Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное цитогенетическое исследование трех видов рода ромашки (Matricaria L. )

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саматадзе, Татьяна Егоровна, Москва

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" ("ВИЛАР").

На правах рукописи УДК 575.853'316.7: 576.316.2:576.354.4

САМАТАДЗЕ ТАТЬЯНА ЕГОРОВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХ ВИДОВ

РОДА РОМАШКА (MATRICARIA L).

03. 00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: к. б. н. О. В. Муравенко, к. с/х н. Г. И. Кл и махин

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы....................................................................................7

1.1. Общая характеристика видов Matricaria chamomilla L., М. inodora L. и M. maritima L.................................................................................................................7

1.1.1. Систематическое положение, распространение в природе и использование в медицине.....................................................................................7.

1.1.2.Морфологическое описание и биологические особенности ромашки........9.

1.1.3. Биологически-активные вещества ромашки аптечной...............................12

1.1.4.Характеристика кариотипа видов ромашки..................................................14

1.2.Современные методы хромосомного анализа......................... ...................15

1.2.1. Изучение митотических хромосом с помощью монохромного окрашивания............................................................................................................15

1.2.2. Методы дифференциального окрашивания хромосом..............................18

1.3. Полиморфизм гетерохроматических районов................................................24

1.4. Анализ поведения хромосом в мейозе...........................................................26

1.4.1. Особенности поведения хромосом в мейозе у автополиплоидов.............27

Заключение..............................................................................................................29

Глава 2. Материалы и методы................................................................................31

2.1. Материалы исследования................................................................................31

2.2. Методы исследования......................................................................................32

Глава 3. Результаты и обсуждение........................................................................38

3.1. Изучение кариотипов трех сортов ромашки аптечной с использованием метода монохромного окрашивания хромосом....................................................38

3.2. Исследование G-подобного бэндинга хромосом ромашки аптечной...........44

3.2.1. Разработка метода G-подобного дифференциального окрашивания

митотических хромосом ромашки..........................................................................45

3.2.2. Рисунок G-окрашивания хромосом ромашки аптечной..............................50

3. 3. Изучение С-дифференциально окрашенных хромосом трех видов ромашки...................................................................................................................59

3.3.1. Идентификация хромосом ромашки аптечной с помощью метода С-окрашивания...........................................................................................................60

3.3.2. Описание стандартного кариотипа С-дифференциально окрашенных хромосом ромашки аптечной................................................................................62

3.3.3. Сравнение рисунков С-бэндинга хромосом в кариотипах 3-х сортов Matricaria chamomilla L...........................................................................................66

3.3.4. Кариотипическое изучение М. inodora и М. maritima L. с помощью метода

С-бэндинга..............................................................................................................68

3.4. Изучение стабильности тетраплоидного сорта Подмосковная ромашки

аптечной..................................................................................................................73

3.4.1. Сравнение кариотипов сорта Подмосковная у суперэлиты и первой репродукции............................................................................................................73

аптечной..................

Выводы....................

Список литературы

.......80

82-111

ВВЕДЕНИЕ.

За последние годы широкое распространение получили исследования геномов различных хозяйственно-ценных растений и их дикорастущих сородичей с помощью разнообразных современных цитогенетических и молекулярно-биологических методов. Это дает возможность лучше понимать генетические особенности изучаемых видов и определять их геномные и эволюционные взаимоотношения как с дикорастущими, так и культурными близкородственными видами. Получаемые данные позволяют целеноправленно находить эффективные пути селекции форм, обогащенных полезными генами. Такие исследования проводятся на многих видах растений ( Dobel et al., 1972; Filion, 1974; Щапова, 1977, 1980; Endrizzi et al., 1985; Motzfeldt et al., 1988; Бадаев и др., 1989; Айзатулина и др., 1989; Муравенко и др., 1991; Cai, Bullen, 1991; Badaeva et al., 1994, 1996; Gecheff, Hvarleva, 1994; Galasso et al., 1996 и другие). Однако геномы далеко не всех полезных видов растений хорошо изучены. В число таких, практически не исследованных, видов входит известное ценное лекарственное растение - ромашка аптечная, и родственные дикорастущие виды ромашки, используемые в народной медицине.

Род ромашки (Matricaria L.) широко изучен флористами, но до сих пор его систематика остается спорной и постоянно меняется (Vaarama, 1955; Флора СССР, 1961; Черепанов, 1981; Растительные ресурсы, 1993.). При этом геномы, входящих в род Matricaria видов, практически не исследовались. У многих видов рода посчитаны хромосомные числа (Tarnavschi 1948; Vaarama 1950; Darlington, Wylie, 1963 Koul, 1964a, б; Больховских и др., 1969; Юрцев, Юрцева 1982), а морфология хромосом изучена слабо и только в кариотипах нескольких видов (Vaarama, 1955; Darlington, Wylie, 1963; Koul, 1964a;

Mathusoodanan, Arora, 1979). Скудность информации связана с тем, что виды ромашки имеют мелкие хромосомы со сходной морфологией, что затрудняет их анализ.

Таким образом, цитогенетическое исследование видов рода ромашки актуально не только для изучения структуры хромосом этих видов, но и для установления геномного состава у разных видов и внутри полиплоидных видов. Проведение такого исследования требует использования не только существующих методов хромосомного анализа, но и разработки новых подходов с целью более полного изучения геномов разных видов ромашки.

Целью данного исследования было цитогенетическое изучение кариотипов трех видов ромашки Matricaria chamomilla L., Matricaria inodora L. и Matricaria maritima L. для характеристики и сравнения геномов этих лекарственных растений.

Непосредственными задачами исследования являлись:

1. Анализ кариотипов двух диплоидных и тетраплоидного сортов М. chamomilla методом классического монохромного окрашивания хромосом.

2. Разработка метода высокоразрешающего G-подобного дифференциального окрашивания (G-бэндинга) хромосом ромашки аптечной.

3. Изучение хромосом в кариотипах трех сортов ромашки аптечной с использованием метода G-бэндинга. Сравнение геномов исследуемых сортов.

4. Изучение хромосом ромашки аптечной и двух дикорастущих видов методом С-окрашивания Исследование межвидового и внутривидового полиморфизма гетерохроматических районов хромосом в кариотипах этих видов.

5. Сравнение результатов монохромного окрашивания, С- и О-бэндинга хромосом в сортах ромашки аптечной, с целью установления сходства и различия их геномов внутри вида М. сЬатотШа.

6. Сравнение рисунков С-окрашивания хромосом в кариотипах всех трех изучаемых видов с целью установления сходства и различия их геномов.

7. Определение цитологической стабильности тетраплоидного сорта ромашки аптечной Подмосковная методами анализа мейоза и С-дифференциального окрашивания митотических хромосом в растениях суперэлиты и первой репродукции.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика видов Matricaria chamomilla L., М. inodora L. и

M. maritima L.

1.1.1. Систематическое положение, распространение в природе и

использование в медицине

Род ромашки относится к семейству сложноцветных Compositae (=Asteraceae). Родовое название ромашки, систематиками изменялось несколько раз: Matricaria L. = Tripleurospermum Sch. Bip. = Matricaria sensu Pobed. = Chamomilla (Черепанов, 1981), поэтому и название видов ромашки имеет много синонимов. Видовые названия ромашки аптечной (2п=2х=18) многочисленны: Matricaria chamomilla L. (= syn. Matricaria recutita L.) (Флора СССР, 1961); Matricaria recutita L. (= Chamomilla recutita) (Черепанов, 1981); Matricaria recutita L. (=Chamomilla recutita (L.) Rauschert, Matricaria chamomilla sensu (L.) (Растительные ресурсы СССР, 1993). Два других вида ромашки: М. inodora L. (= М. perforata L.) (2п=4х=36) и М. maritima L. (=Tripleurospermum maritimum (L.) Koch.) (2n=2x=18), рассматриваемых в данной работе, также имеют много других синонимов (Растительные ресурсы СССР, 1993). В работе были использованы видовые названия ромашки аптечной - Matricaria chamomilla L. , ромашки непахучей - М. inodora L. и ромашки приморской - М. maritima L., как наиболее часто употребляемые в литературе и соответствующие Флоре СССР (1961). Оригинальные образцы видов, описанные К. Линнеем, хранятся в Лондоне (Черепанов, 1981).

Наиболее широкое применение в медицине получила ромашка аптечная, принадлежащая к числу самых древних лекарственных растений. Сведения о

лекарственных свойствах ромашки, успокаивающей судороги и боли, встречаются еще у Диоскорида и Гиппократа. В 1 веке н. э. она была включена в энциклопедию естественных наук. После того, как в конце XV века из цветочных корзинок ромашки аптечной было получено эфирное масло, интерес к этой культуре еще более увеличился. У таких видов ромашки как Matricaria maritime и М. inodora химический состав цветков, листьев и стеблей близок к химическому составу ромашки аптечной (Раал и др., 1987), что позволило использовать эти виды в народной медицине, хотя и не так широко, как ромашку аптечную. Например, ромашку непахучую (М. inodora L.) применяли при ангине, ларингите, как мягчительное, обезболивающее и спазмолитическое средство (Крылов, 1876; Ворошилов, 1941; Махлаюк, 1967).

Родиной М. chamomiiia является восточная и южная Европа (Чиков, 1976). Современный ареал ромашки охватывает почти всю Европу от Скандинавии до Средиземноморья. В значительно меньших масштабах она встречается в Средней Азии, на Кавказе, Сибири и на Дальнем Востоке. На Американский и Австралийский континенты ромашка аптечная попала как сорняк зерновых культур (Илиева, 1971). Ромашка быстро захватывает новые территории, поэтому естественные границы ее ареала очень изменчивы (Чиков, 1976).

М. inodora широко распространена в Европе, но встречается также на Кавказе, в Сибири, на Дальнем Востоке и в Средней Азии. В Америку ромашка непахучая была занесена как сорняк в 18 веке. М. maritima встречается по песчаным морским побережьям Западной и Северной Европы (Котт, 1948).

Ввиду большой потребности в сырье ромашки аптечной, этот вид в конце прошлого века был введен в культуру. В России селекцией и семеноводством

ромашки аптечной стали заниматься с 1953 года. На территории бывшего СССР ромашку выращивают на Украине, особенно в Херсонской области и Крыму, Белоруссии, Краснодарском крае, Московской области и Западной Сибири (Губанов, Фоменко, 1973; Чиков, 1976). Показано, что в культуре сырье получается более однородным и высококачественным (Гаммерман и др., 1990). Другие виды ромашек в культуру не вводились.

1.1.2. Морфологическое описание и биологические особенности ромашки

Matricaria chamomilla L. - это однолетнее травянистое растение с сильным ароматом. Как биологический вид ромашка аптечная характеризуется высокой степенью индивидуальной изменчивости по морфологическим признакам, в том числе существенным с точки зрения хозяйственной ценности -(Глазова, 1970; Пенева, Попова, 1987).

Корень у ромашки стержневой, длиной 15-60 см, мало разветвленный, внутри полый. Листья очередные, сидячие, рассеченные на раздвинутые узколинейные, почти нитевидные (шириной до 0,5 мм) шиловидно заостренные сегменты, заканчивающиеся мягким острием. Соцветия, многочисленные корзинки диаметром до 25 мм (на боковых побегах мельче), расположены на тонко ребристых длинных (до 8 см) цветоножках на верхушках стеблей и боковых побегов. Ложе корзинки полое, голое, в начале цветения полушаровидное, в конце цветения и при плодах удлиненное до узко конической формы высотой 4-6 мм. Последний признак позволяет отличить ромашку аптечную от других сходных с ней видов ромашек: ромашки непахучей М. inodora L.= М. perforata L.), ромашка приморская или трехреберник

приморский (М. maritima), пупавки полевой (Anthemis corvensis L.), пупавки собачьей (Anthemis cotnea L.). Цветоложе у указанных видов ромашек не полое, а диаметр корзинок не превышает 12 мм (Чиков, 1981).

Matricaria inodora L (2n=4x=36) - это однолетнее растение, высотой 20-50 см, голое, реже с волосками. Листья дважды и трижды перисто-рассеченные на линейно-нитевидные дольки. Встречается как сорное растение на огородах и засоряющее культурные посевы ромашки аптечной (Мальцев, 1937; Котт, 1948; Флора СССР., 1961).

Matricaria maritima L. (2n=2x=18) - это однолетнее растение высотой 10-40 см, стебель ветвистый от самого основания или в верхней части, голый, красноватый, особенно при основании. Листья продолговатые или обратно-яйцевидные.

Цветки в корзинках всех описываемых видов ромашек делятся на два типа. Наружный ряд образован 12-18 язычковыми цветками, а внутри расположены многочисленные трубчатые цветки. Краевые язычковые цветки белые, длиной 8-14 мм, шириной 2,5-3 мм с 5 зубцами на верхушке, пестичные; внутренние - трубчатые, золотисто-желтые цветки значительно мельче язычковых, с пяти-зубчатым венчиком, обоеполые. В трубчатых обоеполых цветках лопасти рыльца пестика не раскрываются и не могут воспринимать пыльцу до тех пор, пока собственная пыльца не будет удалена из тычиночной трубки быстро растущим столбиком пестика, играющим роль своеобразного поршня. Эта особенность строения и развития цветка предотвращает самоопыление у ромашки (Юрцев, Юрцева, 1982). Плоды - удлиненные семянки, длиной 1-2 мм, шириной 0,2-0,3 мм.

В цикле развития ромашки аптечной выделяют следующие фазы: всходов; розетки; начала бутонизации; бутонизации; начала цветения; массового цветения; созревания семян. Цветение ромашки аптечной начинается через 30-50 дней после появления всходов и продолжается до поздней осени, что составляет в целом 40-70 дней (Семенихин и др., 1987). За этот период можно провести до 12 сборов соцветий. В отличие от ромашки аптечной, цикл развития ромашки непахучей и трехреберника приморского значительно варьирует. Существуют как озимые, так и яровые формы ромашек, выявлены и 2-летние растения (Кондратенко, 1972).

Ромашки - типичные мезофиты, однако на самых ранних этапах онтогенеза для получения и развития всходов требуются условия повышенной влажности. Наиболее благоприятной среднесуточной температурой вегетационного периода считается 19-21° С. Даже незначительные отклонения условий выращивания ромашки аптечной от оптимальных могут приводить к резким изменениям продуктивности, отношения массы цветков к вегетативной массе, размера цветков и содержания в них эфирного масла (Хотин, 1968; 1969; Svab, 1969; Глазова, 1970; Franz et al., 1975; Holzl, Demuth, 1975; Franz, 1980; Waly, 1980; Peneva, Popova, 1987; Letchamo, Vomel, 1987).

Показано, что у тетраплоидных (2п=4х=36) форм ромашки аптечной происходит увеличение генеративных органов и повышение содержания наиболее ценных компонентов эфирного масла. Соцветия, цветки, семена у тетраплоидной ромашки крупнее, чем у диплоидной формы. Цветки имеют длинную цветоножку. Тетраплоидные растения ромашки менее облиственны. Кусты более выровнены по высоте и компактны, более устойчивы к полеганию. Известны естественные полиплоиды ромашки - М. inodora, однако у аптечной

ромашки тетраплоидные формы получают искусственно, используя различные физические и химические мутагенные факторы ( Глазова, 1971, 1977; Franz, 1980; Глазова и др., 1982).

1.1.3. Биологически-активные вещества ромашки аптечной

В цветочных корзинках ромашки аптечной содержится 0,2 - 0,8% эфирного масла, в состав которого входят следующие биологически-активные вещества: (а) терпеноид хамазулен - густая жидкость темного цвета, хорошо растворимая в органических растворителях и не растворимая в воде; (б) терпены и сесквитерпены; (в) сесквитерпеновые спирты; (г) трициклические спирты; (д) карпиловая, нониловая и изовалериановые кислоты. Методом газово-жидкостной хроматографии в эфирном масле ромашки аптечной удается выделить 16 компонентов, в том числе хамазулен, фариезен, а-бизаболол, а- бизаболооксиды А и В, а-бизаболоноксид А и цистенин-дициклоэфир, флавоноиды - кверциметрин, апиин, а также каротин, кумарины, холин, аскорбиновая и никотиновая кислоты, горькие, слизистые и некоторые другие вещества (Араки др., 1980; Муравьева, 1981; Пенева, Иванчева, 1989).

Наибольшее количество эфирного масла содержится в соцветиях ромашки в фазе массового цветения, в листьях его содержание снижается и достигает минимума в стеблях (Киселева и др., 1969; Глазова, 1977; Franz, 1980; Просовский, Олешко, 1988). Следы эфирного масла были обнаружены также в корнях М. recutita (Reichling, Bisson, 1983).

Содержание в соцветиях эфирного масла и входящего в его состав хамазулена зависит от генетических факторов (Svab, Sarkany, 1975) и условий произрастания (Глазова, 1970; Арак, 1981; Peneva, Popova, 1987; Horn, et al., 1988). Однако, имеющиеся в литературе сведения о влиянии различных

факторов окружающей среды весьма противоречивы. Одни исследователи утверждают, что содержание биологически активных веществ зависит от метеорологических условий, влажности почвы, интенсивности освещения и континентальное™ климата (Waly, 1980; Letchamo, Vomel, 1987; Штейн, Шефер, 1972; Мате, 1972; Franz et al., 1975). Другие, наоборот, отрицают существование такой зависимости (Holzl, Demuth, 1975). Несоответст�