мышей"

РГ5 ОД

2 О ЦДГ: 2СС2

На правах рукописи

ШИХАНОВ НИКОЛАЙ ПАВЛОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕЙРОНОВ В РАЗНЫХ ЛИНИЯХ ИНБРЕДНЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 14.00.02 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САРАНСК-2002

Работа выполнена на кафедре цитологии, гистологии, эмбриологии и кафедре нормальной анатомии Мордовского государственного универститета им. Н.П. Огарева.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РМ

доктор медицинских наук, профессор Сосунов А.А. заслуженный деятель науки РМ доктор медицинских наук, профессор Иванов Н.М.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.И.Корочкин заслуженный деятель науки РУ доктор медицинских наук, профессор В.М.Чучков

Ведущая организация - Научно-исследовательский Институт мозга РАМН

Защита диссертации состоится «_»_2002 г. в_часов на заседании Диссертационного Совета Д 212. 117. 01 в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарева по адресу: 430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «_»_2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

д.б.н. профессор Кругляков П.П.

¿У ¥<Г>3.2 О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Выяснение причин и механизмов повреждения нейронов центральной нервной истемы (ЦНС) является одной из наиболее актуальных проблем современной тео-гтической и практической медицины (Боголепов H.H., 1975; Семченко В.В., Степа-ов С.С. 1995; Cowan, Kandel 2001; Kandel, 2001). Среди многих этио-атогенетических факторов, определяющих повреждение и гибель нервных клеток, гревозбуждение нейронов вследствие активации глутаматных ионотропных и мета-тгропных рецепторов лежит в основе многих заболеваний головного мозга и наи-элее ярко проявляется при эпилепсии (Engel, Pedley, 1.977). Одной из распростра-:1шых форм эпилепсии является височная эпилепсия, связанная, прежде всего, с сражением гиппокампа (Мухин М.Ю. 2000). Морфологически патология гиппо-1мпа определяется как "склероз" и заключается в гибели многих нейронов с разви-!см заместительного глиоза и перестройки синаптических взаимосвязей между :рвными клетками (Mathem et al., 1977; Fisher et al., 1998). Среди многих экспери-ентальных подходов к анализу височной эпилепсии наибольшее признание и рас-ространение получили модели с использованием каиновой кислоты и пилокарпина, ?и которых наблюдается значительное повреждение и гибель нейронов с образова-iicM .новых аномальных синаптических взаимосвязей, что проявляется через ла-.'нтный период в развитии спонтанной эпилептической судорожной актшшосш )clgado-Escueta et al., 1999; Houser, 199$).

Признание существования нейрогенеза - образования новых нейронов из с точных клеток ЦНС в зрелом головном мозге млекопитающих животных и человека швело не только к пересмотру представлений о структуре и деятельности ЦНС, но значительно расширило терапевтические возможности клеточной терапии многих (юлеваний головного мозга (Arsenijevic et al., 2001; Gross, 2000; Pencea et al., 2001). оказано, что судорожная эпилептическая активность в каиновой и пилокарпиной пделях эпилепсии у крыс способствуют нейрогенезу, значительно активируя раз-иожение предшественников и поддерживая жизнеспособность дифференцировйн-.IX клеточных форм (Parent et al., 1997; Scharfman et al., 2000).

Основные сведения по изучению каиновой и пилокарпиновой моделей эпилеп-1И получены на крысах. Мыши, как наиболее широко используемый в настоящее >емя в экспериментах вид животных, вследствие относительной простоты получе-1Я генетически модифицированных линий, изучен в значительно меньшей степени, хтько в некоторых работах приводится сравнительная оценка повреждения нейро-1в и интенсивность нейрогенеза в некоторых инбредных линиях мышей (Kemperann et al., 1997; Schauwecker, Steward, 1997; Schauwecker et al., 2000). Вместе с тем ¡учение исходных линий мышей имеет большое значение для правильной интер-эетации результатов исследования трансгенных животных и выяснения роли генов механизмах клеточных изменений.

В работе также изучены линии генетически модифицированных мышей с различной экспрессией фермента ABAD и рецептора RAGE, а также нокаут мыши без нейропептида Y. Фермент ABAD, относящийся к суперсемейству дегидрогеназо-редуктаз, к короткоцепочным алкогольдегидрогеназо-редуктазам, находится в эндо-плазматической сети и в митохондриях. Он отличается высоким сродством к амилоидному ß- пептиду и, как полагают, принимает участие в генезе болезни Альцгейме-ра, воспалительных и ишемических повреждениях нейронов (Yan et al., 2000). RAGE относится к рецепторам суперсемейства иммуноглобулинов, является основным рецептором конечных продуктов гликозилирования и окисления белков и липидов, образующихся в большом количестве при диабете, воспалении, болезни Альцгеймера, стрессе (Schmidt, Stern, 2000; Schmidt et al., 2000). Связь лиганда с RAGE может приводить к необратимому повреждению клеток. Анализ повреждения нейронов в линиях этих трансгепных животных позволяет не только выяснить некоторые закономерности ответной реакции клеток на перевозбуждение и определить вне- и внутриклеточные сигнальные пути, участвующие в реализации внешних воздействий, но и имеет большое значение для клинической практики.

Цель и задачи исследования:

Цель: Изучить иммуногистохимически морфологию нейронов гиппокампа в норме и степень их повреждения при развитии эпилепсии в разных линия инбредных и генетически модифицированных мышей.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ повреждения нейронов в инбредных линиях С57В и FVB мышей на каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии.

2. Исследовать степень повреждения нейронов гиппокампа у мышей с измененной экспрессией фермента ABAD, рецептора RAGE и нейропептида Y.

3. Изучить нейрогенез гиппокампа в использованных моделях эпилепсии.

Научная новизна исследования

В результате проведенных исследований получены следующие новые данные:

- установлено, что линии С57В и FVB различаются по порогу судорожной активности и степени повреждения нейронов при системном введении каиновой кислоты и пилокарпина;

- каиновая кислота обладает большим тропизмом к нейронам гиппокампа мышей в сравнении с пилокарпином;

- показано наличие прямой корреляции между интенсивностью судорожного синдрома и степенью повреждения нейронов, эта закономерность не зависит от линии инбредных или генетически модифицированных мышей;

- интенсивность нейрогенеза прямо коррелирует со степенью повреждения нейронов;

- мыши с повышенной экспрессией фермента ABAD являются более устойчивыми к нейротоксическому эффекту каиновой кислоты и пилокарпина;

- повреждение нейронов гиппокампа приводит к повышению экспрессии ABAD в нейронах и астроцитах гиппокампа;

- повышение экспрессии рецептора RAGE приводит к большей гибели нейронов гиппокампа при введении каиновой кислоты и пилокарпина;

- нокаут мыши без нейропептида Y отличается большим повреждением нейронов при введении каиновой кислоты.

Научно-практическая значимость

Результаты работы могут иметь практическое значение при разработке методов защиты мозга посредством активации фермента ABAD и снижения эффектов связывания лигандов с рецептором RAGE. Кроме того, повышение экспрессии нейропептида Y может способствовать сохранению нейронов при различных нейроток-сических воздействиях.

Полученные данные значительно расширяют представления о генетически детерминированных свойствах инбредных линий мышей (С57В и FVB), традиционно использующихся для получения генетически модифицированных животных, и. должны учитываться при анализе результатов исследования экспериментально вызванной патологии мозга. Кроме того, изученные инбредные линии более целесообразно использовать в разных экспериментах с генетически модифицированными мышами: С57В - при изучении токсических эффектов, a FVB - мри аначизе защитного действия какого-либо фактора.

Основные положения, выносимые па защиту

1. Инбредные линии мышей С57В и FVB различаются по порогу судорожной активности и степени повреждения нейронов гиппокампа при системном введении каиновой кислоты и пилокарпина.

2. Степень поражения нейронов прямо коррелирует с интенсивностью судорожного синдрома, повреждение нейронов при введении каиновой кислоты и пи-, локарпина различаются.

3. Введение каиновой кислоты с развитием повреждения нейронов гиппокампа приводит к активации нейрогенеза.

4. Особенности повреждения нейронов у генетически модифицированных мышей: защитный эффект фермента ABAD и нейропептида Y, отрицательное влияние рецептора RAGE.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы доложены на XXIX-XXX Огарев-:ких чтениях Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 2000-2001), конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 1999-2000); V Конгрессе Международ-

ной Ассоциации морфологов (Ульяновск, 2000); III Международном симпозиуме «Современные проблемы нейробиологии» (Саранск, 2001), в материалах научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт-Петербург, 2001), на международной научной конференции, посвященной 10-летию образования медицинского факультета «Экология и здоровье человека в XXI веке» (Ульяновск, 2001).

Публикации

Основные положения работы опубликованы в 5 печатных трудах.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», главы собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 156 источников, из которых 45 отечественных и 111 зарубежных. Работа изложена на 115 страницах машинописи, иллюстрирована 87 рисунками (микрофотографии, схемы).

Материал и методы исследования

Работа выполнена на инбредных линиях мышей C57BL/6J (С57В) и FVB/NJ (FVI3), полученных из Jackson Laboratory. Кроме того использованы генетически модифицированные линии мышей, полученные в Колумбийском университете (Ныо Йорк): (1) мыши с повышенной экспрессией фермента ABAD: (а) из линииС57В и (б) и з линии FVB; (2) мыши с повышенной экспрессией рецептора RAGE: (а) из ли-нииС57В и (б) из линии FVB; (3) нокаут мыши без рецептора RÁGE; (4) "доминан-то-рсцессивная" экспрессия "неполноценного" рецептора RAGE, лишенного цито-плазматической части, что приводит к блокированию естественно экспрсссируемых рецепюров в клетках; (5) нокаут мыши без нейропептида Y. Всего в работе использовано 210 мышей самцов в возрасте 7-10 недель, массой тела 19 - 25 г.

Повреждение нейронов гиппокампа моделировали введением каиновой кислоты (КК) и пилокарпина (ПК) (оба SIGMA). КК вводили внутрибрюшинно ( в ряде экспериментов подкожно - отличий в реакции животных при этих двух способах введения отмечено не было) дробно в дозе 10 мг/кг каждый час до появления выраженной судорожной активности 5-ой степени по шкале R.J.Racine (1972). Такая методика введения позволяет уменьшить смертность животных и определить зависимость между дозой КК и судорожной активностью. В ряде экспериментов КК вводили одномоментно в дозах: 25 и 35 мг/кг. ПК вводили внутрибрюшинно в дозе 220 -300 мг/кг (разброс в дозе определяется очень узким промежутком между летальной дозой и дозой, эффективной для вызывания судорожной активности, а также высокой разницей в чувствительности исследованных линий мышей), за полчаса перел введением ПК вводили скополамин (1 мг/кг) для снижения периферических эффектов ПК. Через 1,5-2 часа после начала судорожной активности в целях снижения смертности вводили диазепам (4 мг/кг).

Животных забивали через 6, 12 часов, на первые, пятые сутки и через 3 недели после введения препаратов транскардиальной перфузией фиксатора под наркозом. В качестве фиксатора использовали 4 % параформальдегид в 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,2). Реакции проводили на вибратомных (40 мкм) и криостатных замороженных срезах (10 мкм).

Для идентификации поврежденных нейронов использовали окраску крезил фиолетовым, метод серебрения по F.Gallyas с соавторами (1993), флюоресцентный метод с Fluoro Jade (Schmued, Hopkins, 2000). При серебрении поврежденными нейронами считали только клетки черного цвета. Морфометрический анализ проводили на 1-е и 5-е сутки после эксперимента на препаратах, окрашенных серебром и флюо-рохромом Fluoro Jade, о помощью программы MetaMorph Universal Imaging Corp.no разнице в интенсивности свечения (флюоресценция) или окраски (импрегнация серебром). Количественные показатели обрабатывали программой Origin 6.1.

Для оценки нейрогенеза внутрибрюшинно вводили бромодезоксиуридин (BrdU, SIGMA) в дозе 50 мг/кг в течение 4-х дней, начиная с первых суток после моделирования судорожного синдрома. Для визуализации включения BrdU в ядра использовали первичные моноклональные (мышиные, PharMingen, 1:500 или крысиные, Harlan Sera Lab., 1:200) антитела против BrdU.

Для анализа экспрессии фермента ABAD использовали оригинальные антитела (дар Dr. D.M.Stern, Колумбийский университет) в разведении 1: 500.

В качестве маркеров вновь образованных клеток использовали антитела прошв глиального кислого фибриллярного белка (ГКФБ, DAKO, 1:1000) и виментина (DAKO, 1:1000) (маркеры нейроглиальных клеток, преимущественно астроцитов) и против ядерного белка NeuN (Chemicon, 1:500) и ß-тубулина III (SIGMA, 1:250) (маркеры юных нейронов). Кроме того использовали моноклональное антитело против МАР2 (мнкротрубочно ассоциированный белок - цитоплазматический маркер нейронов) (Sigma, 1:200).

Для анализа изменений некоторых сигнальных путей нейронов, имеющих отношение к повреждению/защите клеток, использовали антитела против Ilsp-70 (Stressgen, 1:200) (семейство белков теплового шока), Egr-1 (Sania Cruz Biotechnology, 1:500) (продукт генов раннего ответа, транскрипционный фактор).

Визуализацию реакции проводили авидин биотиновым методом с диаминобен-зидином (VECTOR) или использовали вторичные антитела, связанные с флюоро-хромами Alexa Fluo 488, 568, 647 (зеленая, красная, фиолетовая флюоресценция соответственно) (Molecular Probes). Препараты с двойным (тройным) окрашиванием разными флюорохромами просматривали в конфокальном микроскопе Laser Sharp 2000 (Bio Rad). Полученные изображения обрабатывали с помощью Adobe Photoshop 5.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование инбредных линий мышей С57В и РУВ показало значительные различия в чувствительности животных к судорожному эффекту КК. Средняя доза КК, вызывающая развитие судорог, соответствовала 37±4.7 мг/кг у РУВ мышей и 25±3.5 мг/кг у С57В мышей. Однако судороги 4-5 степени у мышей РУВ наблюдались значительно чаще (Рис. 1). В то же время смертность у мышей С57В была значительно выше, чем у РУВ (Рис. 1). Следует также отметить, что у мышей линии РУВ чаще наблюдался эпилептический статус в виде постоянных судорожных движений и сильного тремора всего тела, прекращающихся только введением диазепа-ма. Такая особенность мышей линии С57В может быть связана с очень узким "окном'' для эпилептогенного действия КК. Количество поврежденных нейронов в первые сутки после введения КК достоверно не различалось в двух линиях, однако на пятые сутки у мышей РУВ число поврежденных нейронов в пирамидном слое ам.мо-пова рога было достоверно выше, чем у С57В (Рис. 2).

5Я : л- 55 |

1 1 и

с)дороги 4-5 смертность степени

□ пС57В п=25 ОЕ\'В п=25

НС57В ПРЛИ

Рис. 1. Различия в судорожной активности н смертности между линиями мышей С57В и ИУБ при дозе КЛ 40 мг/кг. р<0.005

Рис.2. Степень повреждения нейронов в гиппо-кампс мышеи С57В н РУВ. Звездочкой отмечены достоверные различия р<0.005. ЗИ- зубчатая извилина

Следует отметить, что, несмотря на высокую степень вариабельности, в степени повреждения нейронов хорошо выявлялась прямая зависимость между интенсивностью судорожного синдрома и степенью повреждения нервных клеток. Особенно ярко такая зависимость проявлялась при сравнении эпилептического статуса в виде частых приступов судорог и практически постоянного тремора, и относительно редкими судорожными "припадками" в виде прыжков, стояния на задних лапах или движения назад. В первом случае наблюдалось массивное поражение нейронов на всем протяжении аммонова рога, большинства вставочных нейронов и, как правило, клеток-зерен з>бчатой извилины. При кратковременных судорогах, как правило об-

наруживалось только локальное поражение разных областей гиппокампа: зоны САЗ, хилуса, отдельных участков CAI, нейроны зубчатой извилины оставались обычно малоповреждёнными.

Кроме гиппокампа, поврежденные нейроны находились в энторинальной коре, амигдале, в некоторых ядрах гипоталамуса, стриатуме. Можно отметить, что повреждение нейронов мозжечка отсутствовало.

Введение пилокарпина (ПК) приводило к другой картине судорожного синдрома: животные реже вставали на задние лапы, прыгали, пятились; обычно даже при высоких дозах (300 мг/кг) наблюдался только тремор передней части туловища или всего тела. Смерть животных наступала быстро на фоне клонических судорог, часто без предшествующих приступов судорожной активности.

ПК вызывал более выраженный судорожный синдром у мышей FVB, в сравнении с мышами С57В, также как и развития эпилептического статуса. Однако мыши линии С57В чаще умирали даже без выраженного предшествующего судорожного синдрома. Степень повреждения в разных отделах гиппокампа достоверно не различалась у двух линий мышей, а зависила только от интенсивности судорожного синдрома. Можно отметить, что высокие дозы (300 мг/кг) ПК обычно приводили не только к значительному поражению всех отделов гиппокампа (зубчатая извилина оставалась менее измененной), но и к повреждению нейронов во многих других областях головного мозга. Как правило, наблюдалось поражение нейронов в II- III и IV слоях повой коры, энторинальной коре, амигдале, многих ядрах таламуса и в стриатуме. В некоторых случаях при массивных диффузных поражениях мозга гиппокамп оставался относительно малоизмененным и только интернейроны давали положительную окраску при серебрении и с Fluoro Jade В.

Сравнительный анализ изменения нейронов при КК и ПК свидетельствует, что КК оказывает более избирательное поражение гиппокампа, чем ПК. Поражение при ПК более "полярно" - наблюдается или массивное поражение (большая часть аммо-нова рога, интернейроны, клетки зерна зубчатой извилины), или минимальное с нарушением преимущественно только интернейронов. Следует отметить, что при введении ПК чаще наблюдались массивные поражение гиппокампа, которые при каиновой модели встречались реже, только при длительном судорожном синдроме, соответствующем status epilepticus. Отличительной чертой последнего можно считать значительное повреждение клеток зерен зубчатой извилины.

В работе использованы три способа определения повреждения нервных клеток, что позволяет сравнить их информативность и сопоставить полученные результаты (Рис. 3). Метод серебрения, который применялся в исследовании, отличается простотой и требует меньше времени, чем другой широко используемый импрегнаци-оиный метод (Gallyas et al., 1990, 1992), степень окраски нейронов варьирует от черной до темно-коричневой (что частично определяется и концентрацией серебра в импрегнационном растворе). Fluoro Jade вызывает яркую флюоресценцию только клеток, соответствующих "черным" нейронам при использованном методе серебрения, темно-коричневые клетки обладают слабой флюоресценцией часто не отличи-

мой от неспедифической и поэтому обычно не учитываются при подсчете поврежденных клеток. Таким образом, серебрение позволяет более полно оценить повреждение нейронов и наряду с необратимо измененными клетками (соответствующие "черным" нейронам) выявить нейроны, способные возможно к восстановлению жизнедеятельности (нейроны с темно-коричневой окраской). Аналогичное заключение было получено и другими исследователями при сравнении методов серебрения с флюоресценцией Fluoro Jade (Kubova et al., 2001; Poirier et al., 2001).

Многие поврежденные нейроны имели вид мелких округлых телец, интенсивно окрашенных крезил фиолетовым или серебром, при флюоресценции с Fluoro Jade светящиеся мелкие тельца-встречались гораздо реже, обычно флюоресцировали тела клеток с отростками. Сравнение импрегнационных препаратов с флюоресценцией позволяет заключить, что темно-окрашенные тельца соответствуют клеточным ядрам. Такое изменение нейронов, приобретающих вид мелких телец, соответствует апоптическому варианту гибели клетки. Известно, что апоптоз широко распространен в гиппокампе при поражении нейронов вследствие их перевозбуждения (Yuan, Yankner, 2000). Обращает внимание, и временная динамика таких изменений - апоп-тические тельца обнаруживались чаще на 5-е сутки после введения нейротоксиче-ских агентов - время достаточное для реализации программы апоптоза.

Рис. 3. Поврежденные нейроны после введение КК при окраске серебром (а-в) и Fluoro Jade (г-е). а, б - общий вид гиппокампа при массивном поражении аммонова рога, в, д - поражение в СА1, г, е - локальное поражение в САЗ

При интерпретации этих данных следует отметить, что, несмотря на нередко полярно противоположные точки зрения исследователей, необходимо признать, что только по морфологическим критериям дифференцировка апоптоза и некроза является неоднозначной, поскольку изменения клеток при апоптозе и некрозе не различаются в начальные сроки повреждения (Roy, Sapolsky, 1999; Fujikawa et al., 2000) и судьба клеток определяется, как полагают, уровнем поступления кислорода: в условиях ги-

поксии/ишемии наступает некроз, а при достаточном напряжении кислорода развивается апоптоз (Челышев и др., 2001; Budd, 2001; Carmody; Cotter, 2001).

Использование антител против Hsp-70 показало, что экспрессия белка максимальна в первые сутки после эксперимента. При наличии массивного повреждения гиппокампа на пятые сутки белок не определяется иммуногистохимически. Экспрессия белка прямо коррелирует с повреждением, нейронов и наблюдается только в области их повреждения. Сравнения инбредных линий показало, что в первые сутки у мышей линии FVB наблюдается усиленная экспрессия Hsp-70 в клетках зернах зубчатой извилине, в линии С57В экспрессия белка в клетках зернах отсутствует. Имеется прямая корреляция между экспрессией Hsp-70 и Egr-1, особенно ярко выраженная в зубчатой извилине мышей FVB - в области с усиленной экспрессией Hsp-70 многие нейроны экспрессируют в ядрах Egr-1, однако только в некоторых клетках выявлена совместная локализация этих белков. Повышенная экспрессия Egr-1 наблюдается также в телах реактивных астроцитов.

При введении КК и ПК наблюдалось значительное повышение числа клеток, включивших BrdU, во всех отделах гиппокампа, также как и в других отделах мозга, в которых наблюдалось повреждение нейронов. Степень включения метки прямо коррелировала с интенсивностью поражения нейронов. Следует отметить, что это положение справедливо как для области хилуса, в том числе и субгранулярпого слоя, так и полей CAI и САЗ аммонова рога (Рис. 4). На пятые сутки после введения КК и ПК использование маркеров юных нейронов не позволило достоверно судии, о нервной природе вновь образованных клеток. Вместе с тем многие астроциты. определяемые реакцией с глиальпым кислым фибриллярным белком и виментином и соответствующие по размерам тела и отростков реактивным формам, содержал» BrdU

^ис. 4. Меченые ВгсШ клетки в гнппокампе С57В мышей в контроле (а), при введении КК (б, в и г). Двойное флюоресцентное окрашивание на ВгсШ и маркер ядер нейронов МеиЫ (а,б и в) и на ВгсШ и Г'КФБ (г) (конфокальная микроскопия)

(Рис. 4в). Последнее положение позволяет считать, что реактивные астроциты могут образовываться из зрелых клеток.

Идентификация вновь образованных нейронов была проведена через две недели после введения BrdU как в контроле,так и после судорожного синдрома вследствие введения каиновой кислоты. В контроле только единичные клетки дав&чи положительную реакцию при двойной окраске на BrdU и маркеры юных нейронов. В экспериментальном материале после периода судорожной активности и повреждения нейронов многие нейроны в зубчатой извилине и хилусе содержали BrdU (рис. 4в). '

Особое внимание в работе было уделено анализу повреждения нейронов у генетически модифицированных животных.

Животные с усиленной экспрессией фермента ABAD отличались повышенной устойчивостью к действию КК и ПК. Смертность и порог развития судорог у них значительно отличался от контрольных мышей. Следует отметить, что данное положение было подтверждено на мышах, полученных на основе животных С57В и FVB инбредных линий (Рис. 5, 6). Соотношение смертности и интенсивности судорожного синдрома между трансгенными животными, полученными из линий С57В и FVB, соответствовало соответствующей разнице в контроле.

Анализ степени повреждения нейронов также показал "защитный" эффект повышенной экспрессии ABAD. Число поврежденных пирамидных нейронов в аммо-новом роге в обеих линиях мышей было достоверно меньше у животных с повышенной экспрессией фермента.

смертность сулорып) 5 степени

НС57В E3ABAD+

Рис.5. Смертность и интенсивность судорог у мышей С57В с повышенной экспрессией ABAD

д.И»рогц 5 ctcuctui

HFVB 0ABAD+

Рис. 6. Смертность и интенсивность судорог у мышей FVB с повышенной экспрессией ABAD

Иммуногистохимическое исследование фермента ABAD показало, что после судорожного периода при введении КК или ПК происходит повышение экспрессии фермента в нейронах аммонова рога и зубчатой извилины, что проявляется в усилении интенсивности окраски (или флюоресценции) клеток. Усиление экспрессии фермента наблюдалось в первые сутки после введения КК или ПК и сохранялось на 5-е сутки. Значительно повышалась экспрессия ABAD в реактивных астроцитах

(Рис. 7). В контроле астроциты давали очень слабую положительную реакцию преимущественно в молекулярном слое зубчатой извилины.

Таким образом, полученные данные совпадают с результатами исследований, показавших "защитный'7 эффект ABAD при ишемии головного мозга (Yan et al., 1999).

У трансгенных мышей с повышенной экспрессией рецептора RAGE наблюдалось снижение устойчивости нейронов при перевозбуждении под влиянием КК и ПК. Это проявлялось в увеличении смертности животных и снижении порога развития судорожного синдрома, также как и степени повреждения нервных клеток. Эта закономерность не зависела от исходной инбредной линии мышей, а трансгенные животные, полученные на основе FVB были, менее устойчивы в сравнении с мышами линии С57В. Так именно в этой группе (повышенная экспрессия RAGE, линия FVB) был получен наиболее "яркий" эпилептический статус и была показана максимальная гибель нейронов. Именно у этих трансгенных животных наблюдалась массивная гибель клеток зерен зубчатой извилины, подобного повреждения этих нейронов не было обнаружено ни в одной другой изученной линии крыс.

Рис. 7. Повышение экспрессии ABAD в str. radiatum CAI на 5-е сутки после введения КА.

а) реактивные астроциты, реакция на ГКФБ;

б) реакция на ABAD значительно усилена в пирамидных нейронах и реактивных астро-цитах; .

в) астроциты в str. radiatum CAI в контроле;

г) иммунореактивпость на ABAD в str. radiatum CAI в контроле. Конфокальная микроскопия, двойная окраска на ГКФП (а.п) и ABAD (б,г).

Нокаут мыши без рецептора RAGE отличались, наоборот, устойчивостью к нейротоксическому эффекту КК и ПК.

У мышей, условно обозначенных "доминантно-негативные", у которых была повышена экспрессия неполноценного рецептора, лишенного цитоплазматической части и блокировавшего по невыясненным полностью причинам действие нормальных рецепторов, экспрессирующихся в клетках, наблюдался защитный эффект.

Смертность в группе доминантно-негативных животных была меньше, слабее были выражены судорожные припадки, достоверно снижалась степень повреждения нейронов.

160000 --„ 140000 -¡ 120000 ■ 5 íooooo -

Z 80000 -I 60000 -

5 40000 -^ 20000 -o --

Таким образом, негативное влияние экспрессии рецептора RAGE показано на трех вариантах генетически модифицированных мышей.

Нокаут мыши без нейропептида Y были менее устойчивы к воздействию КК, что проявлялось в повышенной смертности и снижению порога развития судорог, а также степени повреждения нейронов. Можно отметить, что у этих трансгенных животных в отличие от других, изученных в работе, наблюдалась высокая степень избирательного повреждения нейронов гиппокампа и преимущественно зоны CAI ам-монова рога. Другие отделы мозга отличались меньшей степенью повреждения.

В проведенном исследовании впервые на разных линиях мышах показаны изменения, развивающиеся в гиппокампе при введении КК и ПК. Сравнение с данными, полученными на крысах - основным объектом исследований этой модели эпилепсии, показывает, что чувствительность мышей и крыс к КК и ПК принципиально отличается. Дозы КК, приводящие к повреждению нейронов у крыс (10-15 мг/кг), значительно ниже, чем у мышей (30-45 мг/кг), а ПК, напротив, вызывает гибель нейронов у мышей в меньшей дозе (250-300 мг/кг) в сравнении с крысами (315-330 мг/кг).

Несмотря на противоречивые данные разных лабораторий, наиболее уязвимой областью гиппокампа у крыс в моделях с поражением нейронов вследствие перевозбуждения следует признать зону САЗ (Cherubini et al., 1990; Covolan, Mello, 2000; Lee et al., 2001; Pollard et al., 1994; Sater, Nadler, 1990) аммонова рога. Следует отметить, что при ишемических повреждениях у крыс чаще поражается CAI (Sadowski et al., 1999; Sugawaraet al., 2001).

У мышей изученных линий чаще наблюдалось поражение нейронов области CAI, особенно при массивных поражениях гиппокампа как при введении КК, так и при ПК. Такая видовая особенность была отмечена также другими авторами (Inoue et al., 1998;Suzuki et al, 1997; Bouillerer et al., 1999, 2000). Следует отметить, что при незначительном судорожном синдроме повреждение нейронов обычно определялось в САЗ.

Следует также отметить, что у мышей значительно чаще и в большей степени наблюдалось поражение нейронов клеток-зерен зубчатой извилины.

В работе впервые показана прямая зависимость между интенсивностью судорожного синдрома и степенью повреждения нейронов вне зависимости от линии

RAGE+ нокаут

Рис.8. Поражение пирамидных нейронов аммонова рога зоны СА1-3 у трансгенных мышей с повышенной экспрессией RAGE (RAGE +) и у нокаут животных без рецептора. р<0.005

мышей. Особенно ярко это положение проявляется при сравнении эпилептического статуса в виде постоянных судорожных движений с одновременным сильным тремором и судорожного синдрома в виде периодически возникающих нарушений в двигательной активности. Имеющиеся в литературе противоречия в отношении различий в степени повреждения нейронов при одинаковой интенсивности судорожного синдрома можно объяснить отсутствием объективной количественной оценки судорожного синдрома и невозможностью вследствие этого сравнение клинической картины в разных лабораториях. В проведенной работе показано, что инбредные линии мышей действительно различаются по чувствительности к КК и ПК, что прояв-ляется'в разной степени летальности, интенсивности судорожного синдрома и числа поврежденных нейронов, однако степень повреждения нервных клеток прямо коррелирует с интенсивностью судорожного синдрома.

Отмеченная в работе большая степень повреждения нейронов при введении ПК в сравнении с КК, отмечена также у крыс (Covolarl, Mello, 2000) и может быть связана со значительным перевозбуждением нейронов энторинальной коры, амигда-лы, являющихся "входами" возбуждения в гиппокамп, которые в свою очередь активируют нейроны гиппокампа.

При длительном (1,5 - 2 часа) эпилептическом статусе, вызванном введением КК или ПК, массивное поражение гиппокампа постоянно сопровождалось повреждением нейронов зубчатой извилины - одной из наиболее устойчивых структур гиппокампа. Поражение этих нейронов может приводить к феномену "диссоциации" зубчатой извилины, наблюдающемуся в клиническом материале и в хронических моделях эпилепсии (Houser, 1999;BouiIlerer et al., 1999, 2000).

Мыши линии С57В и FVB являются наиболее распространенными источниками получения трансгенных животных, в том числе и для выяснения вопроса об устойчивости нейронов к повреждающим воздействиям. Различия в чувствительности нейронов разных линий позволяют определить гены, ответственные за устойчивость нервных клеток; так было показано, что лабильность некоторых линий мышей к повреждающему воздействию каиновой кислоты определяют гены, локализованные в 5-ой и 1-ой хромосомах (Ferraro et al., 1999; Schauwecker, 2001). Различная чувствительность исходных инбредных линий мышей к другим нейротоксическим агентам была показана в работе G.T.Golden с соавторами (2001).

Одной из возможных причин различий в чувствительности к КК могут являться отличия в кальциевых каналах: у лабильной линии мышей КК вызывает значительно большее повышение уровня ионов кальция в дистальных дендритах (при статистически недостоверной разнице в вызываемых потенциалах) (Shuttleworth, Connor, 2001).

Хотя КК и ПК имеют отличные механизмы влияния на нейроны (КК оказывает влияние на каиновые рецепторы, которые наряду с NMDA и АМРА рецепторами относятся к возбуждающим глутаматным ионотропным рецепторам; ПК влияет на М-холинорецепторы), предполагается, что механизм повреждения нейронов принципиально одинаков - развитие перевозбуждения нейронов, резкая активация глутамат-

ных NMDÁ рецепторов и вследствие этого кальциевая перегрузка клеток (Clifford el al., 1990; Fujikawa et al., 2000). Данное положение в основном базируется на экспериментах с блокаторами разных ионных каналов (Fariello et al., 1989; Fujikawa et al., 1994) и ведет к заключению, что причиной повреждения нервных клеток являются резкая судорожная активность, развивающаяся в ответ на введение возбуждающих агентов, а не само влияние возбуждающих агентов на клетки. Показанные различия в повреждении нейронов гиппокампа в КК и ПК моделях позволяют считать, что прямое влияние также может оказывать влияние на поражение нейронов и модулировать степень повреждения клеток.

На основании работ P.E. Schauwecker с соавторами (1997, 2000) считается, что линия С57В является более устойчивой к повреждению нейронов в сравнении с линией FVB, по данным авторов степень судорожной активности при введении. КК не различается в этих линиях, а гибель нервных клеток значительно выше у мышей FVB.

Наши данные показывают, что в основе различия линий мышей лежит, прежде всего, очень узкий интервал - "окно" для эпилептогенного действия КК и ПК у линии С57В, что значительно затрудняет сравнение судорожной активности, особенно при однократном введении КК (модель, использованная P.E. Schauwecker с соавторами). При развитии эпилептического статуса у мышей С57В повреждение нейронов в этой линии только несколько ниже, чем у мышей FVB.

При анализе данных по устойчивости разных линий мышей следует учитывать, что в разных лабораториях линии мышей могут различаться (так, в работе P.E. Schauwccker с соавторами были использованы мыши С57В из Hilltop Lab. Animals, в проведенном исследовании мыши были получены из Jackson Lab.).

Большое значение имеет возраст животных: молодые животные являются более устойчивыми к нейротоксическим (судорожным) эффектам КК и ПК (Dube et al., 2001; Szot et al., 2001).

Полученные данные свидетельствуют, что в модельных экспериментах по изучению механизмов развития судорожного (эпилептического) синдрома целесообразнее использовать мышей линии FVB или трансгенных животных, полученных из этой линии.

В работе использованы трансгенные мыши с измененной экспрессией двух белков: фермента ABAD и рецептора RAGE. Ранее было показано, что при ишеми-ческом повреждении мозга усиленная экспрессия ABAD показывает защитный эффект, a RAGE, напротив, приводит к усугублению патологии мозга (Schmidt et al., 1999, 2001). Совпадение результатов исследования ишемического повреждения и нарушений вследствие перевозбуждения отражает единство конечного звена патогенетических механизмов, связанного во многом с нарушенным гомеостазом ионов кальция. Конкретные механизмы действия этих белков полностью не выяснены, предполагается, что ABAD "'улучшает'' деятельность митохондрий, в частности препятствуя повышению пористости внутренней мембраны, а взаимодействие лигандов с RAGE может приводить к окислительному стрессу и процессам, связанным с акти-

вацией транскрипционного фактора NF-kB (Yan et al., 1994, 1997). Следует отметить, что оба эти белка обладают высоким сродством к амилоидному Р пептиду. Показанное в работе участие ABAD и RAGE в судорожной активности еще раз, свидетельствует об их большом значении в деятельности нейрона и многообразии сигнальных путей, участвующих в реализации судорожного синдрома.

Нейропептид Y является одним 'из наиболее распространенных в головном мозге (Colmers, Bleakman, 1994; Bing et al., 1996). Он имеет большое значение в развитии эпилепсии, в частности повышает порог судорожной активности in vitro и in vivo (DePrato Primeaux et al., 2000; Furtinge et al., 2001). Полученные нами данные о повышении степени повреждения нейронов и более тяжелом судорожном синдроме при введении КК нокаут мышам соответствуют полученным ранее данным о влиянии нейропептида Y на возбудимость нейронов (El Bahh et al., 2001; Reibel et al., 2001).

ВЫВОДЫ

1. Инбредные линии мышей C57BL/6J и FVB/NJ различаются по чувствительности к каиновой кислоте и пилокарпину. Судорожная активность развивается у С57В мышей при меньших дозах каиновой кислоты, у С57В значительно выше смертность, чем у FVB. Пилокарпин вызывает судорожную активность и статус эпи-лептикус у мышей FVB в меньших дозах в сравнении с С57В, при аналогичных дозах смертность у С57В выше.

2. Степень повреждения нейронов в каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии у мышей прямо коррелирует с интенсивностью и продолжительностью судорожного синдрома и опосредованно зависит от линии инбредных или генетически модифицированных животных.

3. Повреждение нейронов головного мозга мышей при каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии различно, каиновая кислота вызывает более локальное повреждение гиппокампа, пилокарпин приводит к значительному повреждению нейронов других отделов головного мозга.

4. Установлена прямая корреляция между экспрессией белка теплового шока Hsp-70 и фактора транскрипции Egr-1 и поражением нейронов, зависящая от вида нейронов (пирамидные аммонова рога, клетки зерна зубчатой фасции) и линии мышей (С57В, FVB).

5. Интенсивность нейрогенеза (общее число делящихся нервных и нейроглиальных клеток) прямо зависит от степени повреждения нейронов и интенсивности судорожного синдрома.

6. Повышенная экспрессия фермента ABAD в трансгенных мышах оказывает защитный эффект от нейротоксического действия каиновой кислоты и пилокарпина. Судорожная активность приводит к усилению экспрессии фермента в нейронах и астроцитах.

7. Плазмалеммальный рецептор RAGE в экспериментах с моделированием судорожной активности введением каиновой кислоты и пилокарпина понижает протекторные способности нейронов гиппокампа и приводит к повышению повреждения нервных клеток.

8. У нокаут мышей без нейроиептида Y снижается эпилептогенный порог для каи-новрй кислоты и повышается степень повреждения нейронов гиппокампа при системном введении каиновой кислоты.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Стрессовые повреждения головного мозга. Гибель и регенерация нейрона. // Современные проблемы нейробиологии. Исследование висцеральных систем и их регуляции в возрастном аспекте. 3-й Международный симпозиум. Тезисы 1 докладов. Саранск, 2001.-С. 126. (соавторы Ховряков A.B., Кругляков П.П., Айрапетянц М.Г.)

2. Устойчивость нейронов и нейрогенез в гиппокампе в разных исходных генетически модифицированных линиях мышей. // Современные проблемы нейробиологии. Исследование висцеральных систем и их регуляции в возрастном аспекте. 3-й Международный симпозиум. Тезисы докладов. Саранск, 2001.-С.36. (соавторы Балыкова О.П., Иванов Н.М., МакКхан Г., Сосунов A.A.)

3. Закономерности иейрогенеза в зрелом головном мозге млекопитающих. // Современные проблемы нейробиологии. Исследование висцеральных систем и их регуляции в возрастном аспекте. 3-й Международный симпозиум. Тезисы докладов. Саранск, 2001.-С. 22-23. (соавторы МакКхан Г., Сосунов A.A., Балыкова О.П.)

4. Повреждение нейронов гиппокампа в разных исходных линиях мышей. // Российские Морфологические Ведомости, 2001. № 3-4.- С.80-83. (соавторы Балыкова О.П., МакКхан Г., Кругляков П.П., Иванов Н.М., Сосунов A.A.)

5. Исследование нейрогенеза в зубчатой извилине гиппокампа у мышей. //Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей. Материалы научной конференции. Санкт-Петербург, 2001.- С. 97-98 (соавторы Балыкова О.П., Подеров В.Н., Кругляков П.П.,)

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шиханов, Николай Павлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Внутренняя структура гиппокампа.

1.1.1. Деление по полям. Клеточные элементы гиппокампа.

1.1.2. Деление на слои. Внутренние системы связей.

1.2. Нейрогенез в головном мозге зрелых млекопитающих.

1.2.1.Нейрогенез в зрелом головном мозге.

1.2.2. Нейрогенез в субвентрикулярной области.

1.2.3. Нейрогенез в зубчатой извилине гиппокампа.

1.2.4. Стволовые клетки в центральной нервной системе.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕЙРОНОВ В ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЯХ МЫШЕЙ.

3.1. Влияние каиновой кислоты.

3.2. Влияние пилокарпина.

3.3. Анализ повреждения нейронов при введении каиновой кислоты и пилокарпина.

3.4. Обсуждение.

ГЛАВА 4 АНАЛИЗ НЕЙРОГЕНЕЗ А В КОНТРОЛЕ

И ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КАИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

4.1. Анализ нейрогенеза в контроле.

4.2. Анализ нейрогенеза после введения каиновой кислоты.

4.3. Обсуждение.

Глава 5 АНАЛИЗ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕЙРОНОВ ГИППОКАМПА

У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

5.1. Повышенная экспрессия фермента ABAD.

5.2. Генетическое модифицирование экспрессии мембранного рецептора RAGE.

5.3. Доминантно-негативная экспрессия рецептора RAGE.

5.4. Нейропептид Y нокаут мыши.

5.5. Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ повреждения нейронов в разных линиях инбредных и генетически модифицированных мышей"

Актуальность темы. Выяснение причин и механизмов повреждения нейронов центральной нервной системы (ЦНС) является одной из наиболее актуальных проблем современной теоретической и практической медицины (Боголепов Н.Н., 1975; Семченко В.В., Степанов С.С. 1995; Cowan, Kandel 2001; Kandel, 2001). Среди многих этио-патогенетических факторов, определяющих повреждение и гибель нервных клеток, перевозбуждение нейронов вследствие активации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов лежит в основе многих заболеваний головного мозга и наиболее ярко проявляется при эпилепсии (Engel, Pedley,1977). Одной из распространенных форм эпилепсии является височная эпилепсия, связанная, прежде всего, с поражением гиппокампа (Мухин М.Ю., 2000). Морфологически патология гип-покампа определяется как "склероз" и заключается в гибели многих нейронов с развитием заместительного глиоза и перестройки синаптических взаимосвязей между нервными клетками (Mathern et al., 1977; Fisher et al., 1998). Среди многих экспериментальных подходов к анализу височной эпилепсии наибольшее признание и распространение получили модели с использованием каиновой кислоты и пилокарпина, при которых наблюдается значительное повреждение и гибель нейронов с образованием новых аномальных синаптических взаимосвязей, что проявляется через латентный период в развитии спонтанной эпилептической судорожной активности (Delgado-Escueta et al., 1999; Houser, 1999).

Признание существования нейрогенеза - образования новых нейронов из стволовых клеток ЦНС в зрелом головном мозге млекопитающих животных и человека привело не только к пересмотру представлений о структуре и деятельности ЦНС, но и значительно расширило терапевтические возможности клеточной терапии многих заболеваний головного мозга (Arsenijevic et al., 2001; Gross, 2000; Pencea et al., 2001). Показано, что судорожная эпилептическая активность в каиновой и пилокарпиновой моделях эпилепсии у крыс способствуют нейрогенезу, значительно активируя размножение предшественников и поддерживая жизнеспособность дифференцированных клеточных форм (Parent et al., 1997; Scharfman et al., 2000).

Основные сведения по изучению каиновой и пилокарпиновой моделей эпилепсии получены на крысах. Мыши, как наиболее широко используемый в настоящее время в экспериментах вид животных, вследствие относительной простоты получения генетически модифицированных линий изучены в значительно меньшей степени. Только в нескольких работах приводится сравнительная оценка повреждения нейронов и интенсивность нейрогенеза в некоторых инбредных линиях мышей (Kempermann et al., 1997; Schauwecker, Steward, 1997; Schauwecker et al., 2000). Вместе с тем изучение исходных линий мышей имеет большое значение для правильной интерпретации результатов исследования трансгенных животных и выяснения роли генов в механизмах клеточных изменений.

В работе также изучены линии генетически модифицированных мышей с различной экспрессией фермента ABAD и рецептора RAGE, а также нокаут мыши без нейропептида Y. Фермент ABAD, относящийся к суперсемейству дегидрогеназо-редуктаз, к короткоцепочным алкогольдегидрогеназо-редуктазам, находится в эндоплазматической сети и в митохондриях. Он отличается высоким сродством к амилоидному ß- пептиду и, как полагают, принимает участие в генезе болезни Альцгеймера, воспалительных и ишеми-ческих повреждениях нейронов (Yan et al., 2000). RAGE относится к рецепторам суперсемейства иммуноглобулинов, является основным рецептором конечных продуктов гликозилирования и окисления белков и липидов, образующихся в большом количестве при диабете, воспалении, болезни Альцгеймера, стрессе (Schmidt, Stern, 2000; Schmidt et al., 2000). Связь лиганда с RAGE может приводить к необратимому повреждению клеток. Анализ повреждения нейронов в линиях этих трансгенных животных позволяет не только выяснить некоторые закономерности ответной реакции клеток на перевозбуждение и определить вне- и внутриклеточные сигнальные пути, участвующие в реализации внешних воздействий, но и имеет большое значение для клинической практики.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось иммуногистохимическое изучение морфологии нейронов гиппокампа в норме и степень их повреждения при развитии эпилепсии в разных линиях ин-бредных и генетически модифицированных мышей.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

3. Изучить нейрогенез в гиппокампе в использованных моделях эпилепсии.

Научная новизна исследования.

В результате проведенных исследований получены следующие новые данные:

- каиновая кислота обладает большим тропизмом к нейронам гиппокампа мышей в сравнении с пилокарпином;

- интенсивность нейрогенеза прямо коррелирует со степенью повреждения нейронов;

- повреждение нейронов гиппокампа приводит к повышению экспрессии ABAD в нейронах и астроцитах гиппокампа;

- нокаут мыши без нейропептида Y отличается большим повреждением нейронов при введении каиновой кислоты.

Научно-практическая значимость.

Результаты паботы могут иметь практическое значение при разработке методов защиты мозга посредством активации фермента ABAD и снижения эффектов связывания лигандов с рецептором RAGE. Кроме того, повышение экспрессии нейропептида Y может способствовать сохранению нейронов при различных нейротоксических воздействиях.

Полученные данные значительно расширяют представления о генетически детерминированных свойствах инбредных линий мышей (С57В и FVB), традиционно использующихся для получения генетически модифицированных животных, и должны учитываться при анализе результатов исследования экспериментально вызванной патологии мозга. Кроме того, изученные ин-бредные линии более целесообразно использовать в разных экспериментах с генетически модифицированными мышами: С57В - при изучении токсических эффектов, a FVB - при анализе защитного действия какого-либо факто

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Инбредные линии мышей С57В и ИУВ различаются по порогу судорожной активности и степени повреждения нейронов гиппокампа при системном введении каиновой кислоты и пилокарпина.

2. Степень поражения нейронов прямо коррелирует с интенсивностью судорожного синдрома, а повреждения нейронов при введении каиновой кислоты и пилокарпина различаются.

3. Введение каиновой кислоты с развитием повреждения нейронов гиппокампа приводит к активации нейрогенеза. ра.

4. Особенности повреждения нейронов у генетически модифицированных мышей - это защитный эффект фермента ABAD и нейропептида Y, отрицательное влияние рецептора RAGE.

Апробация работы.

Основные положения и результаты работы доложены на XXIX-XXX Огаревских чтениях Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева ( Саранск, 2000-2001), конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева (Саранск, 19992000); V Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ульяновск, 2000); III Международном симпозиуме «Современные проблемы нейробио-логии» (Саранск, 2001), в материалах научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт-Петербург, 2001), на международной научной конференции, посвященной 10-летию образования медицинского факультета «Экология и здоровье человека в XXI веке» (Ульяновск, 2001).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Шиханов, Николай Павлович

выводы

1. Инбредные линии мышей C57BL/6J и FVB/NJ различаются по чувствительности к каиновой кислоте и пилокарпину. Судорожная активность развивается у С57В мышей при меньших дозах каиновой кислоты, у С57В значительно выше смертность, чем у FVB. Пилокарпин вызывает судорожную активность и эпилептический статус у мышей FVB в меньших дозах в сравнении с С57В, при аналогичных дозах смертность у С57В выше.

8. У нокаут мышей без нейропептида Y снижается эпилептогенный порог для каиновой кислоты и повышается степень повреждения нейронов гиппокампа при системном введении каиновой кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использованные в работе модели височной эпилепсии являются наиболее широко используемыми при анализе механизмов не только развития спонтанной возбудимости нейронов, но и повреждения и гибели нейронов при их перевозбуждении.

Уже отмечалось, что основная часть работ в этом направлении выполнена на крысах, мыши стали использоваться только в последнее время благодаря широкому распространению генетически модифицированных животных. В работе использованы две наиболее широко используемые в качестве исходных для получения мутационных изменений линии мышей C57B/6J и FVB/NJ.

Полученные в работе результаты подтверждают ранее установленные особенности эти линий в отношении токсического влияния каиновой кислоты (Schauwecker, Steward, 1997; Schauwecker et al., 2000) и поскольку аналогичная закономерность показана при использовании пилокарпина в качестве нейроток-сического агента позволяют заключить, что отличия связаны с генетической предрасположенностью мышей вне зависимости от природы лигандов, вызывающих повреждение клеток.

Причиной повреждения является хорошо изученный механизм кальциевой перегрузки клеток вследствие возбуждения и открытия NMDA каналов. Причиной их возбуждения может быть прямое влияние использованных лигандов, так и возбуждение, источником которого могут быть области вне гиппокампа, прежде всего энторинальная кора и амигдала. Следует отметить, что в этих областях также часто наблюдалось повреждение нейронов.

Гиппокамп является одной из наиболее хорошо изученных областей головного мозга, начиная с конца XIX века с работ К.Гольджи и Рамон-и-Кахала гиппокамп находится в центре внимания специалистов по нервной системе.

Хорошо изучены также и межнейронные взаимосвязи гиппокампа

Несмотря на детальное изучение многих вопросов нормальной организации и функционирования, механизмов изменений нейронов при патологии, конкретные молекулярные процесс, лежащие в основе даже таких хорошо казалось бы изученных процессов как длительная потенция, остаются окончательно не выясненными. Одной из основных причин недостатка информации являются трудности при "переходе" от анализа одиночной клетки с потоками информации upstream и downstream от какого-либо гена или продукта его эго экспрессии, часто воспринимаемой весьма абстрактно, к популяции, содержащей тысячи и сотни тысяч нейронов и связанных между собой еще большим числом си-наптических и электрических (типа нексусов) контактов.

Особую актуальность и внимание в последнее время приобретают факторы транскрипции и продукты генов раннего ответа. Большое число работ посвящено анализу временно-пространственной закономерности экспрессии этих агентов в гиппокампе при разнообразной патологии.

В проведенном исследовании были показаны особенности экспрессии нескольких таких факторов Egr-1, Hsp-70 и НО-1. Одним из общих заключений при анализе экспрессии этих факторов является зависимость от степени повреждения нейронов. Это представляет особый интерес поскольку реализация этих факторов определяется не только сигнальными путями одной клетки, но и совокупным влиянием клеток друг на друга и таким образом следует естественное заключении о влиянии каких-то еще не идентифицированных агентов, действие которых прямо зависит от числа поврежденных нейронов.

Полученные в работе данные показывают, что между мышами и крысами в использованных моделях имеются различия как в поведении животных во время развития судорожного синдрома, так и в качественно-количественной характеристике повреждения нейронов. Среди отмеченных выше таких отличий наибольший интерес, по нашему мнению, может иметь впервые отмеченная зависимость между интенсивностью судорожного синдрома и величиной повреждения нейронов: при развитии статуса постоянно наблюдалось повреждение CAI, поражение области САЗ и интернейронов более характерно для слабо выраженного судорожного синдрома. Является ли такая особенность только видовой в отношении влияния лигандов или отражает специфичность межнейронных связей в гиппокампе - задача последующих исследований.

В работе не ставилась задача исследовать соотношении некротической и апоптической смерти нейронов, хотя этот вопрос имеет принципиальное значение и с точки терапии поврежденных нейронов и с точки зрения прогноза течения патологии. Как уже отмечалось многие поврежденные нейроны, идентифицируемые использованными методиками, соответствовали по своему виду апоптическим тельцам.

Активация нейрогенеза при повреждении (и/или перевозбуждении) нейронов гиппокампа - хорошо известный факт, менее изученной является судьба вновь образованных нейронов и их значение в деятельности мозга (Alvarez-Buylla, Garcia-Verdugo, 2002; Gage, 2002; Gonzalez et al., 2002; Gould, Gross, 2002; Li et al., 2002; Rakic, 2002). Однако несомненно, что дальнейшие исследования в этом направлении позволять достичь огромных успехов как в лечении, так и в познании деятельности головного мозга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шиханов, Николай Павлович, Саранск

1. Анохин П.К. Биология и нейрофизиология условного рефлекса. М.: Медицина, 1968. 547 с.

2. Анохин П.К. Системогенез как общая закономерность эволюционного процесса//Избранные труды. М.: Наука, 1978. С. 125-151.

3. Артюхина Н.И. Структурно-функциональная организация нейронов и межнейронных связей. М.: Наука, 1979. 285 с.

4. Бабминдра В.П. Аксонный транспорт // Ультраструктура нейрона (транспортные процессы). М.: ВИЙЯИ. 1983. С. 27-67.

5. Бабминдра В.П. Морфология нервной системы. Л.: Наука, 1987.245 с.

6. Бабминдра В.П., Брагина Т.А. Структурные основы межнейронной организации. Л.: Наука. 1982.164 с.

7. Боголепов H.H. Ультраструктура синапсов в норме и патологии. М.: Наука, 1975. 220 с.

8. Буданцев А.Ю. Монаминэргические системы мозга. М.: Наука, 1976. 234 с.

9. Виноградова О. С. Гиппокамп и память. М.: Наука, 1975. 330 с.

10. Воробьев B.C. Цитологические основы нервной трофики // Ультраструктура нейрона (транспортные процессы). М.: ВИНИТИ, 1983. С. 68-136.

11. Гистология (введение в патологию). Под ред. Э.Г. Улумбекова и Ю.Л Челышева. М.: ГЭОТАР. 1997.

12. Глебов Р.Н., Кржижановский Г.Н. Функциональная биохимия синапсов. М.: Медицина, 1978. 326 с.

13. Квинтинский-Рыжов Ю.Н., Акмаева Н.В., Белявский В.Г., Матвиенко A.B., Степанова Л.В. Гистологическая характеристика реакций нейроглии головного мозга лабораторных животных. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии Л.: Медицина, 1990. С. 5-19.

14. Киммельберг Г.К., Норенберг М.Д. Астроциты. // В мире науки.-1989. №6. С. 32-41.

15. Кнорре А.Г., Суворова Л.В. Основные этапы дифференцировки нейрона //Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии, 1959. Т 37. С. 3-18.

16. Королева С.И., Ашмарин И.П. Нейропептид Y: его распространенность и необычная вариабельность функций. Анализ его возможных функций. Успехи физиол. Наук, 2000, Т.30. № 1. С. 31-46.

17. Корочкин Л.П. Нейрогенез и гены // Аналитические аспекты дифференцировки. М.: Наука. 1991. С. 28-56.

18. Кругликов П.И., Орлова Н.В., Стайкова Р. Катехоламинергические механизмы мозга и процессы формирования и фиксации временных связей. -В кн.: Катехоламинергические нейроны. М.: Наука, 1979. С. 86-97.

19. Леонтович Т.А. Нейронная организация подкорковых образований переднего мозга. М.: Медицина, 1978. 382 с.

20. Мак-Кей Р., Рэфф М., Рейхардт Л. Моноклональные антитела к антигенам нервной ткани. ML: Мир, 1984. 272 с.

21. Максимова E.B. Основные этапы дифференцировки нервных клеток // Онтогенез. М.: Наука, 1985. 372 с.

22. Назарян К.Б. Специфические белки нервной ткани. // Журн. нейропа-тологии и психиатрии 1978. № 2. С. 283-292.

23. Нейрохимия (под ред. И.П. Ашмарина и П.В. Стукалова) М.: Изд-во Института Биомед. Химии РАМН. 1996.

24. Нейфах A.A., Тимофеева М.Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития. М.: Наука, 1978. С. 234.

25. Немечек С. и коллектив. Введение в нейробиологию. Avicenum. Прага 1978.

26. Оленев С.Н. Дифференциация нервной ткани в культуре // Культура нервной ткани. Л.: Медицина, 1977. С. 5-62.

27. Оленев С.Н. с участием A.C. Оленева. Нейробиология Петербург. 1995.95 с.

28. Питере А., Палей С., Уэбстер Г. Ультраструктура нервной системы М.: Мир, 1972. 175 с.

29. Поляков Г.И. Основы систематики нейронов новой коры большого мозга человека. М.: Медицина. 1973

30. Резников К.Ю., Назаревская Г.Д., Дерябин В.Е. Количественный анализ мозаичного формирования нейронов в неокортексе и гиппокампе у мышей // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1987. Т. 103. № 6. С. 735738.

31. Ройтбак А.И. Физиология нейроглии. // Руководство по физиологии. Общая физиология нервной системы. Л.: Наука, 1979. С. 607-691.

32. Covolan L, Mello LETemporal profile of neuronal injury following pilocarpine or kainic acid-induced status epilepticus. Epilepsy Res. 2000 Apr;39(2): 133-52.

33. Саксен Л., Каркинен-Яскеляйнен M. Морфогенетические клеточные взаимодействия. Онтогенез, 1980. Т. 11. С. 451- 466.

34. Саркисов С.А., Боголепов H.H. Электронная микроскопия мозга. -М.: Медицина. 1967.

35. Сахаров Д.А. Генеалогия нейронов. М.: Наука, 1974. С. 183.

36. Семченко В.В., Боголепов H.H., Степанов С. С. Синаптоархитекто-ника коры большого мозга (морфометрические аспекты). Омск: ИНК "Омич", 1995.

37. Соколов E.H. Концептуальная рефлекторная дуга как принцип организации нервной системы. Вести. МГУ. Сер. 14, Психология, 1982. Вьш 1.С. 3-12.

38. Сосунов A.A., Чучков В.М, Концепции и принципы организации нервной системы. Рос. Морф. Вед., 1995. № 1. С. 57-61.

39. Сотников О.С., Богута К.К., Голубев А.И., Миничев Ю.С. Механизмы структурной пластичности нейронов и филогенез нервной системы. СПб. Наука, 1994.

40. Хэм А., Кормак Д. Гистология. М.: Мир. 1982.Т1,270с.

41. Челышев Ю.А. Факторы поддержания регенерации периферических нервов. Успехи физиологических наук. 1995. Т. 26. № 3. С. 57 77.

42. Челышев Ю.А., Черепнев Г.В., Сайткулов К.И. Апоптоз в нервной системе. Онтогенез. 2001. Т.32 (2) С. 118-129

43. Шаде Дж. и Форд Д. Основы неврологии. М.: Мир. 1976.

44. Шеперд Г. Нейробиология (в двух томах) М.: Мир. 1987.

45. Шулейкина К.В. Структура и функция развивающегося нейрона. В кн.: Нейронные механизмы развивающегося мозга. М.: Наука, 1979. С. 24-42.

46. Alvarez-Buylla A, Garcia-Verdugo JМ.Neurogenesis in adult subven-tricular zone. J Neurosci. 2002 Feb 1;22 (3): 629-34. Review. No abstract available.

47. Amenta F, Bronzetti E, Sabbatini M, Vega JA.Astrocyte changes in aging cerebral cortex and hippocampus: a quantitative immunohistochemical study. Mi-crosc Res Tech. 1998 Oct l;43(l):29-33.

48. Anderova M, Kubinova S, Mazel T, Chvatal A, Eliasson C, Pekny M, Sykova E.Effect of elevated K(+), hypotonic stress, and cortical spreading depression on astrocyte swelling in GFAP-deficient mice. Glia. 2001 Sep;35(3): 189-203.

49. Arsenijevic Y, Villemure JG, Brunet JF, Bloch JJ5 Deglon N, Kostic C, Zurn A, Aebischer P.Isolation of multipotent neural precursors residing in the cortex of the adult human brain. Exp Neurol. 2001 Jul;170(l):48-62.

50. Bing C, Wang W, Pickavance L, Williams G.The central regulation of energy homeostasis: roles of neuropeptide Y and other brain peptides. Biochem Soc Trans. 1996 May;24(2):559-65.

51. Buckmaster PS, Dudek FE.Neuron loss, granule cell axon reorganization, and functional changes in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats. J Comp Neurol. 1997 Sep l;385(3):385-404.

52. Budd RC.Activation-induced cell death. Curr Opin Immunol. 2001 Jun;13(3):356-62.

53. Bushong EA, Martone ME, Jones YZ, Ellisman MH.Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. J Neurosci. 2002 Jan 1 ;22(1): 183-92.

54. Carmody RJ, Cotter TG.Signalling apoptosis: a radical approach. Redox Rep. 2001;6(2):77-90.

55. Carpenter MK, Inokuma MS, Denham J, Mujtaba T, Chiu CP, Rao MS.Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp Neurol. 2001 Dec;172(2):383-97.

56. Chelyshev IuA, Cherepnev GV, Saitkulov KI. Apoptosis in the nervous system. Ontogenez. 2001 Mar-Apr;32(2):l 18-29.

57. Cherubini E, Rovira C, Ben-Ari Y, Nistri A. Effects of kainate on the excitability of rat hippocampal neurones. Epilepsy Res. 1990 Jan-Feb;5(l): 18-27.

58. Clarke SR, Shetty AK, Bradley JL, Turner DA.Reactive astrocytes express the embryonic intermediate neurofilament nestin. Neuroreport. 1994 Oct 3;5(15): 1885-8.

59. Colmers WF, Bleakman D.Effects of neuropeptide Y on the electrical properties of neurons. Trends Neurosci. 1994 Sep;17(9):373-9.

60. Cooper AJ.Role of glutamine in cerebral nitrogen metabolism and ammonia neurotoxicity. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 2001;7(4):280-6.

61. Covolan L, Ribeiro LT, Longo BM, Mello LE.Cell damage and neurogenesis in the dentate granule cell layer of adult rats after pilocarpine- or kainate-induced status epilepticus. Hippocampus. 20006; 10(2): 169-80.

62. Covolan L, Smith RL, Mello LE.Ultrastructural identification of dentate granule cell death from pilocarpine-induced seizures. Epilepsy Res. 2000a, 41(1):9-21.

63. Cowan WM, Kandel ER.Prospects for neurology and psychiatry. JAMA. 2001 Feb 7;285(5):594-600.

64. Croom J, Taylor IL.Neuropeptide Y, peptide YY and aluminum in Alzheimer's disease: is there an etiological relationship? J Inorg Biochem. 2001 Nov;87(l-2):51-6.

65. D.B. Clifford, J.W. Olney, A.M. Benz, T.A. Fuller and C.F. Zorumski, Ketamine, phencyclidine and MK-801 protect against kainic acid-induced seizure-related brain damage. Epilepsia 31 (1990), pp. 382-390

66. D.G. Fujikawa, A.H. Daniels and J.S. Kim, The competitive NMDA-receptor antagonist CGP 40116 protects against status epilepticus-induced neuronal damage. Epilepsy Res. 17 (1994), pp. 207-219

67. DePrato Primeaux S, Holmes PV, Martin RJ, Dean RG, Edwards GL.Experimentally induced attenuation of neuropeptide-Y gene expression in transgenic mice increases mortality rate following seizures. Neurosci Lett. 2000 Jun 16;287(l):61-4.

68. Donato R.S100: a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type with intracellular and extracellular functional roles. Int J Biochem Cell Biol. 2001 Jul;33(7):637-68

69. Dube C, da Silva Fernandes MJ, Nehlig A.Age-dependent consequences of seizures and the development of temporal lobe epilepsy in the rat. Dev Neurosci. 2001 ;23(3):219-23.

70. Duggal N, Iskander S, Hammond RR.Nestin expression in cortical dysplasia. J Neurosurg. 2001 Sep;95(3):459-65.

71. El Bahh B, Auvergne R, Lere C, Brana C, Le Gal La Salle G, Rougier A.Decreased epileptic susceptibility correlates with neuropeptide Y overexpression in a model of tolerance to excitotoxicity. Brain Res. 2001 Mar 16;894(2):209-17.

72. Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL.Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 2000 Oct;25(9-10): 1439-51.

73. Ferraro TN, Golden GT, Smith GG, St Jean P, Schork NJ, Mulholland N, Ballas C, Schill J, Buono RJ, Berrettini WH. Mapping loci for pentylenetetrazol-induced seizure susceptibility in mice. J Neurosci. 1999 Aug 15;19(16):6733-9.

74. Frerking M, Malenka RC, Nicoll RA.ynaptic activation of kainate receptors on hippocampal interneurons. Nat Neurosci. 1998 Oct;l(6):479-86.

75. Fritschy JM, Kiener T, Bouilleret V, Loup F.GABAergic neurons and GABA(A)-receptors in temporal lobe epilepsy. Neurochem Int. 1999 May;34(5):435-45.

76. Fujikawa DG, Shinmei SS, Cai B.Kainic acid-induced seizures produce necrotic, not apoptotic, neurons with internucleosomal DNA cleavage: implications for programmed cell death mechanisms. Neuroscience. 2000;98(l):41-53.

77. Furtinger S, Pirker S, Czech T, Baumgartner C, Ransmayr G, Sperk G.Plasticity of Y1 and Y2 receptors and neuropeptide Y fibers in patients with temporal lobe epilepsy. J Neurosci. 2001 Aug 1;21(15):5804-12.

78. Furuta A, Rothstein JD, Martin LJ.Glutamate transporter protein subtypes are expressed differentially during rat CNS development. J Neurosci. 1997 Nov l;17(21):8363-75.

79. Gage FH.Neurogenesis in the adult brain. J Neurosci. 2002 Feb l;22(3):612-3. Review. No abstract available.

80. Garbelli R, Munari C, De Biasi S, Vitellaro-Zuccarello L, Galli C, Bramerio M, Mai R, Battaglia G, Spreafico R.Taylor's cortical dysplasia: a confo-cal and ultrastructural immunohistochemical study. Brain Pathol. 1999 Jul;9(3):445-61.

81. Golden GT, Ferraro TN, Smith GG, Snyder RL, Jones NL, Berrettini WH.Acute cocaine-induced seizures: differential sensitivity of six inbred mouse strains. Neuropsychopharmacology. 2001 Mar;24(3):291-9.

82. Gonzalez CL, Gibb R, Kolb B.Functional recovery and dendritic hypertrophy after posterior and complete cingulate lesions on postnatal day 10. Dev Psychobiol. 2002 Mar;40(2): 138-46.

83. Gould E, Gross CG.Neurogenesis in adult mammals: some progress and problems. J Neurosci. 2002 Feb 1;22(3):619-23. Review. No abstract available.

84. Griffin WS, Yeralan O, Sheng JG, Boop FA, Mrak RE, Rovnaghi CR, Burnett BA, Feoktistova A, Van Eldik LJ.Overexpression of the neurotrophic cytokine SI00 beta in human temporal lobe epilepsy. J Neurochem. 1995 Jul;65(l):228-33.

85. Gross CG.Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat Rev Neurosci. 2000 Oct;l(l):67-73. Review.

86. Gruenthal M, Armstrong DR, Ault B, Nadler JV.Comparison of seizures and brain lesions produced by intracerebroventricular kainic acid and bicuculline methiodide. Exp Neurol. 1986 Sep;93(3):621-30.

87. Hajos F, Zilles K.Areas of dormant glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity in the rat brain as revealed by automated image analysis of serial coronal sections. Neurobiology (Bp). 1995;3(1):3-11.

88. Hamilton SE, Schlador ML, McKinnon LA, Chmelar RS, Nathanson NM.Molecular mechanisms for the regulation of the expression and function of muscarinic acetylcholine receptors. J Physiol Paris. 1998 Jun-Aug;92(3-4):275-8.

89. Hassel B.Carboxylation and anaplerosis in neurons and glia. Mol Neuro-biol. 2000 Aug-Dec;22( 1 -3):21 -40.

90. Herx LM, Yong VW.Interleukin-1 beta is required for the early evolution of reactive astrogliosis following CNS lesion. J Neuropathol Exp Neurol. 2001 0ct;60(10):961-71.

91. Holden C.Stem cell research. Primate parthenotes yield stem cells. Science. 2002 Feb l;295(5556):779-80.

92. Holmin S, von Gertten C, Sandberg-Nordqvist AC, Lendahl U, Mathiesen T.Induction of astrocytic nestin expression by depolarization in rats. Neurosci Lett. 2001 Nov 16;314(3): 151-5.

93. Hu RQ, Koh S, Torgerson T, Cole AJ.Neuronal stress and injury in C57/BL mice after systemic kainic acid administration. Brain Res. 1998 Nov 9;810(l-2):229-40.

94. Kandel ER, Squire LR.Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 2000 Nov 10;290(5494):1113-20.

95. Kempermann, G., Kuhn, H.G. and Gage, F.H., 1997. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, pp. 10409-10414.

96. Kerfoot C, Vinters HV, Mathern GW.Cerebral cortical dysplasia: giant neurons show potential for increased excitation and axonal plasticity. Dev Neurosci. 1999 Nov;21 (3-5):260-70.

97. Kullmann DM.Presynaptic kainate receptors in the hippocampus: slowly emerging from obscurity. Neuron. 2001 Nov 20;32(4):561-4.

98. Lee MC, Rho JL, Kim MK, Woo YJ, Kim JH, Nam SC, Suh JJ, Chung WK, Moon JD, Kim HI. c-Jun expression and apoptotic cell death in kainate-induced temporal lobe epilepsy. J Korean Med Sci. 2001 Oct;16(5):649-56.

99. Lee SK, Choe G, Hong KS, Nam HW, Kim JY, Chung CK, Lee DS, Chang KH.Neuroimaging findings of cortical dyslamination with cytomegaly. Epilepsia. 2001 Jul;42(7):850-6.

100. Lemkine GF, Mantero S, Migne C, Raji A, Goula D, Normandie P, Levi G, Demeneix BA.Preferential transfection of adult mouse neural stem cells and their immediate progeny in vivo with polyethylenimine. Mol Cell Neurosci. 2002 Feb;19(2):165-74.

101. Lepekhin EA, Eliasson C, Berthold CH, Berezin V, Bock E, Pekny M.Intermediate filaments regulate astrocyte motility. J Neurochem. 2001 Nov;79(3):617-25.

102. Li Z, Kato T, Kawagishi K, Fukushima N, Yokouchi K, Moriizumi T.Cell dynamics of calretinin-immunoreactive neurons in the rostral migratory stream after ibotenate-induced lesions in the forebrain.Neurosci Res. 2002 Feb;42(2):123-32.

103. Lim DA, Alvarez-Buylla A.Interaction between astrocytes and adult sub-ventricular zone precursors stimulates neurogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jun 22;96(13):7526-31.

104. Liu D, Smith CL, Barone FC, Ellison JA, Lysko PG, Li K, Simpson I A. Astrocytic demise precedes delayed neuronal death in focal ischemic rat brain. Brain Res Mol Brain Res. 1999 May 7;68(l-2):29-41.

105. Liu J, Solway K, Messing RO, Sharp FR.Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci. 1998 Oct l;18(19):7768-78.

106. Malhotra SK, Privat A, Gage FH.Reactive astrocytes: cellular and molecular cues to biological function. Trends Neurosci. 1997 Dec;20(12):570-7.

107. Menet V, Gimenez Y Ribotta M, Sandillon F, Privat A.GFAP null astrocytes are a favorable substrate for neuronal survival and neurite growth. Glia. 2000 Sep;31(3):267-72.

108. Molmin S, von Gertten C, Sandberg-Nordqvist AC, Lendahl U, Mathiesen T.Induction of astrocytic nestin expression by depolarization in rats. Neurosci Lett. 2001 Nov 16;314(3): 151-5.

109. Nilsson M, Perfilieva E, Johansson U, Orwar O, Eriksson PS.Enriched environment increases neurogenesis in the adult rat dentate gyrus and improves spatial memory. J Neurobiol. 1999 Jun 15;39(4):569-78.

110. Nishio S, Morioka T, Hisada K, Fukui M.Temporal lobe epilepsy: a clini-copathological study with special reference to temporal neocortical changes. Neu-rosurg Rev. 2000 Jun;23(2):84-9.

111. Noctor SC, Flint AC, Weissman TA, Dammerman RS, Kriegstein AR.Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 2001 Feb 8;409(6821):714-20.

112. Norton WT.Cell reactions following acute brain injury: a review. Neuro-chemRes. 1999 Feb;24(2):213-8.

113. Palmer TD, Willhoite AR, Gage FH. Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis. J Comp Neurol. 2000 Oct 2;425(4):479-94.

114. Parent JM, Janumpalli S, McNamara JO, Lowenstein DH. Increased dentate granule cell neurogenesis following amygdala kindling in the adult rat. Neurosci Lett. 1998 May 8;247(1):9-12.

115. Pencea V, Bingaman KD, Freedman LJ, Luskin MB.Neurogenesis in the subventricular zone and rostral migratory stream of the neonatal and adult primate forebrain.Exp Neurol. 2001 Nov;172(l):l-16.

116. Pfeiffer B, Meyermann R, Hamprecht B.Immunohistochemical co-localization of glycogen phosphorylase with the astroglial markers glial fibrillary acidic protein and S-100 protein in rat brain sections. Histochemistry. 1992;97(5):405-12.

117. Pinto SS, Gottfried C, Mendez A, Goncalves D, Karl J, Goncalves CA, Wofchuk S, Rodnight R.Immunocontent and secretion of S100B in astrocyte cultures from different brain regions in relation to morphology. FEBS Lett. 2000 Dec 15;486(3):203-7.

118. Piper DR, Mujtaba T, Keyoung H, Roy NS, Goldman SA, Rao MS, Lucero MT. Identification and characterization of neuronal precursors and their progeny from human fetal tissue. J Neurosci Res. 2001 Nov l;66(3):356-68.

119. Pollard H, Charriaut-Marlangue C, Cantagrel S, Represa A, Robain O, Moreau J, Ben-Ari Y. Kainate-induced apoptotic cell death in hippocampal neurons. Neuroscience. 1994 Nov;63(l):7-18.

120. Products with their receptors/binding proteins. J. Biol. Chem. 269: 98899897.

121. R.G. Fariello, G.T. Golden, G.G. Smith and P.F. Reyes, Potentiation of kainic acid epileptogenicity and sparing from neuronal damage by an NMDA receptor antagonist. Epilepsy Res. 3 (1989), pp. 206-213

122. Rakic P.Adult neurogenesis in mammals: an identity crisis. J Neurosci. 2002 Feb l;22(3):614-8. Review. No abstract available.

123. Rao VL, Baskaya MK, Dogan A, Rothstein JD, Dempsey RJ.Traumatic brain injury down-regulates glial glutamate transporter (GLT-1 and GLAST) proteins in rat brain. J Neurochem. 1998 May;70(5):2020-7.

124. Reibel S, Nadi S, Benmaamar R, Larmet Y, Carnahan J, Marescaux C, Depaulis A.Neuropeptide Y and epilepsy: varying effects according to seizure type and receptor activation. Peptides. 2001 Mar;22(3):529-39.

125. Robinson SR. Changes in the cellular distribution of glutamine synthetase in Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 2001 Dec l;66(5):972-80.

126. Roy M. and Sapolsky R. (1999) Neuronal apoptosis in acute necrotic insults: why is this subject such a mess? Trends Neurosci., 22:419-422.

127. Sadowski M, Wisniewski HM, Jakubowska-Sadowska K, Tarnawski M, Lazarewicz JW, Mossakowski MJ. Pattern of neuronal loss in the rat hippocampus following experimental cardiac arrest-induced ischemia. J Neurol Sci. 1999 Sep 15;168(1): 13-20.

128. Sater RA, Nadler JV. On the relation between seizures and brain lesions after intracerebroventricular kainic acid. Neurosci Lett. 1988 Jan 1 l;84(l):73-8.

129. Schafer BW, Heizmann CW.The SI00 family of EF-hand calcium-binding proteins: functions and pathology. Trends Biochem Sci. 1996 Apr;21(4): 134-40

130. Schauwecker P.E. Genetic analysis of excitotoxic cell death in sensitive and resistant strains of mice. In: Abstracts of Society for Neuroscience's 31st Annual Meeting. San Diego, CA November 10 15, 2001. P. 346.

131. Schauwecker PE, Ramirez JJ, Steward O. Genetic dissection of the signals that induce synaptic reorganization. Exp Neurol. 2000 Jan;161(l): 139-52.

132. Schauwecker PE, Steward O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: implications for gene targeting approaches. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Apr 15;94(8):4103-8.

133. Schmidt AM, Stern DM.Receptor for age (RAGE) is a gene within the major histocompatibility class III region: implications for host response mechanisms in homeostasis and chronic disease. Front Biosci. 2001 Oct 1;6:D1151-60.

134. Schmidt AM, Yan SD, Wautier JL, Stern D.Activation of receptor for advanced glycation end products: a mechanism for chronic vascular dysfunction in diabetic vasculopathy and atherosclerosis. Circ Res. 1999 Mar 19;84(5):489-97.

135. Schmidt AM, Yan SD, Yan SF, Stern DM.The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory responses. J Clin Invest. 2001 Oct;108(7):949-55

136. Schmidt-Kastner R, Szymas J. Immunohistochemistry of glial fibrillary acidic protein, vimentin and S-100 protein for study of astrocytes in hippocampus of rat. J Chem Neuroanat. 1990 May-Jun;3(3):l 79-92.

137. Schubert P, Ogata T, Marchini C, Ferroni S.Glia-related pathomecha-nisms in Alzheimer's disease: a therapeutic target? Mech Ageing Dev. 2001 Dec;123(l):47-57. '

138. Scott BW, Wang S, Burnham WM, De Boni U, Wojtowicz JM.Kindling-induced neurogenesis in the dentate gyrus of the rat. Neurosci Lett. 1998 May 29;248(2):73-6.

139. Seri B, Garcia-Verdugo JM, McEwen BS, Alvarez-Buylla A.Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci. 2001 Sep 15;21(18):7153-60.

140. Shuttleworth CW, Connor JA.Strain-dependent differences in calcium signaling predict excitotoxicity in murine hippocampal neurons. J Neurosci. 2001 Jun 15;21(12):4225-36.

141. Silva JG, Mello LE.The role of mossy cell death and activation of protein synthesis in the sprouting of dentate mossy fibers: evidence from calretinin and neo-timm staining in pilocarpine-epileptic mice. Epilepsia. 2000;41 Suppl 6.S18-23.

142. Spreafico R, Battaglia G, Arcelli P, Andermann F, Dubeau F, Palmini A, Olivier A, Villemure JG, Tampieri D, Avanzini G, Avoli M.Cortical dysplasia: an immunocytochemical study of three patients. Neurology. 1998 Jan;50(l):27-36.

143. Spreafico R, Tassi L, Colombo N, Bramerio M, Galli C, Garbelli R, Fer-rario A, Lo Russo G, Munari C.Inhibitory circuits in human dysplastic tissue. Epilepsia. 2000;41 Suppl 6:S 168-73.

144. Sugawara T, Noshita N, Lewen A, Kim GW, Chan PH.Neuronal expression of the DNA repair protein Ku 70 after ischemic preconditioning corresponds to tolerance to global cerebral ischemia. Stroke. 2001 ()ct;32(10):2388-93.

145. Szot P, White SS, McCarthy EB, Turella A, Rejniak SX, Schwartzkroin PAioBehavioral and metabolic features of repetitive seizures in immature and mature rats. Epilepsy Res. 2001 Sep;46(3): 191-203.

146. Tassi L, Pasquier B, Minotti L, Garbelli R, Kahane P, Benabid AL, Batta-glia G, Munari C, Spreafico R.Cortical dysplasia: electroclinical, imaging, and neuropathologic study of 13 patients. Epilepsia. 2001 Sep;42(9):l 112-23.

147. Taylor JP, Sater R, French J, Baltuch G, Crino PB.Transcription of intermediate filament genes is enhanced in focal cortical dysplasia. Acta Neuropathol (Berl). 2001 Aug;102(2):141-8.

148. Umeoka S, Miyamoto O, Nakagawa T, Janjua NA, Nagao S, Itano T.Expression of an embryonic intermediate filament protein in amygdaloid kindled rats. Epilepsy Res. 2001 Mar;43(3):249-53.

149. Vicario-Abejon C, Collin C, Tsoulfas P, McKay RD.Hippocampal stem cells differentiate into excitatory and inhibitory neurons. Eur J Neurosci. 2000 Feb;12(2):677-88.

150. Walz W, Lang MK. Immunocytochemical evidence for a distinct GFAP-negative subpopulation of astrocytes in the adult rat hippocampus. Neurosci Lett. 1998 Dec 4;257(3):127-30.

151. Walz W.Controversy surrounding the existence of discrete functional classes of astrocytes in adult gray matter. Glia. 2000 Aug;31(2):95-103.

152. Werner P, Pitt D, Raine CS.Multiple sclerosis: altered glutamate homeostasis in lesions correlates with oligodendrocyte and axonal damage. Ann Neurol. 2001 Aug;50(2): 169-80.

153. Wu VW, Schwartz JP.Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neurosci Res. 1998 Mar 15;51(6):675-81.

154. Yan SD, Roher A, Chaney M, Zlokovic B, Schmidt AM, Stern D.Cellular cofactors potentiating induction of stress and cytotoxicity by amyloid beta-peptide. Biochim Biophys Acta. 2000 Jul 26; 1502(1): 145-57. Review.

155. Yan, S. D., A. M. Schmidt, G. M. Anderson, J. Zhang, J. Brett, Y. S. Zou, D. Pinsky, and D. Stern. 1994. Enhanced cellular oxidant stress by the interaction of advanced glycation end

156. Yin L, Sun M, Ilic Z, Leffert HL, Sell S.Derivation, characterization, and phenotypic variation of hepatic progenitor cell lines isolated from adult rats. Hepatology. 2002 Feb;35(2):315-24.

157. Zhou M, Kimelberg HK.Freshly isolated hippocampal CAI astrocytes comprise two populations differing in glutamate transporter and AMPA receptor expression. J Neurosci. 2001 Oct 15;21(20):7901-8.

158. Zhou M, Schools GP, Kimelberg HK.GFAP mRNA positive glia acutely isolated from rat hippocampus predominantly show complex current patterns. Brain Res Mol Brain Res. 2000 Mar 10;76( 1): 121 -31.

159. Zilles K, Hajos F, Kalman M, Schleicher A.Mapping of glial fibrillary acidic protein-immunoreactivity in the rat forebrain and mesencephalon by computerized image analysis. J Comp Neurol. 1991 Jun 15;308(3):340-55.

Информация о работе

Шиханов, Николай Павлович
кандидата медицинских наук
Саранск, 2002
ВАК 03.00.25

Диссертация

Сравнительный анализ повреждения нейронов в разных линиях инбредных и генетически модифицированных мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы