Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение растительных промутагенов из различных классов пестицидов в краткосрочных бактериальных тестах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение растительных промутагенов из различных классов пестицидов в краткосрочных бактериальных тестах"

АКАДЕМИЯ НОТ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МККРОЕШОГИИ И ЕКРУ ООЛОГИИ

На правах рукописи

МУХИТДЕШВ АСАН СРАХДИНОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНОЙ ИЗУЧЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ШШУТАШЮВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ПЕСТИЦИДОВ В КРАТКОСРОЧНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТАХ

03 .00.07 - микроуиологдя

АВТОРЕФЕРАТ

дЕСоертадии на соиоканив ученой стеашш кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казахского Государственного университета имени Аль-йараби.

Научные руководители - член-корреспондент АН ЕК, доктор биологических наук Н. Х.ШГАЕВА,

кандидат биологических наук К. С. САБИЩАЯ Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.Б.ЕИГАЛИЕВ,

кандидат биологических наук Н.ТЛОЕШЮВА Ведущая организация - КазНИИ запуган растений

Бацпта состоится июля 1992 года в часов

на заседании специализированного совета К 008.01.01 но ' задаю диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Институте микробиологии "АН ЕК (Алма-Ата, ул.Киро-. ва, 103. Индекс 48С100).

С диосертацпей можно ознакомиться в библиотеке АН РК (Алма-Ата, ул.Шевченко, 28).

Автореферат разослан ЦиОЦД 1992 г.

Учоккй секретарь специализированного совета,

С

кавд-щат биологических наук . М.С.Мухамедпева

Актуальность темы. 3 последнее время в генотоксикологк-оск1тх исследованиях акцент сместился с гаучен'.ш мутагенности сенобкоткков ка выявление их реактивных нгтаболитов, которые огут возникать в результате б'лодопгчесг.оЯ трансформации з ор-'внизыо человека к аявотккх. Постому стаз газ распространение голуч'лли тест-скгтеш, сочзтагодж бактеретлькне культуры и ит-¡ссональнне бэр^акты !.:лекогшта;о;ц;у. ( оЪ о.Х , 1935). Сдна-

:о, для определения потегщгалькой опасности длл человека хж;.чзс~ г.ж загрязнителей необходимо з:-:ать о характере юс преобразсгачия ! организме растения, которое могут акку:/ул:гаоБа?ь средние вещества в теченлга длительного времени. В связи с этим, начиная с )3-:< годов во кнопэс лабораториях лрозодится изучение биотранс-Зормации хпмдааскгас агентов йорменткой систолой растеж;?. Показано, что растения, подобно мяекопэтаизм могут Тми ¿наг.тазарозать «угагеш улт. наоборот, вызывать образование виеокореакткзше .¡стаболктоп (¿'Хо'.-.'а, СапЛИз , 1932). Более того, установлено, тао существуют безвреднее соединения, которые гфЗЕрацаатся в му-, гагеш только г.осле взагс.;одейстакя с растительными &р;.:еьтаг.:ц, тто представляет опрзделешгуп угрозу здоровья человека (3on.-ti.lo, ?1<з'.-;п. , 1978). В связи с этим вопроси бхэтрансфэрмгцкя ксеко--Зкотиков и поджар чувствительна* методов регистрации мутагок;ьк (.¡етабол'.ггов представляет теоретический и пражитеосгай интспес.

Цель 'л зрдсл-,'.! жслодогликА. Целью каетояце? работ:,! 6?,по: подбор чувствительных ¡¡ьтодов регистрации мутгоахшх метаболитов к малке доз г.есткцидоа, выяснение роли р&ая!г»пл: форме-итоз в метаболизма постпц'.щоп.

Для достдашал поставленной цели рааоли<5ъ влодчцыо аад-лчи:

I. ^следование тснатич^екзи актизног.тй пропсзима ¿1 ^-н^д-

МИДа В геСТЭ.Х С - Sc.lrcon.olla typiiirawiuin u ücoheriohia coli.

2. Определение мутагенных аффектов пестицидов в бактериальных гестах с активацией ферментными системами ячменя в условиях ill vivo к in vitro.

3. Изучение модифкцируацего действия НАД^Н -генорирухцей системы, аддукторов и ингибиторов ферментативной активности на мутагенность пестицидов.

4. Изучение слияния низких доз аЛяатоксика Bj на мутагенность пропазпна к фосфамзда.

Научая новизна наследований. Впервые показана возможность использования ^оз и гес -<ромотестов для выявления генотоксич-ностк пестицидов.

Показано, что в системе растительной активации образуются мутагенкиз метаболиты фосфамида, которые, в отличие от исходного соединения, преимущественно индуцируют мутации типа сдвига рш ки считывания.

Выявлена роль НАД<5Н - генерирующей и пероксицазной системы е растительном метаболизма исследуемых пестицидов.

Практическая ценность работы. Для вшачения мутагенности остаточных количеств пестицидов рекомендуется soc - хромотест. Показано, что сценку чувствительности штаммов сальмонелл к пест цидам следует проводить з системе бактерии/гоыогенат растений.

Генетические службам предлагается схема оценки потенциальной опасности пестицидов.

Поло'жэн'ия з'.шосгнке кд зациту.

- Целесообразность использования so¡3 - хромотеста в изучении !.;птабол1гч0с,кой активации пестицидов.

- Бозмо.таоогь посьгггения монооксигеназной активности растеь

тнкверсшгышми индукторами.

- Различия в метаболической активации известного раститель-гого промутагеиа - пропазина и прямого мутагена - фосйямцца.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы з I работах.

Апробация диссертационной работы. Материалы работы докладывались и обсухщалксь на конференции молодых ученых Казахского ¡гнииерсктета км.Аль-Фараби (1991, 1992гг.), "{азах с но го отделения ЕМ О (I9S9), Секция генетических аспектов проблемы "Человек л би-зсфера" (1990).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах ютинопксиого текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов я списка использованной литературы.

Работа включает ¿д" табляцы, "jq рисунков, ~в"описке "литературы 195 источников.

Содержание работы.

______Материалы и методы исследования культуры микроорганизмов,..

Snlnonella typhinurium Ik 98 rfa, hijD 3952, uvr В (pXM 101); ГА 100 r"a, his G 46, uvr В (РШ 101). Escherichia coli Eo 1000 ,'l-JB (rec A+)'и HB 101 (reo A").

Методы исследования.

I. Полуколичественный метод учета гепных мутаций у тео -терных штаммов ' Salmonella -typhimurium.

Ночную культуру бактерий, отмытую от бульона,вносили в селективней полуобогщенный гистидином и бкотиков 0,6® агар, добавляли . раствор исследуемого препарата в используемых концентрациях, активирующую смесь л различных вариаитлх, содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего мини-

мального агара. Учет результатов проводил!! путем подсчета ране тантов на опытных и контрольных чашках.

2. £са - хромотест. Ночную культуру тестерного штамма EcIOOO pju 43, пересевали э свекиЯ бульон и подращивали с а г рацией до оптической плотности 0,6-0,7. К I мл выросшей культу ри добавляли 10-20 мкл исследуемого препарата, растворенного.е водэ гаи Д«С0, и инкубировали 2 часа при 37° С с аэрацией. По истечении 2 часов контакта с исследуемым веществом бактериаль* культуру помешал л в водяну» бака, добавляли две капли 0,1$ si ir три капли хлороформа, энергично встряхивали, добавляли нигрс йенил-галактозвд (ОКШГ) и включали секундомер. Когда смесь npi обретала желтую окраску, реакцию останавливали добавлением I 1. hi\ 2 GOg и отмечали время остановки реакции. Производили cne¡ рофотсмотрические намерения бактериальной суспензии при длине волны 600 нм, а тагсхе р -галакуозвдаэной смеси в Z буфере п] длине волны 420 и 550 нм.

З.Кес -хромотест. Ночную культуру индикаторных бактерий за< вали в бульон и подранивали до плотности 0,4-0,3, переносили пробирки по I мл, куда добавляли исследуемые соединения в соо ветстБуицлх концентрациях. Проб ирки культивировали при 37° С вотршагаанием в течение 2 часов, после чего в качестве инцукт генов, контролирующих синтез ß -галактозицазы, вносили КПТГ (4 • 1лГ'1 1Л. Через 2 часа проводили определение уровня синте р -галактозидазы вышеописанным способом.

Параметры доэовой зависимости рассчитывали в полулогари^ чайкой масштабе и оценивали1', величину дезы мутагена, при кот роя э^ект уменоиалек в 2 раза =Ь Д^,

4. Приготовление растительной активирующей смеси. В эксг ремонтах использовали ячмень сорта "Чер.!иговская-5". Пророст!

гращивали в течение 3 — 5 суток в лаборатортадс условиях с есте-■веиной йотопериодичностью, через 5 суток растения: собирали, мельчали и замораживали. Растительный материал гомогениоирова-! пестиком в ступне, добавляя двойной обтаем фосфатного буфера ',4) и центрифугировал!» 15 минут при режиме 90003 и температу-! -Z -4° С. Супернатантную жщкость отбирали и сразу нспояьзо-1ЛИ э опыт.

В эксперимент включали параллельно варианты с полной акти-тругацэй снесья (ПАС) я неполной активирующей смесью (НАС). В ютап ПАС входили;исследуеммй препарат, суспензия бактерий, ра-.'ительнкЯ гомогекат и кегдкторьт, кеобходждаэ для работы окисли-гльно-восстанэвительнък бермзктов. В вариантах с НАС вместо ко-»(торон вносили соответствущкЗ объем растворителя - эоди.

Результаты исследований

I. Изучение генетической активности проггазша и фосфамдда i тестерных птаммах бактерий без метаболической активации.

Изучались два раэличшх по химическому строения и характеру ггагенного воздействия препарата. Один vía них - пролазим, отко-ггея к группе триазгиовкх пестицидов и является типичным растят-гьнш rrpotrjTRveuoi.; и тщуцируат гейше нутации у мякроорганка-jb только под влиянием растительных: йерментов ( jplev.tt , 1982). зугой - фОСфйМНД, ОТНОСИТСЯ к группе фОСфОрОргР-НЯЧОСКИХ Г.ЭЙТ'ЛЦИ" зв, является пряшл< мутагеном, нкактияируетсл мняросоиаш мле-зптггакд.к и активируется ферментами растительной активация.

Предварительно ота соединения били проверены на плазиидгогх: гаммах fl.-typhimuriu» ТА 98 а ТА 100 бел активации (рисЛ), ан я следовало оявдагь, пролаз mi нэ проявляет активности ггрх рлмоП проворно на обоих штаммах. Оосфшпц для шташа Тд 100 ока-

§1000.

о и*

м

к 800-

(О р

к

« 6С0.

Рч

ч!

га

&4СЮ-

о я в о

о

200"

ТА 98

ХОНГрОлЬ 10

100

хощектрацЕЯ нгг/ чашку

ТА 100

гГ1

Лж.

Я М.

II !!

I!

контроль 10 100 ЮС( жонцеитрец1-я ыкг/чаш;

а! з*

* 600

о

Ен

1С0

I

'200

контроль

ТА 98

1 К'

1 г! к V"

^ гГ.ж

10 100 1000

ТА 100

1000 контроль 10

100

ЮС

о И

концентрации! мкг/чагку

концентрация мкг/чаьху

?ио.1. Уутагоаная актшзносгь пропазкна (а) и. фосфаыида (б) в тсн то ЭЕмса с раохлтолькой акт)лзац.1н;;.

| | - актизац.и..

г"п

ЕЛО.

ПАС.

5ался мутагеном средней степени активности (кра ость превышения уровня ицдуцировантшх реверсий над конгрольным-6-12 раз), а Хая птамма ТА 98-слабым мутагеном (лревгсление над контролем з 21 раза).

Одним кз эффективных методов определения мутагенности язля-зтсн боб - xpoiMTQCT, основанный на использовании ицдикаторно-го штамма E.coli S3 IOQO (pjE43), сконструированного в институте общей генетики АН СССР, у которого структурный ген /> -га-лактозщазы, находится под боб - индуцкбельшч промотором. Это позволяет оценивать мутагенную активность тестируемых соединений путец слежения за синтезом fi -галактозддазы.

концентрация кьсг/мл Ряс.?.. Исследование мутагенной активноотя фосфгъи,дг (а) пропазлна (0) в scs -хромотеоте. --6бэ ьк.тйвац;м.----с растительной ак?льгц£&;1

В данном тесте при прямой проверка пролазил не проявил ак тиэности. Фосфамвд в этих же условиях индуцировал S03-ответ. Максимальное количество фермента - 825 р -галактозвдазных еци ниц, обнаружено при обработке клеток е.coli фосфамицом в кон центрации 100 мкг/ira, что в TI раз превышает контрольный фон а тивности бермента. Дальнейшее увеличение конца.ттрации фосфамвд приводит к снижению оцйекта, это происходит за счет его леталь чего действии на клетки бактерий В.со].i (рис.2). Следует о метить, что'достоверный эф$ект наблюдается в области малых доз I и 10 ынг/мл, для которых активности на штаммах Эймса не обна руг,о но.

В дополнение к указанным вшз методам проведено определен ДНК - повреждащей активности. Для этого был использован гео хронотест. Фосфаыид в этом теста проявил ДНК-тропную активност прячем следует отметить, что также, как и в sos - хромотесте, DTOv матод позволяет обнаружить активность малых доз препарато а этом отношении он чувствительней теста Эймса.

Пропазта, также как и в других бактериальных тестах, не'о .падал генетической активностью (табл.1).

Такта образом, фосфаауд обладает Д1К - повре^даюцим дейст виом к возникновение мутаций под действием малых доз, видимо, се зано с индуцированием процессов ошибочной репарации. Активност пропасла нз обнаружена ни в одном из использованных методов \ гистрадии прямых мутагенов.

?. Растительная активация пропазина и фосфамица.

В последующей серли эксперинентов использована система с метаболической адтпвацией раст тельным л фермегггалш.

Для п.^учочил ыикросомальшх ферментов чадо всего испольг

i

о л

■ о

'И

Еч -J

id ОТ ^ '.!) сЛ J

.¡ 'i M « Il

I

-f о

C7\ СЭ

О (M

m m

о о w

о mocvi -тслюо (ооэоо --t-oom «.tuot-Q уэс-смо

oic^voîn tOcül^LAc^ 0МО1Я.-Г

'Л i спдасл «3

иЭ --f

и

v-l

a

о

43

И

in о

CM

m I <o3) -J4\jf^ •^•CXlG^CVj CU^CVJCO ^

I сЛЛСОСМ ------ '

I I M

nvo -TO _ _

мни : ■з-^гстпсм (H

OI>ftJ-i

1сл oivavdín i'XJM МСЛОМП

I 41 I O-If

1 -H

1 ^ «

+

М-аЗ о œ о « h

I—il O-JÍ

ai

f-

H S h

ЧГ1000

H Н1ЛО

л

3

EiÇIÎRQ

rtí (\Jl/i о M

пПОПО вдоо

EjUIC) Л1Л EHpinin

HHi'J

¡J •d

о

Uih-ОЧ O-i о

я

E-i

2

g

01

о

vi

а

ó

о

-j

E-i

+

Ol -a!

ü

X U

l h

OJ

« O

rj LO

n t=t

o

C3 i ^

fí

,3 S s.

У

ci ÇH 1

I« o -=ц

i^t

Q

я

t-< m

a ">

A ri О

4 UT

zi >4

Ä, to

G g *

I. I

I in ^ч

вт проростки растений, что связано с высоким содержанием в них окислительно-восстановительных ферментов, осуществляющих метаболизм ксенобиотиков. Однако, до настоящего времени, в.литературе нет строгих рекомендаций, какая стадия раннего развития растений является оптимальной для получения гомогената. Обычно указывается, что используются растения в стадии 3 листа, либо оговаривается, что используются 5-7 дневные проростки. В связи с этим мы изучили активирующую способность гомогенатов из проростков яч-кеня, достигших разных стадий развития.

р-с.З. мутагена^ э^срокт проназ^ка, активированного гомогената. ;.з проростков ячаеня разного возраста, а - ытаип ТА. 100; 0 - шагал ТА 98. 1 - 1С мхг/чг.аку; 2 - 100 мкг/чашку; 3 - 1000 мкг/чаш

о

3 4 5 6 7 возраст раотенлЛ, сутки

3 4 5 6 7 возраст раотенкй, супи

Максимальный активирующий эИЬект отмечен при использовании проростков, взятых на 5-ти дневной стадии разоития. Увеличение возраста проростков до 7 суток приводит к снижению регистрируемого о№кта (рис.3).

Супернатант, (фракция 3 9, получанная из гомогената, приготовленного из 5-ти дневных проростков), бил использован в качестве активирующей системы в изучении мутагенной растительной активации <?ясфамкда и пропазина.

В экспериментах in vitro фосйамед приобретает способность индуцировать мутации у двух разных штаммов, причем, если сравнивать уровень активации, оценивая его по количеству индуцируемых ревертактов, то для штамма ТА 100 он повышается лиаь в 1,3 раза, а то время как для штамма ТА 98-в б раз (рис.Г).

Для пропазина активирующий эффект также в большей степени проявляется на ТА 98 штамме - здесь наблюдается 6-ти кратное возрастание числа ревертантов, у ТА 100 их количество увеличивается лизь в 3 раза.

Оба препарата в системе индикаторные бактерии/гомогенат ячменя проявили активность в другом тесте - sos - хромотесте (рис.2).

В этой тест-системе пропазин приобретает sos -инцуцирупцуп активность только после растительной активации, максимум индукции приходится на дозу 500 мкг/мл, а статистически достоверное различие mg жду спонтанным и индуцированным уровнем jb -галакто-зцдазы в клетках е.coli наблюдается ужа при дозе 10 мкг/мл.

Что касается фосфамдда, то в системе растительной активации в целом его sos -индуцирующая активность возрастает незначительно (максимальный коэффициент индукции - 13,5, в то зремя, как в

системе без активации - 10). Следует отметить, однако, следующее существенное отличие в характере регистрируемого эффекта - фос<йа-миц в высоких дозах проявляет значительно большую активность, чем при прямой проверке. Это связано с тем, что продукты растительного метаболизма босйамида оказывается менее токсичными для e.coli I 4е1-' саи препарат.

Что касается эффектов исследуемых препаратов в roc - хромо-тесте после растительной активации, то следует отметить, что в этой системе пропазин активности не проявляет (табл.1), а ДНК— повро.тдата;ее действие фосйамеда сопоставимо с уровнем активности, отопо препарата, наблюдаемым в экспериментах без активации.

3. Изучение роли сЬерыенткых систем растений в бкотрансфор-мации пропазина и фосфашща.

Известно, что ведущее азето в биотрансформацин ксенобиотиков занимает шшросоматьная монооксигеназкая система, осуществляющая метаболизм по КДЦФ-зависишму пути. Однако, если роль кофакторов в системе мнкроеомапьного окисления млекопитающих тщательно изучена к описана, то роль их б растительном метаболизме пестицидов не исследована. Поэтому в работе проведены.специальною энспе-

V

рименты по определении роли кофакторов в мутагенной растительной трансформации фосфаыща и пропазина.

Оказ&пось, что наличие или отсутствие -кофакторов в антивирусе й системе по разному влияет на активация пестицидов. Растительная активация фосй&мнда практически не зависит от присутствия кофакторов.

Дтя активации пропазина, наоборот, наличие кофакторов в ак~ тивирущей сиеси являзгея существенным - в этом случае число репер? актов, индуцированных пропаь/ком в 2-2,5 раза выше, нежели в

вариантах с НАС (рисЛ).

Установленное существенное различна в особенностях растительной активации двух исследуемых препаратов предопределило проведение следующей серии экспериментов, направленных на выяснение роли различных ферментов в трансформации фосфамцца и про-газина в организме растений.

С этой целью изучали действие ингибиторов и индукторов ферментов раст'.ггельной активации. Использовали диэтилидитиокарбонат (ДЭДК), кзляоцийся ингибитором пероксидаз, традиционный ингибитор цитохромного комплекса - окись углерода, а также известные микросомальные индукторы - фенобарбитал и савол. Из обраб: тайных проростков (в условиях in vivo) готовили микросомальные су-пернатанты (фракция S 9), которые вносили в активирующую смесь вместе с,кофакторами, необходимыми для функционирования цитохром Р-450-завискмой системы биотрансформации. Активирующую способность гомогзнатов оценивали по уровня мутагенного эфЬекта, индуцированного пропазиком и фосфамицом у индикаторного птамма 5. typhirr.uriurn ТА 98 (рис.4).

Увеличение кккросомальной активности растительных гомогека-тов приводит к повышению уровня мутагенного эффекта пропазкна на 20-7СТ% при индукции саволом и' 40—110^ фенобарбиталом. Этот препарат оказывается более эффективным индуктором растительных микро-сом.

Поскольку обработкакчд^тироБаннюг;: гомогенаташ з гораздо меньпеЯ степени оказывает влияние ка мутагенный эффект босоамк-да, мокко предположить, что система микрсссмяльного окисления принимает но столь важное участие в активации ййсфамкда, нежели' пропазкна. Это подтверждается н экспериментах по определенна

6CQ

500 4С0

300

ICO

ms^üiS-Ti

ЛЫ

n o

Eh

я л с*

а

о «

с Рч

о

ГА

н о

X

<0 р. о

контроль 10 IGG

концентрация, ыкг/ ча^у

600 500

400

300

200 I0C

IGX

irgffiftsi

контроль

1000

10 100

ковдент^гацли, мкг/чашку

Р.; о. 4. Иод12рп<ецйЯ мутагенних э^ектов проказяна (а) к фос^аш.-да (б) под делстз^ем лнд/кторов к ¿иг^.:торов растительной актизад^а.

СИ - без aKTüBaiwa; 03 - 9; Ш - савол; ЩЗ - фвнобар-

- СО.

влияния ингиботора цитохрсмоз - окиси углерода, на активирующую способность растительного гомогзната. СО почти полностью подавляет активация про пазика. Количество индуцированных ревертактсв в этом варианте л иль вдвое превосходит спонтанный уровень. В цепом, за счет кнгибироэания окисью углероца активности цатохрома, наблюдается снижение мутагенной активности пропазина в 5-5,6 раза. Это указывает на несомненное участке системы микросомального окисления в мутагенной активации гтропазкка. Блокирование отой системы в гораздо меньшей степени влияет ка мутагенную активация фосйамида - эйгзкт снижается линь в 1,6-1,9 раза. Вероятно, ведущая роль в растительной активации этого пестицида отводится иному ферментному комплексу.

Другим берментом, принимающим участке в метаболизме ксенобиотиков в растениях, является перокскдаза. 3 этой связи в серии экспериментов проростки ячменя, из которых получали активирующий гомогена?, обрабатывали ингибитором перокскцазы диэтилдитиокарбо-натом - ДЭДК (рис.5).

ДЭДК в концентрации Г iil значительно (в 3,0-3,9 раза) сникает эффект растительной активации (Ьос^амида. .количество ревертантоз, наблюдаемое в этом варианте опыта,сопоставимо с их индукцией в системе без метаболической активации. Эбйхэкт пропазина при действии ДЭДК уменьшается всего на 10—ЗОЙ (рис. 5).

Это подтверждается такхе и в экспериментах in vitro, где ДЭД'-С вносится непосредственно в полужидкий агар в опытную смесь перед помещением её на чааки (рис. 6). Ео-:>ц;..;.;о.-.;у, в отсн оа;-к.« мутагокная трансформация ос/цссгвляисся, а соиости <w*7 ио.:ок-елдазного ь;ехан1 к.за ^г.'.иг^!.!.., noъ с l акткв.;рухч»та смесь >го;утоя &J21, блск^р';:^.!,! ai'.vi-

L'QIIiU, KG ПрОПСХОДЛГ.

500 400 ■ SCO 200 100

_cri. íSsú1_Ci ..a

pî g

в

I

S,

о

контроль

концентрация, меху чашку

W

ч

о ft CJ

ЬОО

4CÛ

300 ¡¿00

2 СО.

'JIj^ZL

, 1

Ь?

JZi^Ü

контроль

10

кокцонграц^я мкг/ча&гсу

Piío.5. КнгябйроЕашю ьхижацпропаэ^на. (а) я

'¿осу^млда (о) дни,Х1.-1Д1.тиокар5симато.о (обработка расте-nr.ií in vivo ).

□ - без ajcïi^ûiw«; £j - ШЗ; ^ - НАС; jgj -НАСдо-uïiJUWTiiOKapdoM&ï; - ПАС + дьэтмц^Тхокарбомат.

Рис.6. Модификация растительной активации йюсфэмида (а) и пролазила (б) дкэтгаднтиокарбоматом

(обработка in. vitro). -ПАС;---НАС;

• концентрация пестицида 1000 мкг/мл; х - концентрация пестицида 100 мкг/мл.

Таким образом, мутагенная активация пропазина осуществляется главным образом НАДЗН-завистаой мккросемкой монооксигеназ-ной системой. В активации фосфамяда ведшее место принадлежит пероксидазе.

4. Модификация мутагенной активности пропазина ч фосфамида-айльтоксиноМ 3j.

Пестициды могут взаГшодейстзовать^мутагенами среды, представляющими не меньшую опасность. Таковыми, на нал взгляд, являются мпкотоксши микроскопических грибов, достаточно широко распрост-ранешшх в почве и поражающих растительное снрье и пищевые продукты на любом этапе их производства и хранения. Большинство ми-котокспнов обладают канцерогемшм, мутагеннкм и тератогенным -

действием. В этом отношении наиболее изучен айяатонсин Bj, мутагенная активность которого возрастает в процессе как кивотной, так и растительной активации.

В связи с этим, представлялось целесообразным изучить роль сллатоксина в качестве кодификатора мутагенного оМюкта пролазила V. боссгамгда. Мутагенный эййокг исследовался в тесте Эймса с растительной активаций? в условиях viiro in vivo» Эксперименты в системе in vi-¿iO проводились по следующей схема: все ингредиенты опытной смеси (афлатоксин В-r, йюефамид, пропазин, фракция <¿9, индикаторные бактерии) вносились в слой полужидкого агара, а метаболическая активация, индукция мутаций, соответственно рост реверталтов происходили ужо на чашке Петри. 3 системе in vivo айлатоксином ежедневно в течение 5 дней обрабатывались проростки ячменя.

В экспериментах с активацией ir. vitroвидно, что афлатоксин в использованных дозах (I и Ю мкг/мл) оказывает мутагенное действие на индикаторные бактерии (штамм ТА 98). 3 целом препарат в испытанных дозах проявляет эффект средней степени - уровень реве-ртантов у штамма, обработанного анатоксином в.концентрации I мкг/мл-в 8, а в концентрации 10 мкг/мл-в 15,9 раза превосходит спонтанный ¿он (табл.2).

Во всех вариантах опыта наблзцаетсяаддатианыЁэффеьт, причем, суммарный эффект вшге в сочетании аЛлатокскна с босфамцдом.

В экспериментах по метаболтееской активации in vivo с пролаз ином и фосфамнцом взаимодействует не сам афлатоксин Bj, а его метаболиты. Из данных, предетавленных в табл.2, следует, что характер взаимодействия растительных промутагенов с метаболитами анатоксина гакой же,как с исходным препаратом. В большинстве

Таблица 2

Модификация мутагенной активности проглзика и ¿-ос^амкда афяатоксином В-

! 1-Сонцент- Ксниентсания гДтатоксина, мкг/;,:л

Препарат ! вац^я ! мкг/мл обпабстка ^ ! обработка ir. viy0

О ] 10 . ] I I 0

Пропазин 1000 1562 1301 390 1520 1263 306

100 1210 1041 312 1012 956 248

0 I2SI 953 25 1208 876 25

Фосйамиц 1000 1631 1570 468 1882 1415 408

100 1472 1260 281 1309 1178 365

0 1281 553 25 1208 876 25

Примечание: в таблице приведены средние значения количества ревертантов на чааку.

сочетаний наблюдается строгоаддатавныйэффект и только при малой дозе токсина суммарное действие несколько шске ожидаемого. Исходя из такого строгоадджЕивногозффекта, вероятно, можно ожидать еще большего возрастания активности метаболитов пестицидов и аф-латоксина в интактных растениях.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнение различных методов первичной оценки мутагенности пестицидов: метода учета обратных мутаций на штаммах Эймса, sos -хромотеста и re с -хромотеста. Наиболее чувствительным, регистрирующим действие малнх доз препаратов, оказался иoj -хромотест.

2. Подобраш оптгаальные условия приготовления гомогената проростков ячкеня, как компонента тест-системы ба:стерии/микросо-мы растений. Активирующая способность бнла наиболее высокой у фракции s-9 гоиогената 5-ти сутоmrjx проросткоа.

3. 3 присутствии фракции 3 9 гомогената проростков ячменя усиливается мутагенный аффект босфорорганического пестицида фос-йймцца: на еггемме ТА 100-в 2 раза, а на штамме ТА 98-в б саз.

Мутагенные метаболиты Лэсс^муда,образующиеся в системе растительной активации, преимущественно индуцируют мутации типа сдвига рамки считывания.

Л. Мутагенная активация прэяозина осуществляется, главным образоы}КА^ЗН-зависи«зй микросомиой моноокснгеназной системой. В активации йосбамвда ведущее место принадлежит пероксидазной система активации мутагенов.

5. Универсальные ыкхросоиалыгие ицдуеторк, ¿еиобарбитая и с ав о л, могут быть использованы для повышения актквиружтей способности фракции s из проростков ячменя, применяемой в системе бактерии/растения.

6. ААлатоксин Bj в дозе I и 10 мкг/«л вызывает мутации замены пар оснований у CclKoaellc. ty^hinuriun и в сочетании с прэпазиком и фосфаувдои сказывает аддитивное действие.

Список работ, слублзгкоБгашых по материала.; дксссртаци::

1. Савицкая 11.С., К&'.тедеза Г.К., ¡¿ггссва "Д., Г^хитдннов A.C., %^::азцрова ],'.". Изучало цу^агекных а®ектов яеспгцздов я :ix растпгелыгщ: метабагятов ка индикаторных г.шсроэрганггзма-с // Материалы ВсесоюзнойKOiiSepfcHtsai "околого-ганетячеокпй гакг.торшл? состоялся скруиаг?до11 среди", - Караганда, 1990., С.104.

2. .'.(/хптдднов A.C., Ка^екем Г.К, Определенно ¿.'угагенной ffit-кгвностп псетицотак препаратов в баг/герпсльзок тестах// Тезисы ¡созферентш молодых ученых КазГ/, - Ажа-Ата, 1991,-C.2S.

Гфхигдпнов Л,С., Квмешва Г.К,, Савицкая И.О. Использование микроорганизмов для: оценки мутагенной активности растительных метаболитов хишгеосмо: соединений // Экспресс-информация "Новости науки Казахстана. - Алма-Ата, 1991,- вып.2, -С.35-37.

¡.'ухктдинов A.C. Эффективность использования активирующей системы из.приростков ячменя, находящихся на разных стадиях развития // Деп. в Каз.ШИНКИ й 3547 - Ка 91. 25.II.91.

Подписано к печати №.0б, 92 г. Заказ 'f 125 п.л. 2, тираж 100 окз. Бесплатно.

Отпечатано з типографии КазГУ