Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная топография экспрессии гена c-fos в мозге мышей линий C57BL/6 и 129Sv при обучении в задаче условно-рефлекторного замирания

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная топография экспрессии гена c-fos в мозге мышей линий C57BL/6 и 129Sv при обучении в задаче условно-рефлекторного замирания"

На правах рукописи УДК 612.833

Зворыкина Светлана Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА с-О В МОЗГЕ МЫШЕЙ ЛИНИЙ C57BL/6 И 129Sv ПРИ ОБУЧЕНИИ В ЗАДАЧЕ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОГО ЗАМИРАНИЯ

03.00.13 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Отделе системогенеза ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

член-корреспондент РАМН Константин Владимирович Анохин

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Ольга Николаевна Серова

кандидат биологических наук Марина Григорьевна Плескачева

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится 19 мая 2005 г. в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д 002.08.01

при ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН,

Адрес: Москва, ул. Моховая 11, строение 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ НФ им. П.К.Анохина РАМН.

Автореферат разослан 16 апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук

В.А. Гуменюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Известно, что животные разных инбредных линий имеют различные способности к обучению, и поведение их в одних же задачах различается (Vadasz et al., 1992; Crawley, 1997; Montkowski et al., 1997; Contet et al., 2001; Brooks et al., 2004). Подтверждением тому, что генетические факторы играют в этих различиях большую роль, служат данные по селекции на способность и неспособность к определенным видам научения (Тгуоп, 1942; Cooper, Zubek, 1958; Gentsch et al., 1988). Однако нервный субстрат подобных генетических различий изучен недостаточно.

Генетические факторы могут проявляться, в частности, в том, что при решении одних и тех же задач у разных животных оказывается вовлеченным разное количество нейронов в одних и тех же структурах мозга (Ward et al., 1998). Исходя из этого, можно предположить, что мыши инбредных линий, демонстрирующие различия в обучении, например линий C57BL/6 и 129Sv, (Montkowski et al., 1997 Contet et al., 2001), будут различаться составом и числом нейронов, вовлекаемых в разных структурах мозга в процессы обучения.

Экспериментальная проверка этого предположения требует регистрации активности большого числа нейронов у животных разных инбредных линий в одной и той же задаче обучения. Такую возможность предоставляет методика картирования активации нервных клеток при обучении по экспрессии в них индуцируемых транскрипционных факторов. Этот метод служит информативным приемом выявления нейрональных субстратов. обучения и формирования памяти (Анохин, 1989; Dragunow, 1996; Анохин, 1997; Herdegen, Leah, 1998; Tischmeyer, Grimm, 1999; Clayton, 2000; Kaczmarek, 2002; Guzowski, 2002).

Для сравнительного анализа нейронального обеспечения обучения у генетически различных животных требуется задача, в которой транскрипционную активность нейронов можно было бы оценить после однократного сеанса обучения, дающего выраженные и долговременные изменения поведения. Этим условиям удовлетворяет поведенческая модель выработки у мышей и крыс условного рефлекса замирания, получившая в англоязычной литературе название «cued and contextual fear conditioning» (Fanselow, 1980). Эта модель основана на способности животных ассоциировать электрокожное раздражение с обстановкой экспериментальной камеры, в которой они его получили, и звуковым сигналом, предшествовавшим удару током. В результате такого однократного обучения животные замирают при следующем помещении в данную обстановку или же при предъявлении звукового условного сигнала в иной обстановке (Fanselow, 1980; Radulovic, 1998; Sanders et al., 2002).

В настоящей работе экспрессия индуцируемого транскрипционного фактора c-Fos при выработке условнорефлекторного замирания у мышей линий C57BL/6 и 129Sv исследовалась в трех областях мозга: гиппокампе, медиальной лимбической и моторной коре.

Гиппокамп и медиальная лимбическая кора были выбраны как структуры, принимающие непосредственное участие в обеспечении условно-рефлекторного замирания - повреждение этих структур приводит к модификациям или нарушению воспроизведения данного навыка (Kim et al., 1992; Young et al, 1994; Frysztak, Neafsey, 1994; Morgan, Le Doux, 1995; Maren et al., 1997; Anagnostaraset al, 1999; Sanders et al., 2002).

Кроме того, известно, что медиальная лимбическая кора обладает выраженной нейрогенетической (Bayer, 1990), морфологической (Zeng, 1991) и функциональной (Nauta, 1972; Vogt et al, 1992; Баклаваджян с соавт., 2000) гетерогенностью. Эту область коры головного мозга традиционно относят к структурам, регулирующим эмоциональное поведение и необходимым для обучения (MacLean, 1949; Vogt, 1992; Duncan et al., 1996; Joel et al., 1997), однако роль ее различных отделов в процессах обучения остается предметом обсуждения (Divac et al., 1984; Frysztak, Neafsey, 1994; Vogt, 1992; Morgan, LeDoux, 1995). Поэтому в настоящей работе представлялось важным изучить вовлечение нейронов разных участков этой структуры в обучение условно-рефлекторному замиранию.

Поскольку формирование пассивно-оборонительного поведения включает в себя изменения в двигательной активности животных, можно ожидать, что при данном обучении могут происходить пластические изменения и в нейронах моторной коры. Данная структура организована соматотопически, что несомненно требует анализа экспрессии c-Fos на всем ее ростро-каудальном протяжении.

Цель и задачи исследования

Цель работы - изучить вовлечение нейронов коры головного мозга и гиппокампа у мышей инбредных линий C57BL/6 и 129Sv в процессы обучения условно-рефлекторному замиранию.

Задачи:

1. Исследовать различия поведения мышей линий С57В1/6 и 129Sv при обучении в модели условно-рефлекторного замирания.

2. Сравнить у мышей двух данных линий число и топографию распределения нейронов, экспрессирующих c-Fos в медиальной лимбической коре, моторной коре и в гиппокампе после обучения.

3. Сопоставить различия экспрессии c-Fos в мозге мышей С57В1/6 и 129Sv с отличиями в их поведении при выработке и воспроизведении условно-рефлекторного замирания.

Основные результаты и их научная новизна

Исследование поведения мышей линий С57В1/6 и 1298у при обучении в модели условно-рефлекторного замирания и в последующих тестированиях показало, что у обеих линий в результате обучения формируется замирание на условные и обстановочные сигналы, однако существуют межлинейные различия в динамике формирования и угасания этого поведения. У мышей линии С57БЬ/6 замирание наблюдалось уже к концу сеанса обучения, а у 1298у еще нет. При повторном помещении в экспериментальную камеру (тест на обстановочные сигналы) в ходе тестирования у С57В1/6 наблюдалась отчетливая тенденция к снижению длительности замирания и достоверное увеличение двигательной активности, а у 1298у длительность замираний возросла. Таким образом, на завершающем этапе теста на обстановочные условные сигналы длительность замирания у мышей линии 1298у была достоверно выше, чем у С57В1/6.

Обнаружено снижение исследовательской активности мышей из групп активного контроля обеих линий при их повторном помещении в экспериментальную камеру.

Таким образом, поведенческие эксперименты выявили, что процессы формирования и угасания условно-рефлекторного замирания у мышей подвержены влиянию генетических факторов и протекают у мышей линии 1298у медленнее, чем у С57В1/6, а запоминание обстановки эксперимента происходит не только у мышей из группы обучения, но и у животных из группы активного контроля.

С помощью картирования экспрессии индуцируемого транскрипционного фактора с-Бс« были изучены особенности активации областей ГОЛОЁНОГО мозга у мышей двух разных линий при выработке условно-рефлекторного замирания.

Выяснено, что у мышей линии 1298у увеличение экспрессии с-Бс« при обучении наблюдается в большем числе исследованных областей, чем у С57В1/6. Установлено также, что во вторичной моторной коре у мышей линии 1298у при обучении происходит достоверно более высокая экспрессия с-Бс«, чем у С57В1/6.

Обнаружено, что исследованные структуры (гиппокамп, моторная и медиальная лимбическая кора) неоднородны по показателю активации с-Бс« при обучении: в разных отделах исследованных структур наблюдалось различное количество активированных нейронов. Эти неоднородности наблюдались как в мозге мышей из групп обучения, так и активного контроля.

Впервые обнаружен ростро-каудальный градиент экспрессии с-Бс« в моторной коре в условиях обучения, а также разнонаправленные ростро-каудальные градиенты индукции с-Бс« в при обучении в разных отделах гиппокампа (возрастание в ростро-каудальном направлении в области СА1 и снижение в САЗ).

Сопоставление поведения и топографии экспрессии c-Fos у животных разных экспериментальных групп позволило установить диссоциацию вовлечения исследованных областей мозга в ориентировочно-исследовательское и пассивно-оборонительное поведение у мышей.

Научно-практическое значение

Результаты данной работы вносят вклад в понимание нейробиологических основ генетических различий при обучении и формировании памяти. Они показывают, что у животных разных инбредных линий одна и та же задача обучения вызывает транскрипционную активацию различного числа нейронов в головном мозге.

Обнаруженная неравномерность экспрессии c-Fos внутри структур головного мозга при обучении открывает возможность использовать экспрессию с-Fos для изучения функциональной гетерогенности анатомических структур мозга.

Подробное описание особенностей поведения и функциональное картирование мозга мышей линий С57В1/6 и 129Sv представляет практическую важность для трансгенных исследований поведения, поскольку эти линии используются как базовые для получения направленных мутаций генов, экспрессирующихся в нервной системе.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2001, 2003, 2004); на конференции молодых ученых НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (Москва, 2001); на 2-й международной конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); на Центрально-Европейском конгрессе по нейробиологии (Краков, Польша, 2001); на XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, (Казань, 2001); на конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ - ВУЗ - клиника» (Москва, 2002), на IV международном конгрессе польского общества нейронаук (Варшава, Польша 2003) и на международном симпозиуме IBRO «Дифференциация нейронов и пластичность - регуляция внутриклеточными сигналами» (Москва, 2003). Материалы диссертации были апробированы на заседании отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина 11 июня 2004 г.

Структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты, обсуждение и выводы. Рукопись включает страниц машинописного текста, 15 рисунков и 7 таблиц. Список цитируемой литературы включает 122 наименований, из них 20 на русском и 102 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали мышей-самцов инбредных линий C57BL/6 (n=66) и 129Sv,(n=64), массой 25-30г, в возрасте 3-3.5 мес. В течение всего периода содержания животные находились в стандартных клетках (370 х 210 х 155 мм), со свободным доступом к корму и воде. Самцов 129Sv отбирали из потомства от инбредного разведения мышей, полученных из клиники лабораторных животных Института биофизической химии им. М.Планка (Германия). Мышей линии C57BL/6 получали из питомника «Столбовая» (филиал ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАМН) не менее чем за месяц до начала эксперимента, чтобы условия содержания животных обеих линий были сходными.

Процедура обучения и тестирования

Эксперимент начинался с хендлинга животных (по 5 мин в течение 3-х дней). На 4-й день для обучения условно-рефлекторному замиранию животных помещали в пластиковую камеру (20х30х20см) с тремя непрозрачными и одной прозрачной стенами и решетчатым электродным полом и через 2 мин включали на 30 с звуковой сигнал (10 кГц, 70 дБ), который на фоне последних 2 с звучания сопровождался электрокожным раздражением (0.7 mА). Мышь извлекали из экспериментальной камеры через 30 с и возвращали в домашнюю клетку. Животных из группы активного контроля помещали в экспериментальную камеру на 3 мин без предъявления звука и тока.

Через 80 мин от начала обучения животных тестировали. Одних животных из каждой группы помещали на 6 мин в ту же экспериментальную камеру (тест на условные обстановочные сигналы), а других высаживали в новую для них среду (прозрачную пластиковую камеру 20x26x14см, с гладким полом, освещенную красной лампой) и после 3 мин ознакомления на 3 мин включали звук (тест на условный звуковой сигнал). Регистрировали длительности замираний (определяемых как отсутствие у животного любых движений, кроме дыхательных), локомоций, стоек на задних лапах и груминга. Все поведенческие показатели были выражены в процентах от длительности соответствующих периодов обучения и тестирований.

Немедленно по окончании теста (через 90 минут после начала обучения) часть животных из групп обучения и активного контроля декапитировали. Мышей из группы пассивного контроля декапитировали сразу после извлечения их из домашней клетки. Извлеченные мозги замораживали в жидком азоте.

Общая схема экспериментальной процедуры и количественный состав экспериментальных групп показаны на рис. 1.

Иммуногистохимия

С каждого мозга с помощью криостата было получено по 28 фронтальных срезов толщиной 20 мкм, собранных с шагом в 200 мкм. Иммуногистохимическое выявление c-Fos-позитивных нейронов проводили по протоколу авидин-биотин-пироксидазного иммунногистохимического набора ("Vector Laboratories", США) с использованием поликлональных кроличьих антител к c-Fos ("Calbiochem", Ab-5 Cat. №РС38,США).

Дни: 1-3

90 мин

Рис.1 Схема эксперимента и состав экспериментальных групп

Количественный анализ экспрессии c-Fos

Срезы оцифровывали при увеличении х12,5 на бинокулярном микроскопе Leica М-420 (Германия) с помощью сканирующей CCD камеры Kaiser Dual-Pro (Германия). Число c-Fos-позитивных ядер в каждой из выбранных структур, а также площадь, занимаемая ею на данном срезе, подсчитывалась с помощью программы анализа изображений Image Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, США).

Границы всех анализируемых структур определяли в соответствии с атласом мозга мыши (Franklin, Paxinos, 1997) для срезов со следующими АР координатами относительно брегмы («+» означает, что срез был расположен ростральнее брегмы, а «-» - каудальнее брегмы): АР +2.46, +2.34, +2.22, +1.94, +1.78, +1.54, +1.18, +0.38, +0.02, -0.22, -0.94, -1.22, -1.46, -1.58, -1.82, -2.06, -2.18, -2.46, -2.54, -2.70, -2.92. Медиальная лимбическая кора была представлена в 21 координатной точке (от АР +2.46 до АР-2.92), моторная кора - в 15 точках (от АР +2.46 до АР-1.82), гиппокамп - в 11 точках (от АР-0.94 до АР-2.92).

Количество c-Fos-позитивных нейронов для всех анализируемых структур на каждом срезе подсчитывали в обоих полушариях мозга. Плотность экспрессии c-Fos вычисляли по формуле: ^слева + №права)/2»0.1 и выражали как число c-Fos-позитивных клеток (N) в 0,1мм2.

Статистический анализ данных

Статистическая оценка поведенческих данных осуществлялась с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (post-hoc тест для межгрупповых и межлинейных сравнений) и критерия Вилкоксона (для оценки изменений, происходящих в поведении животных на разных этапах обучения и тестирований). Различия считались достоверными при р<0.05.

Анализ равномерности распределения Fos-позитивных клеток вдоль ростро-каудальной оси мозга по каждой из структур осуществляли с помощью ANOVA (категориальный фактор - «координата среза относительно брегмы»). Коэффициент корреляции Спирмена между координатой срезов и плотностью c-Fos-позитивных нейронов (при р<0.05) указывал на характер выявленных неравномерностей: увеличение (при г<0) или снижение (при г>0) уровня экспрессии вдоль ростро-каудальной оси мозга. Для попарного межгруппового сравнения распределений экспрессии в мозге мышей использовали «анализ контрастов» (ANOVA, категориальный фактор - «группа»). Межгрупповое сравнение уровней экспрессии с-Fos в каждой координатной точке исследуемых структур проводили с помощью post-hoc теста Шеффе для множественных сравнений, (однофакторный ANOVA, категориальный фактор - «группа»).

РЕЗУЛЬТАТЫ 1.1. Поведение мышей во время сеанса обучения

Для анализа поведения животных во время обучения период пребывания в экспериментальной камере был разделен на три этапа: «до звукового сигнала» (от 0 до 120 сек в сеансе обучения, рис.2А), «в период звукового сигнала», оканчивающийся 2-х секундным электрокожным раздражением (от 120 до 150 сек, рис.2Б) и «после звукового сигнала и тока» (от 150 до 180 сек, рис.2В). Такие же временные интервалы были использованы для анализа поведения животных из группы активного контроля.

Поведение животных на первом этапе характеризовалось выраженной локомоторной активностью, грумингом и стойками на задних лапах (рис.2А). Длительность локомоторной активности у мышей линий С57В1/6 и 129Sv не различалась (11.0+0.77 и 10.48+1.07 в группах обучения (ОБ), 10.07+1.01 и 7.69+1.43 В группах активного контроля (АК)). Однако, суммарная длительность как груминга, так и стоек на задних лапах, была достоверно больше у мышей линии С57В1/6, чем у 129Sv (груминг: ОБ С57В1/6 vs. 129Sv 3.99+0.39 и 1.42+0.35 (р<0.05), АК С57В1/6 vs. 129Sv 3.58+0.61 и 1.65+0.51 (р<0.05); стойки: ОБ С57В1/6 vs. 129Sv 2.63+0.45 и 0.18+0.09 (р<0.05), АК С57В1/6 vs. 129Sv 2.73+0.67 и 0.05+0.06 (р<0.05)). Следовательно, поведение двух линий мышей различалось с самого начала сеанса обучения. Введение звукового сигнала (второй этап) не внесло существенных изменений в поведение животных.

Между группами обучения и активного контроля ни на первом ни на втором этапах не было обнаружено достоверных различий в поведении.

На третьем этапе изменилось поведение мышей из групп обучения, но не групп активного контроля у обеих линий (рис.2В). Суммарная длительность замираний по сравнению со вторым этапом достоверно возросла у мышей С57В1/6, но не у 129Sv (у С57В1/6 ОБ с 0.38+0.2 до 11.19+2.19, р<0.01; у 129Sv ОБ с 0.44+0.26 до 2.22+1.09, р=0.14). Достоверно уменьшились длительность

локомоций и груминга у обеих линий (локомоция: у С57В1/6 ОБ с 7.45+0.82 до 2.3б±0.42, у 129Sv ОБ с 9.52+0.34 до 3.2+0.56; груминг: у С57В1/6 ОБ с 3.55+1.09 до 0.18+0.15, у 129Sv ОБ с 3.3+0.91 до 0.02+0.02 (р<0.05)) и стоек - только у С57В1/6 (у С57В1/6 ОБ с 2.0+0.38 до 0.53+0.24, р<0.01). При этом у мышей из группы обучения линии С57БЬ/6 достоверные различия были обнаружены для всех четырех поведенческих параметров по сравнению с активным контролем, а у 129Sv только длительность груминга стала достоверно ниже чем у активного контроля. Это свидетельствует о том, что на третьем этапе у мышей С57В1/6 в результате обучения развились более выраженные поведенческие изменения, чем у 129Sv.

1.2. Поведение мышей в тесте на обстановочные сигналы

Тест на условные обстановочные сигналы был разделен для анализа на два равных этапа: с 0 по 180 сек и с 180 по 360 сек (рис.3). На первом этапе теста длительность замираний у животных из групп обучения обеих линий была достоверно выше по сравнению с третьим этапом сеанса обучения (на рис.2В и ЗА): у С57В1/6 ОБ 11.19+2.19 и 21.0113.31, у 129Sv ОБ 2.2211.09 и 18.71+3.43 р<0.05. Длительность замирания у мышей обеих линий была также достоверно выше у обученных животных по сравнению с группами активного контроля: у 129Sv ОБ ™ АК - 18.71+3.43 и 2.48+1.42 (р<0.01); у С57В1/6 ОБ vs. АК -21.01+3.31 и 0.60+0.21 (р<0.001). Межлинейных различий в длительности замирания на первом этапе обстановочного теста обнаружено не было. Эти данные свидетельствуют об одинаково эффективном обучении мышей обеих линий на условные обстановочные сигналы.

У обученных мышей С57В1/6 наблюдалось снижение длительности двигательной активности (побежек и стоек на задних лапах) и груминга по сравнению с активным контролем. У обученных мышей 129Sv по сравнению с активным контролем была снижена лишь длительность груминга в первые 3 мин обстановочного теста. Таким образом, у обученных мышей в тесте не только усиливался пассивно-оборонительный компонент поведения (замирание), но в той или иной степени изменился весь набор поведенческих реакций.

Мыши из групп активного контроля не демонстрировали замирания при повторном помещении в экспериментальную камеру. Однако их поведение отличалось от первого сеанса: уменьшились количество и суммарная длительность локомоций (у АК-С57 с 10.0711.01 до 6.0711.94, р=0,03; у AK-129Sv c7.69il.43 до 2.5211.08, р=0,02) и стоек на задних лапах (у АК-С57 с 2.7310.67 до 1.1810.64, р=0,03), а длительность груминга, напротив, возросла почти в два раза (у АК-С57 с 3.58Ю.61 до 5.6811.06, р=0,42; у AK-129Sv с 1.6510.62 до 3.7611.09, р=0,20). Эти изменения говорят о снижении исследовательской активности и

позволяют сделать вывод о том, что животные группы активного контроля в тесте на контекст распознают обстановку экспериментальной камеры как знакомую.

Межлинейные различия в длительности замирания в тестах выявились лишь во втором периоде обстановочного теста: длительность замирания у мышей из группы обучения линии 129Sv была выше, чем у С57В1/6 -соответственно, 26.36±4.29 и 13.97±2.35, р<0.01.

У обученных мышей линии 129Sv наблюдалось достоверное увеличение средней длительности замирания от первого ко второму периоду теста: с 18.71+3.43 до 26.36±4.29 (р=0.03). У С57В1/6, напротив, наблюдалась тенденция к снижению длительности замирания ко второму периоду теста: с 21.01+3.31 до 13.9712.35 (р=0.079), а двигательная активность возрастала (с 3.29+0.66 до 4.92+0.6, р<0.05). Таким образом, у мышей линии 129Sv по сравнению с С57В1/6 наблюдалось более медленное снижение замирания в ходе обстановочного теста.

1.3. Поведение мышей в тесте на звуковой сигнал

Данный тест состоял из двух этапов: «до предъявления звукового сигнала» (0-180 сек) и «во время звукового сигнала» (180-360 сек) (рис.4).

На первом этапе поведение обученных мышей обеих линий не отличалось от активного контроля. Кроме того, поведение животных всех экспериментальных групп (рис.4А - первые 3 минуты теста, до предъявления условного сигнала в новой камере) напоминало поведение, наблюдавшееся при первом помещении животных в экспериментальную камеру (рис.2А ) - много локомоций и стоек на задних лапах, являющихся показателями исследовательской активности животных, низкий уровень замираний.

Во втором периоде теста длительность замирания у мышей обеих линий достоверно возрастала у обученных животных по сравнению с активным контролем: у 129Sv ОБ vs. АК - 21.27+2.97 и 4.60+1.14 (р<0.001); у С57В1/6 ОБ vs. АК- 21.34+2.81 и 3.59+1.73 (р<0.001). Эти данные свидетельствуют об эффективном обучении мышей обеих линий на звуковой условный сигнал.

2.1. Экспрессия c-Fos в моторной коре

Исследование топографии экспрессии с-Бс« в первичной и вторичной моторной коре (М1 и М2) проводили у мышей пяти экспериментальных групп, на 15 координатных уровнях от АР+2.46до АР-1.82 (рис.5 и 6).

Анализ выявил неравномерность распределения Бс8-позитивных клеток в моторной коре вдоль ростро-каудальной оси как в группах обучения, так и активного контроля у обеих линий (р0.001). Отрицательное значение коэффициента корреляции г между координатой срезов (расстояние от брегмы) и количеством с-Рс8-позитивных нейронов указывает на достоверное градиентное

увеличение уровня экспрессии в ростро-каудальном направлении в группах как активного контроля, так и обучения.

Рис.7 Паттерны экспрессии c-Fos в первичной моторной коре мышей

В обоих регионах моторной коры распределение с-Рс«-позитивных нейронов вдоль ростро-каудальной оси в группе пассивного контроля достоверно отличалось от групп обучения и активного контроля. Эти различия наблюдались у обеих линий. Сравнение групп обучения и активного контроля выявило достоверные отличия распределений активных нейронов в как в М1 так и в М2. Эти различия наблюдались у обеих линий. Внутри обоих регионов достоверных межлинейных различий в распределениях экспрессии не наблюдалось.

Сравнение плотности экспрессии с-Бс^ на каждом отдельном координатном уровне не выявило достоверных межгрупповых различий в ростральных частях первичной моторной коры с АР +2.46 до АР +1.54 (рис.5, рис.7). При сравнении групп обучения с пассивным контролем был обнаружен более высокий уровень экспрессии (р<0.05) у обеих линий в М1 в диапазоне с АР +1.18 по АР -1.82. В группах активного контроля по сравнению с пассивным контролем более высокий уровень экспрессии наблюдался в отдельных координатных точках медиальной и каудальной части М1 у обеих линий (рис.5, рис.7). Большее количество Бс^-позитивных клеток в группах обучения по сравнению с группами активного контроля в М1 обнаружено: у 1298у - в точках с АР координатами +1.18, -0.22 и -1.82; у С57БЬ/6 только в АР -1.82 (рис.5, рис.7).

Поведение животных при обучении условнорефлекторному замиранию и при тестированиях

Рис. 2 ОБУЧЕНИЕ

Рис. 3 ТЕСТ: помещение в «камеру-1»

Ростро-каудальные паттерны c-Fos экспрессии в моторной коре

Д -О- F(14,48) —10.73, р < 0,001; г =-0.79 р < 0.00 F(14,82) s 18.58, р < 0,001; г = -0.82 р < 0.00 F(14,47) = 14.65, р < 0,001 ; г = -0.79 р < 0.00 F(14,65) = 15.07, р < 0,001; г = -0.82 р < 0.00 F(14,40) =0.80, р-0,67; г = 0.12 р = 0.35

-0-VS-®-

-•-VS-0--•-VS-*-

-Ф-VS--O-VS-

F(1,5) = 12, p< 0,02 F(1,5) = 47, p < 0,001 F(1,5) = 14, p<0,01 F(1,5) = 8.6, p< 0,03 F{1,5) » 65, p < 0,0001 F(1,5) = 18, p<0,01 F(1,5) = 6.3,^=405 F(1,5) = 0.3, p=0,в

A - ANOVA, группирующий фактор - «координата среза»

Б -ANOVA, метод повторных измерений (анализ контрастов), группирующий фактор - «группа»

* -ANOVA, тест Шеффе («post hoc test»), группирующий Фактор - «группа»_

Д -О- F(14,48) = 5.92, р < 0,001; г = -0.71 р < 0.00 -•- F(14,81) = 9.83, р < 0,001; г = -0.64 р < 0.00 -ф- F(14,47) = 3.86, р < 0,001; г = -0.68 р < 0.00 F(14,65) = 5.19, р < 0,001; г = -0.68 р < 0.00 F(14,40)■ 0.40, р»0,97; г»-0.02 р «0.91

С -0-VS-»- F(1,5) -♦-VS-«- F(1,5) -Ф-VS-O F(1,5) -Ф-VS-*- F(1,5) -Ф-VS-*- F(1,5) -0-VS-0- F(1,5) -+-VS-+- F(1,5) -O-VS-ф- F(1,5)

= 12, p< 0,02 = 70, p < 0,0001 = ЛЛ,р<0,01 = 9.6, p < 0,03 = 79, p < 0,0001 —21,p <0,01 =4.9,jusJLÛZ = 0.2, p = 0,7

Паттерны c-Fos экспрессии в дорзо- и вентромедиальной лимбической коре

Рис. 10 Гиппокамп,поле СА1

Рис. 10-12 Ростро-каудальные фадиенты экспрессии c-Fos гиппокампе. А - ANOVA, группирующий фактор - «координата среза», Б - ANOVA, метод повторных измерений (анализ контрастов), группирующий фактор -«группа», * - ANOVA, тест Шеффе («post hoc test»), группирующий фактор - «группа». По оси ординат - количество c-Fos+ нейронов/0.1мм2

Такое же возрастание экспрессии относительно группы пассивного контроля наблюдалось и в М2 у С57В1/6: для группы обучения - каудальнее АР +1.94, а для группы активного контроля - каудальнее АР +1.54 (рис.6). У мышей линии 129Sv в группе обучения по сравнении с пассивным контролем наблюдался более высокий уровень экспрессии Fos на всем протяжении М2, а в группе активного контроля - только в каудальной ее части. Большее количество Fos-позитивных клеток в группе обучения по сравнению с группой активного контроля в М2 обнаружено только у 129Sv - в медиальной части, в точках с АР координатами от +1.78по -0.22 (рис.6).

Межлинейные различия в уровне экспрессии c-Fos во вторичной моторной коре были выявлены только у групп обученных животных: в координатной точке АР -0.22 у мышей 129Sv плотность c-Fos-экспрессирующих нейронов была выше, чем у С57В1/6.

Представленные данные свидетельствуют о том, что нейроны ростральной части моторной коры вовлекаются в обучение в данной задаче в меньшей степени, чем нейроны каудальных отделов моторной коры. Обучение усиливает экспрессию c-Fos в более каудальных регионах, соответствующих моторным представительствам передних и задних лап мышей. Этот процесс был более выражен у мышей линии 129Sv.

2.2. Экспрессия c-Fos в медиальной лимбической коре

Экспрессия c-Fos в дорзальных и вентральных регионах медиальной лимбической коры мышей экспериментальных групп оценивалась на 21 координатном уровне от АР +2.46 до АР-2.92 (рис.8 и 9).

В дорзальной части медиальной лимбической коры (ДМЛк), включающей область 1 цингулярной коры (Cgl) и ретросплениальную агранулярную кору (RSA), неравномерность экспрессии была выявлена только в одной группе -активного контроля 129Sv (F(20,65)=3.07, p<0,001). В вентромедиальной лимбической коре (ВМЛк), включающей прелимбическую кору (PrL), область 2 цингулярной коры (Cg2) и ретросплениальную гранулярную кору (RSG), неравномерность экспрессии наблюдалась как у животных из группы активного контроля так и обучения.

В ДМЛк корреляция между АР координатой срезов и плотностью c-Fos-позитивных нейронов была достоверной только в группах активного контроля обеих линий: для AK-129Sv г = -0.22, р<0.04, для AK-C57BL/6 г=-0.24, р<0.03. Отрицательное значение коэффициента корреляции указывает на усиление экспрессии c-Fos от ростральной к средней части ДМЛк.

В ВМЛк была выявлена достоверная положительная корреляция между координатой срезов и количеством c-Fos-позитивных нейронов у 129Sv в группе обучения (г=0.26, р<0.002), и у C57BL/6 в обеих экспериментальных группах. Это указывает на наличие участка со снижением экспрессии c-Fos: от средней к каудальной части ВМЛк.

В медиальной лимбической коре у обеих линий распределение плотности экспрессии c-Fos вдоль ростро-каудальной оси мозга в группе пассивного контроля достоверно отличалось от групп обучения и активного контроля. Внутрилинейное сравнение групп обучения и активного контроля выявило достоверные отличия в ДМЛк у мышей линии 129Sv.

При попарном внутрикоординатном сравнении - как в дорзальной, так и в вентральной областях медиальной лимбической коры в группе обучения уровень экспрессии c-Fos был выше, чем в группе пассивного контроля в большинстве координатных точек. В группе активного контроля по сравнению с группой пассивного контроля уровень экспрессии c-Fos был выше в средней части обеих структур, причем у C57BL/6 достоверные отличия наблюдались в большем числе координатных точек. Достоверно более высокая плотность c-Fos-позитивных нейронов в группе обучения по сравнению с группой активного контроля обнаружено в ДМЛк лишь у 129Sv (в средней части Cgl и каудальной RSA), а в вентральной области медиальной лимбической коры - в RSG регионе: у 129Sv в координатных точках -1.46, -2.06и -2.70;у 57В1/6 - в точке -1.82(рис.9).

Межлинейные различия в экспрессии c-Fos в медиальной лимбической коре наблюдались лишь в виде тенденции: у обученных мышей 129Sv наблюдалось несколько большее количество c-Fos-позитивных нейронов в каудальной RSA области по сравнению с С57В1/6 (р = 0.08).

2.3. Экспрессия c-Fos в гиппокампе

Топография экспрессии c-Fos в гиппокампе была изучена по срезам мозга на 11 координатных уровнях: от АР-0.94 до -2.94 (рис. 10-12). В гиппокампе с-Fos-экспрессирующие нейроны располагались почти исключительно в пирамидном слое полей СА1 и САЗ, и в гранулярном слое зубчатой фасции.

В поле СА1 неравномерность экспрессии c-Fos по ростро-каудальной оси мозга была выявлена у животных из групп обучения обеих линий и группы активного контроля линии 129Sv (рис.10). В поле САЗ неравномерность экспрессии c-Fos при обучении обнаружена только у линии 129Sv (рис.11), а в зубчатой фасции - у линии С57В1/6 (рис.12).

В поле СА1 гиппокампа мышей из групп обучения у обеих линий и в группе активного контроля С57В1/6 было обнаружено увеличение плотности с-Fos-позитивных нейронов в ростро-каудальном направлении (г<0, р<0.05, рис.10А). В то же время, положительное значение коэффициента корреляции Спирмена для показателей экспрессии c-Fos в поле САЗ гиппокампа и в зубчатой фасции мышей из этих же групп (г>0, р<0.05, рис.11 А) указывает на достоверное снижение экспрессии в ростро-каудальном направлении. У мышей из группы пассивного контроля уровень экспрессия c-Fos был равномерно низким как в СА1, так и в САЗ поле гиппокампа.

Попарное межгрупповое сравнение распределений экспрессии с-Рсв выявило достоверные отличия между группами обучения и пассивного контроля в СА1, САЗ и Бв у мышей обеих линий; между группами активного и пассивного контроля - только в САЗ и в зубчатой фасции у мышей обеих линий; между группами активного контроля и обучения - в виде тенденции (Р(1,12)=4.33 р=0.06) - в СА1 у С57В1/6.

При попарном внутрикоординатном сравнении более высокая плотность экспрессии в группе обучения, чем в группе активного контроля была обнаружена в ростральной части поля САЗ у 129Sv и в точке АР -2.06 (р < 0.05). В группах обучения при сравнении с группами пассивного контроля плотность экспрессии с-Рсв была выше в большинстве координатных точек САЗ и зубчатой фасции у мышей обеих линий, в СА1 у мышей линии С57В1/6, и в ростральной и каудальной частях СА1 у мышей линии 129Sv. В группах активного контроля более высокий уровень экспрессии с-Рсв по сравнению с группами пассивного контроля обнаружен: у 129Sv - в медиальной и каудальной части САЗ и каудальной части зубчатой фасции, а у С57В1/6 - только в медиальной части САЗ. Межлинейные различия в экспрессии с-Рсв были выявлены лишь в виде тенденции к более высокому уровню экспрессии с-Рс« у 129Sv по сравнению с С57В1/6 в ростральной части САЗ (р = 0.09 в точке АР-1.22) и каудальной части зубчатой фасции (р < 0.1 в точках с АР -2.54 и -2.7) и только у мышей из групп обучения.

ОБСУЖДЕНИЕ

Различия поведения мышей линий С57В1/6 и 129Sv в модели условно-рефлекторного замирания

Наши эксперименты показали, что итог обучения в модели условно-рефлекторного замирания (замирание при повторном помещении в обстановку экспериментальной камеры или при предъявлении звукового сигнала) был одинаков у обеих линий мышей, т.е., независим от их генетических различий. Однако, у мышей линии С57В1/6 была обнаружена большая, чем у 129Sv, длительность замирания на последнем этапе сеанса обучения, после нанесения электрокожного раздражения. Это свидетельствует в пользу того, что формирование поведения замирания у мышей линии С57БР/6 начиналось раньше, чем у 129Sv, еще в период их нахождения в экспериментальной камере во время сеанса обучения.

Результаты тестирования реакций животных на звуковой сигнал и обстановку через 80 мин после сеанса обучения свидетельствуют об эффективной выработке условно-рефлекторного замирания у мышей обеих линий. При этом более высокая длительность замираний у обученных животных в новой для них обстановке до предъявления звукового сигнала (рис.4А), по

сравнению с периодом до включения звукового сигнала в сеансе обучения (рис.2А), указывает на повышенный уровень неспецифической тревожности у мышей, подвергавшихся электроболевому воздействию. У обученных мышей линии 129Sv эта неспецифическая тревожность была выражена сильнее, т.к. подавление локомоторной активности в новой обстановке у них было выражено более, чем у мышей С57В1/6. Эти результаты совпадают с данными других исследований, свидетельствующих о более высокой тревожности мышей линии 129Sv по сравнению с С57В1/6 (Contet et al., 2001; Dockstader, van der Kooy, 2001).

В тесте на обстановочные сигналы у мышей 129Sv происходило достоверное увеличение средней длительности замирания от первого ко второму периоду. У С57В1/6, напротив, наблюдались усиление двигательной активности и тенденция к снижению длительности замираний, так что во втором периоде обстановочного теста длительность замирания у мышей из группы обучения линии 129Sv была достоверно выше, чем у С57В1/6. Уменьшение выраженности данного поведения у мышей линии С57В1/6 в ходе обстановочного теста может рассматриваться как процесс угасания реакции замирания. Данный процесс отсутствовал у мышей линии 129Sv.

Эти результаты согласуются с данными литературы: мыши линии 129Sv демонстрируют нормальную способность к обучению в модели «контекстуальный условный страх», не отличаясь от С57В1/6 в длительности замираний в тестах через 24 часа (Owen et al., 1997; Nguyen et al., 2000; Holmes et al., 2002; Balogh et al., 2003). Различия между этими линиями проявляются, однако, в более сильном снижении двигательной активности у 129S6/Sv, чем у C57B1/6J (Bothe et al., 2004). Комплексный поведенческий анализ линий 129S2/Sv и C57B1/6J в батарее тестов на сенсомоторные функции, эмоциональность и когнитивные процессы у животных показывает, что различия в поведении двух линий связаны скорее с моторной активностью, тревожностью или мотивацией, чем с фундаментальной когнитивной недостаточностью мышей 129Sv (Montkowski et al., 1997; Contet et al., 2001; Dockstader, van der Kooy, 2001).

Большинство исследований по угашению условнорефлекторного замирания связаны с изучением механизмов долговременной памяти и, поэтому, в них сравнивалось поведение животных при повторных тестированиях, а не на протяжении одного теста (Stiedl et al., 1999; Waddell et al., 2004; Schimanski et al., 2002; Siegmund et al., 2005; Harrell, Allan, 2003). Однако, в нескольких работах было обнаружено сходное с нашими данными двукратное снижение замираний у мышей С57В1/6 в ходе 6-минутного теста на контекст (Valentinuzzi et al., 1998; Lattal, Abel, 2001; Waddell et al., 2004).

Таким образом, динамика формирования и угасания замирания в аверсивной обстановке отличается у двух исследованных инбредных линий

мышей, что дает основание предполагать, что эти процессы находятся под влиянием генетических факторов.

Различие поведения мышей групп обучения и активного контроля

Эксперименты настоящей работы показали, что обучение мышей обеих исследованных линий приводило к формированию выраженного условно-рефлекторного замирания, как на обстановочные, так и на звуковые сигналы (см. рис.1).

Кроме этого, наши опыты также выявили, что и у животных из группы активного контроля, не получавших электрокожного раздражения, поведение при повторном помещении в экспериментальную камеру отличалось от наблюдавшегося во время первого сеанса. У этих животных при втором помещении в камеру уменьшалось количество и суммарная длительность локомоций и стоек на задних лапах, а длительность груминга, напротив, возрастала (см. рис. 2А и ЗА). Эти изменения говорят о снижении исследовательской активности у мышей группы активного контроля и позволяют сделать вывод о том, что эти животные во время теста распознают обстановку экспериментальной камеры как уже знакомую.

Исходя из этого, следует сделать вывод, что в использованной нами экспериментальной модели формирование памяти, изменяющей поведение животных, происходило у мышей как группы обучения, так и группы активного контроля.

Известно, что формирование памяти у животных в обеих экспериментальных ситуациях сопровождается экспрессией с-Бс^ в нейронах головного мозга (МПапсмс й а1, 1998). Следовательно, исследовавшиеся нами при нейрокартировании области мозга могли содержать нейроны, активация с-Бс^ в которых происходила как в связи с запоминанием новой обстановки, так и в связи с модификацией оборонительного поведения животных. Поэтому, межгрупповые и/или межлинейные различия в экспрессии с-Бс^ анализировались нами с учетом возможного вовлечения исследованных структур мозга в обе эти формы памяти.

Связь экспрессии c-Fos с обучением и поведением

При выработке условно-рефлекторного замирания наблюдалась общая для обеих линий активация экспрессии с-Бс^ в двух из исследованных областей мозга: в представительстве задних лап моторной коры и в ретросплениальной гранулярной коре. У мышей 129Sv были также активированы моторное представительство передних лап первичной моторной коры, медиальная часть вторичной моторной коры, дорзомедиальная лимбическая кора (часть поля 1

цингулярной коры и каудальная часть ретросплениальной агранулярной коры), ростральная и медиальная части поля САЗ. Кроме того, у обученных мышей линии 129Sv была выявлена область вторичной моторной коры с достоверно более высокой экспрессией c-Fos по сравнению с мышами линии С57В1/6. Таким образом, у мышей линии 129Sv увеличение экспрессии c-Fos при обучении наблюдалось в большем числе областей, чем у С57В1/6.

Сопоставление этих данных с результатами анализа поведения показывает, что у животных линии С57В1/6, обладающих более быстрой динамикой выработки и угасания условной реакции замирания, экспрессия c-Fos при обучении происходит в меньшем числе нейронов. Этот факт может иметь два возможных объяснения. Во-первых, наблюдаемые различия в условно-рефлекторном замирании могут не зависеть от функций исследованных структур мозга и, поэтому, межлинейные различия в экспрессии c-Fos в этих структурах не имеют прямого отношения к различиям в обучении между двумя линиями. Против такого предположения, однако, выступают данные о нарушении выработки условно-рефлекторного замирания при разрушениях гиппокампа и ретросплениальной коры (Kim et al., 1992; Young et al., 1994; Frysztak, Neafsey, 1994; Morgan, Le Doux, 1995; Maren et al., 1997; Anagnostaraset al, 1999; Sanders et al., 2002). Другое объяснение отрицательной связи между скоростью обучения и числом c-Fos экспрессирующих нейронов может состоять в том, что у более быстро обучающихся животных происходит перебор меньшего числа новых пробных комбинаций нейрональной активности и, следовательно, c-Fos экспрессируется в меньшем количестве клеток. Эта возможность представляется более вероятной, так как она хорошо согласуется с ранее полученными данными корреляции индивидуальных различий в темпах обучения и экспрессии гена c-fos в коре головного мозга (Анохин и соавт., 2000).

Сопоставление поведения животных из групп обучения и активного контроля указывает на то, что общая для этих групп активация c-Fos может быть связана с общим для обеих групп исследовательским поведением в экспериментальной камере. Однако, наборы структур, в нейронах которых происходили изменения экспрессии c-Fos, связанные с исследовательским поведением (сравнение групп активного и пассивного контроля), различались у мышей двух линий. Специфичными для линии С57В1/6 была активации экспрессии в медиальной первичной моторной коре, медиальной вторичной моторной коре, каудальных регионах дорзомедиальной и вентромедиальной лимбической коры, ростральной и медиальной части поля САЗ гиппокампа. Специфичная для 129Sv экспрессия c-Fos наблюдалась в каудальной части поля САЗ гиппокампа и каудальной части зубчатой фасции.

По данным литературы, различия в уровне активации c-Fos в гиппокампе выявляются в задачах, требующих специфической «пространственной» памяти (Vann et al., 2000). Различные поля гиппокампа могут вовлекаться на разных стадиях обучения дифференцированно: при ознакомлении с новой средой

преимущественно активируется СА1, существенно слабее - САЗ и меньше или равно - зубчатая фасция; в начале обучения обонятельной дискриминации - поле САЗ активируется сильнее, чем СА1, а экспрессия в зубчатой фасции не отличается от базального уровня (Hess et al., 1995). Сопоставление этих результатов с данными нашей работы, позволяет заключить, что выработка условно-рефлекторного замирания, в отличие от пространственного обучения, не связана со значимой активацией c-Fos в нейронах поля СА1. Однако, на основании наших данных мы можем говорить о том, что в исследовании новой среды участвуют нейроны поля САЗ у мышей обеих линий и зубчатой фасции -у линии 129Sv.

Обнаруженное в наших опытах повышение экспрессии c-Fos в моторной коре мышей обеих экспериментальных групп по сравнению с пассивным контролем, по-видимому, не связано с собственно моторной активностью животных при обследовании экспериментальной камеры, поскольку известно, что моторная нагрузка сама по себе не вызывает усиления экспрессии c-fos (Kleim et al, 1996; Badiani et al, 1998). Возможное объяснение состоит в том, что при обследовании экспериментальной камеры животные перемещались непривычным для них способом - перехватывая лапками прутья решетчатого пола. Это требует формирования новой координация, обеспечивающая новый тип локомоции. Известно, что экспрессия c-fos в моторной коре может быть индуцирована моторным обучением (Castro-Alamancos, 1992; Kleim et al, 1996). Кроме того, показано, что инъекция ингибитора синтеза белка анизомицина в моторную кору снижает успешность обучения крыс моторному навыку (Luft et al., 2004), что также указывает на зависимость пластичности в этой области мозга у взрослых животных от экспрессии генов.

В настоящей работе мы обнаружили, что в моторной коре мышей из групп обучения и активного контроля экспрессия c-Fos имеет ростро-каудальный градиент, с высокой экспрессией в областях моторных представительств передних и задних лап и низкой - в моторном представительстве морды (см. рис.5 и 7). Данного градиента не наблюдается в мозге мышей группы пассивного контроля, взятых из домашних клеток. Градиентное возрастание уровня экспрессии c-Fos было также обнаружено в поле СА1 гиппокампа мышей из групп обучения обеих линий и группы активного контроля с57В1/6. В то же время в поле САЗ гиппокампа и в зубчатой фасции мышей из этих же групп было обнаружено достоверное снижение числа c-Fos-позитивных нейронов в ростро-каудальном направлении.

В литературе до сих пор не было данных о градиентных изменениях уровня экспрессии c-fos в моторной коре или о разнонаправленных градиентах экспрессии в гиппокампе. Возрастание уровня экспрессии в каудальных частях СА1, САЗ и в зубчатой фасции показано в гиппокампе полевок, обучавшихся в 8-рукавном лабиринте по сравнению с группой активного контроля, тогда как различий в ростральных частях не обнаружено (Купцов и др., 2005). В работе

Badiani et al., 1998, при исследовании экспрессии c-fos в мозге крыс на нескольких рострокаудальных уровнях (+1.6, +0.5, +1.3 мм от брегмы), было показано, что большинство структур (цингулярная кора, моторная кора, сенсомоторная кора, пириформная кора и дорзальное эндопириформное ядро), взятые в этих границах, не имеют рострокаудальных градиентов экспрессии с-fos (в моторной коре крыс на этих координатных уровнях находится моторное представительство передних и задних лап). В клауструме во всех группах, включая контрольные, было показано снижение, а в соматосенсорной коре -увеличение уровня экспрессии c-fos вдоль рострокаудальной оси мозга у животных, помещенных в ситуацию новизны, и при сочетании «новизны» с инъекцией амфетамина. В соматосенсорной коре градиент экспрессии c-fos был изучен Badiani и соавт. (1998) на 10 уровнях с +2.2 до -1.7 мм по брегме, где последовательно расположены сенсорные представительства челюстей, губ, носа и вибриссное «бочонковое поле». Как и в нашем случае, градиент экспрессии c-fos находился в соответствии с соматотопической организацией этой структуры.

При исследовании экспрессии c-Fos в медиальной лимбической коре в тестах на тревожность Duncan и соавт., (1996) обнаружили максимальные уровни экспрессии в ростральных регионах и в несколько раз более низкие в несколько раз в цингулярной и ретросплениальной коре. Эти данные согласуются с нашими данными о неравномерном распределении экспрессии с-Fos в медиальной лимбической коре и свидетельствуют о функциональной гетерогенности медиальной лимбической коры при ее вовлечении в процессы обучения.

Таким образом, данные по поведению и по топографии экспрессии c-Fos в мозге мышей разных экспериментальных групп позволяют заключить, что инбредные линии мышей C57BL/6 и 129Sv различаются по вовлечению нейронов моторной, медиальной лимбической коры и гиппокампа в обучение условно-рефлекторному замиранию. Обнаруженный нами феномен неравномерности распределения экспрессии c-Fos в структурах коры головного мозга и гиппокампа может отражать функциональную гетерогенность этих структур мозга в процессах обучения.

ВЫВОДЫ

1. Обучение в модели условно-рефлекторного замирания приводит к изменениям поведения у мышей обеих исследованных линий - C57BL/6 и 129Sv. Это выражается в высоком уровне замирания обученных животных при их повторном помещении в обстановку, где они ранее получали электрокожное раздражение, а также при предъявлении им условного звукового сигнала в новой обстановке.

2. Линии мышей С57БЬ/6 и 1298у не отличаются между собой по показателю времени замирания в тестах на обстановочные сигналы и на звуковой условный сигнал. Однако в ходе обучения, после нанесения электрокожного раздражения, замирание у мышей линии С57БЬ/6 более выражено, чем у 1298у. Кроме того, у линии 1298у наблюдается более стойкое сохранение замирания в обстановочном тесте. У С57БЬ/6 в ходе этого теста наблюдалась отчетливая тенденция к снижению длительности замирания и достоверное увеличение двигательной активности. Это свидетельствует о том, что процессы модификации пассивно-оборонительного поведения в исследуемой задаче находятся под влиянием генетических факторов и протекают у мышей линии 1298у медленнее, чем у мышей линии С57БЬ/6.

3. Животные обеих линий из группы активного контроля также изменяют свое поведение при повторном попадании в экспериментальную обстановку. Снижение у них исследовательской активности во время повторного сеанса свидетельствует о существовании у них памяти об обстановке, приобретенной в первом сеансе.

4. Во всех исследованных структурах мозга, кроме области СА1 гиппокампа, у мышей из групп обучения и активного контроля обнаружены участки с более высокой, чем у пассивного контроля экспрессией транскрипционного фактора с-Бс«. Эта активация структур мозга, общая у групп обучения и активного контроля, может быть связана с формированием памяти об обстановке, сходной у обеих групп.

5. При обучении, по сравнению с активным контролем, общее для обеих линий увеличение экспрессии с-Бс« наблюдается лишь в двух регионах - в представительстве задних лап моторной коры и в ретросплениальной гранулярной коре. Эти области коры головного мозга могут быть вовлечены в общие для животных обеих линий аспекты формирования памяти об опасности среды и модификации пассивно-оборонительного поведения.

6. Выявлена область достоверно более высокой экспрессии с-Бсв во вторичной моторной коре мышей из группы обучения линии 1298у по сравнению с мышами линии С57В1/6. У мышей 1298у линии наблюдается также тенденция к более высокой, чем у С57БЬ/6 экспрессии с-Бс« в ретросплениальной агранулярной коре, ростральной части поля САЗ гиппокампа и в каудальной части зубчатой фасции. Эти структуры мозга могут быть специфически вовлечены в процессы, имеющие отношение к динамике формирования и угашения поведения замирания, различающиеся между двумя инбредными линиями мышей.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зворыкина С.В., Анохин К.В. Исследование топографии c-Fos-экспрессирующих нейронов в неокортексе мышей при обучении условно-рефлекторному замиранию // Журнал Высшей Нервной Деятельности. -2003. - Т. 53. - № 4. - С. 526-530.

2. Zworykina S., Anokhin К., Studies of the topography of c-Fos-expressing neurons in the mouse neocortex during training to conditioned reflex freezing // Neurosci Behav Physiol. -2004. -T. 34. -№8. -C. 869-872.

3. Зворыкина С.В. Распределение Fos-экспрессирующих нейронов в неокортексе мышей при обучении условно-рефлекторному замиранию // Тезисы доклада на конференции «Опыт интеграции научных исследований НИИ - ВУЗ - клиника». - Москва, 2002. - Труды межведомственного научного совета по экспериментальной и прикладной физиологии. - Т.11, «Системные аспекты физиологических функций». - С.220.

4. Zworykina S., Anokhin К., Topography of c-Fos expression in the cortical and hippocampal neurons of 129Sv and C57B1/6 mice during fear conditioning // Abstracts of VI international congress of polish neuroscience society. - Warsaw, Poland July 16-19 2003. - Acta neurobiologiae experimentalis. -2003. - V.63. - № 3. - C.279.

5. Зворыкина С.В. Экспрессия гена c-fos в нейронах коры головного мозга мышей при обучении // Тезисы доклада на 2-й международной конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2001. - Т.2, с.304.

6. Зворыкина С.В. Особенности оборонительного обучения и экспрессия гена с-fos в мозге мышей двух разных линий // Тезисы доклада на конференции молодых ученых Научно-исследовательского института нормальной физиологии им. П.К. Анохина. - Москва, 2001.

7. Zworykina S.V., Anokhin K.V. Comparison of patterns of c-fos expression in brain of C57BL/6 and 129Sv mice during fear conditioning learning // Abstracts of Central European Conference of Neurobiology. - Krakow, Poland, 11-15 August 2001.-P. 164.

8. Зворыкина С.В. Экспресия гена c-fos в нейронах коры головного мозга мышей после обучения контекстуальному и условно-рефлекторному замиранию // Тезисы доклада на XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова. - Казань, 28-25 сентября 2001, с.95.

9. Zworykina S., Anokhin К., Rostro-caudal patterns of c-Fos expression in the motor and cingulate cortex of 129Sv and C57B1/6 mice during fear conditioning learning // Abstracts of international simposium of IBRO "Neuron Differentiation and plastisity - regulation by intercellular signals". - Moscow, Russia, July 6-9 2003. -P. 60.

Принято к исполнению 13/04/2005 Исполнено 14/04/2005

Заказ № 757 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)747-64-70 (095)318-40-68 www.autGreferat.ru

07 МАЯ 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зворыкина, Светлана Викторовна

1.1 АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.2 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. РАЗЛИЧИЯ В ПОВЕДЕНИИ МЫШЕЙ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ Sv и C57BL/

2.2. c-Fos КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАРКЕР ДЛЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО КАРТИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ МОЗГА ПРИ ОБУЧЕНИИ

2.3. ФОРМИРОВАНИЕ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ В МОДЕЛИ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОГО ЗАМИРАНИЯ

2.4. ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА СТРУКТУР МОЗГА И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА

2.4.1. ГиппокАМП

2.4.2. МЕДИАЛЬНАЯ ЛИМБИЧЕСКАЯ (ЦИНГУ ЛЯРНАЯ) КОРА

2.4.3. МОТОРНАЯ КОРА

3. МЕТОДИКА

3.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ

3.2. ПРОЦЕДУРА ОБУЧЕНИЯ И ТЕСТИРОВАНИЯ З.З.ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ НЕЙРОНОВ, экспРЕСсирующих C-Fos

3.4. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ C-FOS

3.5. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДАННЫХ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ ВО ВРЕМЯ СЕАНСА ОБУЧЕНИЯ

4.2. ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ В ТЕСТЕ НА ОБСТАНОВОЧНЫЕ СИГНАЛЫ

4.3. ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ В ТЕСТЕ НА ЗВУКОВОЙ СИГНАЛ

4.4. ТОПОГРАФИЯ ЭКСПРЕССИИ C-FOS В МОТОРНОЙ КОРЕ

4.5. ТОПОГРАФИЯ ЭКСПРЕССИИ C-FOS В МЕДИАЛЬНОЙ ЛИМБИЧЕСКОЙ КОРЕ

4.6. ТОПОГРАФИЯ ЭКСПРЕССИИ C-FOS В ГИППОКАМПЕ

5. ОБСУЖДЕНИЕ

5.1.РАЗЛИЧИЯ ПОВЕДЕНИЯ МЫШЕЙ ЛИНИЙ C57BL/6 и 129SV ПРИ О Б У Ч Е Н И И И ТЕСТИРОВАНИИ в МОДЕЛИ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОГО ЗАМИРАНИЯ

5.2.РАЗЛИЧИЕ ПОВЕДЕНИЯ МЫШЕЙ ГРУПП ОБУЧЕНИЯ И АКТИВНОГО КОНТРОЛЯ

5.3.СВЯЗЬ ЭКСПРЕССИИ C-FOS С ОБУЧЕНИЕМ И ПОВЕДЕНИЕМ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная топография экспрессии гена c-fos в мозге мышей линий C57BL/6 и 129Sv при обучении в задаче условно-рефлекторного замирания"

1.1 Актуальность исследования Известно, что животные разных инбредных линий имеют различные способности к обучению, и поведение их в одних же задачах различается (Vadasz et al., 1992; Crawley, 1997; Montkowski et al, 1997; Contet et al., 2001; Brooks et al., 2004). Подтверждением тому, что генетические факторы играют в этих различиях большую роль, служат классические работы по селекции на способность и неспособность к определенным видам научения (Searle, 1949; Bignami, 1965). Однако нервный субстрат подобных генетических различий изучен недостаточно.Существуют указания на то, что генетические различия проявляются, в частности, в том, что при решении одних и тех же задач у разных животных оказывается задействованным разное количество нейронов в одних и тех же структурах мозга (Ward et al., 1998). Исходя из этого, можно ожидать, что мыши инбредных линий, демонстрирующие значительные различия в обучении, например линий C57BL/6 и 129Sv, (Montkowski et al., 1997 Contet et al., 2001a; Contet et al., 2001b), будут различаться составом и числом нейронов, вовлекаемых в разных структурах мозга в процессы обучения.Экспериментальная проверка этого предположения требует регистрации активности большого числа нейронов у генетически различных животных в одной и той же задаче обучения. Такую возможность предоставляет метод картирования активности нервных клеток по экспрессии в них индуцируемых транскрипционных факторов. Этот метод служит информативным приемом выявления нейрональных субстратов обучения и формирования памяти (Анохин, 1989; Dragunow, 1996; Анохин, 1997; Herdegen, Leah, 1998; Tischmeyer, Grimm, 1999; Kaczmarek L., 2002; Guzowski, 2001). В его основе лежит то, что белковые продукты ранних генов, синтезированные в ответ на действующие на нейрон при обучении экстраклеточные сигналы, запускают транскрипцию поздних генов-мишеней, приводящую к долговременным пластическим изменениям связей нейронов и формированию долговременной памяти (Анохин, 1997; Kaczmarek L., 2002; Guzowski, 2001).Для сравнительного анализа нейронального обеспечения обучения у генетически различных животных требуется задача, в которой транскрипционную активность нейронов можно было бы оценить после однократного сеанса обучения, дающего выраженные и долговременные изменения поведения. Этим условиям удовлетворяет модель выработки у мышей и крыс условного рефлекса замирания (Bolles, Collier, 1976; Fanselow, 1980). В англоязычной литературе она получила название «cued and contextual fear conditioning» (Fanselow, 1980). Эта модель основана на способности животных ассоциировать электрокожное раздражение с обстановкой экспериментальной камеры, в которой они его получили, и звуковым сигналом, предшествовавшим удару током. В результате такого однократного обучения животные замирают при следующем помещении в данную обстановку или же при предъявлении звукового условного сигнала в иной обстановке (Fanselow, 1980; Radulovic, 1998; Sanders et al., 2003).В настоящей работе экспрессия транскрипционного фактора c-Fos при выработке условнорефлекторного замирания у мышей линий C57BL/6 и 129Sv исследовалась в трех областях мозга: гиппокампе, медиальной лимбической и моторной коре.Гиппокамп и медиальная лимбическая кора были выбраны как структуры мозга, принимающие непосредственное участие в обеспечении условно-рефлекторного замирания. Повреждение этих структур приводит к нарушению данного навыка (Kim et al., 1992; Young et al., 1994; Frysztak, Neafsey, 1994; Morgan, Le Doux, 1995; Maren et al., 1997; Anagnostaras et al, 1999; Kjelstrup et al., 2002; Sanders et al., 2003 ). Участие гиппокампа, в частности, было показано при обучении в модели «контекстуальное замирание», где обстановка экспериментальной камеры, в которой животные Получили удар тока, является условным сигналом (Kim & Fanselow, 1992; Frankland et al, 1998).Кроме того, медиальную лимбическую кору традиционно относят к структурам, регулирующим эмоциональное поведение и необходимых для обучения (MacLean, 1949; Vogt, 1992; Duncan et ah, 1996; Joel et al., 1997).Известно, что эта область коры головного мозга обладает выраженной нейрогенетической (Bayer, 1990), морфологической (Zeng, 1991) и функциональной (Nauta, 1972; Vogt et al, 1992; Баклаваджян с соавт., 2000) гетерогенностью, однако роль ее различных отделов в процессах обучения остается предметом обсуждения (Divac et al., 1984; Frysztak, Neafsey, 1994; Vogt, 1992; Morgan, LeDoux, 1995). Поэтому в настоящей работе представлялось важным изучить вовлечение нейронов разных участков этой структуры в выработку изучаемого поведения.Поскольку формирование пассивно-оборонительного поведения включает в себя изменения и в двигательной активности животных, можно ожидать, что при данном обучении могут происходить пластические изменения и в нейронах моторной коры. Пластичность моторной коры взрослых животных при обучении была недавно показана в серии экспериментов с изучением эффектов ингибиторов синтеза белка (Luft et al., 2004). Данная область коры организована соматотопически, и существование карты моторных представительств различных частей тела мыши в этой области (Проничев, 2000) потребовало анализа экспрессии c-Fos на всем ростро-каудальном протяжении этой структуры.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Зворыкина, Светлана Викторовна

1. Обучение в модели условно-рефлекторного замирания приводит к изменениям поведения у мышей обеих исследованных линий - C57BL/6 и 129Sv. Это выражается в высоком уровне замирания обученных животных при их повторном помещении в обстановку, где они ранее получали электрокожное раздражение, а также при предъявлении им условного звукового сигнала в новой обстановке.2. Линии мышей C57BL/6 и 129Sv не отличаются между собой по показателю времени замирания в тестах на обстановочные сигналы и на звуковой условный сигнал. Однако в ходе обучения, после нанесения электрокожного раздражения, замирание у мышей линии C57BL/6 более выражено, чем у 129Sv. Кроме того, у линии 129Sv наблюдается более стойкое сохранение замирания в обстановочном тесте. У C57BL/6 в ходе этого теста наблюдалась отчетливая тенденция к снижению длительности замирания и достоверное увеличение двигательной активности. Это свидетельствует о том, что процессы модификации пассивно оборонительного поведения в исследуемой задаче находятся под влиянием генетических факторов и протекают у мышей линии 129Sv медленнее, чем у мышей линии C57BL/6.3. Животные обеих линий из группы активного контроля также изменяют свое поведение при повторном попадании в экспериментальную обстановку. Снижение у них исследовательской активности во время повторного сеанса свидетельствует о существовании у них памяти об обстановке, приобретенной в первом сеансе.4. Во всех исследованных структурах мозга, кроме области СА1 гиппокампа, у мышей из групп об)^ения и активного контроля обнаружены участки с более высокой, чем у пассивного контроля экспрессией транскрипционного фактора c-Fos. Эта активация структур мозга, общая у групп обучения и активного контроля, может быть связана с формированием памяти об обстановке, сходной у обеих групп.5. При обучении, по сравнению с активным контролем, общее для обеих линий увеличение экспрессии c-Fos наблюдается лишь в двух регионах - в представительстве задних лап моторной коры и в ретросплениальной гранулярной коре. Эти области коры головного мозга могут быть вовлечены в общие для животных обеих линий аспекты формирования памяти об опасности среды и модификации пассивно-оборонительного поведения,

6. Выявлена область достоверно более высокой экспрессии c-Fos во вторичной моторной коре мышей из группы обучения линии 129Sv по сравнению с мышами линии С57В1/6. У мышей 129Sv линии наблюдается также тенденция к более высокой, чем у C57BL/6 экспрессии c-Fos в ретросплениальной агранулярной коре, ростральной части поля САЗ гиппокампа и в каудальней части зубчатой фасции. Эти структуры мозга могут быть специфически вовлечены в процессы, имеющие отношение к динамике формирования и угашения поведения замирания, различающиеся между двумя инбредными линиями мышей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зворыкина, Светлана Викторовна, Москва

1. Анохин П.К. (1973). Принципиальные вопросы общей теории функциональных систем. Принципы системной организации функций. Москва, 5-61.

2. Анохин К.В. (1996). Обучение и память в молекулярно-генетической перспективе. Двенадцатые сеченовские чтения. Москва, «Диалог», МГУ, 23.

3. Анохин К.В. (1997). Молекулярные сценарии консолидации долговременной памяти. Журнал Высшей Нервной Деятельности им. И.П.Павлова, 47(2), 261-279.

4. Анохин К.В. (2003). Молекулярная генетика памяти: когнитивная регуляция экспрессии генов в мозге при обучении. В сб. «Успехи функциональнй нейрохимии», 2-е изд., под ред. А.Дамбиновой и А.В.Арутюняна. Санкт-Питербург, Изд-во -Питерб. ун-та, 516с.

5. Анохин К.В., Судаков К.В., (1993). Системная организация поведения: новизна, как ведущий фактор экспрессии ранних генов в мозге при обучении. Успехи Физиологических наук, 24, 53-70.

6. Анохин К.В., Судаков К.В., Рябинин А.Э. (2000). Экспрессия гена с- fos в мозге у мышей в динамике выработки навыков оборонительного поведения. Журнал высшей нервной деятельности им. И.П.Павлова, 50 (1), 88-94.

7. Баклаваджян О.Г., Нерсесян Л.Б., Аветисян Е.А. и др. (2000). Нейрональная организация лимбико-(цингуло-)висцеральной рефлекторной дуги. Успехи Физиологических наук, 31(4), 11-23.

8. Батуев А.С. (1970). Функции двигательного анализатора. Ленинград, ЛГУ, 224с.

9. Виноградова, О.С. (1975 ). Гиппокамп и память. Москва, 333с.

10. Вольнова А.Б., Ленков Д.Н. (1982). Организация моторного представительства в неокортексе белой крысы: данные макро- и микростимуляции. Журнал Высшей Нервной Деятельности им. И.П.Павлова, 32{\), 122-130.

11. Гуревич М.О., Быховская Г.Х., Урановский Я. (1929). Сравнительная цитоархитектоника коры большого мозга грызунов. В сб. «Высшая нервная деятельность», Изд-во Коммунистической академии, Москва, 1, 13-38.

12. Дьюсбери Д. (1981). Поведение животных: Сравнительные аспекты. Москва, Мир. 480с.

13. Конорски Ю.М.Д. (1970). Интегративная деятельность мозга. Москва, «Мир», 412с.

14. Ленков Д.Н., Моченков Б.П. (1984). Моторное представительство лицевой мускулатуры в неокортексе кролика. Журнал Высшей Нервной Деятельности им. И.П.Павлова, 34(1), 81-88.

15. Николе Дж.Г., Мартин Ф.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. (2003). От нейрона к мозгу. Москва, УРСС, 672с.

16. Пигарева, М. Л. (1983). Экспериментальная нейропсихология эмоций: Автореферат диссертации доктора биологических наук. Москва, 38с.

17. Проничев И.В. (2000). Морфофункциональная организация центральных систем управления лицевой мускулатурой у взрослых и развивающихся мышей. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. 287с

18. Светухина В.М. (1962). Цитоархитектоника новой коры мозга в отряде грызунов (крыса белая). Арх. АГЭ, 52 (XLII), 2, 31-44.

19. Симонов П.В. (1987). Мотивированный люзг.Москва, «Наука», 238 с .

20. Смирнов П.В. (1976). Стереотаксическая неврология. Л., 246с.

21. Чиженкова Р.А. (1986). Структурно-функциональная организация сенсомоторной коры. Москва, Наука. 240с

22. Швырков В.Б. (1978). Нейрофизиологическое изучение системных механизмов поведения. Москва, Наука. 240с.

23. Швырков В.Б. (1995). Введение в объективную психофизиологию. Нейрональные основы психики. Москва, Ин-т психологии РАН. 162.

24. Adey W.R., Walter D.E., Hendrix Е. (1961). Computer techniques in correlation and spectral analyses of cerebral slow waves during discriminative behavior. Experimental Neurology, 3, 501-524.

25. Ambrogi Lorenzini C , Baldi E., Bucherelli C , Tassoni G, (1996). Role of dorsal hippocampus in acquisition and retrieval of rat's passive avoidance response: a tetrodotozin functional inactivation study. Brain Research, 730, 32-39.

26. Ambrogi Lorenzini C , Baldi E., Bucherelli C , Tassoni G. (1997): Role of ventral hippocampus in acquisition, consolidation and retrieval of rat's passive avoidance response memory trace. Brain Research, 768(1-2), .242-248.

27. Ammassari-Teule M., Hoffman H-J., Rossi-Arnaud C. (1993). Learning in inbred mice: strain soecific abilities across three radial maze problems. Behaviour Genetic, 23, 405-412.

28. Anagnostaras SG, Maren S, Fanselow MS. (1999) Temporally graded retrograde amnesia of contextual fear after hippocampal damage in rats: within-subjects examination. JNeurosci. 19(3), 1106-1114.

29. Anagnostopoulos A.V., Mobraaten L.E., Sharp J.J., Davisson M.T. (2001). Transgenic and knockout databases: behavioral profiles of mouse mutants. Physiology and Behavior, 73(5), 675-89.

30. Arnsten A.F.T., Cai J.X., Murphy B.L., Goldman-Rakic P.C. (1994). Dopamine Dl receptor mechanisms in the cognitive performance of yong adult and aged monkQ-ys. Neuropharmacology, 116, 143-151.

31. Badiani A., Gates M. M., Day H. E. W., Watson S. J., Akil H., and Robinson T. E. (1998). Amphetamine-Induced Behavior, Dopamine Release, and c-fos mRNA Expression: Modulation by Environmental Novelty. The Journal ofNeuroscience, 18(24), 10579-10593.

32. Baeg EH, Kim YB, Jang J, Юш HT, Mook-Jung I, Jung MW. (2001). Fast spiking and regular spiking neural correlates of fear conditioning in the medial prefrontal cortex of the rat. Cerebral Cortex, 11, (5), 441-51.

33. Balogh S. A., Wehner J. M. (2003). Inbred mouse strain differences in the establishment of long-term fear memory. Behavioural Brain Research, 140, 97-106.

34. Bannerman D.M., Grubb M., DeaconR.M., Feldon J., RowlingJ.N. (2003). Ventral hippocampal lessions affect anxiety but not spatial learning. Behavior Brain Research, 17, 139(1-2), 197-213.

35. Bast Т., Zhang Wei-Ning, and Feldon J. (2003). Dorsal Hippocampus and Classical Fear Conditioning to Tone and Context in Rats: Effects of Local NMDAReceptor Blockade and Stimulation. Hippocampus, 13, 657-675.

36. Bayer S.A,, (1990). Neurogenetic patterns in the medial limbic cortex of the rat related to anatomical connections with the thalamus and striatum. Exptrimental Neuroljgy, 107(26), 132-42.

37. Bignami G. (1965). Selection for high rates and low rates of conditioning in the rat. Animal Behaviour, 13, 221-227.

38. Bolles R.C., Collier A.C. (1976). The effect of predictive cues on freezing in rats. Animal learning and behavior, 4, 6-8.

39. Bouton ME, Bolles RC. (1979). Role of conditioned contextual stimuli in reinstatement of extinguished fear. Eximentalp Psychoogy and Animal Behaviour Process, 5(4), 368-378.

40. Brooks S.P., Pask Т., Jones L., Dunnett S.B. (2004). Behavioural profiles of inbred mouse strains used as transgenic backgrounds. I: motor tests. Genes Brain Behaviour, 3(4), 206-15,

41. Bunsey M.D. and Eichenbaum H., (1996). Conservation of hippocampal memory function in rats and humans. Nature, 379, 255-257.

42. Burn V. H., Otnaess M.K., Molden S., Steffenach H.-A., Witter M.P. et al. (2002). Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry. Science, 296, 2243-2246.

43. Calamandrei, G. and Keverne, E.B. (1994). Differential expression of Fos protein in the brain of female mice dependent on pup sensory cues and maternal QxpQriQnce. Behavioral Neuroscience, 108, 113-120.

44. Carter C.S., Braver T.S., Barch D.M., Botvinick M.M., Noll D., Cohen J.D. (1998). Anterior cingulate cortex, error detection, and the online monitoring of performance. Science, 280, 747-749.

45. Castro-Alamancos M.A., Borrell J., Garcia Segura L.M. (1992). Performance in an escape task induces Fos-like immunoreactivity in a specific area of the motor cortex of the rat. Neuroscience, 49; 157-162.

46. Collier A.C. (1977). Preference for shock signal as function of the temporal accurancy of signals. Learning and memor,S, 159-170.

47. Contet C , Rawlins J.N., Bannerman D.M. (2001a). Faster is not surer - a comparison of C57B1/6J and 129S2/Sv mouse strain in watermaze. Behavior Brain Research. 125, 261-267.

48. Davis M. (1992). The Role of the Amygdala in Conditioned Fear. In: "Tte amygdala: Neurobiological Aspects of Emotion, Memory, and Mental Dysfunction ", Aggleton JP, ed.. New York, Wiley-Liss,.255-306.

49. Deacon R.M., Bannerman D.M., Kirby B.P., Croucher A., Rawlins J.N.P. (2002). Effects cytotoxic hippocampal lesion in mice on a cognitive test battery. Behavioural Brain Research, 133, 57-68..,

50. Deacon R.M., Croucher A., Rawlins J.N.P. (2002). Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behavior Brain Research, 132, 203-213.

51. Deacon T.W., Eichenbaum H.E., Rosenberg P., Eckman K.W. (1983). Afferent connections of the peririnal cortex in the rat. Journal Comparative Neurology, 220, 168-190.

52. Divac I., Morgenson R.J., Blanchard D.C., Blanchard D.C. (1984). Mesial cortical lesions and fear behavior in the wild rat. Physiological Psychology, 12, 271-274.

53. Dockstader C.L., van der Kooy D. (2001). Mouse strain differences in opiate reward learning are explained in anxiety, not reward or learning. Journal ofNeurosciences, 21(22), 9077-9081.

54. Donoghue J.P., Wise S.P. (1982). The motor cortex of the rat: cytoarchitectonture and microstimulation mapping. Journal of Comparative Neurology, 212(1), 76-88.

55. Dragunow M. (1996). A role for immediate-early transcription factors in learning and memory. Behavioral Genetic^ 26(3), 293-299.

56. Duncan GE, Knapp DJ, Breese GR (1996). Neuroanatomical characterization of Fos induction in rat behavioral models of anxiety. Brain Research, lU, 19-191.

57. Fanselow M.S. (1980). Pavlovian Journal of Biological Sciences,15, 177- 182.

58. Fanselow M.S. (1994). Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychon. Bull. Rev, 1, 429-438.

59. Fanselow M.S., BoUes R.C. (1979). Naloxon and shock-eliciting freezing in the rat. Journal Comparative Physiological Psyhology, 93, 736-744.

60. Flint J., Corley R., DeFries L.C., Fulker D.W., Gray J.A., Miller S., Collins A.C. (1995). A simple genetic basis for a complex psychological trait in laboratory mice. Science, 269, 1432-1435.

61. Frankland P.W., Cestari V., Filipkowwski R.K., McDonald R.J., Silva A. (1998). The dorsal hippocampus is essential for context discrimination, but not for contextual conditioning. Behavior Neuroscience, 112, 863-874.

62. Franklin K. B. J., Paxinos G. (1997^ The Mouse Brain in Steriotaxic Coordinate, Academic Press, San Diego, California, USA,

63. Frysztak R., Neafsey E. (1994). The effect of medial frontal cortex lesions on cardiovascular conditioned emotional responses in the rat. Brain Research, 643, 181-188.

64. Fuster J.M. (1998). Distributed memory for both short and long term. Neurobiol. Learning and. Memory, 70, 268-274.

65. Gerlai R. (1996). Gene-targeting studies of mammalian behavior: is it the mutation or background genotype? Trends Neuroscience, 19, (5), 177-181.

66. Goldman-Rakic P.S. (1987). Development of cortical circuitry and cognitive function. Children Development, 58, 601-622.

67. Goldman-Rakic P.S. (1996). Regional and cellular fraction of working memory. Process National Academy of Sciences of USA, 93, 13473-13480.

68. Greenberg M.E. , Shyu A.B., Belasco J.G. (1990). Deadenylation: a mechanism controlling c-fos mRNA decay. Enzyme, 44, 181-192.

69. Duncan G.E., Knapp D.J., Breese G.R. (1996). Neuroanatomical characterization of Fos induction in rat behavioral models of anxiety. Brain Research, 713,79-91.

70. Gustafson J.W., Felbain-Keramidas Sh.L. (1977). Behavioral and neural approaches to the function of the mystacial vibrissae. Psychological Bulletin, 84(3), 477-488.

71. Hall R.D., Lindholm E.P. (1974). Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Research, 66(1), 23-38.

72. Harrell AV, Allan AM. (2003). Improvements in hippocampal-dependent learning and decremental attention in 5-HT(3) receptor overexpressing mice. 1.earning and Memory, 10(5), 410-419.

73. Herdegen Т., Leah J. (1998). Inducible and constitutive transcription factors in mammalian neurons sustem: control of gene expression by Jun, Fos and Krox and CREB/ATF proteins. Brain Research Reviews, 28, 370-382.

74. Hess U. S., Lynch G. and Gall С M. (1995). Regional patterns of c-fos mRNA expression in rat hippocampus following exploration of a novel environment versus performance of a well-learned discrimination. Journal of Neuroscience, 15, 7796-7809.

75. Hirsh, R. (1974). The hippocampus and contextual retrieval of information from memory: a theory. Behavior Biology, 12, 421-444.

76. Hock B.J. & Bunsey M.D. (1998). Differential effects of dorsal and ventral hippocampal lesions. J. Neuroscience, 18 (17), p. 7027-7032

77. Holmes A, Wrenn CC, Harris AP, Thayer KE, Crawley JN. (2002). Behavioral profiles of inbred strains on novel olfactory, spatial and emotional tests for reference memory in mice. Genes, Brain and Behavior, 1(1), 55-69.

78. Ito S., Stuphorn v. , Brown J. W., Schall J. D. (2003). Performance Monitoring by the Anterior Cingulate Cortex During Saccade Countermanding. 5с/еисе, 302(5642), 120-122.

79. Jue He, Kiyofumi Yamada, and Toshitaka Nabeshima (2002). A Role of Fos Expression in the CA3 Region of the Hippocampus in Spatial MemoryFormation in Rats. Neuropsychopharmacologe, 26(2), 259-268.

80. Jung M.V., Weiner S.I., McNaughton B.L. (1994). Comparison of spatial firing characteristics of units in dorsal and ventral hippocampus of the rat. Journal ofNeurosciense, 14, 7347-7356.

81. Jarrard I.E., Becker, (1977). The effects of selective hippocampal lessions on DRL behavior in rats. Behavior Biology, 21, 393-404.

82. Kim J.J., Fanselow M.S. (1992). Modality-specific retrograde amnesia of fear. Science, 256, 615-611.

83. Kimble, ЮтЫе., (1970). Effect of hippocampal lessions on extinction and "hipothesis" behaviour in rat. Physiology And Behavior, 5, 735-738.

84. Kjelstrup K.G., Tuvnes F.A., Steffenach H.A., Murison R., Moser E.I., Moser M.B. (2002). Reduced fear expression after lesions of the ventral hippocampus. Process National Academy of Sciences of USA, 99(16), 10825-10830 .

85. Юе1т J.A., Lussnig E., Schwarz E., Comery T.A., Greenough W.T. (1996). Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. Journal of N euros cience, 16, 4529.

86. Krieg W. (1963). Connection of the cerebral cortex. Copyright, USA, Brain Books, 294-300.

87. Lamprecht R., Dudai Y. (1996). Transient of c-Fos expression in rat amigdala during training is required for encoding conditioned taste aversion memory. Lerning and Memory, 3, 31-41.

88. Lathe R. (1996). Mice, gene targeting and behaviour: more then just genetic background. Trends ofNeuroscience, 19(5), 183-186.

89. Lattal K. M., Abel T. (2001). Different Requirements for Protein Synthesis in Acquisition and Extinction of Spatial Preferences and Context-Evoked Fear. The Journal of Neuroscience, 21(15), 5773-5780.

90. Le Doux (1992). Emotion and Amygdala. In: "Tte amygdala: Neurobiological Aspects of Emotion, Memory, and Mental Dysfunction", Aggleton JP, ed., New York: Wiley-Liss, 339-351.

91. Le Doux J.E. (2000). Emotion Circuits in the Brain. Annual Revues of Neurosciences,23, 155-184.

92. Le Doux J.E., Cicchetti P., Xagoraris A., Romanski L-M. (1990). The lateral amygdaloid nucleus: Sensory interface of amygdala in fear conditioning. Journal of Neuroscience, 10, 1062-1069.

93. Li e x . , Waters R.S. (1991). Organization of the mouse motor cortex studied by retrograde tracing and intracortical microstimulation (ICMS) mapping. Canadian Journal Neurologica. Sciences., 18(1), 28-38.

94. Lipp H.-P. and Wolfer D.P. (1995). New paths towards old dreams: microphrenology. In: Behavioral brain research in naturalistic and semi-nauralistic settings, edited by Alleva et al., 3-36.

95. Lipp H.-P. and Wolfer D.P. (1998). Genetically modified mice and cognition. Current Opinions of Neurobiology, 8(2), 272-280.

96. Luft A.R., Buitrago M.M., Ringer Т., Dichgans J., Schulz J.B. (2004) Motor skill learning depends on protein synthesis in motor cortex after training. Journal ofNeuroscience, 24(29):6515-20.

97. Maren S., Fanselow M.S. (1995). Synaptic plastisity in the basolateral amygdala induced by hippocampal formation stimulation in vivo. Journal of Neurosciences, 15, 7548-7564.

98. McGuinness E., Sivertsen D., Allman J.M. (1980). Organization of the face representation in macaque motor cortex. Journal of Comparative Neurology, 193(3), 591-608.

99. Means L.W., Douglas R.J. (1970). Effects of hippocampal lesions on cue utilization in spatial discrimination in rats. Journal of Comparative Physiological Psychology, 1^(2), 254-260

100. Milanovic S., Radulovic J., Laban O., Stiedl., Henn F., Spiess J. (1998). Production of the Fos protein after contextual fear conditioning of C57Bl/6n mice. Brain Research, 784, 37-47.

101. Mileusnic R., Anokhin K.V., Rose S.P.R., (1996). Antisense oligodeoxynucleotides to c-fos are amnestic for passive avoidance in the chick. NeuroReport. 7, 1269-1274.

102. Miner L.L. (1997). Cocain reward and locomotor activity in C57B1/6J and 129/SvJ inbred mice after their Fl cross. Pharmacological Biochemistry and Behavior, 58, 25-30.

103. Mitz AR, Wise SP. (1987). The somatotopic organization of the supplementary motor area: intracortical microstimulation mapping. Journal of Neuroscience, (4), 1010-1021.

104. Montkowski A., Poettig M., Mederer A., Holsboer F. (1997). Behavioral performance in three substrains of mouse strain 129. Brain Research, 762, 12-18.

105. Morgan M., LeDoux J. (1995). Differential contribution of dorsal and ventral medial prefrontal cortex to the acquisition and extinction of conditioned fear in rats, Behavior Neurosciences, 109, 681.

106. Moser M.-B. & Moser E.I. (1995). Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Process National Academy of Science of USA, 92, 9697-9701.

107. Moser M.-B. & Moser E.I. (1998). Distributed Encoding and Retrieval of Spatial Memory in the Hippocampus. Journal of Neuroscience, 18(18), 7535-7542.

108. Moser EI, Paulsen O. (2001). New excitement in cognitive space: between place cells and spatial memory. Current Opinion of Neurobiology, 11(6), 745-751.

109. Murrey E.A., Gaffan D., Mishkin M. (1993). Neural substrates of visual stimulus-stimulus association in rhesus monkeys. Journal of Neuroscience., 13, 4549-4561.

110. Nauta W (1972). Neural associations of the frontal cortex. Acta neurobiologiae experimental is, 32, 125-140..

111. Nguyen P.v., Abel Т., Kandel E. R. and Roussoudan B. (2000). Strain- dependent Differences in LTP and Hippocampus-dependent Memory in Inbred Mice. Learning & Memory, 7, 170-179.

112. O'Keef J., Nadel L. (1978). The hippocampus as a cognitive map. Oxford, England: Clarendon Press.

113. Papez, J. W. (1937). A proposed mechanism of emotion. Archives of Neurology and Psychology, 38, 725-43.

114. Pailor R., Baskall L., Wehner J.M. (1993). Behavioral dissociations between C57B1/6 and DBA/2 mice on learning and memory tasks: hippocampal-dysfunction hypotesis. Psychobiology, 21, 11-26.

115. Preuss TM, Stepniewska I, Kaas JH. (1996). Movement representation in the dorsal and ventral premotor areas of owl monkeys: a microstimulation study. Journal of Comparative Neurology, 371(4), 649-676,

116. Picciotto M.R. (1999). Knock-out mouse models used to study neurobiological systems. Critical Revues of Neurobiology, 13(2), 103-49.

117. Porter L.L., Sakamoto K. (1988). Organization and synaptic relationships of the projection from the primary sensory to the primary motor cortex in the cat. Journal of Comparative Neurology, 271(3), 387-96.

118. Posner M.I. (1994) Attention: the mechanisms of consciousness. Process National Academy of Science of USA, 91, 7398-7403.

119. Radulovic J., Kammermeier J, Spiess J. (1998). Generalization of fear responses in C57BL:6N mice subjected to one-trial foreground contextual fear conditioning. Behavioural Brain Research, 95, 179-189.

120. Rosen J, Fanselow M, Young S, Sitcoske M, Maren S, (1998). Immediate-early gene expression in the amygdala following footshock stress and contextual fear conditioning. Brain Research, 796, 132-142.

121. Sanders M.J., Wiltgen B.J., Fanselow M.S. (2003). The place of the hippocampus in fear conditioning European Journal of Pharmacology, 463, 217-223.

122. Sanderson K.J., Welker W., Shambes J.M. (1984). Ruvaluation of motor cortex and sjmatosensor overlap in cerebrol cortex of albino rats. Brain Research, 292, 251-260.

123. Schimanski LA, Wahlsten D, Nguyen PV. (2002). Selective modification of short-term hippocampal synaptic plasticity and impaired memory extinction in mice with a congenitally reduced hippocampal commissure. Journal of Neuroscience, 22(18), 8277-8286.

124. Scoville W.B., Milner B. (1957). Loss of recent memory after bilateral hippocampal lessions. Journal of Neurological Neurosurgery and Psyhiatry, 20, 11-21.

125. Searle L.V. (1949). The organization of hereditary maze-brightness and maze-dullness. Genetic Psychology Monographs, 39, 279-325.

126. Selmanoff MK, Maxson SC, Ginsburg BE. (1976). Chromosomal determinants of intermale aggressive behavior in inbred mice. Behavioral Genetic, 6(1), 53-69.

127. Siegmund A., Langnaese K, Wotjak C.T. (2005). Differences in extinction of conditioned fear in C57BL/6 substrains are unrelated to expression of alpha-synuclein. Behaviour Brain Research, 157(2), 291-298.

128. Simons D.J., Durkam D., Woolsey T.A. (1984). Functional organization of mouse and rat SmI barrel cortex following vibrissal damage on different postnatal days. Somatosens. Res, 1(3), 207-245.

129. Sokolowski J.D., McGuIlough I.D., Salamon J.D. (1994). Effects of dofamine depletions in the medial prefrontal cortex on active avoidance behavior and escape in the rat. Brain Research, 651, 293-299.

130. Stark Н., Bischof A., Scheich H. (1999). Increase of extracellular dopamine in prefrontal cortex of gerbils during acquisition of the avoidance strategy in the shuttle-box. Neuroscience Letters, 264, 77-80.

131. Stevens R. and Cowey A. (1973). Effects of dorsal and ventral hippocampal lessions on spontaneous alteration, learned alteration, and probability learning in rats. Brain Research, 52,203-224.

132. Stiedl O., Radulovic J., Lohmann R., Birkenfel, K., Palve M., Kammermeier J., Sananbenesi F. & Spiess J. (1999). Strain and substrain differences in context- and tone-dependent fear conditioning of inbred mice. Behavioural Brain Research 104, 1-12.

133. Szabowski A, Maas-Szabowski N, Andrecht S, Kolbus A, Schorpp- Kistner M, Fusenig NE, Angel P (2000). c-Jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymal-epidermal interaction in skin. Cell, 103, 745-755.

134. Tischmeyer W., Grimm R. (1999). Activation of immediate early genes and memory formation. Cell Molecular Life Science, 55(4), 564-574

135. Vann D., Brown M.W., Erichsen J., Aggleton P. (2000). Fos imaging reveals differential patterns of hippocampal and parahippocampal subfield activation in rats in response to different spatial memory tests. Journal of Neurosciences, 20 (7), 2711-2718.

136. Vogt BA, Finch DM, Olson CR. (1992). Functional heterogeneity in cingulate cortex: the anterior executive and posterior evaluative regions. Cerebral Cortex, 2(6), 435-443.

137. Vosatka R.J, Hermanowski V.A, Metz R, Ziff E.B. (1989). Dynamic interactions of c-fos protein inserum-stimulated 3T3 cells. Journal of Cell Physiology, 38, 493-502.

138. Waddell J, Dunnett C, Falls WA. (2004). C57BL/6J and DBA/2J mice differ in extinction and renewal of extinguished conditioned fear. Behavioural Brain Research, 154(2), 567-576.

139. Ward B.C., Nordeen E.J., Nordeen K.W. (1998). Individual variation in neuron number predicts differences in the propensity for avian vocal imitation. Process National Academy of Science of USA, 95(3), 1277-82.

140. Werlen G., Belin D., Conne В., Roche E., Lew D.P., Prentki M. (1993). Intracellular Ca2+ and the regulation of early response gene expression in HL-60 myeloid leukemia cells. Journal of Biological Chemistry, 268,16596-16601.

141. Withers G.S., GreenoughW.T, (1987). Reach training selectively alters dendritic branching in subpopulations of layer II-III pyramidals in rat motor-somatosensory forelimb cortex. Neuropsychologia, 27, 61-69.

142. Worley P. F., Bhat R.V., Baraban J.M., Erickson C.A., McNaughton B.L., Barens C.A. (1993). Thresholds for sinaptic activation of transcription factors in hippocampus: correlation with long-term enhancement. Journal of Neurosciences, 13, 4776-4786.

143. Young S.L., Bohenek D.L., Fanselow M.S. (1994). NMDA processes mediate anterograde amnesia of contextual fear conditioning induced by hippocampal damage: immunization against amnesia by context preexposure Behaviour Neuroscience, 108(1), 19-29.

144. Zashley K.S (1941). Talamo-cortical connection of the rat's brain. Journal of Comparative Neurology, 75(1), 67-121.

145. Zeng D., Stuesse S.L. (1991). Morphological heterogeneity within the cingulate cortex in rat: a horseradish peroxidase transport study. Brain Research, 565(2), 290-299.