Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение активации различных отделов гиппокампа после выполнения грызунами пространственных тестов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение активации различных отделов гиппокампа после выполнения грызунами пространственных тестов"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

На правах рукописи

Купцов Павел Андреевич

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛОВ ГИППОКАМПА ПОСЛЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ГРЫЗУНАМИ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ

ТЕСТОВ.

03.00.13. - Физиология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики поведения биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова и в Отделе системогенеза ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Плескачева Марина Григорьевна доктор медицинских наук член-корреспондент РАМН Анохин Константин Владимирович

доктор биологических наук Дубынин Вячеслав Альбертович

доктор биологических наук Ермакова Ирина Владимировна

Ведущая организация: НИИ мозга РАМН

15 ^

Защита диссертации состоится 13 февраля 2006 г. в_часов

на заседании Диссертационного Ученого Совета Д 501.001.93 при биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. Адрес: Москва, Воробьевы горы, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 13 февраля 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, У /? /

доктор биологических наук /7^/7 Умарова Б.А.

/o&f

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Гиппокамп - одна из центральных структур мозга отвечающая за ряд сложных когнитивных процессов, в том числе ориентировочно-исследовательское поведение (напр. Douglas, 1967; Виноградова 1975; Save et al., 1992) и пространственное обучение и память (Olton et al., 1978; Morris et al., 1982). Несмотря на долгую историю изучения, функции и принципы работы гиппокампа во многом не ясны и активно обсуждаются (Vinogradova, 2001; Burgess, 2002; Good, 2002; Small, 2002; Jacobs, Schenk 2003 и др.). Исследования последних лет подтверждают более ранние предположения (напр. Hughes, 1965; Унгиадзе, 1970 и др.) о функциональной неоднородности разных отделов гиппокампа. Так современные морфологические данные позволяют рассматривать гиппокамп как сложную трехмерную структуру, ростральная и каудальная часть которой получает проекции от разных частей энторинальной коры (Amaral, Witter 1989, 1995; Insausty et al., 1997; Dolorfo et al., 1998а,б; Witter et al., 2000). Характеристики «клеток места» поля СА1 отличаются в разных точках росгрокаудальной оси (Jung et al., 1994). Развитие методов тонких избирательных удалений позволило накопить данные об участии разных отделов гиппокампа в процессах пространственного обучения и памяти (см. Poucet et. al 1994а; Moser et al., 1993, 1998; Bannerman et al., 1999, 2003, 2004; Kjelstrup et al., 2002; Ferbinteanu et al., 2003; Pothuizen et al., 2004). Однако, необходимо отметить, что выводы многих исследователей об особенностях функционирования разных отделов гиппокампа, часто не согласуются друг с другом (см. напр. Richmonds et al., 1999 и Bannermann et al., 1999; Moser et al., 1993 и de Hoz et al., 2003).

Важно подчеркнуть, что даже в случае использования щадящих удалений структур исследователи оценивают функционирование поврежденного мозга, неинвазивные методы позволяют этого избежать. В представленной работе мы проводили оценку функционирования неповрежденной структуры путем картирования активации нейронов по экспрессии в них продуктов гена c-fos. (Sagar et al., 1988; Dragunow, Faull, 1989; Анохин, 1997; Herdegen et al., 1998; Kaczmarek, 2002). Использование такого маркера позволяет оценить активацию как сразу многих отделов мозга, так и одной структуры на всем её протяжении, что крайне сложно сделать, применяя электрофизиологические методы и разрушая отделы мозга.

Особенности экспрессии c-Fos в гиппокампе после пространственного обучения изучены недостаточно, такие исследования появились сравнительно недавно и они немногочисленны (Vann et al. 2000а; Guzovski et al., 2001; He et al., 2002a,b; Passino et al., 2002; Jenkins et al., 2003, 2004; Touzani et al., 2003). Необходимо отметить, что в этих работах не оценивали активацию гиппокампа на всем его протяжении, поэтому в настоящем исследовании представлялось важным изучить экспрессию c-fos в гиппокампе вдоль всей его продольной оси. Кроме того, в перечисленных выше работах, экспрессию оценивали после длительного и сложного обучения в радиальном и других лабиринтах. В отличие от этих исследований, нас интересовал непосредственно начальный эффект обучения и освоения нового пространства, без дополнительных влияний, таких как выработанные стратегии посещений рукавов, пищевая мотивация, излишнее стрессирование и др.

В качестве объектов нашего исследования были выбраны лабораторные мыши хорошо изученной инбредной линии C57BIV6, для которых характерна интенсивная исследовательская активность (Crusio, 1989) и высокий уровень решения пространственных тестов (Ammassari-Teule et al, 1993), и представители грызунов (рыжая и обыкновенная полевка), принадлежащих к другому семейству (Хомяковые, Cricetidae). Известно, что полевки хорошо обучаются выполнению различных пространственных задач (напр. Galea et al., 1994а; Teskey et al., 1998), в ряде случаев лучше, чем лабораторные мыши (Pleskacheva et al, 2000). Сопоставление физиологических особенностей работы гиппокампа и поведения полевок и лабораторных мышей позволит, с одной стороны, избежать акцентирования на узко специализированных для лабораторных животных феноменах, а с другой стороны, выявить видоспецифические особенности поведения грызунов, занимающих в природных условиях определенные экологические ниши. В то же вре^С схЪЖёСТггдаштых, полученных на грызунах

разных видов, позволит предположить, что обнаруженные феномены активации гиппокампа могут носить общий характер, по крайней мере, для грызунов.

Цели и задачи исследования

Изучение активации различных отделов гиппокампа грызунов на начальных этапах обучения и освоения нового пространства.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методики, позволяющие быстро оценивать начальные этапы пространственного обучения и освоения нового пространства, адекватные для тестирования и лабораторных мышей, и полевок, выловленных в местах их обитания

2. Оценить экспрессию с-Иоя в разных областях гиппокампа и зубчатой фасции при пространственном обучении и освоении нового пространства, используя иммунногистохимический метод.

3. Исследовать поведете и особенности экспрессии с-Роя у лабораторных мышей линии С57В176 и полевок.

Основные результаты и их научная новизна

Для оценки начальных этапов пространственного обучения и освоения пространства были разработаны новые методики, позволяющие быстро и без дополнительного стрессирования тестировать лабораторных и диких мышевидных грызунов: модификации теста «открытое поле» с контролируемыми зрительными стимулами и 8-лучевого радиального лабиринта с возможностью выхода в домашнюю клетку. Выявлено, что полевки лучше, чем лабораторные мыши, запоминают местоположение убежища (рыжие полевки) или направление рукава, ведущего к выходу из лабиринта (обыкновенные полевки), используя для ориентации дистантные зрительные стимулы.

Впервые были изучены особенности экспрессии с-Гоя в гиппокампе и зубчатой фасции грызунов на начальных этапах обучения и освоения ими нового пространства. Необходимо отметить, что оценка экспрессии с-Роэ у полевок после обучения ранее другими исследователями не проводилась.

Наши данные подтвердили выводы других исследователей об активации гиппокампа при выполнении пространственных задач (напр. Уапп а1., 2000а; (ЗшоузИ е1 а1., 2001 и др.) Однако, впервые показано, что такая активация была неравномерна в разных частях гиппокампа Усиление экспрессии с-Роя в разных частях структуры было вызвано различными экспериментальными факторами Так, активация каудальных отделов полей гиппокампа и зубчатой фасции, очевидно, бьиа следствием перемещения животных в пространстве. Когда ограничивали возможность их передвижения, интенсивность экспрессии заметно снижалась Введение новых зрительных стимулов не вызывало дополнительной активации каудальных отделов, но активировало ростральные области гиппокампа. Усиление экспрессии в этом случае было слабее, чем вызванное в каудальном гиппокампе передвижением животных. Хотя поведение животных в условиях симметричного и асимметричного расположения зрительных стимулов различалось, этот фактор слабо влиял на экспрессию в ростральных отделах гиппокампа. Кроме того, в проведенных экспериментах была выявлена синергичность в активации поля САЗ и зубчатой фасции, в отличие от поля СА1, ростральные области которого слабо изменяли активность при перемещении животных.

Сравнение особенностей активации экспрессии с-Роя в гиппокампе лабораторных мышей и полевок выявило принципиальное сходство этих процессов у сравниваемых видов. И у тех, и у других перемещение, как в открытом поле, так и в лабиринте, активировало каудальные отделы, тогда как новые зрительные стимулы воздействовали преимущественно на ростральные отделы. Это может свидетельствовать о том, что выявленные эффекты носят общий, по крайней мере, для грызунов характер и отражают различную роль ростральных и каудальных отделов гиппокампа в поведении животных. Выявлены и различия в активации гиппокампа: у лабораторных мышей отмечено большее, чем у полевок, усиление экспрессии с-Роя в ответ на перемещение животных и на введение новых стимулов.

Научно-практическое значение

Полученные новые результаты вносят вклад в понимания принципов функционирования гиппокампа, его участия в процессах, связанных с перемещением и ориентированием животных в пространстве. Проведенное исследование позволило показать, что ростральная и каудальная части гиппокампа по-разному вовлекаются в процессы освоения нового пространства Обнаруженные факты существенно уточняют, дополняют имеющиеся немногочисленные данные о функциональной неоднородности гиппокампа и могут быть использованы для дальнейшего его изучения, особенно для нейрофизиологических исследований каудальных отделов, характеристики нейронной активности которых слабо изучены. Учитывая факты, свидетельствующие о неоднородности различных частей гиппокампа и зубчатой фасции приматов (см. напр. Colombo et al., 1998; Small, 2002), полученные данные могут пополнить фундаментальные знания о работе этих структур, необходимые для развития методов диагностики и лечения ряда заболеваний человека (например, височной эпилепсии, болезни Альцгеймера, различных травм мозга, повреждающих гиппокамп).

Сравнение лабораторных и диких грызунов может быть полезно для уточнения оценки влияния процессов доместикации и лабораторного разведения на поведение животных и функционирование структур мозга.

Разработанные поведенческие методики могут быть широко использованы (в том числе и для изучения характеристик пространственного обучения и памяти диких грызунов) поскольку, по сравнению с существующими методами (например, водный тест Морриса, радиальный лабиринт), они обладают рядом преимуществ, так как основаны на естественной реакции животных (быстрое запоминание местоположения убежища), не требуют длительного обучения и характеризуются низким уровнем стрессирования.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых НИИ ВНД и НФ (Москва, 2002), на Международном Совещании териологического общества (Москва, 2003), на IV Фору No европейского общества нейрофизиологов (FENS, Лиссабон, Португалия, 2004), на XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005).

Материалы диссертации были апробированы на заседании кафедры высшей нервной деятельности Биологического ф-та МГУ им М.В. Ломоносова 27 октября 2005 г.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением методов, результатов и их обсуждения, выводов, и списка литературы. Работа включает 148 страниц машинописного текста, содержит 14 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 213 источников.

ЭКСПЕРИМЕНТ 1А И 1Б. ПРОСТРАНСТВЕННОЕ ОБУЧЕНИЕ В МОДИФИЦИРОВАННОМ «ОТКРЫТОМ ПОЛЕ» С КОНТРОЛИРУЕМЫМИ ЗРИТЕЛЬНЫМИ СТИМУЛАМИ.

МЕТОДИКА

Животные: В работе использовали мышей инбредной линии C57BL/6 (Эксперимент 1 А), массой 18-21 г, и рыжих полевок, массой 13-21 г (Эксперимент 1Б). Данные о распределении животных по экспериментальным группам представлены в таблице 1.

Экспериментальная установка: Животных тестировали в круглом «открытом поле», диаметром 150 см, при освещенности 140-160 люкс. Арена была окружена непрозрачным занавесом черного цвета, диаметром 250 см Внутри к нему были прикреплены по кругу прозрачные конверты формата А4 (210x297мм), расположенных в 3 ряда по 24. В них во время основного эксперимента помешали стимулы - белые листы с напечатанными черными геометрическими фигурами

3

(треугольники, кресты, круги) размером А4. Стимулы могли бьггь расположены асимметрично, в этом случае одна треть каждого ряда была заполнена только крестами, другая - кругами и третья -треугольниками, или симметрично - каждый ряд был представлен только одним типом фигур. Регистрацию поведения животного осуществляли с помощью автоматизированной системы, состоящей из видеокамеры Sony и персонального компьютера, оснащенного дополнительной платой видео ввода изображения Picolo. Программа Ethovision (Noldus, Нидерланды версии 1.96 и 3.0), позволяла сохранять траекторию перемещения животного в виде координат. Записанные треки конвертировали в программу Wintrack (www.dpwolfer ch/wintrack. Wolfer et al, 2001), с помощью которой определяли длину пройденного пути и время пребывания в различных зонах арены.

Процедура тестирования:

Эксперимент 1Ач Мыши были предварительно ознакомлены с ареной (3 дня, два 10-мин выпуска в день) Одновременно с началом приучения в домашнюю клетку животных помещали картонную коробочку-убежище (10X6X6 см).

Основной эксперимент проводили на 4-й день (6 попыток, по 6 минут с 10-мин интервалом). Мышей из контрольной группы тестировали в условиях, аналогичных этапу приучения, т.е. в арене без дополнительных стимулов Для других трех групп на занавес прикрепляли стимулы, а на пол арены, в центр одного из квадрантов, ставили коробочку-убежище из домашней клетки животного. Перед шестой попыткой убежище убирали. В двух группах с асимметричным и симметричным расположением дистантных зрительных стимулов коробочка на протяжении всего эксперимента находилась в одном и том же квадранте относительно внешних стимулов. Для разных особей местоположение коробочки было различно. Для третьей опытной группы стимулы располагали асимметрично, а местоположение коробочки варьировали от попытки к попытке. После окончания эксперимента мышь отсаживали в отдельную клетку на 45 минут, по истечении которых проводили декапитацию Оценку фонового уровня экспрессии проводили в мозге интактных животных (группа пассивного контроля), взятых из домашней клетки.

Для иммуногистохимических исследований случайным образом было выбрано по 8 животных из каждой экспериментальной группы.

Эксперимент !Б% В связи с видоспецифическими особенностями рыжих полевок (высокий уровнень тревожности, склонность к замиранию, меньшая, чем у мышей, подвижность) процедура тестирования была несколько изменена Во время предварительного этапа длительность попытки составляла 15 минут, интервал между ними - 30 минут. Во время основного эксперимента (4-й день) полевок тестировали в 4-х попытках (по 10 минут с интервалом 15 минут), перед последней - убежище убирали.

Иммуногистохимическая процедура: Из замороженных образцов мозга на криостате "Microm Н-505" приготовляли серии коронарных срезов толщиной 20 мкм, собранных с шагом 100 мкм. Их начинали собирать на предметные стекла с момента появления гиппокампа (расстояние от брегмы -1,06 мм) до его каудальных отделов (расстояние от брегмы -3.8 мм). Срезы идентифицировали с помощью атласа мозга мышей линии C57BL/6 (Franklin, Paxinos, 1984) Имуногистохимическое выявление c-Fos-иммунореактивных нейронов проводили по стандартному протоколу с использованием поликлональных кроличьих антител к белку c-Fos (АВ-5, Calbiochem, США) и аввдин-биотин-пероксидазного набора (Vector Laboratories, США).

Изображения гиппокампа оцифровывали с разрешением 3840x3072 с помощью цифровой камеры Nikon DX1200 и программы Act-1 (Nikon, США). Площадь выбранных структур (поля СА1, САЗ и зубчатая фасция) на срезе и число c-Fos-положительных клеток в каждой из них определяли с помощью программы анализа изображений Image Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, США). Границы полей определяли в соответствии с атласом мозга мыши (Franklin, Paxinos, 1984) Для каждой структуры рассчитывали показатель плотности как отношение количества c-Fos-активированных клеток к площади структуры Для анализа экспрессии c-Fos в разных частях гиппокампа было выбрано 8 рострокаудальных уровней срезов, каждый из которых объединял два или три значения АР координаты относительно брегмы Соответствие выбранных уровней и координат атласа показано в таблице 2.

4

Выбранные уровни 1 2 3 4 5 6 7 8

АР координата -1.22, -1.58, -1.82, -2.18, -2.46, -2.8, -3.16, -3.52,

(расстояние от •1.34, -1.7 -1.94 -2.3 -2.52, -2,92 -3.28 -3.64,

брегмы, мм) -1.46 -2.06 -2.7 • 3,08 -3.4 -3.8

Таблица 2. Уровни анализа срезов и их соответствие координатам атласа (Franklin, Paxinos 1984).

Статистический анализ: Дня статистического анализа использовали методы многофакторного дисперсионного анализа, t-критерий Стьюдента для независимых выборок, корреляционный анализ Спирмана. Различия считались достоверными при р<0.05. Анализ проводили с помощью программного обеспечения Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент 1А (с мышами С57В1/6)

Поведение мышей в модифицированном открытом поле:

Несмотря на интенсивное приучение, во время основного эксперимента (4-й день) мыши активно передвигались по арене, заходили в центр и посещали убежище. У животных, которых тестировали в условиях асимметричного расположения стимулов, выявлено снижение длины пути к 5-й попытке по сравнению с 1-й (для группы, у которой местоположение убежища было постоянным, t(u)=3.86, р<0.01; для группы, у которой варьировали его местоположение, t<n)=5.04, р<0.001). В 6-ю попытку (коробочка была убрана из арены), по сравнению с предыдущей, увеличивалась подвижность (t<7)=5.57, р<0.001) только тех мышей, которых тестировали в условиях асимметричного расположения стимулов и постоянного местоположения убежища. Только эти мыши, когда убежище убирали, проводили больше времени в квадранте, где оно стояло раньше, по сравнению с противоположным (t<22)=2.23, р<0.05) (рис. 1А).

Иммуногистохимические результаты:

Анализ иммуногистохимических данных выявил существенную неоднородность активации гиппокампа вдоль рострокаудальной оси. В группе активного контроля (животных которой выпускали в знакомое открытое поле без дополнительных стимулов), по сравнению с пассивным контролем, отмечено значительное усиление экспрессии c-Fos в каудальных отделах всех анализируемых полей (в 4-6 раз). Ростральные области поля САЗ и зубчатой фасции активировались слабее (в 2-3 раза), а в поле CAI экспрессия не превышала уровень пассивного контроля (рис. 2А). 2-х факторный дисперсионный анализ (факторы «группа» и «уровень среза») выявил во всех структурах достоверные эффекты группы и уровня (за исключением поля САЗ). Достоверный эффект взаимодействия этих факторов был только в поле CAI (табл. 3). Таким образом, перемещение животных даже по знакомой арене значительно усиливало экспрессию c-Fos, особенно в каудальных частях гиппокампа.

Введение новых дистантных зрительных стимулов и знакомого убежища не изменило активацию каудальных отделов (относительно активного контроля), но вызвало дополнительное усиление экспрессии c-Fos (в 1.5 - 2 раза) в ростральных отделах всех исследуемых полей, но в большей степени в САЗ (рис. 2Б). Для всех полей показаны достоверные отличия характеристик групп, тестировавшихся при разных вариантах расположения стимулов, от активного контроля (табл. 3). Кроме того, во всех случаях была выявлена и достоверная зависимость активации от уровня анализируемого среза. Различное расположение стимулов не оказывало значительного влияния на интенсивность экспрессии с-Fos.

Полученные данные позволили предположить, что именно перемещение мышей по арене оказывает самое существенное влияние на активацию гиппокампа, и особенно его каудальных отделов. Для проверки этого предположения были проведены контрольные опыты, в которых была сохранена вся схема эксперимента, но животных не выпускали, а помещали в арену в прозрачном цилиндре. Как и в предыдущем случае, пребывание в арене вызывало значимое усиление экспрессии, по сравнению с

пассивным контролем, в каудальных и средних отделах гиппокампа, но уровень экспрессии был ниже, чем в опытах с перемещающимися животными (табл. 3, рис. ЗА). На рис. 4А, где представлены показатели изменения интенсивности экспрессии в процентах, относительно значений пассивного контроля, видно, что активация экспрессии c-Fos у свободно перемещающихся мышей наибольшим образом усиливалась в каудальных и средних (но не в ростральных) отделах поля САЗ и зубчатой фасции. В поле CAI эти различия были менее выражены и отмечены только для наиболее каудального уровня. Дисперсионный анализ (факторы «перемещение» и «уровень») выявил достоверное воздействие перемещения на показатели экспрессии в поле САЗ (F(, ж))=23.78, р<0.001) и зубчатой фасции (F(i ад=52.61, JX0.001 X достоверную зависимость интенсивности экспрессии от уровня среза во всех полях: CAI (F(7>8o)=4.73, р<0.001), САЗ (F(7,xo)=9-20, р<0.001) и зубчатой фасции (F(7,8o)=8.17, р<0.001).

В контрольном эксперименте введение новых зрительных стимулов несколько усиливало экспрессию, но не во всех группах мышей (рис.ЗБ). Попарное сравнение с активным контролем показателей опытных групп, которых тестировали при дополнительных зрительных стимулах, выявило, что, как и в случае со свободно перемещающимися мышами, усиление экспрессии отмечено преимущественно в ростральных отделах полей CAI и САЗ, но только в случае асимметрично расположенных стимулов (с постоянным местоположением убежища), а в зубчатой фасции - и в случае симметричного расположения стимулов (табл. 3). Сравнение характеристик животных, которых тестировали при разных вариантах расположения стимулов, показало, что большая интенсивность экспрессии была у мышей, которых тестировали при асимметричном расположении зрительных стимулов и стабильным местоположением убежища, по сравнению с другими группами. Эти различия были наиболее выражены для поля CAI (в ростральных отделах).

Эксперимент 1Б (с рыжими полевками)

Поведение полевок в модифицированном открытом поле.

Во всех проведенных экспериментах не было выявлено половых различий в поведении и экспрессии c-Fos. Здесь и далее данные рассматриваются без разделения по полу.

Так же как и мыши, практически все полевки, несмотря на интенсивное приучение, активно перемещались по арене и посещали убежище, но, в отличие от мышей у полевок не было выраженных изменений длины пути в разных попытках и группах. Полевки по-разному реагировали на исчезновения убежища (4-я попытка). 5 полевок из разных групп были малоактивны. Они были исключены из дальнейшего анализа предпочтения разных зон арены. Так же как и мыши, только полевки группы с асимметричным расположением стимулов и стабильным местоположением убежища предпочитали больше перемещаться в целевом квадранте, где ранее стояло убежище, по сравнению с противоположным (t<7f=2.43, р<0.05). Чтобы исключить влияние активности у стенки арены, был проведен анализ количества пересечений центральной зоны квадрантов. И в этом случае достоверные различия между числом посещений целевой зоны и соседних (tp)=2.56, р<0.05), а также и противоположной (t(7)=2.65, р<0.05), обнаружены только для полевок этой группы (рис. 1 Б).

Иммуногистохимические результаты:

Показано значительное усиление экспрессии c-Fos в гиппокампе у полевок всех групп, перемещавшихся в открытом поле, по сравнению с группой пассивного контроля (рис. 5А, табл. 4). Как и у мышей, высадка в знакомое «открытое поле» вызывала значительно усиление экспрессии c-Fos в каудальных отделах гиппокампа и зубчатой фасции (в 3-4 раза). Однако, необходимо отметить, что в отличие от мышей, у полевок практически не выявлена активация ростральных отделов поля САЗ и зубчатой фасции в группе активного контроля. Достоверные различия между пассивным и активным контролем обнаружены по всем исследуемым структурам, а эффект уровня заметен только в зубчатой фасции.

Так же как и у мышей, у полевок появление новых зрительных стимулов и знакомого убежища не изменяло активацию каудальных отделов гиппокампа, а вызывало усиление экспрессии в ростральных и промежуточных отделах, но, в отличие от мышей, дополнительная активация была отмечена только у одной группы (асимметричное расположение зрительных стимулов в сочетании с нестабильным местоположением убежища, рис. 5Б, табл. 4). Значительные отличия показателей этой группы от

6

характеристик активного контроля обнаружены для всех полей. Попарное сравнение опытных групп выявило, что интенсивность экспрессии у группы с нестабильным местоположением убежища достоверно превышала значения у двух других, не различавшихся между собой.

В дополнительных контрольных опытах (полевок высаживали в арену в прозрачном цилиндре), так же как и в экспериментах с мышами, показано, что пребывание животных в арене несколько усиливало, по сравнению с пассивным контролем, интенсивность экспрессии c-Fos только в полях CAI и САЗ (промежуточные и каудальные отделы) (рис. 6А, табл. 4). Это усиление было слабее, чем эффект при перемещении животных по арене. Как и у мышей, наиболее значительные различия между свободно перемещающимися и неперемещающимеся животными были обнаружены в каудальных отделах (5-8 уровень) всех полей (рис. 4Б). Дисперсионный анализ (факторы «перемещение» и ((уровень») выявил значимый эффект перемещения на показатели экспрессии (CAI: F(i,ss>=16.38, р<0.001, САЗ: F(i 88)=20.88, р<0.001, зубчатая фасция: F(]iss)=50.98, pO.OOl), достоверную зависимость от уровня среза (CAI: F(7,88)=4.72, р<0.001, САЗ: F(7,88)=4.47, pcO.OOl, зубчатая фасция: F(7,88)=6.57, pcO.OOl), а в поле САЗ и эффект взаимодействия этих факторов (F(ii7 88)=3.34, р<0.01).

Введение новых стимулов и убежища вызвало дополнительное усиление экспрессии, относительно активного контроля, в ростральных и средних отделах полей CAI и САЗ гиппокампа только в случае их симметричного расположения (рис. 6Б, табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 1А И 1Б

Как показали проведенные эксперименты, предложенная методика адекватна для тестирования пространственной памяти и лабораторных мышей, и рыжих полевок. Даже на 4-й день все мыши и большинство полевок активно перемещались по арене, часто заходя в центр. Введение новых стимулов дополнительно усиливало исследовательскую активность, грызуны особенно активно обследовали убежище. Высокий уровень исследовательской активности у мышей линии C57BL/6 в наших экспериментах, подтвердил данные и других авторов (напр. Crusio et al., 1989).

Мыши и полевки, которых тестировали при асимметричном расположении зрительных стимулов и стабильном местоположением убежища, в последнюю попытку чаще посещали и дольше находились в месте, где убежище было расположено ранее, по сравнению с другими зонами, что свидетельствует о запоминании местоположения убежища. Когда те же зрительные стимулы были расположены симметрично, животные не имели возможности запоминать местонахождение убежища, так как влияние каких либо оставшихся неконтролируемыми стимулов практически исключалось. Полученные данные подтверждают выводы других авторов о преимущественном использовании лабораторными грызунами для запоминания места в пространстве, например, в радиальном лабиринте, именно дистантных зрительных стимулов (Suzuki et al., 1980, Ammassari-Teule et al., 2001).

Необходимо отметить, что полевки запоминали местоположение убежище значительно точнее, чем мыши. По-видимому, предложенная задача является более адекватной для диких рыжих полевок, которым свойственно затаивание в убежище в потенциально опасной ситуации, чем для мышей C57BL/6, для которых коробочка является в большей степени объектом интенсивной исследовательской активности, чем убежищем. С другой стороны, мы можем предположить, что такие различия могут отражать и лучшие способности рыжих полевок к пространственному обучению. Наши данные подтверждают результаты исследования, в котором показано, что рыжие полевки успешно обучаются в пространственной версии водного теста Морриса (Pleskacheva et al., 2000). Они значительно точнее находили скрытую платформу, чем полевки другого вида (экономки), и их результаты превосходили известные из других литературных данных показатели лабораторных мышей (Lipp, Wolfer, 1998). Мы можем согласиться с предложенным ранее объяснением (Pleskacheva et al., 2000), что хорошие способности рыжих полевок к пространственному обучению обусловлены их экологическими особенностями, широкими адаптивными возможностями этого вида. Их индивидуальные участки обширны и с неоднородным ландшафтом (Громов, Ербаева, 1993). Поиск кормов, дисперсно распределенных по большой территории (в частности, семян), требует значительной нагрузки на пространственную память.

Несмотря на некоторые различия в поведении, были выявлены общие закономерности экспрессии с-Ров в гиппокампе мышей и полевок. В наших экспериментах высокий уровень исследовательской активности сопровождался и интенсивной экспрессией с-Ров в гиппокампе. В отличие от многих предшествующих работ (напр. Не й а1, 2002 а,б, Разйто й а!., 2002,), в которых анализ проводили на срезах, взятых в ростральной части гиппокампа, нами были проанализированы серии срезов, взятых с разных частей структуры, что позволило достаточно детально оценить активацию. Было обнаружено, что экспрессия была неравномерной в разных частях и полях гиппокампа и зубчатой фасции. Причем активация на разных уровнях оси была вызвана различными факторами эксперимента. И у мышей, и у полевок перемещение по арене вызывало значительную активацию каудальной части гиппокампа, в то время как введение новых зрительных стимулов и знакомого убежища не изменяло активацию этих областей, но активировало ростральные отделы. Необходимо отметить, что у полевок, в отличие от мышей, дополнительная активация ростральных отделов обнаружена только в том случае, когда стимулы были расположены асимметрично, и местоположение убежища не было стабильным. Большую экспрессию в этой группе можно объяснить тем, что, по-видимому, для полевок в большей степени, чем для мышей, у которых этих различий выявлено не было, значима нестабильность места укрытия. Опыты, в которых мыши и полевки не перемещались по арене, а находились в прозрачном цилиндре, подтвердили предположение о влиянии перемещения на активацию каудальных отделов гиппокампа. Введение новых зрительных стимулов дополнительно усиливало активацию ростральных отделов гиппокампа только в некоторых группах мышей и полевок. Возможно, это связано с малым числом животных в группах и индивидуальными различиями, особенно выраженными у полевок. Обнаруженные особенности активации ростральной и каудальной части гиппокампа будут рассмотрены далее в общем обсужде1ЛШ.

Таким образом, необходимо отметить, что выявленные феномены активации гиппокампа мышей линии С57В1У6 и рыжих полевок во многом сходны, что позволяет с большой надежностью рассматривать их как базовые явления функционирования гиппокампа грызунов. Для проверки полученных эффектов был проведен эксперимент, в котором использовали модифицированный 8-рукавный радиальный лабиринт. В этом случае животных опытной и контрольной группы тестировали в одинаковом и знакомом контексте. Целью этого эксперимента было оценить влияние перемещения в структурированной среде лабиринта на активацию гиппокампа.

ЭКСПЕРИМЕНТЫ 2А И 2Б. ОБУЧЕНИЕ В МОДИФИЦИРОВАННОМ РАДИАЛЬНОМ ЛАБИРИНТЕ, С ВОЗМОЖНОСТЬЮ ВЫХОДА В ДОМАШНЮЮ КЛЕТКУ.

МЕТОДИКА:

Животные: В работе использовали мышей инбредной линии С57В1У6 (Эксперимент 2А), массой 18-21 г., и обыкновенных полевок (Эксперимент 2Б), массой 16-24 г. (см. таблицу 1).

Экспериментальная установка: 8-рукавный радиальный лабиринт (длина прозрачного рукава 32 см, диаметр центральной части 36 см) был модифицирован таким образом, что бы животные могли из конца рукава попадать в домашнюю клетку. Для этого в рукавах была установлена односторонняя непрозрачная дверь, через которую животное могло туда пройти Все рукава вели к клетками с опилками из домашней Во время эксперимента все двери были блокированы, за исключением одной, которая могла быть свободно открыта животным. Что бы исключить ориентирование по внутри лабиринтным стимулам, после каждой попытки лабиринт поворачивали, сохраняя направление целевого рукава. Для мышей лабиринт ярко освещали, что бы усилить мотивацию выхода из лабиринта, для пугливых полевок эксперимент проводили при более слабом освещении. Как и в предыдущих экспериментах, автоматическую регистрацию траектории животного осуществляли с помощью системы ЕйоУ&оп.

Вид Тип эксперимента Экспериментальные группы N Источник

мыши C57BL/6 Модифицированное открытое поле с контролируемыми зрительными стимулами. Животные перемешались по арене. Эксперимент 1А Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища 12<?<? Питомник «Столбовая»

Асимметричное расположение стимулов + нестабильное местоположение убежища 12<?<?

Симметричное расположение стимулов пав

Активный контроль 12<?с?

Пассивный контроль Ш

Модифицированное открытое поле с контролируемыми зрительными стимулами. Животные находились в стеклянном цилиццре. Эксперимент 1А Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища 4<?<?

Асимметричное расположение стимулов + нестабильное местоположение убежища 4с? с?

Симметричное расположение стимулов 4с?<?

Активный контроль 4<?с?

Модифицированный радиальный лабиринт. Эксперимент 2А Опытная группа Ш

Активный контроль Ш

Пассивный контроль 5вЗ

Рыжая полевка ('Clethrionomys glareolus Schreb) Модифицированное открытое поле с контролируемыми зрительными стимулами. Животные свободно перемешались по арене. Эксперимент 1Б Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища 9(7(J(?+ 2$$) Торопецкий заказник «Чистый Лес» (Тверская область) июль-сентябрь 2003г. Звенигородская биостанции МГУ (Московская область) август -сентябрь 2004г.

Асимметричное расположение стимулов + нестабильное местоположение убежища 9(8(3(? + 1?)

Симметричное расположение стимулов 9(5<?с?+ 4??)

Активный контроль 9 (7<?(?+ 225)

Пассивный контроль 4(2<?<?+ 222)

Модифицированное открытое поле с контролируемыми зрительными стимулами. Животные находились в стеклянном цилиндре. Эксперимент 1Б Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища 12)

Асимметричное расположение стимулов + нестабильное местоположение убежища 4 (Ш)

Симметричное расположение стимулов 4(3с?с?+ 12)

Активный контроль 4(3<?<? + 12)

Обыкновенная полевка (Microtus arvalis Pall.,) Модифицированный радиальный лабиринт. Эксперимент 2Б. Опытная группа 6<5<i(? + 12) Торопецкий заказник «Чистый Лес» (Тверская область) июль-сентябрь 2001 и 2002 гг.

Активный контроль б (4<?<?+ 222)

Пассивный контроль 4(3&? + 12)

Таблица 1. Число, пол и вид животных, используемых в экспериментах.

А

Б

целевой соседние противо- целевой соседние противо-

положный положный

Квадранты Квадранты

Рис. 1.

А. Средние (±ошибка средней) значения долей времени проведенного мышами С57ВЬ/6 в различных квадрантах арены.

Б. Средние (±ошибка средней) значения количества пересечений полевками центральной зоны (30см) квадрантов.

Отличия показателей соседних и противоположной зоны от целевой достоверны при * - р<0.05

Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища

цн Асимметричное расположение стимулов + ^^ нестабильное местоположение убежища

Симметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища

12345678 1тч234 5л678

Рострокаудальный уровень Рострокаудапьныи уровень

рострально каудально рострально каудально

Рис. 2. Средние (Юшибка средней) значения плотности с-Ров положительных нейронов на различных уровнях срезов.

Эксперимент 1А с мышами С57ВЬ/6. Мыши свободно перемещались по арене. Отличия показателей групп от активного контроля достоверны при * - р<0.05, " - р<0.01, - р<0.001.

+ Группа активного контроля

X Группа пасивного контроля

А Асимметричное расположение стимулов + стабильное местоположение убежища

_ Асимметричное расположение стимулов + нестабильное местоположение убежища

Симметричное расположение стимулов

СА1

ж* **

12345678 12345678

Рострокаудальный уровень Рострокаудальный уровень

рострально каудально рострально каудально

Рис. 3. Средние (±ошибка средней) значения плотности с-Ров положительных нейронов на различных уровнях срезов.

Эксперимент 1А с мышами С57ВЬ/6. Мыши находились в прозрачном цилиндре Отличия показателей групп от активного контроля достоверны при * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001. Прочие обозначения такие же как на рисунке 2.

500

400

300

200

100 500

49]

400

350

300

250

200

150

100

Зубчатая фасция

Жш

¡3

САЗ

1 2 3 4 5 6 7 6

Рострокаудальный уровень рострально кяудально

Зубчатая фасция

1 2 3 4 5 6 7 8

Рострокаудальный уровень рострально каудально

Рис. 4. Средние (±ошибка средней) значения доли плотности с-Роз положительных нейронов относительно пассивного контроля. Отличия от показателей перемещающихся животных достоверны при # - р<0.05, ## - р<0.01, ### - р<0.001. А: Мыши С57ВЬ/6 Б: Рыжие полевки

► Животные перемешались по арене. - Животные находились в прозрачном цилиндре

Зубчатая фасция

1 2 3 4 5 6 7 8

Рострокаудапьный уровень рострально каудалыю

1 2 3 4 5 8 7 8

Рострокаудапьный уровень рострально каудалыю

Рис. 5. Средние (¿ошибка средней) значения плотности с-Ров положительных нейронов на различных уровнях срезов.

Эксперимент 1Б с рыжими полевками. Животные свободно перемещались по арене. Отличия показателей групп от активного контроля достоверны при * - р<0.05, " - р<0.01, как на рисунке 2.

110 IX

СА1

САЗ

ю

Зубчатая фасция

1 2 3 4 5 6 7 8

Рострокаудальный уровень рострально каудально

1 2 3 4 5 6 7 8

Рострокаудальный уровень рострально каудально

Рис. 6. Средние (±ошибка средней) значения плотности с-Ров положительных нейронов на различных уровнях срезов.

Эксперимент 1Б с рыжими полевками. Животные помещены в прозрачный цилиндр-Отличия показателей групп от активного контроля достоверны при * - р<0.05, " - р<0.01, *** - р<0.001. Прочие обозначения такие же как на рисунке 2.

А Б

Рис. 7. Средние (±ошибка средней)значения плотность с-Роз положительных нейронов на различных уровнях срезов.

Эксперимент 2. А - Мыши С57ВЬ/6, Б - обыкновенные полевки. Отличия показателей групп от активного контроля достоверны при * - р<0.05, ** - р<0.01, "* - р<0.001.

А Опытная группа + Группа активного контроля X Группа паснвного контроля

Процедура тестирования: Животных предварительно обучали (5 дней, 6 попыток в день) проходить через рукав, отсоединенный от лабиринта, и выходить в домашнюю клетку. Приучение проводили в той же комнате, где и проводили основной эксперимент, что позволяло ознакомить животных со всеми компонентами обстановки опыта, за исключением самого лабиринта. На шестой день (основной эксперимент: 6 попыток с 15-минутным интервалом) животных из опытной группы обучали находить выход из лабиринта, через один единственный открытый рукав. Животных из группы активного контроля 6 раз с 15-минутным интервалом выпускали в рукав, отсоединенный от лабиринта, через который они выходили в домашнюю клетку (так же как и при предварительном обучении). После окончания эксперимента животных отсаживали в домашнюю клетку на 1,5 часа, по истечении которых проводили декапитацию. Оценку фонового уровня экспрессии проводили у интактных животных (группа пассивного контроля), взятых из домашней клетки. Иммуногистохимическая процедура и статистический анализ были идентичны описшшым выше (см. Эксперимент 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ: Эксперимент 2А (мыши C57BL/6)

Поведение э/сивотных в лабиринте: Показано, что мыши активно перемешались по лабиринту, неоднократно посещая все рукава, но не было обнаружено значимых изменений времени выхода и латентных периодов первого посещения целевого и других рукавов по мере обучения..

Иммуногистохимические результаты: Так же как и в эксперименте 1 выявлены существенные различия по уровню экспрессии у разных групп, а также неравномерная её активация в различных частях гиппокампа (рис. 7А). В группе активного контроля, по сравнению с пассивным контролем, наблюдали большую интенсивность экспрессии во всех исследуемых структурах (CAI, САЗ и зубчатая фасция) на всем их протяжении. Различия групп достоверны, отмечена и зависимость интенсивности экспрессии от уровня среза во всех исследуемых структурах, а значимый эффект взаимодействия факторов показан только для поля САЗ (табл. 5). Перемещение мышей по лабиринту вызывало дополнительное усиление экспрессии c-Fos (относительно активного контроля), но оно было неравномерно на разный исследуемых уровнях. Наибольший рост экспрессии был выявлен в каудальных отделах полей (в 2-2,5 раз), несколько ниже в ростральных отделах поля САЗ и зубчатой фасции (1.3-1.5), а в ростральной части поля CAI их не было. Дисперсионный анализ выявил достоверные групповые различия и эффекты уровня во всех исследуемых структурах. Причем, достоверный эффект взаимодействия этих факторов обнаружен только в поле CAI (рис. 7А, табл 5).

Эксперимент 2Б (рыжие полевки)

Поведение животных в лабиринте: Полевки, как и мыши, активно перемещались, обследовали лабиринт и успешно находили выход из него, систематического снижения показателей длины пути и латентного периода выхода из лабиринта не было. Латентный период первого посещения целевого рукава достоверно снижался уже во 2-ю попытку (t<8)=3.14, р<0.05), а у большинства особей это было отмечено и в последующие попытки. При этом латентный период первого посещения нецелевых рукавов возрастал от попытки к попытке.

Иммуногистохимические результаты: Также как и у мышей, контрольная процедура (переход полевки через изолированный рукав в домашнюю клетку) вызывала увеличение экспрессии, по сравнению с пассивным контролем, несмотря на то, что животное неоднократно это делало во время приучения (рис. 7Б). Дисперсионный анализ выявил эффекты сходные тем, что обнаружены у мышей, за исключением того, что эффект взаимодействия факторов «группа» и «уровень» был показан для зубчатой фасции (табл. 5). Как и у мышей, перемещение обыкновенных полевок по лабиринту вызывало активацию c-Fos по сравнению с активным контролем преимущественно в каудальных отделах гиппокампа. Наибольшее усиление было отмечено для САЗ и зубчатой фасции, в то время как, в CAI они были только на самом каудальном уровне (8 уровень). В отличие от мышей, в ростральных отделах гиппокампа полевок интенсивность экспрессии практически не различалась между опытной и контрольной группой. Дисперсионный анализ выявил достоверные групповые различия (в САЗ и зубчатой фасции) и эффекты уровня (во всех полях). В отличии от мышей эффект взаимодействия этих факторов отмечен во всех полях. Необходимо отметить, что во всех группах (в том числе и в пассивном контроле) и структурах у полевок был отмечен меньший уровень экспрессии, чем у мышей С57В1/6.

Группы Перемещение СА1 САЗ Зубчатая фасция

Группа Уровень Группа X Уровень Группа Уровень Группа X Уровень Группа Уровень Группа X Уровень

АК ув. ПК Перемещались по арене 174.91,,^ р<0.001 11.57(7^4) р<0.001 8.19(1,7,84) р<0.001 314.00(1,84) р<0.001 нл. н.д. 150.14(Ц4) р<0.001 32.71(7,84) р<0.001 н.д.

АС уб. АК 9-39(1,112) р<0.01 20.87(7,112) р<0.001 Н.Д. 22.71(1,111) р<0.001 2.57(7,111) р<0.05 Н.Д. 17.49(1,112) р<0.001 8.17(7,112) р<0.001 Н.Д.

АН ув. АК 10.10(1,112) р<0.01 32.46(7,112) р<0.001 н.д. 38.23(1,112) р<0.001 3.26(7,112) р<0.01 2.60(1,7,112) р<0.05 5.28(1,112) р<0.05 7.72(7,п2) р<0.001 Н.д.

СС УБ. АК 8.38(1,110) р<0.01 15.40(7,„2) р<0.001 н.д. 11.81(1,109) р<0.001 5.42(7,109) р<0.001 Н.Д. 1936(1,110) р<0.001 7.72(7,112) р<0.001 Н.Д.

АС ув. АН н.д. 26.98(7,и2) р<0.001 н.д. н д. 5.47(7,111) р<0.001 Н.Д. Н.Д. 11.61(7 112) р<0.001 Н.Д.

АС уэ. СС н.д. 12.03(7,ПО) р<0.001 н.д. н.д. 6.06(7,108) р<0.001 Н.Д. Н.Д. 7.48(7 по) р<0.001 н.д.

СС УЭ. АН н.д. 17.08(7,110), р<0.001 н.д. н д. 6.55(7,109) р<0.001 2.99(1,7,109) р<0.01 6.23(1 по) р<0.05 7.33(7,по) р<0.001 н.д.

АК уб. ПК Находились в прозрачном цилиндре 57.34 (1,48) р<0.001 3.17 (7,48)» р<0.01 Н.Д. 71.80(1.48, р<0.001 Н.Д. Н.Д. 15.91(1,48) р<0.001 3.86(7,48) р<0.01 н.д.

АС УБ. АК 14.06(1^)8) р<0.001 3.74,7,48) р<0.01 Н.Д. 11.83(1,48) р<0.001 Н.Д. Н.Д. 20.87,1,48) р<0.001 8.86(7,48) р<0.001 н.д.

АН уб. АК н.д. 4.01(7,4») р<0.01 Н.Д. н.д. н.д. Н.Д. Н.Д. 2.43(7,48) р<0.05 Н.Д.

СС уб. АК н.д. 4.48(7,48) р<0.001 н.д. Н.Д. н.д. Н.Д. 32.40(1,48), р<0.001 11.03(7,48) р<0.001 Н.Д.

АС УБ. АН 28.94(1,48) р<0.001 6.80(7,48) р<0.001 н.д. 8.60(1,48) р<0.01 Н.Д. Н.д. 18.56(1 48) р<0.001 3.65(7 48) р<0.01 Н.Д.

АС уб. СС 17.85(148) рс0.001 7.46,7,48) р<0.001 Н.Д. н.д. 2.26(7 48) р<0.05 Н.Д. Н.д. 14.79(7 48) р<0.001 Н.Д.

СС УБ. АН Н.д. 7.80(7,48) р<0.001 Н.д. н.д. Н.Д. Н.Д. 26.69(1,48) р<0.001 4.96(7 48) р<0.001 Н.Д.

Таблица 3. Значения Г-критерия 2-х факторного (фактор «группа» и «уровень среза») дисперсионного анализа (в скобках - степени свободы) и уровни достоверности (н.д. - различия не достоверны - р>0.05). Жирным шрифтом выделено сравнение с; ктивным контролем. Эксперимент 1А: Мыши С57В1У6. ПК -пассивный контроль, АК - активный контроль, АС - асимметричное расположение стимулов и стабильное местоположение убежища, АН - асимметричное расположение стимулов и нестабильное местоположение убежища, СС - симметричное расположение стимулов.

Групп ы Перемещение СА1 САЗ Зубчатая фасция

Группа Уровень Группа X Уровень Группа Уровень Группа X Уровень Группа Уровень Группа X Уровень

АК УЭ. ПК Перемещалис ь по арене 41.96(138) р<0.001 Н.Д. н.д. 36.68(138) р<0.001 н.д. Н.Д. З4.54(138) р<0.001 2.47(738) р<0.05 н.д.

АС УЭ. АК и.д. 6.43(7,128) р<0.001 н.д. И.Д. Р10.01(7,128) р<0.001 Н.Д. Н.Д. 8.47(7,128) р<0.001 2.91(1,7,128) р<0.01

АН УБ. АК 13.00(М28) р<0.001 н.д. н.д. 13.20,,, ,28) р<0.001 5.40(7,128) р<0.001 Н.Д. 17.02(1,128) р<0.001 7.48(7,128) р<0.001 3.35(1,7,128) р<0.01

СС ув. АК Н.Д. 4.78(7,128) р<0.001 Н.Д. н.д. 7.88(7,128) р<0.001 Н.Д. Н.Д. 4.74(7,,28) р<0.001 Н.Д.

АС Ув. АН 5.35(1,12») р<0.05 н.д. н.д. 17.12(1 128) р<0.001 5.18(7,128) р<0.001 Н.Д. 1 1.63(1 128) р<0.001 16.27(7 128) р<0.001 Н.Д.

АСУБ. СС н.д. 4.12(7 128) р<0.001 н.д. н.д. 7.47(7,128) р<0.001 Н.Д. н.д. 11.63(7 128) р<0.001 Н.Д.

СС Ув. АН 9.40(1,128) р<0.01 н.д. н.д. 12.540 ,28) р<0.001 4.44(7 128) р<0.001 Н.Д. 5.46(1,128) р<0.05 10.72(7 ,28) р<0.001 Н.Д.

АК Ув. ПК Находились в прозрачном цилиндре 9.01(1,48) р<0.01 Н.Д. Н.д. 4.50(1,48), р<0.05 н.д. Н.Д. Н.Д. н.д. Н.Д.

АС УЭ. АК н.д. Н.Д. н.д. н.д. 2.96 (7,48) р<0.05 Н.Д. Н.Д. Н.Д. Н.Д.

АН УЭ. АК 6.76(1,48) р<0.05 Н.Д. н.д. н.д. н.д. Н.Д. н.д. Н.Д. Н.Д.

СС УЯ. АК 29.95(1,48) р<0.001 н.д. Н.Д. 18.13(1,48) р<0.001 2.58(7,48) р<0.05 Н.Д. н.д. Н.Д. Н.Д.

АС УЭ. АН н.д. н.д. Н.Д. н.д. Н.Д. Н.Д. н.д. н.д. Н.Д.

АС УБ. СС 19.99(1,48) р<0.001 н.д. н.д. 14.89(,48) р<0.001 3.50(7 48) р<0.01 Н.Д. 6.52(1,48) р<0.05 Н.Д. Н.Д.

СС УБ. АН 7.69(1,48) р<0.01 н.д. н.д. 8.14(148) р<0.01 2.45(7 48) р<0.05 Н.Д. н.д. Н.Д. н.д.

Таблица 4. Значения Р-критерия 2-х факторного (фактор «группа» и «уровень среза») дисперсионного анализа (в скобках - степени свободы) и уровни достоверности (н.д. - различия не достоверны - р>0.05). Эксперимент 1 .Б: Рыжие полевки. Жирным шрифтом выделено сравнение с активным контролем. Сокращения групп те же, что и в таблице 3.

Вид Группы СА1 САЗ Зубчатая фасция

Группа Уровень Группа X Уровень Группа Уровень ГруппаХ Уровень Группа Уровень Группа X Уровень

Мыши ПК 436.21 2.61 НА 482.64(1,231) 9.67 2.43 76.40 10.74 НА

С57В176 VS. АК 0,238) 1X0.001 ГЧ38) р<0.05 р<0.001 cm 1X0.001 (1.7Д31) р<0.05 (1Л5) р<0.001 (7,235) р<0.001

АК 49.42 6.84 3.34 50.97(,,,7б, 4.95 Н.Д. 131.51 8.64 Н.Д.

VS. ОП (1 176) р<0.001 (7.176) р<0.001 (1,7,176) [К0.01 р<0.001 (7.176) р<0.001 (1,176) р<0.001 (7,176) р<0.001

Обыкно- ПК 187.17 3.23 НА 184.23(1,155) 4.27 «А 107.53 12.27 3.17

венные полевки VS. АК (1J61) 1X0.001 (7Д61) р<0.001 р<0.001 (7,155) р<0001 (1,1<И> 1X0.001 (7,168) р<0.001 (1,7489) 1X0.01

АК Н.Д. Н.Д. 3.01 17.02(1,179) Н.Д. 2.24 25.45 5.93 2.33

VS. ОП (1,7,185) р<0.01 р<0.001 (1,7,179) р<0.05 (1,189) р<0.001 (7,189) р<0.001 (1,7,189) р<0.05

Таблица 5. Значения Р-критерия 2-х факторного (фактор «группа» и «уровень среза») дисперсионного анализа (в скобках - степени свободы) и уровни достоверности (н.д. - различия не достоверны - р>0.05). Жирным шрифтом выделено сравнение с активным контролем. Эксперимент 2А и 2Б: ПК - группа пассивного контроля, АК - группа активного контроля, ОП -опытная группа.

ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 2А И 2

Проведенное исследование показало, что у мышей, в отличие от полевок, не обнаружено признаков запоминания направления целевого рукава. Вероятно, это может свидетельствовать о низкой мотивации выхода из лабиринта и предпочтением к его продолжительному обследованию, несмотря на яркое освещение. Очевидно, мотивация быстрого ухода в домашнюю клетку у лабораторных мышей не столь сильна, как у диких полевок. Как уже отмечалась выше, такая высокая исследовательская активность характерна для линии С57В1У6 (Сгизю, 1989). Полевки оказались способны быстро запоминать направление целевого рукава и находить выход из лабиринта, У них, в отличие от мышей, были выявлены показатели, характеризующие предпочтение целевого рукава, ведущего в клетку. Вращение лабиринта между попытками исключало использование любых внутрилабиринтных стимулов, выделение целевого рукава могло быть только на основе ориентации по внелабиринтным (главным образом зрительным) стимулам. Это подтверждается тем фактом, что у полевок не было обнаружено предпочтения ру кавов, через которых они выходили в предыдущую попытку.

И у мышей, и у полевок, которых тестировали в лабиринте, экспрессия с-Роз в гиппокампе была выше, чем у представителей контрольных групп. Эти результаты подтверждают данные других авторов, полученных на крысах, обучавшихся выполнению стандартной пространственной задачи в 8-лучевом (Уапп е1 а1., 2000, Не е1 а1., 2002а,б), и на мышах линий С57В1У76 и ОВА2 в модифицированном крестообразном (Раввто е1 а1., 2002) и радиальном лабиринте (Тоигаш е1 а1., 2003), несмотря на значительные отличия процедур обучения и используемых контрольных групп. Однако, мы оценивали не эффект выработанного навыка, как это было сделано другими авторами (напр. Уалп е1 а1., 2000а), а влияние на экспрессию с-Роб непосредственно освоения нового пространства и начальных этапов обучения - в нашей работе мыши впервые попадали в сложный лабиринт, где лишь один рукав вел в домашнюю клетку. Наши данные показали, что наиболее значительная активация, вызванная перемещением по лабиринту была в каудальных частях СА1, САЗ и зубчатой фасции, в ростральных отделах экспрессия усиливалась слабее и только у мышей С57В176. В нашем случае группу активного контроля составляли грызуны, которых не помещали в лабиринт, они лишь перемещались внутри рукавов, отсоединенных от него, и выходили в домашнюю клетку, то есть в контроле не было той же самой, что и в опыте, пространственно структурированной среды. Нами показано, что и выполнение

этого навыка (переход из изолированного рукава в клетку) вызывало значительное усиление c-Fos экспрессии во всем гиппокампе и зубчатой фасции, на всем их протяжении, по сравнению с состоянием покоя в жилой клетке, хотя не такое сильное, как вызванное исследование лабиринта.

Таким образом, в данном эксперименте мы подтвердили данные, полученные при тестировании мышей и полевок в модифицированном открытом поле, о функциональной неоднородности разных частей гиппокампа, и связи активации каудальной части с перемещением животного в сложной среде.

Обнаруженный нами факт более низкого уровня экспрессии у обыкновенных полевок, по сравнению с мышами C57BL/6 позволяет предположить, что эти различия могут быть связаны с особенностями строения и функционирования гиппокампа у полевок. Данных, подтверждающих это предположение немного, но, например, известно, что площади интра- и инфрапирамидных проекций мшистых волокон (аксоны гранулярных клеток зубчатой фасции, заканчивающиеся на базальных дендритах пирамидных нейронов поля САЗ) у полевок рода Microtus значительно крайне малы (Pleskacheva et al., 2001), по сравнению с тем, что обнаружено у мышей C57BL/6 (Schwegler et al., 1990).

ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на различия методик - перемещалось ли животное в структурированной (лабиринт) или неструктурированной («открытое поле») среде - в обоих типах экспериментов нами были выявлены сходные особенности экспрессии c-Fos. В каудалыюм гиппокампе экспрессия c-Fos была значительно выше у животных активно перемещавшихся в пространстве. Новые зрительные стимулы практически не оказывали влияние на активацию этих отделов, но усиливали экспрессию в ростральной части.

Исследований, посвященных изучению неоднородности гиппокампа (особенно его каудальных отделов) грызунов и других млекопитающих, крайне мало. В недавнем исследовании активации (по уровню метаболизма меченой дезоксиглкжозы) разных отделов гиппокампа после обучения в радиальном лабиринте так же отмечено неоднородное вовлечение полей СА1, САЗ и зубчатой фасции на разных рострокаудальных уровнях (Ros et al., 2005). В нашей и в описываемой работе отмечены схожие эффекты- активация средней и каудальной частей поля СА1 и средней части поля САЗ на ранних этапах пространственного обучения. Недавно обнаружено, что экспрессия раннего гена Arc/Arg3 I после пространственного обучения в водном тесте Морриса была на всем протяжении гиппокампа, тогда как при воспроизведении эксперимента через 1 месяц активация отмечена только в ростральной части (Gusev et al, 2005). Наши данные отчасти согласуются с результатами работы Зворыкиной (2005), так же показавшей неоднородность экспрессии c-Fos в гиппокампе мышей разных линий. Обследование новой экспериментальной камеры вызывало значительное усиление экспрессии с-Fos в каудальной части поля СА1 (но не в ростральной), а так же в САЗ и зубчатой фасции на всем их протяжении Собственно обучение условнорефлекторному замиранию лишь незначительно увеличивало уровень экспрессии c-Fos в ростральной части поля САЗ.

Немногочисленные данные о функциональной неоднородности гиппокампа нередко противоречивы и допускают неоднозначное объяснение. По литературным источникам можно выделить два направления изучения Первое предполагает, что основная роль более каудальных отделов (часто их называют вентральным гиппокампом) заключается в регуляции механизмов страха и тревожности, а ростральный (дорзальный) в большей степени вовлекается в процессы пространственного обучения и памяти (напр. Moser et al., 1993, 1995, Bannerman et al., 1999, 2003, Kjelstrup, et al, 2002, Steffenach et al., 2005) Наши данные нельзя полностью объяснить этой гипотезой. Безусловно, мы не можем исключить влияние стессирующих воздействий процедуры на экспрессию c-Fos Логично предположить, что наиболее сильно этот эффект будет проявляться у диких полевок (особенно у очень пугливой рыжей полевки, это подтверждают данные наших пилотных экспериментов) Но в наших опытах сходные особенности активации каудальных частей гиппокампа были выявлены и у мышей линии C57BL/6 (с низким уровнем тревожности) Кроме того, предварительное приучение и высокая активность всех животных во время экспериментов позволяет предположить достаточно низкий уровень стресса в наших условиях Процедуры воздействия на животных, которых выпускали в открытое поле, и в цилиндр в значительной степени совпадали, но только у перемещающихся грызунов было отмечено

21

усиление c-Fos активации в каудальном гиппокампе. Таким образом, высокая активация каудальной части гиппокампа, очевидно, в большей степени вызвана другими процессами, связанные с перемещением и исследованием пространства.

Вторая трактовка, встречающаяся в современной литературе, заключается в том, что и дорзальный и вентральный гиппокамп участвуют в обработке пространственной информации (Jung et al., 1994, Poucet et al., 1994a, 6, Vann et al., 2000, de Hoz et al. 2003, Ferbinteneu et al. 2003), но, вероятно, по-разному. Отмечено участие вентрального гиппокампа в обеспечении исследовательской реакции животых. Например, выявлены положительные корреляции уровня внеклеточного ацетилхолина в вентральном гиппокампе и интенсивностью исследовательской активности в «открытом поле» (Thiel et al., 1998). Разрушение вентрального, но не дорзального гиппокампа приводит к гиперактивности животных (см. напр. Bannerman et al., 1999, Richmond et al., 1999).

Согласно нашим данным, активация каудальных частей гиппокампа, по-видимому, определяется в значительной степени процессами, сопровождающими перемещение животного и исследование нового, или недостаточно изученного, пространства. Активация этих отделов происходила даже при отсутствии зрительных ориентиров. Навигация в этом случае происходит за счет механизмов счисления пути (path integration, dead reckoning) - интеграция кинестетических и вестибулярных сигналов, с помощью которых животное может запоминать свой путь и успешно возвращаться на место страта (Etienne et al., 1996, Whishaw et al., 1997, Mittelstaedt, 2000). До сих пор нет точного ответа о степени участия собственно гиппокампа в этих процессах, но рядом авторов показано, что разрушение I иппокампа нарушает процессы счисления пути (напр. Maaswinkel et al., 1999, Wallace et al., 2003)

По некоторым современным представлениям о нейронной основе процессов навигации гиппокамп входит в комплекс структур, наряду с префронтальной корой и прилежащим ядром (п. accumbens), ответственных за пространственное ориентирование, запоминание места и формирование пути (см. обзор Poucet et al., 2004). Выявленные нами эффекты (высокая интенсивность экспрессии c-Fos в каудальном гиппокампе при перемещении животных в пространстве) подтверждают эту гипотезу Необходимо отметить, что само по себе движение (бег по бегущей дорожке) не вызывает активацию с-Fos в гиппокампе (Touzani et al., 2003).

В отличие от каудальных отделов, активация ростральных отделов зависела от введения новых зрительных стимулов. Сходные факты влияния нового местоположения зрительных стимулов отмечены и другими авторами (Jenkins et al, 2004). Выполнение стандартной пространственной задачи (8-лучевой радиальный лабиринт) в этих условиях вызывало активацию СА1, САЗ и зубчатой фасции только в их ростральных отделах. К сожалению, в этой работе не проведено сравнение с интактными животными, и, следовательно, нельзя определить, было ли отмечено усиление c-Fos активности в каудальной части гиппокампа. Увеличение уровня экспрессии c-Fos в ростральных частях гиппокампа, вызванное тестированием в новой комнате, отмечали и ранее (Vann et al., 2000а), но в этой работе эффект был выявлен и в каудальных отделах гиппокампа. В отличие от этих данных, в нашей работе введение новых зрительных стимулов не влияло на интенсивность экспрессии в каудальном гиппокампе.

Несмотря на различия в поведении мышей, тестировавшихся в условиях разного расположения стимулов, в том числе и в ситуации, когда грызуны могли запоминать местоположение убежища, этот фактор практически не оказывал влияния на активацию гиппокампа. Так же не выявлено принципиальных отличий в активации гиппокампа у обыкновенных полевок, запоминавших направление целевого рукава, и мышей, показателей обучения которых обнаружено не было. Известно, что уровень экспрессии ранних генов в ростральных отделах гиппокампа после решения пространственной или непространственной задачи в водном тесте Морриса, различающихся по типам значимых зрительных стимулов, практически не различался (Guzowski et al., 2001). Возможно, эффект расположения стимулов может быть выявлен в других структурах, таких как субикулярный комплекс, энторинальная, постринальная, ретросплениальная кора, где усиливалась экспрессии c-Fos после пространственного обучения (Vann et al, 2000) и которые входят в систему head-direction, участвующей в формировании и контроле перемещения животных в пространстве (напр. Taube, 1998). Кроме того, можно предположить, что в наших экспериментах ростральные части гиппокампа мышей C57BL/6, в

22

особенности поля СЛЗ (поскольку там было обнаружено наибольшее усиление), активируются в ответ на «непространственные» характеристики стимулов, очевидно, главным образом на новизну стимулов. Это согласуется с представлением О.С. Виноградовой о роли гиппокампа как компаратора знакомых и новых сигналов (Виноградова, 1975, Vinogradova, 2001). В этой гипотезе основная роль поля САЗ заключается в выявление новизны сигнала.

Необходимо отметить, что только у мышей была выявлена активация и ростральных областей поля САЗ и зубчатой фасции, в отличие от поля СА1, при перемещении животных по арене открытого поля и в лабиринте Нами не было найдено исследований, где было бы оценено влияние как такового перемещения животных в сложной пространственной среде на интенсивность экспрессии c-Fos. Возможно это связано с тем, что применяемые авторами (напр. Vann et al., 2000а; Не t al., 2002а,б, и др.) тесты были сложны и включали в себя многие компоненты, которые авторы отдельно не могли проанализировать.

Проведенные эксперименты выявили сходство характера активации ростральных отделов поля САЗ и зубчатой фасции, в отличие от поля СА1, но только для мышей линии C57BL/6. Функциональные различия полей гиппокампа были отмечены и ранее (см. напр. Виноградова. 1975; Hess et al.,1995a,6; Tsien et al., 1996; Chen, Tonegawa, 1997; Blum et al., 1999; Vinogradova 2001; Brun et al., 2002; Lee, Kesner, 2003; Kesner et al., 2004; Leutgeb, et al, 2004; Vazdaijanova et al., 2004). Наши результаты подтвердили выводы других авторов об определенном функциональном сходстве поля САЗ и зубчатой фасции (Tsien et al, 1996; Chen, Tonegawa, 1997, Blum et al, 1999, Lee, Kesner, 2003). В отличие от других полей, в ростральной части поля СА1 не было выявлено активации связанной с перемещением животных по арене. Необходимо отметить, что в работах других исследователей найдено, что когда животное впервые попадает в сложную пространственную среду активация поля СА1 более выражена, чем поля САЗ (Hess et al.,1995a,6; Vann et al., 2000a; Leutgeb, et al, 2004, Vazdaijanova et al, 2004). Однако, при повторном тестировании животных в одной и той же обстановке, активация нейронов СА1 значительно уменьшалась (напр Vazdaijanova et al., 2004). Мы можем предположить, что активация ростральной части поля СА1 могла быть угашена после 3-х дневного приучения к арене и процедуре тестирования, и параметры экспериментальной среды (форма и размер арены, освещение, уровень шума и др.) уже не были новыми для животных.

Таким образом, в нашей работе показаны значительные функциональные различия разных отделов гиппокампа. Активация ростральных частей, по-видимому, в большей степени связана с новизной экспериментальной среды, это согласуется с большинством современных работ (см. напр. Vann et al., 2000а, Jenkins et al., 2004, обзор Bannerman et al., 2004). В то же время, интенсивная экспрессия c-Fos в каудальных отделах ицдуцировалась, с большой вероятностью, перемещением животных в пространстве и, возможно, исследовательской активностью

выводы

1. На ранних этапах обучения и освоения пространства и у полевок, и у мышей, обнаружена неравномерная активация экспрессии c-Fos на разных рострокаудальных уровнях гиппокампа

2. Показано, что активация экспрессии c-Fos в каудальных отделах гиппокампа определяется собственно передвижением животного в пространстве. Введение новых зрительных стимулов не вызывает дополнительной активации этой области.

3. Экспрессия c-Fos в ростральных отделах гиппокампа активировалась при введении новых стимулов. Усиление экспрессии в этом случае было значительно ниже, чем вызванное в каудальном гиппокампе передвижением животных.

4. Характер исследовательской активности и освоения нового пространства различался в зависимости от расположения внешних зрительных стимулов (а также стабильного и нестабильного положение убежища). Однако, это оказывало слабое влияние на интенсивность экспрессии c-Fos в гиппокампе.

5. Выявлены существенные различия активации экспрессии c-Fos в полях CAI, САЗ гиппокампа и зубчатой фасции на разных рострокаудальных уровнях. Характер активации поля САЗ и зубчатой фасции был сходен, и отличался от поля CAI.

6. Лабораторные мыши отличались от полевок более высоким общим уровнем экспрессии c-Fos в гиппокампе и большим ее увеличением в ответ на введение новых стимулов, хотя и несколько уступали полевкам по характеристикам пространственной памяти.

7. Сходство данных, полученных на грызунах разных видов, позволяет предположить, что обнаруженные особенности активации каудального и рострального гиппокампа носят достаточно общий характер и отражают различную роль этих отделов в поведении животных.

1. Купцов ПА., Плескачева М.Г., Воронков Д.Н., Линп Х.П., Анохин К.В Особенности экспрессии гена с-Роз по рострокаудальной оси гиппокампа обыкновенных полевок после быстрого обучения пространственной задаче Журнал Высшей Нервной Деятельности им. И П. Павлова т 55, №2: 231-

2. Купцов П.А., Плескачева М.Г., Анохин К.В. Обучение рыжих полевок (Clethrionomys glareolus Schreb) запоминанию местоположения убежища в модифицированном открытом поле Журнал Высшей Нервной Деятельности им. И.П. Павлова в печати. 2006

3. П.А. Купцов, Д.Н. Воронков. Изучение экспрессии c-fos гена в гиппокампе при быстром пространственном обучении у обыкновенных полевок (Microtus Arvalis) Тезисы научной конференции молодых ученых. Москва. 9-10 октября, 2002.

4. Купцов П.А., Плескачева М.Г., Воронков Д.Н., Липп Х.П., Анохин К.В Активация различных областей гиппокампа обыкновенных полевок Microtus arvalis при быстром пространственном обучении в лабиринте. Тезисы Международного совещания териологического общества с. 189-190, Москва, 2003.

5. Kuptsov Р A., Pleskacheva М. G. & Anokhin К. Rostro-caudal characteristics of c-fos expression in mouse hippocampus after testing in open field with different stimulus contexts Abstract of 4* Forum of European Neurosciences. Lisbon 2004.

6 П.А. Купцов, МГ Плескачева, К.В. Анохин. Различная активация областей гиппокампа при поведении и пространственной ориентации мышей в открытом поле Тезисы XIX съезда физиологического общества им. И.П.Павлова. Екатеринбург 2004.

7. Купцов П.А. Различная активация полей гиппокампа мышей после тестирования их в модифицированном открытом поле Тезисы всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». Санкт-Петербург 2005.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

240.2005

Заказ No 15/01/05 Подписано в печать 11 01 2005 Тираж 100 экз Уел п л 1

ООО "Цифровичок", тгл (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 }) www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

»- 1 O 9 f

i

r

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Купцов, Павел Андреевич

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Строение гиппокампа и зубчатой фасции.

2.2. Роль гиппокампа в процессах, обеспечивающих пространственное обучение и память животных.

2.3 Использование метода картирования с помощью экспрессии ранних генов и других неинвазивных методов для оценки функций гиппокампа.

2.4. Пространственное обучение у полевок и других мышевидных грызунов.

3. Эксперимент 1А и 1Б. Пространственное обучение в модифицированном «открытом поле» с контролируемыми зрительными стимулами.

3.1. Методика.

3.2. Результаты.

3.3. Обсуждение.

4. Эксперимент 2А и 2Б. Обучение в модифицированном радиальном лабиринте, с возможностью выхода в домашнюю клетку.

4.1. Методика.

4.2. Результаты.

4.3. Обсуждение.

5. Общее обсуждение.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение активации различных отделов гиппокампа после выполнения грызунами пространственных тестов"

Актуальность исследованияГиппокамп - одна из центральных структур мозга отвечающая за рядсложных когнитивных процессов, в том числе ориентировочноисследовательское поведение (напр. Douglas, 1967; Виноградова 1975; Save etal., 1992) и пространственное обучение и память (Olton et al., 1978; Morris et al.,1982), Несмотря на долгую историю изучения, функции и принципы работыгиппокампа во многом не ясны и активно обсуждаются (Vinogradova, 2001;Burgess, 2002; Good, 2002; Small, 2002; Jacobs, Schenk 2003 и др.). Исследованияпоследних лет подтверждают более ранние предположения (напр. Hughes, 1965;Унгиадзе, 1970 и др.) о функциональной неоднородности разных отделовгиппокампа. Так современные морфологические данные позволяютрассматривать гиппокамп как сложную трехмерную структуру, ростральная икаудальная часть которой получает проекции от разных частей энторинальнойкоры (Amaral, Witter 1989, 1995; Insausty et al., 1997; Dolorfo et al., 1998a,6;Witter et al., 2000). Характеристики «клеток места» поля CAl отличаются вразных точках рострокаудальной оси (Jung et al., 1994). Развитие методовтонких избирательных удалений позволило накопить дапные об участии разныхотделов гиппокампа в процессах пространственного обучения и памяти (см.Poucet et. al 1994а; Moser et al., 1993, 1998; Bannerman et al, 1999, 2003, 2004;Kjelstrup et al., 2002; Ferbinteanu et al., 2003; Pothuizen et al., 2004). Однако,необходимо отметить, что выводы многих исследователей об особенностяхфункционирования разных отделов гиппокампа, часто не согласуются друг сдругом (см. напр. Richmonds et al., 1999 и Bannennann et al., 1999; Moser et al.,1993ndeHozetal.,2003).Важно подчеркнуть, что даже в случае использования щадящих удаленийструктур исследователи оценивают функционирование поврежденного мозга,пеинвазивные методы позволяют этого избежать. В представленной работе мыпроводили оценку функционирования неповрежденной структуры путемкартирования активации нейронов по экспрессии в них продуктов гена c-fos.(Sagar et al., 1988; Dragunow, Faull, 1989; Анохин, 1997; Herdegen et al., 1998;Kaczmarek, 2002), Использование такого маркера позволяет оценить активациюкак сразу многих отделов мозга, так и одной структуры на всем её протяжении,что крайне сложно сделать, применяя электрофизиологические методы иразрушая отделы мозга.Особенности экспрессии c-Fos в гиппокампе после пространственногообучения изучены недостаточно, такие исследования ноявились сравнительнонедавно и они немногочисленны (Vann et al. 2000а; Guzovski et al., 2001; He etal., 2002a,b; Passino et al, 2002; Jenkins et al., 2003, 2004; Touzani et al., 2003).Необходимо отметить, что в этих работах не оценивали активацию гиппокампана всем его протяжении, поэтому в настоящем исследовании представлялосьважным изучить экспрессию c-fos в гиппокампе вдоль всей его продольной оси.Кроме того, в перечисленных выше работах, экспрессию оценивали последлительного и сложного обучения в радиальном и других лабиринтах. Вотличие от этих исследований, нас интересовал непосредственно начальныйэффект обучения и освоения нового пространства, без дополнительныхвлияний, таких как выработанные стратегии посещений рукавов, пищеваямотивация, излишнее стрессирование и др.В качестве объектов нашего исследоваиия были выбраны лабораторныемыши хорошо изученной инбредной линии C57BL/6, для которых характернаинтенсивная исследовательская активность (Crusio, 1989) и высокий уровеньрешения пространственных тестов (Ammassari-Teule et al., 1993), ипредставители грызунов (рыжая и обыкиовенная полевка), принадлежащих кдругому семейству (Хомяковые, Cricetidae). Известио, что полевки хорошообучаются выполнению различных пространственных задач (напр. Galea et al.,1994а; Teskey et al., 1998), в ряде случаев лучше, чем лабораторные мыши(Pleskacheva et al., 2000). Сопоставление физиологических особенностей работыгиппокампа и поведения полевок и лабораторных мышей позволит, с однойстороны, избежать акцентирования на узко специализированных длялабораторных животных феноменах, а с другой стороны, выявитьвидоспецифические особенности поведения грызунов, занимающих вприродных условиях определенные экологические ниши. В то же время,схожесть данных, полученных на грызунах разных видов, позволитпредположить, что обнаруженные феномены активации гиппокампа могутносить общий характер, по крайней мере, для грызунов.Цели и задачи исследованияИзучение активации различных отделов гиппокампа грызунов наначальных этапах обучения и освоения нового нространства.В связи с этим были ноставлены следующие задачи:1. Разработать методики, позволяющие быстро оценивать начальныеэтапы пространственного обучения и освоения нового пространства,адекватные для тестирования и лабораторных мыщей, и полевок, выловленныхв местах их обитания2. Оценить экспрессию c-Fos в разных областях гиппокампа и зубчатойфасции при прострагютвенном обучении и освоении нового нространства,используя иммунногистохимический метод.3. Исследовать поведение и особенности экспрессии c-Fos улабораторных мышей линии C57BL/6 и полевок.Основные результаты и их научная новизнаДля оценки начальных этапов пространственного обучения и освоенияпространства были разработаны новые методики, нозволяющие быстро и бездополнительного стрессирования тестировать лабораторных и дикихмыщевидных грызунов: модификации теста «открытое поле» сконтролируемыми зрительиыми стимулами и 8-лучевого радиальноголабиринта с возможностью выхода в домащнюю клетку. Выявлено, чтополевки лучше, чем лабораторные мыши, запоминают местоположениеубежища (рыжие полевки) или нанравление рукава, ведущего к выходу излабиринта (обыкновенные полевки), используя для ориентации дистантныезрительные стимулы.Впервые были изучены особенности экспрессии c-Fos в гиппокампе изубчатой фасции грызунов на начальных этапах обучения и освоения иминового пространства. Необходимо отметить, что оценка экспрессии c-Fos уполевок после обучения ранее другими исследователями не проводилась.Наши данные нодтвердили выводы других исследователей об активациигиппокампа при выполнении пространственных задач (напр. Vann et al., 2000а;Guzovski et al., 2001 и др.). Однако, впервые показано, что такая активация быланеравномерна в разных частях гиппокампа. Усиление экспрессии c-Fos вразных частях структуры было вызвано различными экспериментальнымифакторами. Так, активация каудальных отделов полей гиппокампа и зубчатойфасции, очевидно, была следствием перемещения животных в пространстве.Когда ограничивали возможность их передвижения, интенсивность экспрессиизаметно снижалась. Введение новых зрительных стимулов не вызывалодополнительной активации каудальных отделов, но активировало ростральныеобласти гиппокампа. Усиление экспрессии в этом случае было слабее, чемвызванное в каудальном гиппокампе передвижепием животных. Хотяповедение животных в условиях симметричного и асимметричногорасположения зрительных стимулов различалось, этот фактор слабо влиял наэкспрессию в ростральных отделах гиппокампа. Кроме того, в проведенныхэкспериментах была выявлена синергичность в активации поля САЗ и зубчатойфасции, в отличие от поля СА1, ростральные области которого слабо изменялиактивность при перемещении животных.Сравнение особенностей активации экспрессии c-Fos в гиппокампелабораторных мышей и полевок выявило принципиальное сходство этихпроцессов у сравниваемых видов. И у тех, и у других перемещение, как воткрытом ноле, так и в лабиринте, активировало каудальные отделы, тогда какновые зрительные стимулы воздействовали преимущественно на ростральныеотделы. Это может свидетельствовать о том, что выявленные эффекты носятобщий, по крайней мере, для грызунов характер и отражают различную рольростральных и каудальных отделов гиппокампа в поведении животных.Выявлены и различия в активации гиппокампа: у лабораторных мышейотмечено большее, чем у полевок, усиление экспрессии c-Fos в ответ наперемеш,ение животных и на введение новых стимулов.Научно-практическое значениеПолученные новые результаты вносят вклад в понимапия принциповфункционирования гиппокампа, его участия в процессах, связанных сперемещением и ориентированием животных в пространстве. Проведенноеисследование позволило показать, что ростральпая и каудальная частигиппокампа по-разному вовлекаются в процессы освоения нового пространства.Обнаруженные факты существенно уточняют, дополняют имеющиесянемногочисленные данные о функциональной неоднородности гиппокампа имогут быть использовапы для дальнейшего его изучения, особенно длянейрофизиологических исследований каудальных отделов, характеристикинейронной активности которых слабо изучены. Учитывая факты,свидетельствующие о неоднородности различных частей гиппокампа изубчатой фасции приматов (см. напр. Colombo et al., 1998; Small, 2002),полученные данные могут пополнить фундаментальные знания о работе этихструктур, необходимые для развития методов диагностики и лечения рядазаболеваний человека (например, височпой эпилепсии, болезни Альцгеймера,различных травм мозга, повреждающих гиппокамп).Сравнение лабораторных и диких грызунов может быть полезно дляуточнения оценки влияния процессов доместикации и лабораторногоразведения на поведение животных и функционирование структур мозга.Разработанные поведенческие методики могут быть широкоиспользованы (в том числе и для изучения характеристик пространственногообучения и памяти диких грызунов) поскольку, по сравнению ссуществующими методами (например, водный тест Морриса, радиальныйлабиринт), они обладают рядом преимуществ, так как основаны наестественной реакцни животных (быстрое заноминание местоположенияубежища), не требуют длительного обучения и характеризуются низкимуровнем стрессирования.Апробация работыРабота была выполнена в лаборатории физиологии и генетики поведениякафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им.М.В. Ломоносова и в отделе системогенеза ГУ НИИ нормальной физиологииим. П.К. Анохина.Материалы диссертации были представлены на конференции молодыхученых НИИ ВНД и НФ (Москва, 2002), на Международном Совещаниитериологического общества (Москва, 2003), на IV Форуме европейскогообщества нейрофизиологов (FENS, Лиссабон, Нортугалия, 2004), на XIXСъезде физиологического общества им. И.Н. Навлова (Екатеринбург, 2004), наВсероссийской конференции молодых исследователей «Физиология имедицина» (Санкт-Нетербург, 2005).Материалы диссертации были апробированы на заседании кафедрывысшей нервной деятельности Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова27 октября 2005 г.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Купцов, Павел Андреевич

1. На ранних этапах обучения и освоения пространства и у полевок, и у

мышей, обнаружена неравномерная активация экспрессии c-Fos на

разных рострокаудальных уровнях гиппокампа. 2. Показано, что активация экспрессии c-Fos в каудальных отделах

гиппокампа определяется собственно передвижением животного в

пространстве. Введение новых зрительных стимулов не вызывает

дополнительной активации этой области. 3. Экспрессия c-Fos в ростральных отделах гиппокампа активировалась при

введении новых стимулов. Усиление интенсивности экспрессии в этом

случае было значительно ниже, чем вызванное в каудальном гиппокампе

передвижением животпых,

4. Характер исследовательской активпости и освоения нового пространства

различался в зависимости от расположения внешних зрительных

стимулов (а также стабильного и нестабильного положение убежища). Однако, это оказывало слабое влияние на интенсивность экспрессии с Fos в гиппокампе,

5. Выявлены существенные различия активации экспрессии c-Fos в полях

СА1, САЗ гиппокампа и зубчатой фасции на разных рострокаудальных

уровнях. Характер активации поля САЗ и зубчатой фасции был сходен, и

отличался от поля СА1,

6. Лабораторные мыши отличались от полевок более высоким общим

уровнем экспрессии c-Fos в гиппокампе и большим ее увеличением в

ответ на введение новых стимулов, хотя и несколько уступали полевкам

по характеристикам прострапственной памяти,

7. Сходство данных, полученных на грызунах разных видов, позволяет

предположить, что обнаруженные особенности активации каудального и

рострального гиппокампа носят достаточно общий характер и отражают

различную роль этих отделов в поведении животных,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Купцов, Павел Андреевич, Москва

1. Анохин К.В. (1977) Молекулярно-генетические предносылки системотогенеза поведенческих актов. Теория системотогенеза / ред. СудаковК.В. Москва, с. 215-276.

2. П. Бабаи, К.В. Анохин, О.Н. Долгов, К.В. Судаков. Особенности экспрессии гена c-fos в мозге крыс с различным исследовательским иоборонительным поведением. Журн. Высш. Нерв. Деят. 50 (6):966-973, 2000.

3. Виногадова О.С. (1975) Гиппокамп и память 334с. М.: Наука.

4. Гамильтон Л.У. (1984) Основы анатомии лимбической системы крысы. 183 с.

5. Григорьев Н.Р. (1998). Функциональная организация поисковой активности. Автореферат диссертации на соискание ученой стенени докторамедицинских наук. Чита. 42 с

6. Громов И.М., М.А. Ербаева. (1993) Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны. С-Нетербург:Зоологический институт АН, 520 с.

7. Зворыкина СВ. (2005) Сравнительная топография экспрессии гена c-fos в мозге мышей линий C57BL/6 и 129Sv при обучении в задачеусловнорефлекторного замирания. Автореферат на соискание ученой степеникандидата биологических наук. Москва.

8. Соколов В.Е., Башенина Н.В. (ред) (1994). Обыкновенная полевка: виды- двойники Microtus arvalis Pallas, 1779, Microtus rossiaemeridionalis Ognev, 1928.ред. M.: Наука

9. Унгиадзе A.A. (1970) Новеденческие и электрофизиологические эффекты электрического раздражения гиппокампа. Физиологический журнал СССР им.Сеченова Т. LVI. № 11.С. 1531-1538.

10. Чайченко Г.М. (1984) Функциональная роль дорзального и вентрального гиппокампа в оборонительном поведении крыс. Журн. Высш. Нерв. Деят. Т. 34С. 1109-1115.113

11. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. (1991) "Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения". Москва, Высшая школа.

12. Яскин В.А., Ленец Л.И. (1996). Специфические черты строения головного мозга видов-двойников обыкновенной полевки. Зоологический журнал 75:1715-1721.

13. Яскин В.А. (1998). Динамика массы гнппокампа и особенности пространственного поведения в годовом цикле у рыжей полевки. ДокладыАкадемии Наук 360: 141-144.

14. Aggleton J.P., Brown M.W. (1999). Episodic memory, amnesia, and the hippocampal-anterior thalamic axis. Behav.Brain Sci. 22:425-444.

15. Almendral J.M., Sommer D., MacDonald-Bravo H., Burckhardt J., Perera J., Bravo R. (1988). Complexity of the early genetic response to growth factors in mousefibroblasts. Mol. Cell. Biol. 8: 2140-2148.

16. Alyan S., McNaughton B.L. (1999). Hippocampectomized rats are capable of homing by path integration. Behav.Neurosci. 113:19-31.

17. Amaral D.G., Witter M.P. (1989). The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience 31:571-591.

18. Amaral D.G., Witter M. (1995). The hippocampal formation. In: Paxinos G, ed. The rat nervous system. London: Academic Press, p 443-493.

19. Andersen P., Bliss T.V., Skrede K.K. (1971). Lamellar organization of hippocampal pathway. Exp Brain Res. 13(2):222-238

20. Anokhin K.V., Rose S.P.R. (1991a). Learning-induced increase of immediate early gene messenger RNA in the chick forebrain. Eiir JNeurosci 5:162-167.

21. Anokhin K.V., Mileusnic R., Shamakina l.Y., Rose S.P. (19916). Effects of early experience on c-fos gene expression in the chick forebrain. Brain Res 544:101-107.

22. Ammassari-Teule M., Restivo L., Pietteur V., Passino E. (2001). Learning about the context in genetically-defined mice. Behav.Brain Res. 125:195-204.

23. Bannerman D.M., Yee B.K., Good M.A., Heupel M.J., Iversen S.D., Rawlins J.N. (1999). Double dissociation of function within the hippocampus: a comparison114of dorsal, ventral, and complete hippocampal cytotoxic lesions. BEHAVNEUROSCI 113:1170-1188.

24. Bannerman D.M., Grubb M., Deacon R.M.J., Yee B.K., Feldon J., Rawlins J.N.P. (2002). Ventral hippocampal lesions affect anxiety but not spatial learning.Behav Brain Res. 139:197-213.

25. Bannerman D.M., Rawlins J.N.P., McHugh S.B., Deacon R.M.J.,. Yee B.K, Bast Т., Zhang W.-N., Pothuizen H.H.J., Feldon J. Regional dissociations within thehippocampus—memory and anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 28(2004) 273-283

26. Bardgett M.E., Henry J.D. (1999). Locomotor activity and accumbens Fos expression driven by ventral hippocampal stimulation require Dl and D2 receptors.Neuroscience 94:59-70.

27. Barnes C.A., Nadel L., Honig W.K, (1980) Spatial memory deficit in senescent rats. Can J Psychol 34:29-39.

28. Barondes S.H., Cohen H.D. (1968). Memory impairment after subcutaneous injection of acetoxycycloheximide. Science. 160(827):556-7.

29. Bayer S.A. (1985). Hippocampal region. In: Paxinos G, ed. The rat nervous system. Sydney Orlando San Diego New York London Toronto Montreal Tokyo:Academic Press, p 335-352.

30. Bertaina-Anglade V., Tramu G., Destrade С (2000). Differential learning- stage dependent patterns of c-Fos protein expression in brain regions during theacquisition and memory consolidation of an operant task in mice. Eur.J.Neurosci.12:3803-3812.

31. Best P.J., White A.M., Minai A. (2001) Spatial processing in the brain: the activity of hippocampal place cells. Annu.Rev.Neurosci. 24:459-486.

32. Birke L.I., D'Udine В., Albonetti M.E. (1985). Exploratory behavior of two species of murid rodents, Acomys cahirinus and Mus musculus: a comparative study.Behav Neural Biol. 43(2): 143-61.115

33. Blum S., Moore A.N., Adams F., Dash P.K. (1999). A mitogen-activated protein kinase cascade in the CA1/CA2 sub field of the dorsal hippocampus isessential for long-term spatial memory. J. Neurosci 19:3535-3544.

34. Brown M.A., Shaф P.E. (1995). Simulation of spatial learning in the Morris water maze by a neural network model of the hippocampal formation and nucleusaccumbens. Hippocampus. 5:171-188.

35. Brun V.H., Otnass M.K., Molden S., Steffenach H.A., Witter M.P., Moser M.B., Moser E.I. (2002). Place cells and place recognition maintained by directentorhinal-hippocampal circuitry.Science. 296(5576):2243-6.

36. Burck K.B., Liu E.T., Larrick J.W. Oncogenes: An Introduction to the Concept of Cancer Genes, Springer-Verlag, New York, 1988.

37. Bures J., Fenton A.A., Kaminsky Y., Zinyuk L. (1997). Place cells and place navigation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94:343-350.

38. Burwell R.D., Amaral D.G. (1998). Cortical afferents of the perirhinal, postrhinal, and entorhinal cortices of the rat. J.Comp.NeuroI. 398:179-205.

39. Cassel,J.C., Cassel,S., Galani,R., Kelche,C., Will,B. & Jarrard,L. (1998). Fimbria-fomix vs selective hippocampal lesions in rats: effects on locomotor activityand spatial learning and memory. Neurobiol Leam. Mem., 69 , 22-45.

40. Chen C , Tonegawa S. (1997). Molecular genetic analysis of synaptic plasticity,activity-dependent neural development, learning, and memory in themammalian brain. Annu Rev Neurosci 20:157-84.

41. Chiba A.A., Kesner R.P. Jackson P.A. (2002). Two forms of spatial memory: a double dissociation between the parietal cortex and the hippocampus in the rat.Behav. Neurosci., 116, 874-883.

42. Clark R.E., Broadbent N.J., Squire L.R. (2004). Hippocampus and remote spatial memory in rats. Hippocampus 15(2):260-72.

43. Colombo M., Femandez Т., Nakamura K., Gross C.G. (1998). Functional differentiation along the anterior-posterior axis of the hippocampus in monkeys.J.Neurophysiol. 80:1002-1005.116

44. Crusio W.E., Schwegler H., van Abeelen J.H. (1989). Behavioral responses to novelty and structural variation of the hippocampus in mice. I. Quantitative-geneticanalysis of behavior in the open-field. Behav.Brain Res. 32:75-80.

45. Curran Т., Teich N.M., (1982). Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBI murine osteosarcoma virus, Virology 116: 221-233.

46. Curran Т., Miller AD., Zokas L., Verma I.M. (1984). Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell 36:259-268.

47. Dell'Omo G., Pleskacheva M.G., Wolfer D.P., Lipp H.P., Shore R.F. (2003). Comparative effects of exposure to an organophosphate pesticide on locomotoractivity of laboratory mice and five species of wild rodents.Bull.Environ.Contam.Toxicol. 70:138-145.

48. Dobly A. (2001). Movement pattern of male common voles (Microtiis arvalis) in a network of Y junction: role of distant visual cues and scent marks. Can. J. Zool.79: 2228-2238.

49. Dolorfo C.L., Amaral D.G. (1998a). Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. J.Comp.Neurol. 398:49-82.

50. Dolorfo C.L., Amaral D.G. (19986). Entorhinal cortex of the rat: topographic organization of the cells of origin of the perforant path projection to the dentategyrus. J.Comp.Neurol. 398:25-48.

51. He J., Yamada K., Nabeshima T. (2002a). A role of Fos expression in the CA3 region of the hippocampus in spatial memory formation in rats.Neuropsychopharmacology. 26:259-268.

52. He J., Yamada K., Nakajima A., Kamei H., Nabeshima T. (20026). Learning and memory in two different reward tasks in a radial arm maze in rats. Behav.BrainRes. 134:139-148.

53. Herdegen Т., Leah J.D. (1998). Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and ICrox,and CREBrATF proteins. Brain Research Reviews 28: 370^90

54. Hess U.S., Lynch G., Gall CM. (1995a). Changes in c-fos mRNA expression in rat brain during odor discrimination learning: differential involvement ofhippocampal subfields CAl andCA3. J.Neurosci. 15:4786-4795.

55. Hess U.S., Lynch G., Gall CM. (19956). Regional patterns of c-fos mRNA expression in rat hippocampus following exploration of a novel environment versusperformance of a well-learned discrimination. J.Neurosci. 15:7796-7809.

56. Hjorth-Simonsen A., Laurberg S. (1977). Commissural connections of the dentate area in the rat. J Comp Neurol. 174(4):591-606.

57. Hock B.J.J., Bunsey M.D. (1998). Differential effects of dorsal and ventral hippocampal lesions. J.Neurosci. 18:7027-7032.

58. Hollup S.A., Molden S., Donnett J.G., Moser M.B., Moser E.L (2001). Place fields of rat hippocampal pyramidal cells and spatial learning in the watermaze.EunJ.Neurosci. 13:1197-1208.

59. Hughes K.R. (1965). Dorsal and ventral hippocampus lesions and maze learning: influence of preoperative environment. Can J Psycho 1 19: 325-332.

60. Hunt S.P., Pini A., Evan G. (1987). Induction of c-fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation. Nature. 328 (6131):632-4.120

61. Hyden Н,, Egyhazi. E, (1962). Changes in the base composition of nuclear ribonucleic acid of neurons during a short period of enhanced protein production. J.CellBiol. 15:37-44.

62. Hyden H., Egyhazi. E. (1964). Changes in RNA content and base composition in cortical neurons of rats in a learning experiment involving transfer of handedness.Proc Natl Acad Sci USA. 52:1030-5.

63. Hyden H., Lange P.W. (1968). Protein synthesis in the hippocampal pyramidal cells of rats during a behavioral test. Science. 159(821): 1370-3.

64. Iaria G., Petrides M., Dagher A., Pike В., Bohbot V.D. (2003). Cognitive strategies dependent on the hippocampus and caudate nucleus in human navigation:variability and change with practice. J Neurosci. 23(13):5945-52.

65. Insausti R., Amaral D.G., Cowan W.M. (1987). The entorhinal cortex of the monkey: II. Cortical afferents. J.Comp.Neurol. 264:356-395.

66. Insausti R., Herrero M.T., Witter M.P. (1997). Entorhinal cortex of the rat: cytoarchitectonic subdivisions and the origin and distribution of cortical efferents.Hippocampus. 7:146-183.

67. Jenkins T.A., Dias R., Amin E., Aggleton J.P. (2002a). Changes in Fos expression in the rat brain after unilateral lesions of the anterior thalamic nuclei. EurJ Neurosci 16:1425-1432.

68. Jenkins T.A., Dias R., Amin E., Brown MW., Aggleton J.P. (20026). Fos imaging reveals that lesions of the anterior thalamic nuclei produce widespreadlimbic hypoactivity in rats. J.Neurosci. 22:5230-5238.

69. Jenkins T.A., Amin E., Harold G.T., Pearce J.M., Aggleton J.P. (2003). Distinct patterns of hippocampal formation activity associated with different spatialtasks: a Fos imaging study in rats. Exp.Brain Res. 151:514-523.121

70. Jung M.W., Wiener S.I., McNaughton B.L. (1994). Comparison of spatial firing characteristics of units in dorsal and ventral hippocampus of the rat.J.Neurosci. 14:7347-7356.

71. Kabbaj M., Akil H. (2001). Individual differences in novelty-seeking behavior in rats: a c-fos study. Neuroscience. 106:535-545.

72. Kaczmarek L., Robertson H.J., (eds) Handbook of Chemical Neuroanatomy Vol. 19: Immediate Early Genes and Inducible Transcription Factors in Mapping ofthe Central Nervous System Function and Dysfunction. 2002 Elsevier Science B. V.

73. Kavaliers M., Galea L.A. (1994). Spatial water maze learning using celestial cues by the meadow vole, Microtus pennsylvanicus. Behav.Brain Res. 61:97-100.

74. Kesner R.P., Novak J.M. (1982). Serial position curve in rats: role of the dorsal hippocampus. Science 218:173-175.

75. Kesner R.P., Beers D.R. (1988). Dissociation of data-based and expectancy- based memory following hippocampal lesions in rats. Behav. Neural. Biol., 50, 46-60

76. Kesner R.P., Lee I., Gilbert P. (2004). A behavioral assessment of hippocampal function based on a subregional analysis. Rev.Neurosci. 15:333-351.

77. Kjelstrup K.G., Tuvnes F.A., Steffenach H.A., Murison R., Moser E.I., Moser M.B. (2002). Reduced fear expression after lesions of the ventral hippocampus. ProcNatl Acad Sci USA. 99(16): 10825-30.

78. Knierim J.J., Kudrimoti H.S., McNaughton B.L. (1995). Place cells, head direction cells, and the learning of landmark stability. J.Neurosci. 15:1648-1659.122

79. Lau L.F., Nathans D. (1985). Identification of a set of genes expressed during the GOrGl transition of cultured mouse cells, EMBO J. 4 3145-3151.

80. Laurberg S. (1979). Commissural and intrinsic connections of the rat hippocampus. J. CompNeurol. 184(4):685-708.

81. Laurberg S., Sorensen K.E. (1981). Associational and commissural collaterals of neurons in the hippocampal formation (hilus fasciae dentatae and subfield CA3).BrainRes. 212(2):287-300.

82. Lee I., Kesner R.P. (2004). Encoding versus retrieval of spatial memory: double dissociation between the dentate gyms and the perforant path inputs into CA3in the dorsal hippocampus. Hippocampus. 14:66-76.

83. Leutgeb S., Leutgeb J.K., Treves A., Moser M.B., Moser E.I. (2004). Distinct ensemble codes in hippocampal areas CA3 and CAl. Science. 305(5688): 1295-8.

84. Levy R, Friedman HR, Davachi L, Goldman Rakic PS (1997) Differential activation of the caudate nucleus in primates performing spatial and nonspatialworking memory tasks. J.Neurosci. 17:3870-3882.

85. R.W. Lim, B.C. Varnum, H.R. Herschman (1987). Cloning of tetradecanoyl phorbol ester-induced primary response sequences and their expression in density-arrested Swiss 3T3 cells and a TPA. nonproliferative variant, Oncogene 1:263-270.

86. Lipp H.P., Wolfer D.P. (1998). Genetically modified mice and cognition. Curr.Opin.Neurobiol 8:272-280.

87. Maaswinkel H., Jarrard L.E., Whishaw I.Q. (1999). Hippocampectomized rats are impaired in homing by path integration. Hippocampus 9:553-561.

88. Maguire E.A., Burgess N., Donnett J.G., Frackowiak R.S., Frith CD., O'Keefe. (1998). Knowing where and getting there: a human navigation network. Science.280(5365):921-4.

89. Martin P.D. (2001). Locomotion towards a goal alters the synchronous firing of neurons recorded simultaneously in the subiculum and nucleus accumbens of rats.Behav.Brain Res. 124:19-28.123

90. Masuda Y., Odashima J., Murai S., Saito H., et al. Radial arm maze behavior in mice when a return to the home cage serves as the reinforced // Physiology &Behavior 1994. V. 56. N. 4. P. 785-788.

91. McNaughton B.L., Barnes C.A., Meltzer J., Sutherland R.J. (1989). Hippocampal granule cells are necessary for normal spatial learning but not forspatially-selective pyramidal cell discharge. Exp,Brain Res. 76:485-496.

92. Milanovic S., Radulovic J., Laban O., Stiedl O., Henn F., Spiess J. (1998). Production of the Fos protein after contextual fear conditioning of C57BL/6N mice.Brain Res. 784:37-47.

93. Mittelstaedt H. (2000) Triple-loop model of path control by head direction and place cells. Biol.Cybern. 83:261-270.

94. Mittleman G., Whishaw I.Q., Jones G.H., Koch M., Robbins T.W. (1990). Cortical, hippocampal, and striatal mediation of schedule-induced behaviors.BEHAV NEUROSCI 104:399-409.

95. Mogenson G.J., Nielsen M. (1984). A study of the contribution of hippocampal-accumbens-subpallidal projections to locomotor activity. Behav NeuralBiol. 42(1):38-51

96. Morris R.G., Garrud P., Rawlins J.N., O'Keefe J. (1982). Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature 297:681-683.

97. Moser E., Moser M.B., Andersen P. (1993). Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present followingventral lesions. J.Neurosci. 13:3916-3925.124

98. Moser M.B., Moser E.I., Forrest E., Andersen P., Morris R.G. (1995). Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus. Proc.Natl.Acad Sci U.S.A.92:9697-9701.

99. Moser M.B., Moser E.I. (1998). Distributed encoding and retrieval of spatial memory in the hippocampus. J.Neurosci. 18:7535-7542.

100. Nilsson O.G., Strecker R.E., Daszuta A., Bjijrklund A. (1988.) Combined cholinergic and serotonergic denervation of the forebrain produces severe deficits in aspatial learning task in the rat. Brain Res 453:235-246.

101. Nitz D., McNaughton B. (2004). Differential modulation of CAl and dentate gyrus intemeurons during exploration of novel environments. J.Neurophysiol.91:863-872.

102. O'Keefe J., Conway D.H. (1978). Hippocampal place units in the freely- moving rat: whv thev fire when thev fire. Exn Brain Res 3 1:573-590.

103. O'Keefe J., Dostrovsky J. (1971). The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Res 34:171-175

104. O'Keefe J., Nadel L. (1978). The hippocampus as a cognitive map. Oxford University Press:

105. Ohl F., Michaelis Т., Fujimori H., Frahm J., Rensing S., Fuchs E. (1999). Volumetric MRI measurements of the tree shrew hippocampus. J NEUROSCIMETHODS 88:189-193.

106. Olton D.S., Samuelson R.J. (1976). Remembrance of places passed: spatial memory in rats. J.Exp.Psychol.Anim.Behav.Proc. 2:97-116.

107. Olton D.S. (1978). Characteristics of spatial memory. In: Cognitive processes in animal behavior (Hulse SH, Fowler H, Honig WK eds), pp 341-373. Hillsdale, NJ:1.awrence Erlbaum Associates.

108. Olton D.S., Walker J.A., Gage F.H. (1978). Hippocampal connections and spatial discrimination. Brain Research 139:295-308.

109. Olton D.S., Becker J.T., Handelmann G.E. (1979). Hippocampus, space, and memory. Behav.Brain Sci. 2:313-365.125

110. Packard M.G., Teather L.A. (1997). Double dissociation of hippocampal and dorsal-striatal memory systems by posttraining intracerebral injections of 2-amino-5-phosphonopentanoic acid. Behav. Neurosci., I l l , 543-551.

111. Papa M., Pellicano M.P., Welzl H., Sadile A.G. (1993). Distributed changes in c-Fos and c-Jun immunoreactivity in the rat brain associated with arousal andhabituation to novelty. Brain Res.Bull. 32:509-515.

112. Pare D., Llinas R. (1994). Non-lamellar propagation of entorhinal influences in the hippocampal formation: multiple electrode recordings in the isolated guinea pigbrain in vitro. Hippocampus. 4(4):403-9.

113. Parron C, Poucet В., Save E. (2001). Re-evaluation of the spatial memory deficits induced by hippocampal short lasting inactivation reveals the need forcortical co-operation. BEHAV BRAIN RES, 127, 71-79.

114. Pleskacheva M.G., Wolfer D.P., Kupriyanova I.F., Nikolenko D.L., Scheffrahn H., DeirOmo G., Lipp H.P. (2000). Hippocampal mossy fibers and swimmingnavigation learning in two vole species occupying different habitats. Hippocampus.10:17-30.

115. Poucet В., Thinus B.C., MuUer R.U. (1994a). Place cells in the ventral hippocampus of rats. Neuroreport. 5:2045-2048.

116. Poucet В., Buhot M.C. (19946). Effects of medial septal or unilateral hippocampal inactivations on reference and working spatial memory in rats.Hippocampus. 4:315-321.

117. Poucet В., Lenck-Santini P.P., Hok V., Save E., Banquet J.P., Gaussier P., Muller R.U. (2004). Spatial navigation and hippocampal place cell firing: theproblem of goal encoding. Rev Neurosci. 15(2):89-107.

118. Ransone L.J., Verma I.M. (1990). Nuclear proto-oncogenes FOS and JUN, Annu. Rev. Cell Biol. 6: 539-557.

119. Redish A.D. (2001). The hippocampal debate: are we asking the right questions? Behav.Brain Res. 127:81-98.

120. Rusakov,D.A., Davies,H.A., Harrison,E., Diana,G., Richter,L.G., Bliss,T.V. & Stewart,M.G. (1997). Ultrastructural synaptic correlates of spatial learning in rathippocampus. Neuroscience, 80, 69-77.

121. Ros J., Pellerin L., Magara F., Dauguet J., Schenk F., Magistretti P.J. (2005). Metabolic activation pattern of distinct hippocampal subregions during spatiallearning and memory retrieval. J Cereb Blood Flow Metab. Aug, 31.127

122. Roullet P., Lassalle J.M, (1990). Genetic variation, hippocampal mossy fibres distribution, novelty reactions and spatial representation in mice. Behav.Brain Res.41:61-70.

123. Roullet P., Lassalle J.M. (1992). Behavioural strategies, sensorial processes and hippocampal mossy fibre distribution in radial maze performance in mice.Behav.Brain Res. 48:77-85.

124. Sagar S.M., Sharp F.R., Curran T. (1988). Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science 240:1328-1331.

125. Sakurai H., Yamashita Y., Sassone-Corsi P., Gombos G. (1991). Immunohistochemistry of c-fos in mouse brain during postnatal development: basallevels and changing response to metrazol and kainite injection, Eur. J. Neurosci. 3:764-770.

126. Save E., Poucet В., Foreman N., Buhot M.C. (1992). Object exploration and reactions to spatial and nonspatial changes in hooded rats following damage toparietal cortex or hippocampal formation. Behav.Neurosci. 106:447-456.

127. Save E., Cressant A., Thinus B.C., Poucet B. (1998). Spatial firing of hippocampal place cells in blind rats. J.Neurosci. 18:1818-1826.

128. Save E., Poucet B. (2000). Involvement of the hippocampus and associative parietal cortex in the use of proximal and distal landmarks for navigation. BEHAVBRAIN RES 109:195-206.

129. Schacter,G.B., Yang,C.R., Innis,N.K. & Mogenson,G.J. (1989). The role of the hippocampal-nucleus accumbens pathway in radial-arm maze performance. BRAINRES, 494, 339-349.

130. Schenk F. (1989) A homing procedure for studying spatial memory in immature and adult rodents. J.Neurosci.Methods 26:249-258.

131. Schwegler H., Crusio W.E., Lipp H.P. (1989). A correlation between radial maze learning and the size of the mossy fiber terminal field in mice. Behav.BrainRes. Suppl. 33:309-0.128

132. Schwegler Н., Crusio W.E., Brust I. (1990). Hippocampal mossy fibers and radial-maze learning in the mouse: a correlation with spatial working memory but notwith non- spatial reference memory. Neuroscience. 34:293-298.

133. Schwegler H., Crusio W.E., Lipp H.P., Brust I., Mueller G.G. (1991). Early postnatal hyperthyroidism alters hippocampal circuitry and improves radial-mazelearning in adult mice. J NEUROSCI 11:2102-2106.

134. Shen A.Y., Tsai C.T. (1995). Neural connection from hippocampus to nucleus accumbens and the subpallidal area and their contribution to locomotor activity.Chin.J.Physiol. 38:111-116.

135. Small S.A. (2002). The longitudinal axis of the hippocampal formation: its anatomy, circuitry, and role in cognitive function. Rev.Neurosci. 13:183-194.

136. Smeyne R.J., Curran Т., Morgan J.l. (1992). Temporal and spatial expression of a fos-lacZ transgene in the developing nervous system. Brain Res.Mol.Brain Res.16:158-162.

137. Smith J, Hurst JL, Barnard CJ (1994) Comparing behaviour in wild and laboratory strains of the house mouse: Levels of comparison and functional inference.Behav.Processes 32: 79-86.

138. Squire L.R., Barondes S.H. (1970). Actinomycin-D: effects on memory at different times after training. Nature. 225(5233):649-50.

139. Stackman R.W., Golob E.J., Bassett J.P., Taube J.S. (2003). Passive transport disrupts directional path integration by rat head direction cells. J Neurophysiol.90:2862-2874.

140. Steffenach H.A., Sloviter R.S., Moser Е.1., Moser M.B. (2002). Impaired retention of spatial memory after transection of longitudinally oriented axons ofhippocampal CA3 pyramidal cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 99(5):3194-8.129

141. Steffenach H.A., Witter M., Moser M.B., Moser E.I. (2005). Spatial memory in the rat requires the dorsolateral band of the entorhinal cortex. Neuron 45:301-313.

142. Stoelzel C.R., Stavnezer A.J., Denenberg V.H., Ward M., Markus E.L (2002). The effects of aging and dorsal hippocampal lesions: performance on spatial andnonspatial comparable versions of the water maze. Neurobiol Learn.Mem. 78:217-233.

143. Suzuki S.W., Augerinos G., Black B.A (1980). Stimulus control of spatial behavior on the eight-arm maze in rats // Learning and Motivation V. 1 P. 11-18.

144. Swanson L.W., Wyss J.M., Cowan W.M. (1978). An autoradiographic study of the organization of intrahippocampal association pathways in the rat. J Comp Neurol.181(4):681-715.

145. Sziklas,V., Petrides,M. (2002). Effects of lesions to the hippocampus or the fomix on allocentric conditional associative learning in rats. Hippocampus, 12, 543-550.

146. Taube J.S. (1998). Head direction cells and the neurophysiological basis for a sense of direction. Prog.Neurobiol. 55:225-256.

147. Thinus Blanc C, Save E., Poucet В., Buhot M.C. (1991). The effects of reversible inactivations of the hippocampus on exploratory activity and spatialmemory. Hippocampus., 1, 365-371.

148. C. Thinus-Blanc. Animal spatial cognition: behavioural and brain approach. World Scientific: Singapore-New Jersey-London-Hong Kong, 1996.

149. Tischmeyer W., Kaczmarek L., Strauss M., Jork R., Matthies H. (1990). Accumulation of c-fos mRNA in rat hippocampus during acquisition of a brightnessdiscrimination. Behav.Neural.Biol. 54:165-171.

150. Tolman, E. C. (1948). Cognitive maps in rats and men. Psychological Review, 55, 189-208130

151. Touzani К., Marighetto A., Jaffard R. (2003). Fos imaging reveals ageing- related changes in hippocampal response to radial maze discrimination testing inmice. Eur.J.Neurosci. 17:628-640.

152. Tsien J.Z., Huerta P.T., Tonegawa S. (1996). The essential role of hippocampal CAl NMDA receptor-dependent synaptic plasticity in spatial memory seecomments.. Cell 87:1327-1338.

153. Tubbiola M.L., Wysocki C.J. (1997). FOS immunoreactivity after exposure to conspecific or heterospecific urine: where are chemosensory cues sorted? Physiol.Behav. 1997. V. 62. № 4. P. 867-870.

154. Van Beveren C , van Straaten F., Curran Т., Muller R., Verma I.M. (1983). Analysis of FBJ-MuSV provirus and c-fos (mouse) gene reveals that viral andcellular fos gene products have different carboxy termini. Cell 32:1241-1255.

155. Vann S.D., Brown M.W., Erichsen J.T., Aggleton J.P. (2000a). Fos imaging reveals differential patterns of hippocampal and parahippocampal subfield activationin rats in response to different spatial memory tests. J.Neurosci. 20:2711-2718.

156. Vann S.D., Brown M.W., Aggleton J.P. (20006). Fos expression in the rostral thalamic nuclei and associated cortical regions in response to different spatialmemory tests. Neuroscience. 101:983-991.

157. Vann S.D., Brown M.W., Erichsen J.T., Aggleton J.P. (2000B). Using fos imaging in the rat to reveal the anatomical extent of the disruptive effects of fornixlesions. J.Neurosci. 20:8144-8152.

158. Vazdarjanova A., Guzowski J.F. (2004). Differences in hippocampal neuronal population responses to modifications of an environmental context: evidence fordistinct, yet complementary, functions of CA3 and CAl ensembles. J Neurosci.24(29):6489-96.131

159. Vinogradova O.S. (2001) Hippocampus as comparator: role of the two input and two output systems of the hippocampus in selection and registration ofinformation. Hippocampus. 11:578-598.

160. Wallace D.G., Hines D.J., Whishaw I.Q. (2002) Quantification of a single exploratory trip reveals hippocampal formation mediated dead reckoning.J.Neurosci.Methods. 113:131-145.

161. Wan H., Aggleton J.P., Brown M.W. (1999). Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J.Neurosci. 19:1142-1148.

162. Wan H., Warburton E.C., Kusmierek P., Aggleton J.P., Kowalska D.M., Brown M.W. (2001). Fos imaging reveals differential neuronal activation of areas ofrat temporal cortex by novel and familiar sounds. Eur.J.Neurosci. 14:118-124.

163. Whishaw I.Q., Vanderwolf C.H. (1971). Hippocampal EEG and behavior: effects of variation in body temperature and relation of EEG to vibrissae movement,swimming and shivering. PHYSIOL BEHAV 6:391-397.

164. Whishaw I.Q. (1972). Hippocampal electroencephalographic activity in the Mongolian gerbil during natural behaviours and wheel running and in the rat duringwheel running and conditioned immobility. Can.J Psychol. 26:219-239.

165. Whishaw I.Q., McKenna J.E., Maaswinkel H. (1997) Hippocampal lesions and path integration. Curr.Opin.Neurobiol 7:228-234.

166. White L.E., Price J.L. (1993). The functional anatomy of limbic status epilepticus in the rat. I. Patterns of 14C-2-deoxyglucose uptake and Fosimmunocytochemistry. J.Neurosci. 13:4787-4809.

167. Wimer C.C., Wimer R.E., Roderick Т.Н. (1971). Some behavioral differences associated with relative size of hippocampus in the mouse. J Comp Physiol Psychol76:57-65.132

168. Witter M.P., Wouterlood F.G., Naber P.A., van Haeften T. (2000). Anatomical organization of the parahippocampal-hippocampal network. Ann.N.Y.Acad.Sci.911:1-24.

169. Wolf O.T., Dyakin V., Patel A., Vadasz C , De Leon M.J., McEwen B.S., BuUoch K. (2002). Volumetric structural magnetic resonance imaging (MRI) of therat hippocampus following kainic acid (KA) treatment. Brain Res. 934:87-96.

170. Wolfer D.P., Madani R., Valenti P., Lipp H.P. (2001). Extended analysis of path data from mutant mice using the public domain software Wintrack.Physiol.Behav. 73:745-753.

171. Zemp J.W., Wilson J.E., Schlesinger K., Boggan W.O., Glassman E. (1966). Brain function and macromolecules. I. Incorporation of uridine into RNA of mousebrain during short-term training experience. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 55(6): 1423-31.