Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование мембранных Mg2+ и Са2+-АТФаз в функционально различных мышцах животных разного уровня эволюционного развития

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование мембранных Mg2+ и Са2+-АТФаз в функционально различных мышцах животных разного уровня эволюционного развития"

Р | О и Н

РОССИЙСКАЯ, АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

АГАСАНДЯН Марианна Владимировна

УДК 577.152.313:591.112:591.175:597.82

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ

М§2+— И Са2+— АТФаз В ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧНЫХ МЫШЦАХ ЖИВОТНЫХ РАЗНОГО УРОВНЯ ЭВОЛЮЦИОННОГО РАЗВИТИЯ

Специальность: 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1 £93

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимии мыши и подвижных клеток Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН. -

Научный руководитель — доктор биологических наук В. П. Нестеров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. М. Казенное; кандидат биологических наук Н. В. Кулева.

Ведущая организация — Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург.

заседании Специализированного ученого совета К.002.89.01 при ИЭФиБ им/И. М. Сеченоза РАН.'

Адрес: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. М. Тореза. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И. М. Сеченова РАН.

Защита состоится « » »

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

К.002.89.01, кандидат биологических наук

Л. В. Зуева

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAlOUi

Актуалх^кость проблем»f И скелетных мкитах и шюкардо позво-ночннх центральную роль в процессах запуска сокршцонля играют мембрани Т-сиотемы /ИТ/. Обеспечивая бастрое нроведоняе воэбук-деншх с сарколеммы вглубь мишечннх волокон, эти мембран« передают пусковой сигнал на торминалыте цлсгорпи саркоплазыаткческого ретлкулума /СР/, регулирующего уровень л ммоплазмо. Нерешенность фундаментального вопроса о молекулярном механизме пэроноса трпггериого сигнала С ИТ на CP /nica el al., 1M1| «esteros;, 1992 / делает актуальна,! исследование свойств тлокуляриих компонентов этих Мембран, обеспечивающих саму нозмокность осуществления внутриклеточной пусковой сигнализации, Однако вплоть до поденного времени бкохшячеекпо исследования МТ бшш затруднены из-за на-, возмокноетя та отдолонли от ирлмоси других клеточпкх мембран. Разработка элективных методов «идоле нш из шшгсшшх иашой очи-щенних мембрашшх Дракций привела к ццонткТ'Икадил спепяТической для МТ высокоактивной Г,^+-Аг1\'аян, которую стали рассматривать в качество энзиматячаского маркера а тих мембран / sabbadini Bt ai., 1903J Hidalgo, 1903 /. Несмотря на сходство нокоторих структур-номолекулярннх характеристик этого '¡ермонта с Са'^-АТФаэой CP б»ля установлен« сущестяошше отличия по рил у Окохтячвек/к сиойств отях АВДаз / ныв «t ai., 1907 /. что позволило высказать предположение об юс генетически предопределенном различии

/oamiani Bt al., 19В7 /. УСТПЦОПЛвНИЭ у.'ПИЛЧеСКОЙ ННДЛВЯДуаЛЫЮ-

стл Ыд/^-АТФази »»двинуло задачу вшюнешш ее функциональной роля в мишечних мембранах. Тем но (.генов ни одно из предположений до сих пор но получило достаточного экспериментального подтверждения. Определенной нрсдпосчыкой успешного решешш данной задачи является углубленно н:шях представлений о свойствах этой АИазн, в частности, ьиишлешто связи неаду ее свойствами г функ-цпональш;(.1 правилом мембран, для которых характерна нреимущвст-вонная локализация итого (Тормепта.

Согласно данннм литорагурн, скоростные характеристики циклоп "сокращение-расслаблолиэ" поперечнополосатых мшпп коррелируют сб степенью развития' 'Г-слстош н CP, a также с количеством мостиковпх контактов меглу их мембранами. На <}оно шроо-#шаш-оivvibiioíl сонрачешюстп утях систем шгаптелышй интерес представляет стпшптолыгоо изучение свойств молекулярных компонентов

- й -

мембран Ш1 и СР. В первую очеродь ого относится к 1.1^ - и Са^+-АТФаэам, тем более, что до настоящего времени как сами Т-сисгша и СР, так и молекул ирные компоненты их мембран очень ограничено охарактеризованы лишь в некоторых разных шапочных волокнах позвоночных. В го же время следует отметить, что сравнительное изучение отях АМаз с использованием разнообразных в монофункциональном отношении мшечиых тканей, животных различного уровня эволюционного развития создает предпосылки выявления ведущих биотических (¡акторов формирования специфических свойств изучаемых (¿вршятов, а также,' соответственно, и установления возможной функциональной роли Мд^-АТФаэы в мышцах.

Цель и задачу исследования. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение свойств и особенностей распределения мембранных Мср+ - и Са"+~А'Мгаз в функционально различных ша-цах животных разного уровня эволюционного развития, а таглв выявление на отой основе вдзш»:иой фушсциональной роли Ы^"-АТФазы в мышечных тканях. Длн достижения указанной цели били поставлены следующие задачи:

- провести систематическое сравнительное исследование оообои костей распределения К^- и Са^-АТЗаз в мембранах функционально различных мшц животных разного уровня эволюционного развития;

- получить выаокоочыцвпныв фракции шмбран Т-каналов и сар-коплазматического ретикулума мышц различного гистогенетического типа;

- провести сравнительное исследование свойств Мер - и Са -АТФаз, локализованных в этих мембранных фракциях;

- разработать метод хролцтографического разделения и очистки исследуемых ферментов;

- исследовать влшщиа на активность и Са''+-АТФаз различных факторов /гшербария, невесомость, дешрвация, тенотомия, различные" форш параличей, тренировка/, вызывающих изменения 'функционального состояния мышечных тканей;

- исследовать чувствительность Н^1"- и Са *- АТФаз по отношении к фармакологичвешвд агентам, .оказывающим влияние на мышечное сокращение.

' Йаучная новизна. Впервые проведен развернутый сравнительный анализ распределения и свойств и Са';+-АТ4аз в мембранах

функционально различных мышц животных разного уровня эвоявдионно

- 3 -

i • (

развития, позволивший выявить-универсальную локализацию Mcjí^"-ЛТФазн как основного интегрального (Тормента мембран Т-каналов и их функциональных аналогов. На основании различия в свойствах исследуемых мембранных <}сркентов впервые разработан метод хрома-тографнческого разделения и Ca2+-A№i3 из общего окотракта,

возводивший получить высокоочщегшые препараты этих форментов о минимальными потерши их количества на всех этапах выделения.

Практическая значимость тботы. Результата проведенных исследований были использовали в медико-биологической практике для оценки состояния периферическо/1 части двигательного аппарата животных при воздействии на них экстремальных факторов среди /невесомости, гипербарической среди, температуры, давления и др./. Они способствовали выяснению адаптационных пределов мышц двигательного аппарата и миокарда в условиях длительных глубоководных погружения. И, Наконец, результаты данной работы служат перспективной предпосылкой к разработке новой проблемы - принципов патогенетически обоснованного лечения и профилактики двигательных расстройств при различных [формах церебрального паралича.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований доложены и обсуждены на:.

всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышечного сокращения / Тбилиси, 1985, Тбилиси, 1&Í35, Киев,1986, Москва, 1806, Пущино, 11307, Ленинград,1988, Тбилиси,1989, Москва, 19Э0/, на Международном рабочем совещании по программе "Интеркосмоо" ■/Москва., 1906/, на У1 Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рнб /Вильнюс,IS05/.

Но материала!,! диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации..Диссертация состоит из введения, обзора литературы экспериментальной части /б^и/.,' заключения, выводов и списка осношои используемом литературы ?é! наименовании, из них ЗЦ отечественных и зарубожных авторов/. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая. К страниц списка*, литера туры. Текст диссертации иллюстрирован /3 таблицами и /2 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЁТСДО ИССЛЕДОВАНИЯ

Источником для выделения и очистки и Са^+-АТФаз служи-

ли мембранные фракции функционально различных мышц разных ввдов животных, полученные но модифицированному методу / шсшэо et ai., 19вэ /. Дополнительное разделение МТ и мембран саркоилазматическо-го ротикулума /МСР/ осуществляли с помощью загрузки везикул CP оксалатоы Са"+ с последующим ультрацентри£угированием в широкоступенчатом градиенте плотности сахарозы для полного их разделения

/ Sabbadiili et al., 1903 /.

Аистаюсть Но>,+-АТФазн определяли в среде, содержащей: 20 Ш HEPÏÏS7, 150 мМ/Из. CI, I мМгЭГТЛ, С,5 ыГЛ MgCIg, 20-50 мкг мембранного белка. Активность Са^+-А'Мазы определяли яо разности между активностью Ма^'-АТФазы и активностью, полученной после добавления 20 мкМ CaCIg в реакционную смесь. Активацию осуществляли Б мМ АТФ, остановку реакции - '¿0 % ТХУ. Общий объем пробы составлял 0,7 мл. Инкубацию,для определения Са^-АТФазы проводили 10 мин при О?0 С, для Mo?1'-АТФазы - при

Активность ¡Термеятов выр&кагга вмикротлях образовавшегося Pi эа час на иг белка. Содержание неорганического ({остита определяли 110 методу /cible, Lends, 1963 /.

Бедок определяли методами /ciarkwall et al., 1981} Bradford at al.,IS?<

Проверку качества везикул, полученных фракций осуществляли двумя способами:

- по возможности ({оршрошшш с помощью потенциалочувотви-тельннх флуоресцентных зондов dis -С -/5/ й 0хапо1-У1 кваэиравно-весюго мембранного потенциала на мембранах возикул /зеышпэ, Un-

danmayai, 19В4 /} '

- по способности осуществлять АТФ-зависимый транспорт '1JCa через везикулированиш мембраны Aurucaua et ai.,' 19В4 /. Радиоактивность определяли на ладкосгном сцинтилляционном спектрометре 5L -00 фирмы "Intertachniqua" /франция/. .

Шделенио и очистка включали двустадинную экстракцию исследуемых ферментов из общей микросомальнои фракции с помощью лизот лщетина или фосфолипазы "А" по модифицированному нами методу / Hiiigigo et ai., isвз / и хроматографическое разделение и

Са^-АТФаз на хроматографичоскш-комплексе rpis »фирмы "Фармация", Разделение- и очистку исследуемых ([ериентов-проводили в два этапа. Иеррш заключался в очистке экстракта от липвдов путем их сорбции

и катионлте в ацетатном б,деро /рН 4,0/. Разделение проводили, орбируя ферменты на анионите в трнс-IICI буппре / рП 8,5/. annum осуществляли в градиенте NaCI.

Гомогенность препаратов определили с помощью sns -элоктро-ореза В 5,7 'I ПАЛГ /DriscaU St Bl„ 1РЯ5 /,

.Определение 1|осТод;шццного состава полученных мембранных ракит проводили методом микротонтюслоиноЕ хроматографии по мо-

H,|ИUlpoвашюму методу / Нэез, Dorr, 1975 /.

Донервалня и тепотомия, Эксперименты проводили па кошках, поращш проводили в сторплышх условиях под пепбуталовой аносте-кей /40 иг/кг/ леса. Донервация осуществлялась путем перерезки едшищного нерва правой задней ¡.оиечпости в области подколенной мы. Тонотомия - перерезкой ахиллопого сухожилия. Цостоперациошшй. ориод в обоих случаях составлял 21 день. На исследование брали ве группы быстрых скелетных мшц - разгибателей Д. Gastrocnemius,

I. Plantarla / ц СГИбаТОЛОЙ /m.Flbinlla, в. ЕМ. /, В КаЧОСТВО МОДЛ9Н-

ой (лышш изучали камбаловвдиую /т. soieue /, таше относящуюся разгибателя?,!.

Образцы Mimirmo.i ткани / m. col /дотеп, пораженных разшд.та одаами г.аробтг-ыгого птплнчп, брали во время оперативного вмеша-'ольства у больных, страдающих спастическим гомшарезом и парали-ем Срба. В качество контрольных образцов были использованы одно-мошше мышцы, взятые при операции у детей с отдаленными последствиями травин с нормальной ОТ.

Серия опытов с "'изнческо/t тренировкой проводилась следующим ■бразом: в лево!': конечности, елухаыей контролем, денерващш про-одгдп путем перерезки седалищного нерва, в правой - перерезался

ИШЬ ОТрОСТОК,ИШШрППруЩИЙ m. Gastrocnemius modinUe, ОСТОПЫШв

плацы сохраняли нормальную шшорвашго. После этого ;киьотное за-тавляли бегать, в результате чого осуществлялась механическая 1аста,«;а донервиропанцого отдела m. Gastrocnu«iiU3.

ГКЗУДЬТЛТН II ОБС/лДййЯЗ

"í.jiccjjn^oijaniie рпсиродолошш t.-y*'- и Ca';+-AT'i>a3 в мембранах íkotpux скелетных шкц позвоночных if оослозгопочпых .-¡¡квотных.

i3o избе:.:ан;га ногреиностей, ойусло. л синих получением препара-•ов различии;,!:! способами, в. настощей работе МТ и МСР выделяли >дш« методом - ультрацептри^углроваппем в многоступенчатом гра-(иенто ПЛОТНОСТИ сахарозы / Scales, SabbadJ.nl, 1У79/.

На рис.1 а,б представлены результаты изучения распределения активности исследуемых ферментов, полученные на быстрых мышцах 17 ввдов позвоночных и 5 видов беспозвоночных животных. Можно видеть, что по распределению активности Са2+-А*ГФазы /рис.1 а/ все исследуемые рбъакты делятся на две группы. В первой группе наивысшая активность сосредоточена в легких фракциях, представляющих собой мембранные везикулы продолговатого ретикулума /29-32 % плотности сахарозы/ мышц высших позвоночных животных. Во второй группе пик активности Са2+-АТФазы смещен в область тяжелых фракций, включающих терминальные цистерны СР. Эту группу составляют мембраны мышц беспозвоночных и низших позвоночных животных; для них характерен более низкий уровень активности Са^-АИази. Смещение пика активности Са^-АТЬази в этой группе мышечных мембран в область тяжелых фракций, по-видимому, свидетельствует о том, что в процессе эволюции прежде произошло Зормирование мембранных структур, подобных терминальным цистернам СР, а в дальнейшем у высших позвоночных появились и продолговатые структуры, обогащенные Са^-АТФаэой, в результате чего произошло пространственное разделение фррм 1 Са^+-АТФазы.

Максимальная активность М^-АТФаэы /рисЛ б/ сосредоточена 'дЭ мембранных фракциях, расположенных на поверхности 29-32 % плотности сахарозы для всех без исключения объектов. По плотности сахарозы фракции, обладающие максимальной активностью М^-А'Мазы соответствуют мембранам Т-каналов быстрых скелетных мышц позвоноч ных животных» Интересно, что, несмотря на различия в степени развития Т-систвии в мышцах исследуемых объектов, модальное значение распределения активнооти (Ж^-АТФазы одно и то *в, то есть вне • зависимости от объекта исследования этот фермент ассоциирован о, определенными мембранами.

Такое "своеобразное распределение активности катион-зависимых АТФаз в мембранах быстрых скелетных мышц стимулировало расширение ' втих исследований на мышечные ткани другого гистогенетического типа. '

2.Исследование распределения Мс^ - и Са^-АТФаз в Мембранах , функционально различных мышц.

л % исследовании использовали мембранные фракции, полученные уем ке методом из медленных скелетных,, сердечных и гладких мншц разных ввдов позвоночных животных. "••

позвоночные

беспозвоночные + минора + рыбы

¿5 /сахароза, т%/

400 .

300

00

£ ' О.

,1 •

ь 100

и а 1 <а з к

3'.

Ь)

позвоночные + беспозвоночные

--1-,-,-,-1-

' -б оО 35 40 45 /сахароза, г%/ рис.1. Распределение активности а/ Са^- и б/ М^-АТфаз в мембранных фракциях быстрых скелетных Ыышц позвоночных и беспозвоночных животных.

- О -

Из рио.й а иолшо «вдеть, что шисималыгая активность Са'^-АТФазы медленных скелетных и сердечных мышц разных видов позвоночных хшютних по сравно ни» с быстрыми скелет шли; ышцаш сив-Ь|сны в область более тихслих прлкций /Г-Л-Ж % плотности сахарозы/ Распределении же активности Са^-АТФази в мембранных структурах гладких мышц пасших позвоночных подобно таковому в мышечных мембранах низших позвоночных и беспозвоночных животных, где модальное значение кривой распределения приходится на тнкелые п.ракции СР, представляющие собой терминальные цистерны /56-Пб % плотноси сахарозы/,

Бпо зависимости от объекта исследования максимальная активность Мс^+-ЛТФази ассоциирована с мембранными фракция.«!, по плотности соответствующими мембранам Т-каналов быстрых скелетных мышц. Такая уникальная локализация М^'-АТ&ази в !,• шшечннх мембранах свидетельствует о высоком аволщионноы консерватизме зтогс фермента. Дня проверки данного иредоолохгешш необходимо было более глубоко изучить свойства Н^'^-А'Шэц в фушеционалнга различи! мышцах.

Я.Иоблс¡¡.онанис свойств и Оа'^-АТФаз дупкционалыю раз-

■ личных мим; разину видов :пшо'пшх. ■

Исследования проводили на скелетных /быстрых и ыедлонных/, сердечной и гладких шлицах разных видов позвоночных ¡¡ш>отнш< /минога, лягушка, курипа, г.ошкп, обезьяна/. Для оценки ткане- и ви-доспош^аршости исслодуемнх Ферментов, образин всех тканей получали от каждого вида животного в отдельности. Описанные, вше мел бранные фракции, судя по активности ферментов, представляли собо! смесь МТ и МСР. Разделение от.их мембран осуществляли по модифиш рованпону методу /¿аььайш вь а1., ювз /, в результате чего полу.-чали чистые мембранные фракции СР, обладающие, только Са^+-АТЬаз-:юй активность», и фракции, обладающие лишь М^-АТ^азной активностью, представляющие собой везикулы мембран Т-каналов. Из глад' г.их мышц такае была выделена и-ракцик, обладающая исключительно . М4?+-АТФазноп активностью. Однако ввиду отсутствия в этих мышцах сформированной Т-системи, полученные иеили везикулы, вероятно, ■ представляют собой препарат предшественников МТ, называемых "поверхностными или субсарколешальнш.ш" везикулами. Таким образом для всех видов мышц была продемонстрирована раздельная локализация Ый?+- и Са2+-А'ГФаз в различных мембранах, то есть бнло дока-

t

о.

зано, что М^ -АТФаэа является.индивидуальным интегратьннм ферментом, ассоциированным с определенным видом мембран.

Следующий этап исследования заключался в определении оптимальных условий проявления активности Ыс^"1"- и Са^+-АТФаз в соответствующих мембранных структурах исследуемых мышц /рис.3 а,б и рис.4 а,б/. Можно видеть, что Мй?+-АТФаэа во всех исследуемых мышцах сохраняет высокий уровень активности в широком диапазоне рН- и 'Io для всех фуншдаоналыю различных мышц разных видов животных /рис.4 а,б/. Оптимальные значения проявления активности Ма?+-АТФазы были одинаковы для всех мышц и составляли: рН - 7,2, Г - 25°С, •

Ош р.

Активность Са -АТФазы, в отличие от -АТОазы, выявляется в более узких диапазонах рН и /рис.3 а,б/ и оптимальные значения ов проявлония обнаруживают выраженную тканеспецифичность /быстрые скелетные - рН - 7,0, Io - 45°С, медленные скелетные -рН - 7,3, Io - <10°С, сердечные - рН - 7,3, Т° - 40°С, гладкие -рН - 7,5-0,0, Т° - 45°С/

, О.

Существуют данные о структурной гомологии Mg- - и Са -АВДаз. В связи с этим для окончательного подтверждения существования их как различных интегральных Лермонтов была сделана попытка произвести их разделение с помощью хроматографических методов.

4.Хропатогра<Т'нческоо разделение и Са'^-АТОаз из общей

микросоглачыюй нрпкции.

Мшсросомальную Оракцию получали из большой грудной мышцы курицы. Экстракцию ферментов из общей мпкросомалыюЯ фракции осуществляли С ПОМОЩЬЮ лизолецитит ИЛИ фОС'ТОЛИПаЭЫ "A"/Hldalgo et al., . I9B.V. После второй экстракции практически весь белок, судя по активности ферментов, оказывался в солюбилизированной форме.

На основании разшпш в изоэлектртеских точках и рН-оптиму-

о, п.

мах М^.'- и Са" -АТОаз удалось разработать метод их хроматографического разделения и очистки на хроматографотеском комплексе фирмы "Фармация", осуществляющиеся в два этапа. Первый этап заключается в освобождении общего экстракта белков от липидов и лизоле-гштина^ сорбируя их на колонке с катионлтом п ацетатном буфере цри pIJ-4,8. агюшго проводили тем ;.те буфером в градиенте waci . Белок при этом на колонке но сорбировался /рис. 5/. Второй этап состоял в разделении болков на анионито в трис-НС1-буфере/рН-8,5/.

*

т

^

I *

200 .

100

«

з ь V

ч;

Раипредедашш активности а/ Ся2+- и б/ Ы^-АТФаз . в ыеыбранних фракциях Функционально ]>ааличных мышц позвоночных животных.

медленные сколвтше ыышш миокард

гладкие милаш

45 /¿ахароэа, г//

"йистрые скелетные ыышци медленные сквмвтшв мшш миокард гладкие ышоцы

■1Г) /Сахарова, г,

}0О

»zoo

-¡оо

600

500-

ш

500-

¿00

'00

6 7 8 9 pli "10 20 30 40 :jb =Т°

pttd.4 Нлшшиа а/ pil и о/ 1° среда инкубации на активность и^-АИоэы -о- бнстрых и л-медленных скелетных, -э-сердвчной и гладких мышц позвоночных животиых. -

- 1Г: -

о,л

0,7 Ofi

V «з

Q2

т

3 4

7 В S 10

I 2 3 4 сорбция злвция

рио,Б Хроыатографичаская очистка исходного экстракта мембранных

белков от лшвдов на колонке " moho S ", буфер: ацетат Уа~11СЯ, pll 4,8.11o осп абсцисс - объем элиции /мл/, по оси ординат - он тическая плотность D 2(,о /01'н* еД»/ •

.2 - ё 4 т ' Ъ 3

■ сорбци* 1 алюция

рис.6 Хроматографическое рааделенве мембранних белков на колонке " мош <? ". буфер: трис-HCI, 'рН fí,5. lío оси абсцисс - объём элющш Дш/, по, оси ординат - оптическая.илотность D -¿¿¿у

В этом случае происходит сорбция болков на колонке /рис, 6/. Эяю-ция осуществлялась в тех же условиях в градиенте маС1 и выявила существование двух белкових пиков, первый из которых, как показал он-зшатический анализ, представляет собой Мс^-АМазу, второй - Са*^-АТОазу. Б результате этих процедур произошла очистка ферментов, по сравнению с исходным экстрактом, в 67,8 и 15,5 раз.соответственно. Гомогенность полученных препаратов была получена электрофоретичес-ки. При wjs -электрофорезе в ПААГ было обнаружено, что оба препарата имеют одинаковую электрофоретическую подвижность и обладают молекулярной массой около 102 кДа.

Таким образом, на основании всех полученных результатов можно утверждать, что ВД'1"- и Са^-АИази являются различными интегральными ферментами, ассоциированными с разними момбраиами /Т-каналов и саркоплазматического ретикулуыа/ и, несмотря на структурное сходство, отличающимися по ряду биохимических свойств.

В дальнейшем для выяснения роли Мср^-АТБазы в Т-каналах была исследована чувствительность этого (рормонта к различного рода воздействиям, влияющим на характер шшючного сокращения.

5. Влияние внешних экстремальных условий на активность 1.1й и Са^-АТОаз погтерочнополосатнх мыпц.'

Внешние экстремальные факторы, влияющие на физиологические процессу в мышцах, могу оказывать воздействие на компоненты системы электромеханического сопряжения, обеспечивающие процессы возбуждения - расслабления ммцц.

В работе было исследовано влияние невесомости и гшербарии на активность и Са2+-А1Фаз поперечнополосатых мышц.

Исследование состояния мембранных и Са^-АМ^аз скелет-

ной мускулатуры крыс, совершивших 7-суточный kocmiwockhíí полет показало /рис. 7а/, что и условиях невесомости происходит прирост активности Са^-АТФаэы /на 25 % по сравнению с синхронным контролем/ за счет фермента, локализованного в легких (Тракциях CP /щюдолгоаа-тый ретшеулум/. В тяжелой фракции мембран /триаднке комплексы/, осуществляющих функциональны-! контакт Т-каналов и СР^ изменений активности'локализованных в них ферментов / и Са^-АТФаэ но происходит. Следовательно, условия невесомости /функциональное выключение мышц/ в первую очередь плияют на процессы, обеспечивающие удаление кальция из шюплазма, то есть на процессы, контролирующие расслабление мышц.

Аналогичные результаты ошш получены в серии экспоримонтоп по^ воздействию условии гипорбаричасюй среды на активность Mcj. - и Са -

- M -

ii: '

'Ï {•' * V

г! i

Ï Г

Г

л

•i

M" Ü . Li

<•■ s ■ tí

i¿ ü

§ f

• ti (i

(= t '

■ г- с

'.ï S'-

S -g

0

1 lí

Г 2

3 П t'>

S ¿i

г'-

£

Г; !•

ú h Li . к

1! Л

iä ri

■

о"

s

CP л.ф./продолговлтый ротикулум,легкая фракция/

CP л.ф.

07 т.ф.

"CP л.ф.

CP т.Ф

быстрые скелетные миинн

медленные скелетные мшяда

инокам

^ \f'\ у

АТФаэ. Исследования П)ююд1иш на мембранных фракциях быстрых и медленных скелетных н сердечной мышц трох видов позвоночных животных /чаши, морские свинки, обезьяны/. Из¡.¡вшит даплопио, температуру и состав гигорбаричесгай среды, а таете количество шр таций погружений. Как и в условиях космического полота, в серии гипербарических экспериментов отмечается'устойчивость активности Ма^-АТФаэы при лыбнх изменениях условий экспериментов /рис.7 а,б/. Б то же время увеличение давления вызывало прирост активности Са"+-АТФазн, локализованной в легких ч-рагавдях СР /на 15 %/ /рис.7 а/. Са"'-АТФаза, локализованная в мембранах терминальных цистерн СР, била более устойчива к различного рода экстремальным воздействие. Отмочено, что при той же воличшга давления замена гелю-киолородной смеси /гелиокс/ на трпмикс, включаыцкй азот, купирует ойнарукиваемпе в гслиоксо изменения ферментативной активности. Установлено гаже, что прирост активности Са^-АТОази легких ¡¡'ракдий, Еозаикаидий при первом погружении, в дальне, шен но изгоняется с увеличением количества погружений.

Помимо внешних зкетреыальшх «оздойстшЛ-существует род внутренних факторов, влияние. которых приводит к значительным изменениям всей молекулярной структуры мышечного волокна и прежде всего всех мембранных образований. К таким Факторам в пер-.вую очередь относится разного рода нарушения шйротрофического контроля.

- 6.Активность Чу1"-, и Са^'-АТФаз при развитии атрофии бИ-

СТРЫХ И МОДЛОНННХ СКОЛОТШ.'У МШЩ.

MeHTcUißriU иКОЛСИЦШЛ. О 1 { ^U' J llJ Ut , yj<A J)JlLüf irji't uui 11J Jll ДЧ 1lö JJUai 1.1111 ■ 4

тенотомки, а таете генетически продоиродолотшх в виде разных Яорм церебрального паралича /паралич Зрба, спастический геми-парез/. Помшо этого бгло исследовано влияние тренировки /механического растяжения/ на денорвированную мышцу. ■

• Результаты показали, что при атрофии, вызванной денорвя-циап, наибольшой потерей веса отличаются быстрые скелотнно шлицы группы разгибателей /м. Gastracnamius, m. Plantaris/ - ОНИ Гвря-ит до 43,5 /» веса; нашонылей - медленные /т. snieua /, тершцие около % веса. При этом в наиболее ноторявшеМ в весе группе разгибателей зафиксирован прирост активности Са^-АШ-азы в

легких Фракциях CP /15;<?/; в тяжелых фракциях прирост бил-незначителен /рис.0 а/. Наряду с этим в сгибателях наблюдается резкое снижение активности Са^-ЛТФазы - на 70 % в легких н.ракциях CP и на 30 íj - в тдаелнх мракциях СР. То есть в этих мышцах дунерва-ция вызывает интенсификацию Са'-^-АТфазн, локализованной в терминальных цистернах и снижение активности этой АТСазы, локализованной в продолговатом СР.

Таким образом, наши результаты свидетельствуй о нивелировке различий между свойствами компонентов мембран'быстрых и медленных мьшщ при атрофии, развивающейся в. результате денервации.

В медленной мышце / m.saieua /, которая таюке является разгибателем, активация Са^+-АТФазы весила незначительна, а активность Мср+-АТФази практически не меняется /рйс.О а,б/.

Изменения активности Са^'.- и. Мср^-АТФаз, происходящие на более ранних сроках денервации /14 дней/, вырокеиы значительно слабее, хотя и имеют ту ке направленность.

В ышца'х группы разгибателей /быстр&х и медленных/ постде-'нервациошше изменения активности Са^-АТФазы млеют одинаковую тенденцию, то ость можно предположить, что либо при нарушении нейротрофического контроля Функциональная специализация мышц по .сравнению с морфологическими различиями имеет первоочередное значение, либо в быстрых разгибателях постденервациошша изменения на молекулярном уровне происходят на более поздних сроках развивающейся атрофии.

При атрофии, вызванной порерозкой сухошшш /то но томней/, наибольшой потерей веса /до G0 %/ отличаются медленные окелат-ные мышцы. Быстрые сколетние мницд - как сгибатели, так л разгибатели - теряют в веса одинаково /26 %/. Upa этом наиболее потерявшей в весе Полненной мшце а1;тивнооть Сай+-ЛТФази в легких Фракциях CP сшшются на 50 а в тяжелых - повышается на 15 % /рис.0 а/. В быстрых мышцах обоих групп активность Ca^-ATtosu практически 'не меняется как в -легких, так а в ti¿:újikx фрагллях СР.

Активность !,!^"+-АКазы при тенотопии в быстрых и медлошшх мышцах отличается стабильностью /ряс.В б/.

Получоннпо наш результат!! ио/шзшяют, чзо как нри атро>!>ш, вызванной деиергшшей, так и нри г.тгхмш, к.иьлчке¡и П'ЮшаоН, основной ¡mTXii'ficJíbuuti балок CP - Са^-АТ-noít лгр- гт ¡■¡п.'.чгтель-H.vi) роль в адаптационных нровесоах, npo»:awi;riir в oh.-îi-wwi-

( } ° Г!1

о ГО О

а> V

>'5 п-

N я

о.'

М (V

о ' ч •

О

< 1 а: Ь'

К

сл — п: п ;

•,

ос"

1 1 ) <» '!

11 гг 1

^ 1 го о С.

> + 1 И •П-

63 ь (С1 *

»и п

и р а' (

•С.1 ! ,

со г.1 н £

»- ч. 1 1 п

1 й (1С П

«я

Ц>

(П

•Л ш 1) *

п си -

Д-

01

о СЛ 'г

к> : Г". Т5 со Л

п ми . <ъ

Г- НПО

Ь ^

1 1 . Ы П)

:--! и

и Н

I п

л

Е- г<

■

г;

донерпания

тенотомия

тренировка

■дёнерЕй-дия '

тенотония

паралич ¿роа

. спдщчтаскиК гвмипдрва-

те но томил

-дшарвашщ.

-дшвд&шш-

тенотомия

-драпировка...

ленервапия

тенотомия

паралич Р1рбя

спастически}! гомипарез

денервация

тенотомил

ленервапия

тенотомия

л$широжа_

.дшгершшя

тенотомия паралич Зрба

сп п, с тич п пки » гр.мипаре а

лгжергшшя

тенотомия

пых мшпшх. Устойчивости Ыс^. -АТСазы в условиях атрофии, вызванной дснервацкей и тонотомией, подтверждает предположение об универсальности функционально;; роли этого формента в мембранах Т-ка-налов, не связанной со специфическими физиологическими особенностями втих мышц.

В экспериментах на больных, стродащих параличем Эрба, обнаружены аналогичные денервационнш изменения,состоящие в падении уровня актишости Са^-АТФазн /50 Й/ гак в легких фракциях СР, так и в тяжелых, что свидетельствует об отсутствии зависимости изменений, вызываемых нарушением нейротрофического контроля в мышцах, от природы этих нарушений, /генетически предопределеиша.или экспериментально вызванные/. В случае поражения мышц спастическим генипирезом актщшосТь Са^-АТФазы по срашюнию с контролем ■' возрастает на 70 % /рис.Й а/. Активность М<р -АТйазы, как и в предыдущих экспериментах, практически но меняется. То есть при спастическом гемипарезе в мышце; стремящейся к расслаблении, возникает адаптационное увеличение Оа-аккумуми^утюй активности, приводящей к понижению мг/триклеточной концонтрации Са^+ йосвобож-деншо его из связи с троиошшом С.

Регулярная механическая растякка /тренировка/ донорвирован-ной мышцы /тершщел 43,5 $ веса/ сникает потерю веса /до 15 Знзиматическое исследование выявило возрастание активности Са^-АТФазы в обоих случаях . При'этом можно видеть, что физическая . тренировка, снижает степень изменений активности фермента, возникающих при донорвации /рис.8 а/.

Активность Мй^-АТФазы, как и во всех предыдущих исследованиях не меняется, что, вероятно, свидетельствует о том, что этот фермент не участвует в транспортам процессах, а выполняет регу -ляторную функций.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов однозначно свидетельствуют, что внутриклеточная мембранная система, участвующая в электромеханическом сШряжонии мышц, является весьма лабильной системой мышечного волокна, меняющейся при перестройках его функции в зависимости от характера инервационных влияний.

Одним из подходов к изучению природы меямембраняой передачи сигнала является использование веществ, избирательно модулирующих проводимость ионных каналов.

1

1 —

3 со

су

п

бкссрке скел.:.

65

"ленные скел.мыплк

бьтс1сь"б скел •

. I I р.ч

.медлекже скел.мьж

с Г

■

8;

У-ИСУ.&О! .

" ----- ~ « 2+' 2+

г.У.гЛ-:/,5 .'"/¡згалоги'ТЭСХ»: активных ъ-е:цеств на активность а>Са"~ - и б/.¿о -л1'*в.з

сналько 5аэ«етнкк Примечание: приведенные'результаты статистически' дос:

отличаете?; ст контроля (р<.С,С5).

/нхп» веркс'

- -

В связи с этим большой интерес представляла оценка действия таких соединении на активность АТФаз, логллизованных в основных мембранных структурах, осуществляющих передачу пускового сигнала.

, '''.Влияние Физиологически активных веществ на активности и Са^-АТФаз. • • ^ '

Изучено воздействие на активность и Са^-АТФаз известных органических /верамапил,Д-ССО/ и неорганических /СА2+, 1й12+, Ва2+/ (¡локаторов Са-каналов, общих анестетиков /хлоралгидрат/, а тагав новых. амшюсоедшешй ряда -?КР-525А, обладающих вкракинным инотроп-иым действием на мшицы.'

■ Полученные результаты показали, что Фармакологические агенты, блокирующие развитие процесса Са-активации мышечного сокращения, могут оказывать ингибирумдер влияние на активность мембранных АТФаз ,в мышцах. Вы пшена высокая1 тканевая и химическая специфичность такого ингибирования. Показано, что ни один из ферментных препаратов из всех изученных мышечных тканей не обнаружил чувствительности к известным органическим блока торам Са-каналов /вораиаиилу и Д-СОО/ во всех исследуемых концентрациях, а такко к общим анестетикам /рис.9 а,б/. Неорганические блока тори Са-каналов - двухвалентные катионы и аминосоединения оказывали ингибирущее действие на активность исследуемюс ферментов, однако этот эффект зависел от вида мышечной ткани, из которой были выделены мембранные препараты. Наибольшей устойивостью к действию всякого рода ингибиторов обладали

• АИазные системы мембран медленных скелетных мышц. Среди исследованных двухвалентных катионов наиболее активнш ингибитором оказался СА, а среди аминосоединений - лропаргиловып аналог -525Л

/ в , N -диэтиламиноэтил-2,2,2-ди11)енилпропаргилацвтаг/ и Ш1-26 ' /4,4-дифенил, 1-дизтиламюга,' й-гоксин/, то есть вещоства, включав* щие в свою структуру ацетиленовую связь.

Таким образом, результаты наших исследований продемонстрирова-

* ли возможность использования фармакологических агентов различной химической природы дл«. выявления особенностей структурно-химической организации мембранных АТФазных систем мышц, отличающихся по уровня развития сократительной функции.

ВЫВОДЫ

1.Продемонстрирована универсальная локализация Мс^'-АТФазн

в мембранах Т-оистемн поперечнополосатых мышц, а такие в аналогичных ей структурах в гладгамишечной ткани.

2. Выявлены различия в свойствах и Са2+-А№аз /рН-и оптимуми, чувствительность к различным'фармакологическим агентам и т.д./, подтверждающие индивидуальность этих ферментов,

3.Обнаружена высокая тканевая спецмЬданость Са^-АТФази на (1оне выраконного эволюциошюхх) консерватизма МсЬ^-АТФази.

4.Установлены различия в чувствительности к разлитого рода воздействиям двух фэрм Са~+-АТФазы быстрых скелетных мышц - ло!са-лизованнок в продолговатом ротикулуш и в терминальных цистернах СТ.'

5.На основании разницы в свойствах /рН, изоточкц/ разработан метод хроматографического разделения и очистки и Са"^-А1\Ьаз из общей микросомальной фракции, обеспечивающий значительный выход исследуемнх белков и их очистку в 67,8 и 15,5 раз соответственно,

6.Показано, что при нарушении нейротрофического контроля в быстрых мышцах-сгибителях активируется Са^-АТФаза, локализованная в продолговатом ретикулуме, и снижается активность Са2+-А№азн, локализованной в терминальных цистернах СР, что свидетельствует о шгвблировке различий между продолговатыми структурами и терминальными цистернами ретикулума и, соответственно, между системами Са-контроля быстрых и медленных мышц.

7.Обнаружено, что наиболее.устойчивыми ко всякого рода воздействиям шляются исследуемые наш АТФази медленных скелетных мышц, а самими пластичными - АТФааы миокарда.

Список публикаций по теме диссертации

. I.Михайлова /Агасаццян/ М.В., Сахарин Э.Х. Особенности распределения ¡К^АТФазы в мембранах скелетных мышц й миокарда лягушки. '//Теа.докл. У Всесоюзной конфер. по биохимии мышц, Тбилиси, 1585. '

2.Михайлова' /Агасандян/ М.В., Сафарян ЭЛ. Распределениа транспортных АТФаз в мембранах скелетных мышц позвоночных штатных;' //Тез. докл. 1У Всео.мокуниверс. шнф'. по "Биологии ] ело тки", Тбилиси, 1й1>5.

У. Михайлова /Агасавдш/ M.B., Нестеров А.П., Сафарян ЭЛ. АТФазная активность мембранных препаратов миноги речной. //У1 Есе-союзн, конф. по экологической Физиологии и биохимии риб. Тез.дога. Вильнюс, 1065,

4.Нестеров D.ÍI., Сафарш-ЭЛ., Демина ÍI.1I., Михайлова /Агасан-дян/ М.В. Формирование катион-регулируеыой системы внутриклеточной медитации возбуждения поверхностной мембраны в эволюции мнац. //Тез. докл. на У Всесоюзн. биохимическом съезде. Киев, ¿906.

5.Нестеров Ü.1I., Сафарян ЭЛ., Домина ÍÍ.H., Шхайлова/Лгаеан-дян/ М.В. Формирование внутриклеточной катцон-зависшой системы передачи пусковой информации в ходе эволюции мыш. //Докл. на У Псе-соизн. óuoxm. съезде. Киев, 1906. ■

6.Нестеров Б.П., Шмелев П.К., Сафарян Э.Х.; Демина U.U., Ми-.' хайлова/Агасандш/ М.В. Влияние факторов космического полета на состояние системи электромеханического сопряжения скелетных мшц крысы.//Тез. докл. на Мекдунар. сов.,прогр. "Интеркосмоо", Москва, 1906. ; .

. '/.Нестеров В,П., Демина H.H., Са^еряи ЭЛ., МпхаГуюва/Агасан-дян/ М.В., Шделев В.К., Серебреникова Т.П. Исследование влишия факторов -космического полета на биохимические характеристики мышеч-.ной ткани позвоночных животных.//Спец. отчет ШШ МЗ СССР, Л-д, исх.»2/660 от 27.06.86., 1986,.

В.Михайлова/Агасандян/ М.В., Сафарян ЭЛ., Нестеров В.П. Локализация Md^+-A'N>a3H в мембранах скелетных мышц и миокарда лягушки. //1урн. эволюц. биохш. и Физиолог., т.20, ie'¿, 1987.

Э.Михайлова/Агасандян/ М.В., CaO'apíai Э.л., Арутюнян P.C. Влияние дсшервации на активность мембранных АТФаз Т-системы и сарко--плазматического ротикулума скелетных мышц разного функционального профиля.//Тез.докл. УШ Всесоюзн. сиып. "Биофизика и биохи.шя биологическое подвижности", Пущино, IÜ07.

• ' 10.Демина И.Н., Нестеров D.H., ¡лщиЛлова/Агасандян/ М.В., Костюм В.Б. Влияние гипербаричоских условий на компоненты внутриклеточной катион-зависимой системы регуляции мышечной деятельности.// Тез.докл.на Всес.конф, по гипорбарической физиологии. Спец.сбор,, Ленинград, 19Б8.

П.Ыихаилова/Агасандян/ MtB., Гоптарева Н.Б., Нестеров В.П. Локализация и свойства МЛ-зависгалых АМаз в мембранах различных мшщ куриц.//Тез.докл. У1 Всес.конф.но биохимии мышц. Тбилиси, 1989.

-

1И.Михайлова /Агаваццлн/ 1,1. В., Нестеров й.Ц. Влияние блокато-ров Са-каналов на активность мембранных АТФазннх систем функционально различных мышц.//Тез.докл. ¡¡а у Всосоюзн.кодф. "Физиология и биохимия медиа-горных процессов". Москва, 1990.

1а.Мнха1иова /Агасавдш/ И. В., Гонта рева Н.В., Несторов а.Ц. Распределение и свойства -АТФаэы в мембранах Функционально различных мышц курицы.//Кури, эьолюц. биохим. и (физиологии, т.2В, »4, 1992,

Л1 яеяирлч