Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование биофизических механизмов действия гербицидов на фотосинтез культурных и сорных растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование биофизических механизмов действия гербицидов на фотосинтез культурных и сорных растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИН СГИТУТ ХИМИЧЯ СКОЙ ФИЗ ИКЛ им. Н. Н. СЕМЕНОВА

На правах рукописи УДК 577.3:633.11:633.16

БАЙРАМОВ ХАЛЙЛ БАЙРАМ оглы

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОФИЗИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ . ДЕЙСТВИЯ ГЕРБИЦИДОВ НА ФОТОСИНТЕЗ КУЛЬТУРНЫХ И СОРНЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.02 - БИОФИЗИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москзз-1992

'"^ота выполнена в Института физики АН Азербайджана и Институте химической физики им.Н.Н.Семенова РАН.

Научный руководитель: докгор химических наук, профессор М.Г.Гольдфельд

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Г.Г.Комиссаров кандидат биологических наук, доцент К.Н.Тимофеев

Ведущая организация: Физический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится "/^" 1992 г.

на заседании Специализированного совета Д 002.26.07 при Институте химической физики РАН по адресу: 117977, Москва, В-334, ГС1Ы, ул.Косыгина, д.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ИХФ РАН.

Ученый секретарь

Специализированного довега, кандидат химических наук

М.А.СМОТРША

| ОБ ШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и зе актуальность. Гербициды (ГЦ) и регуляторы роста в настоящее время доминируют среди прочих химических средств защити растении. Ассортимент препаратов, применяемых ъ этом качестве, непрерывно совершенствуется, ведется широкий поиск все более эффективных средств, с возможно меньшей дозой расхода и быстрой разлагаемостъю в почве, более селективных но своему фитотысспческому эффекту в отношении сорных растений. Направленный синтез новых соединений в значительной ..¡ере опирается на результата детального изучения механизма взаимодействия гербицидов с рецепторпнми центрами, на знание структуры этих рецепторов. В то время, гербицид.! как ингибиторы определенных стадий растительного метаболизма сами могут рассматриваться как инструмент исследования струк. урно-тункционалъной организации растительной клетки и,в особенности,фотосинтеза, так как именно последний, будучи специфичным для зеленых растений, обеспечивает селективность гербицидов как ингибиторов растительного обмена веществ.

Поиск гербицидов, избирательно действующих на сорные растения и относительно малотоксичных для культурных видов и сортов требует сопоставительного исследования явлений, индуцированных гербицидами в растительных организмах на различных уровнях- от первичных процессов фотосинтеза до физиологической регуляции.

Этим определяется актуальность общей цели исследования: провести сравнительное исследование биофизическими .методами влияния гербицидов нескольких групп, главным образом действующих на уровне световой стадии фотосинтеза, на фотоиидуцирован-нне реакции б культурных и сорных растениях на уровне оргзниз-

- г -

ыа, фотосинтезирующей ткани и изолированного хлоропласта.

При зтои решались следующие частные задачи:

1. Изучить влияние гербицидов на реакцию Хилла по данный кинетики фотовосстановления экзогенных акцепторов электрона спектрофотоыетрическим методом, фотовосстановления эндогенного акцептора электрона-пигмента Р700 в реакционных центрах фотосистемы I (ФС1), а также путем измерений медленной индукции флуоресценции (МИФ).

2. Изучить влияние ГЦ на активный транспорт протонов и фо-тофосфорилирование в хлороплаетах высших растений.

3. Путем измерений термолюминесценции (ТЛ) изучить влияние ГЦ на транспорт электронов на донорной стороне фотосистемы II (ФОН).

Сравнить результаты действия ГЦ в условиях обработки интактного растения, срезанного листа и изолированных хлоро-плестов.

5. Сравнить результаты действия ГЦ на фотосинтетические реакции культурных и сорных растений.

Научная новизна работы состоит в том, что получены ранее неизвестные характеристики влияния 13 гербицидов, принадлежащих к различным классам, в том числе: галоидзамещенные мочевины, сим-триазины, производные беизиыидаэола, галоид-производные фенола, галоидзамещенные пиридины, на отдельные стадии процесса фотосинтеза в сорных и культурных растениях. С применением ряда биофизических методов получена взаимно дополняющая информация о центрах и механизмах их действия на фотосинтетический аппарат.

Практическая ценность результатов работы состоит в том, что полученные характеристики влияния гербицидов позволили уточнить центры их действия в растениях и выявить различия эф-

фактов атих соединений в культурных и сорных растениях, а такие на уровне тканей и изолированных органелл.

Апробация работы,. Основные результаты диссертационного исследования докладывались на следующих научных собраниях: Всесоюзная конференция "Химия и технология пиридинсодержащих пестицидов", Черноголовка, 1988 г.; УН Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Звенигород, 1989 г. ; семинар по физико-химической биологии ИХФ РАН , декабрь 1991г.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, . обзора литературы, трех глав с описанием методов эксперимента, собственных результатов автора и их обсуждения, а такне выводов. Диссертация содержит страницы, 34 рисунка, 3 таблицы и

список литературы из 138 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ГЛАВА I. Обзор литературы. В главе I кратко изложены литературные данные о структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата высших растений, о связи между двумя световыми реакциями фотосинтеза. Основное внимание уделено влиянию различных классов гербицидов на реакции в листьях и хлоропластах.

ГЛАВА 2. Объекты и методика эксперимента. Основная часть работы выполнена на листьях и хлоропластах пшеницы ($иЫи1/п сорт "Кавказский") и листьях сорных растений: однодольного овсюга (Ауепа рЫоьа-) И двудольной сурепки (Вагбг&й мигали). Еще одним объектом исследования служили хлоропласты бобов (Уилл -{аЦЬсорта "Русские черные") и гороха (РЬип ¿^¿аис*, сорт "Превосходный"). Различными методами проведено сравнительное изучение ин-гибирующего влияния гербицидов на базалыши и сопряненньй с син-

- ч -

теаом АТФ электронный транспорт, синтез АТФ и фотоиндуцирован-ный перенос протонов в хлоропласта* б зависимости ст концентрации гербицидов. За кинетикой окислительно-воостановшельных превращений реакционных центров Р700 сладили по величине сигнала ЭПР I от окисленной формы Р700*. О фотохимической активности фотосистемы IJ судили по восстановлению окисле "'ных центров Р700+ в ответ на включение непрерывного света "К = 665 им, возбуждающего обе фотосистемы, или в ожвет на короткую мс) вспышку насыщающего белого cEtiva. Влияние гербицидов на структуру тилакоидных мембран хлоропллстов изучали с помощью лшшдо-растворииых спчнсвых бондов Ij ^ , Ij; ' cn" любилизнруищихся тилаксидными мембранами.

В работе использовались спиновиз зонды производства фирмы „¿ума":

I. СН3(С1!2)12- С - (СН2)3СООН J

'сУ-0 L—h

г. сн3сн2 - с - (снР)14 - соон u

3. СН30Н2 - С - (CH2)I/f - coochj lj - cii3

c\-0 ' _v I—f-,c Hi /---\

1.CH3(CH2)9- /¡/f—,/v—Q

U "---"A

При изучении зависимости медл-.'ми».'! индукции флуоресценции хлорофилла ст интенсивно,.ги воаоуидгюч'Л'а сьета, времени темнозой адаптации и возраста растений измерения проводили на листьях. Флуоресценцию возбуждали широкополосные синим сватсм (средняя длина волны 450 hi.) и регистрировала на длине полны 686 ни.

сат9

Измерения ТЛ проводили на установке кафедры биофизики физического факультета МГУ. ТЛ измеряли через 1-2 суток после обра-битки растений через корневую систему в вегетационном опыте. Высечки ли. льев адаптировали 10 мин. к темноте при комнатной температуре. Образец охлаждали до температуры облучения и осве-■дали 3 мин., а затем быстро охлаидали до 77 К. Кривые ТЛ записывали при скорости нагрева 35 град/мин в интервале'от -40 до и со скоростью 20 град/мин в интервале 40 - 70°С.

Кривые медленной индукции флуоресценции регистрировали на установке, собранной по однолучевой схеме при интенсивности возбуждающего свата около 3,5 Вт/м^. Излучение измеряли при 636 им при комнатной томпвратуое.

Кинетику переменной флуоресценции измеряли с помощью одно-лучевого спектрофлуорпметра с фосфороскопическим разделением актиничного и измерительного лучей.

ГЛАВА 3. Сравнительное изучение влияния сюл-триазкнор на листья и хлоропласт 'культурны" и сорных растений. В главе 3 проведено сравнительное изучение иигио'ирувдего действия гербицидов класса симтриаэинов на базальний и сопряженный с синтезом АТФ электронный транспорт, синтез АТФ и фотоиндуцирог нное поглощение протонов в хлоропластах гороха и бобов в зависимости от концентрации гербицидов.

Данные метода ЗПР (окислительно-восстановительные превращения центров Р700) свидетельствуют о высокой эффективности симтриазинов. 50^-ное ингибированиа наблюдаетоя при соотношении концентраций гербицид/Р?00 = 1,1-2 ,8 . По реакции Хияла получаются заниженные значения этой величины. Показано, что ингиби-рояание сим-триазинами АТФ и фотоиндуцированнсго поглощения про-тоноз внутритилакоидным пространством обусловлено блокирование« электронного транспорта, 'а не их протонофорнюш свойствами.

Эти данные, сопоставленные действием разных сим-триази-нов на фотоиндуцированное изменение рН в среде инкубации хлоро-плэстоя, обусловленнн переносом прогонов во внутритилакоидное пространство. На рис.1 предсгавлсны зависимости величины фото-иидуцированиого поглощения протонов от концентрации сим-триззи-нов при рН среды 6,7 . Как и для других световых реакций - фого-зосстановления ферр.ицианида, фотофосфорилиролания - наибольший ингибиторный эффект оказывали тербутрин и котофор. Наименее эффективный ингибитор - пропазин. Следует отмени. что характерное время полуспада рН в среде инкубации после выключения света ( .С 1/2), определяемое пассивным выходом протонов наружу, практически не зависит от присутствия оим-триазонов в широком

Рис.1. Зависимости величины поглощения прогонов (I) и константы скорости (Кт) выхода протонов из тилакоидной мембраны (2) от концентрации атр чина (А), пропазинз (Б), котофора (В) и тербутри-на (Г) в суспензии хлоропласгов гороха при рг! 6,7 .

интервале концентрации (Ю^-Ю^Ц). й нашем случае кинетика спада Д р близка к экспоненциальной, поэтому К^О.бУЗ/С^ • Го обстоятельство, что исследованные нами 'гербициды влияют на но не затра-

гивают параметр Кг, свидетельствует о том, что их действие на фотоиндуцированное поглощение прогонов обусловлено ингибированием электронного транспорта, а не прогонофорны-ми свойствами гербицидов. В пользу этого узсвергдения служит такке тот факт, что эффективность энергетического сопряжения (отношение АТФ/2е~) практически не падает по

мере значительного ингибирования электронного транспорта сим-триазинами. ДосЗэвлеьяе ингибиторов в равной мере подавляет электронный транспорт и синтез АТг. Это однозначно свидетельствует о том, что падение скорости 4)ос.])орллировэ"ня с увеличением коп цен три паи еим-триазинов,в первую очередь, обусловлено блокированием ими электронного транспорта, а не разобщающим дей-стзием этих гербицидов.

Методом медленной индукции люминесценции изучено действие

-7

в иирокай области концентраций ( 10 -10 М) 13 гербицидов различных классов нз фотоси.нгзтическиД аппарат культурных (пшеница) и сорных (овсюг, сурепка) растений. Зыязлоны различия в действии классических гербицидов - ингибиторов электронного транскорта на культурные и сорые растения с одно.! стороны, двудольный и однодольный сорняки, с другой, а такье различия в действии классических гербицидов: диуронэ, террутрнна и г.п и гербицидов неклзссического типа: лонтрела и других хлорпроизводных пи кол нн о з о й кислста.

На рлс.2 показала кинетика изменении флуоресценции хлорофилла, а лиегьзз пшеницы, овсюга и сурепки в контроле л после обработки различными концентрациями гербутрина. Сравнение контрольных кинетических кривых для грех видов растений показывает, что адаптация фотосинтегического аппарата к освещению осуществля-е5'ся у этих трех растений не одинаково. У сурепки, относящейся к двудольный, первоначальный быстрый рост .флуоресценции сменяется сравнительно быстрым спадом. Спад 4 У однодольных з: -ков -пшеницы и овсюга - идет на свету значительно медленнее. Световой спад отражает снижение уровня воссгановленносги первичного хининногэ акцептора электронов £СЦ. Все три растительных вида обнаруживают высокую, хотя и несколько различную чувствительность к тероутрпну - типичному ингибитору транспорта электронов на

- а -

гъ

и

ги

п

К'

[ "

и

Рис.2. Кинетические кривые ¡'И^ листьев пшеницы (Л), овсюга (Б), сурепки (3), оор&боган-ных тербутрином в концентрации: 1-контроль с этанола, '¿-5- Ю-7 Ю~б, .'О'3, Ш~\1, соответственно, методом л а — куумноп инфильтрации. Г-то л.е при И8ССИВН0Л обработке. Здесь: ( р ) - включение света, ( / ) - выключение света.

уровне акцептора ОСИ класса замеченных фенил-ыочевин. 2то проявляется з устранении светового опади Л ¿>,, или его существенном замедлении. В случае, когда при очень низкой концентрации гербицида (0,1 мкМ) полное подавление не наблюдалось, кинетика, по-видимому, свидетельствует о неоднородности центров ФОН: в части цепей, транспорт электронов полностью подавлен, и соответствующая компонента сво-овол индукции флуоресценции быстро выходит на плато. Другая часть цепей, где ингчбирование не достигнуто, дает переменную составляющую, спадающую ио времени. Резуль-гирующэя кривея, очевидно, представляет собой аупзриозицт ох'их двух компонент.

Хотя разрешающее время установки позволяло ¡¡ашегрирояать лишь медленную индукцию флуоресценции, да.:;е и в наблюдаемом масштабе времени видно, что при малых концентрациях, особенно з трех

случаях, когда светозой спад индукции .флуоресценции иолт ;гьв не подавлен, нарастание флуоресценции до стационарного значения осуществляется во времени (рис.2А: концентрации 0,1 , 1,0 , 10 мкМ, 2Б: концентрации. 0,1 , 1,0 мкМ, 23: концентрации 0,1 , 10 мчМ). Учитыз я, что интенсивность флуоресценции в каждый донный момент отражает степень зос 'ановленности акцептора

(I , монно заключить, что переход 0( з восстановленное состояние гакыз происходит с некоторой задержкой, по крайней мере в части центров. Путем срав!.:ния по этим двум характеристикам: с.ветово"у спаду и скорости нарастания флупресценции в ответ ¡:з включение озета, из сопоставления кривых па рис.2 А, Б видно, что овсюг менее чувствителен к тербутрнну, чей пвеница, а слепка заметно более чувствительна. Далее, сравнивая два способа введения: вакуумную инфильтрацию и пассивную обработку, видим (рис.2 В, Г), что концентрация 0,1 мк!<1, достаточная для п":;авле~ Ш1Я электронного транспорта при втором способе, полностью не по ■ давляет световой спад, тогда как при первом способа достигается полное ингнбнрование.

Для пшеницы и овсюга не получено закономерных и статистически значимых изменений темповой флуоресценции Фд иод действием гербицида. Это означает, что гербицид не влияет на эффективность переноса возбуждения от антенного пигмента к реакционному центру.

Выязлег; некоторые различия в ч^стзительиости переменной флуоресценции к отдельным гербицидам у сурепки и овсюга. Так, агразии, относящийся к классу сим-гриазинов, полностью подавлял транспорт элекгроноз в листьях авсюга в концентрации 1,0 мкМ, тогда как диуро-. в концентрации ДО мкМ г ачк.ельно, но. все ецз не полностью подавлял оно. эл^.иронов от фотосистемы II. В целом это соответствует высокой эффективности лрэзина, пршеняе-

мого на практике для борьбы как с одно-, так и двудольным сорняками в посевах ряда культур, нащлмер, кориандра, виноградника. Диурон гак;ке .¡слользуегся для с лрьбы с одно-, и двудольными сорняками в посевах хлопчатника, цитрусовых, ягодных и плодовых культур. Наши д;..шые свидетельствуют в целом о меньшей чувствие ьности двух изученных видов сорных растений к диурону пр сравнению с этразином и несколько меньшем различии эффектов диурона при обработке сурепки и овсюга.

Исследована ТЛ листьев пшеницы, обработанной гербицидами диуроном и гербугрином через корневую систему. Методика регистрации ТЛ при разных температурах облучения позволила выявить рас...ичия .в их лнгибирующем действии на первичные процессы фотосинтеза. Предполагается, что эти различия обусловлены характером связывания гербицидов с мембраной тилакоидов как на донориой стороне ФСП.

На ркс.З приведены кривые TJI листьев пшеницы в контроле и после обработки диуроном и тербутрином. На кривых ТЛ контрольных листьев можно выделить две основные полосы: низкотемпературную в области -50° ... О? и высокотемпературную в области 20-50°С.

Полосу ТЛ в области отрицательных температур можно отнес..! к пику А, связываемому р ^дом авторов с рекомбинацией отрицательных за, 1дов первичного хинонного акцептора ФСН и положительных зарядов KSK, соответствующих состоянию ^ и . Полосу в области п-логительных температур мокно отнести к пикам bj и В2, возникавцим при рекомбинации отрицательных зарядов р-оричного хинонного акцептора и положительных зарядов ¿'j и > соот-яетственно. Гербацидкый, или - пик в облчсти температур С "30° хорогю п;^является кой в присутствии-диурона, так и в присутствии тероутринз ( рис.3 ). Мы приписываем гот пик рекомбинации отрицательны* зарядов С\д и положительных зарядов состояния ^

ТСМПЕРДТУРД РЕГИСТРАЦИИ ТЛ \ 'с /

Рис.3. Характерные кривые термолшннес-ценции листьев пшеницы при разных темпе-рат pax облучения (указаны цифрами у кривых): I-i ;нтроль, 2-после обработки диу-р он ом, 3-после обработки тербутрином.

Этот вывод основан на следующих заключен-лх.

Зо-лервых, в присутствии даурона инп.бирован перенос электронов от^д к Q з и состоят1'? ¿¡g не накапливается. Во-вторых, интенсивный (? -пик в присутствии диуронэ и тербутрина

наблюдается при достаточно низких температурах облуче: л, когда подавллш переходы менду ^-состояниями. Наконец, в-третьих, име-втся данные, свидетельствующие о том, чтоДиурон и тербутрнн действуют и на КВК, блокируя переходы мекд» $ -состояниями.

С понижением температуры облучонип наибольаие изменения как з контрою, так и в присутствии гербицидов и, -териезаег низко. ш-пературная полоса А ( рис.3 и 4 ); Максимальная сзетосучмэ поло-сн А наблюдается при температуре'облучения -30° ( рис.'* ). Это обусловлено следующим. При болзе высоких кмиературах (-10°, р:ю.З), с одной стороны, интенсивно протвкэпг обратила реакции й

Рис.А. Относительный вклад светосуммы полосы А (пло-г.эдь под кривой ТЛ в интервале температур регистрации -40 -0°) ь общую светосумму кривой TJ1: I-конгроль,после обработки тербутрином (2) и ДИу pOiJOM (3).

íCix, так что не накапливаются д , ас другой, • евд не ингибированы переходы (¡¿i—, так что на накапливаются состояния $J и ответственные за полосу А. При болеь, низких температурах (-50°,рис.З) гак*е не накапливаются <?3 - и - состояния, поскольку при понижении температуры в этой дш ааоне последовательно "замораживаются" переходы а ¿2-^3 '

В присутствии гербицидов относительный вклад полосы А в об-.¡¡ty свеюсумну уменьшается ( рис.4, кривые 2 и 3). Очевидно, это связано, с дополнительным к т .пературному, блокированием перенота электронов г' Q^ к Qg 3 присутствии диурона и тербутрина, в рааультате этого в присутствии гербицидов более интек■ ивчо накапливаются состо,.,шя и "разгорается" - пик ТЛ. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что максимум полосы А в присутствии диурона^ и тербутрина сдвинут в область более высоких температур. Особенно наглядно это видно при температу; ч облучения -30° для диуро-'а ( рис.3 )2 Это позволяет оделась вывод о том, что исследованные гербициды действуют и на КВК, блокируя,в частности, переходы между -' - состояниями, ответственными за излучение полисы А.

твмпсратыра оеличанип (*С|

Сравнительный анализ изменений ТЛ в присутствии диурона и тербутрина позволяет сделзгь выво" о сходном характере их действия на фотосп тетнческий аппарат растений. В то не время полученные данные указывают на некоторые различия в их гербицидном действии. Р'ло обнору;:.-ло, что обцая саетосуыма ТЛ в присутствии дпуронз при всех исследованных тенперату.лх облучения, как правило, больше, чем в присутствии тербутрина. С другой стороны, в присутствии диурона наименее выражен вклад в общую светосум-ыу полосы А (рис.4). Эти да.мые свидетельствуют о более сильном ингкбиручцем действии диурона по сравнению « тербутрином.

Различия в гербицидном действии диурона и тербутрина проявляются ток;-::е в незначительных различиях энергий активации -пика,что особенно заметно при температурах облучения -30° и -50° (рис.3): максимум - пика в присутствии тербутрина сдвинут а область более низких температур, что указывает но различный характер изменений окислительно-восстановительных сзойстз тилакоид-ной мембраны па акцепторной и дснорной с.ороне ФСП.

Таким образом, излучение ТЛ обработанных гербицидами листьев позволило обнаружить различия в иигибиругацем действии диурона и тербутрина на первичные процессы фотосинтеза.

ГЛАЗА 4. Действие функционально замененных гзлоидпиридинов на первичные процессы фотосинтеза при различных способах обработки. Механизм действия лонгрела.и ряда синтезированных в последние годы галоидпроизводных .пиридина -до настоящем времена не изучим. Известно, что лонтрел нарушает фе..олыши обмен в растениях. Характер действия его нэ первичные реакции .ьотосич-тезз не выяснен. 3 связи с этим было изучено дейстли>; различных концентраций лонтрела и его пгоиззодннх Ни баззлн«.'. и полный »,3 присутствии АДФ и 5Н) электронный транспорт, сянгел АГ5 и топндуг.лровашюе поглощение протонов з хлорала :пх лногьах

- Ih -

культурных и сорных растении. Для сравнения изучали влияний на те же параметры классического инги'чтора - диурзна. Обнаружено слабое ингибирован: i галоидпиркдинам:' электрон-транспортной цепи и синтеза АТФ при высоких концентрациях. Сравнительное изучение ингибирования тех ке : :оропластов диуроном, место и механизм действия которого хорошо известны, поз олило сделать вывод, что лонтрел и его производные действуют на ЗТЦ на акцепторной стороне ФСII.

Представляло интерес рассмотреть влияние соединений ряда галоидпиридиноз на медленную индукцию злуоресценцш: хлорофилла. Такие опыты были выполнены на листьях проростков пшеницы и двух сор"ых растений: двудольной сурепки и однодольного овсюга.

На рис.5 представлены кривые индукции флуоресценции листьев пшеницы, овсюга и сурепки ( соотв. А,Б и В), обработанных лонтре-лом в концентрациях 0,1 - 10 ыкМ методом вакуумной" инфильтрации. Лонтрел не является эффективным ингибитором электронного транс-пор, j в хлоропластах и не вызывает обычных для ингибиторов этого • типа изменений в кинетике флуоресценции. Тем не менее, картина индукции флуоресценции существенно меняется в присутствии лонтрел а.З листьях пшеницы и,отчасти - сурепки в присутствии лонт ел появляется отчетливо выр'-'-енная немонотонная кинетика затухания флуоресценции: появляется короткоживущая компонента и наблюдаются переходные явления.

Несколько снижается величина ¿ iu. В то ке время, на листьях озсвга никаких изменений обнару,..'.но не было. Большие концентрации q 100 ш« вызывали падение уровня переменной флуоресценции при неизменном уровне Ф0. Характерный для ..онтрела в малых концент"з-Циях ;0,1 - 1,0 ик1Л) эффект появления, быстро затухающей компоненты флуоресценции по крайней мере в час-ч центров ыокно было бы объг^ннть ускоренней оттока электронов за счет разобщения алектрон-

н

Л

V

1л

\

•и

I

I

I 2

ч»

Рис.5. Кинетические кривые МИФ листьев пшеницы (А) и овсюга (Б), обработанных методом вакуумной инфильтрации: 1-контроль с 1% этанола, 2-5-лонтрел в концентрации Ю-7,Ю-6, Ю-**, 10" М, соответственно. В- то не для сурепки при пассивной обработке:

1-контроль бет этанола,

2-4 - лонтрел^з концентрации Ю~б, Ю"5, Ю-4М, соответственно.Здесь:

( ? ) - включение света, ( ^ ) - выключение света.

ного транспорта и фосфори-лирования. Однако, лонтрел не является разобщителем о! в хлоропластах. Изменения

кинетики редокспревращений некоторых компонент электрон-транспортной цепи хлоропласгов в присутствии лонгрела показали, что в условиях включения и выключения све"з или изменений его спектрального состава, лонтрел существенно ускоряет установление редокс-равновесий, соответствующих данному ре;;;'"!у освещения, как в сторону окисления, так и в сторону восстановления. Известно, что реакции, лк.штирующие транспорт электронов в цепи, сопрявены с присоединением л диссоциацией протонов, поскольку в них участвуют хинонные соединения и.весьма возмоино, что именно передача прогонов в реакциях, проходящих в мембранной фазе, ограничивает скорость процессов в целом. Вещества, способные ускорить эти процессы путем воздействия на структуру мембраны или непосредственно путем переноса протонов, могут вызывать наблюдае-

ыые эффект в кинетике медленной индукции флуоресценции.

Для геграхлорпиколиновой кислоты из листьях сурепки отчетливо заметно общее снижение нач^ыюго выхода переменной флуоресценции. Доке при весьма низких концентрациях (10 ыкМ) и этому добавляется замедление первоначального роста, обычно свидетельствующее о некотором подавлении реакций на донорпоп стороне ФСН.

Таким образом, для гербицидов не классического типа (лонтрел и его производные) получен ряд новых, ранее не наблюдавшихся эффектов, интерпретация которых не монет быть достигнута в рамках традиционных предположений и механизмах подавления электрон-транспортных реакций вблизи акцепторного комплекса фотосистемы П.

Метод термолшинесцеиции позволил дополнить полученные ре -зультоты данными о состоянии КВК.

Обработка пшеницы и сурепки лонгрелом и питрил-З,6-дихлор-пиколиповой кислоты (НДГИ) изменяет вид кривых ТЛ, причем,по-разному у разных растений. В концентрации Ю-2,Н лонтрел сильно увеличивает интенсивность компоненты пика Л с Тц= -2 —8°С у пшеницы при температурах облучения -20 —40°С по сравнению с контролем, по влияя существенно на другие компоненты. В области более низких температур облучения ее интенсивность подает. Так как за эту компоненту ответственна рекомбинация зарядов^ , можно полагать, что лонтрел способствует накоплению положительных зарядов, поскольку он слабо влияет на ¿¡д. Отметим также, что максимум отношения светосуммы О0щ У листьев пшеницы, обработанной лонгре-лоы, сдвигается в более низкотемпературную область ( 30°С) по срввнению о контролем ( -20°С)

Не кривых ТЛ пшеницы, обработанной НДПК (рис.6), -интенсивностькомпонент ¡пика :о Тм=-2 - т8°С;1акже, как и при обработке лонгрелсы,'увеличивается, а более низкотемпературный - уменьшается

Рис.6. Изменение кривых ТЛ листьев 10-дневных пророст-нов пшеницы в зависимости от температуры облучения (-70 - 0°С): I—контрольные растения, 2-обработанныа в течение двух суток НДЛК в концентрации Ю"^!! по оса абсцисс - температура регистр а ц.ш.

по сравнению с контролем, что четко видно на кривой, полученной при темперам ре облучения -30°С. Кроме того, в обработанных НДПК листьях растет светосуыма ТЛ а области 0-30°С при То0л=-20- -70°С, Интересно отметить такае.чго отношение ^ПР" seuna-ратуре облучения -30°С иень-це, чем а контроле (рио.7), з противоположность наблюдаемому при обработке лонтрелоу. Такая асе зависимость наблюдалась у паеницы, обработанной сим-три аз и ном. Taima образом, ЩШК оказывает на ТЛ паеницы действче, ппдобное действию.ингибиторов электронного транспор а мезду ÍC. Последнее с. ¡о подтверждено методом МИФ и по реакции Хшиа.

Для сурепки, обработанной лонтрелом, характерно уменьшение по. сравнеь-.ю с контролем ТЛ ? области 45-70°С.

Общая свегосумма ТЛ сурепки,обработанной лонтрелом, меньше светосуммы контрольной сурепки за исключением Тодл=-30°С. При этом

Рис.7. Отношение свето-суммы листьев

„/ 10-дневных проростков

/о

с 'о пшеницы: 1-конгрольные

.ЭОБЩ _

эоб1д 60

до

20

растения, 2-обработан-ные в течение двух суток НДПК к концентрш и По оси абсцисс -- температура облучения.

характерна для контрольных растений зависимость

¿общ 01 тобл старанязт-ся. Отношение светосуммы

¿А^общУ Л110Тьев сурепки, обработанной

2

и 4-1-1_I_1_|_I_

-60 -40 -20 0,°С лонтрелоы, имеет макси-

мум при Тобл=-30°С.

Таким образом,НДПК подобно диурону и тербутрину, ингибирует электронный транспорт между ¡'СИ • ФС1, а также действует на КВК ;.онорной стороны фСЦ. Наблюдаются характерные различия в зависимости от Тобд. У листьев пшеницы и сурепки, обработанных НДПК, а такке диуроном и тербутрином, общая светосуыма выше, чем в контроле. Светосумма ТЛ листьев растений, обработанных лонтрелом, при понижении температуры облучения уменьшается по сравнению с контролем: у пшеницы при Тобл нике - 40°С, у весенней сурепки - ниже - 50°С. У осенней сурепки <>общ меньше, чем в контроле при всех температурах облучения. Изменение В1 при обработке как пшеницы, так и сурепки не укладывается, таким образом, в рам...» традиционных представлений о влиянии гербицидов на Функционирование акцепторного и донорного комплексов

ГЛАВА 5. Влияние гербицидов различных классов на функциональное состояние электрон-транспортной цепи высших растений. Известно, что бензимидазолы обладают широкий спектром биологической активности. В зависимости от концентрации они стимулируют роот растений или оказывают гербицидный эффект, влияют на электронный транспорт и окислительное фосфорилирование. Синтезированные в ИХФ РАН аминометилпроизводные 5(б)-оксибензимидазола обладают антиоксидантной и рострегулирующей активностью. Нами изучено влияние 2-метил-5-оксибензи1.шдазол-дигидрохлорида (.Био 40) и его аналога - препарата Био-50 на электронный транспорт в хлоропластах и листьях культурных и сорных растений.

На рис.8 представлены кинетические кривые окислительно-восстановительных превращений Р700 хлоропластов в контроле, при обработке Био-40 в концентрации 2'10~'(1.1 и атразином в концентрации 5'10~% кривые 1,2,3,соответственно).

____I

---- ------Рис.8. Кинетические кривые окислитель-

но-восстановителышх превращений Р700 хлоропластов бобов контрольных (I), обработанных 2'10~\1 Био-40(2) и 5'Ю"б1,1 атразином (3). Стрелками обозначены моменты включения ( 'Р ),выключения { { ) и переключения света |г ) соответствующей длины волны.

Из сравнения кривых видно, что величина & А/А-показатель активности ФОН, равная, в контроле 0,87, не изменяется для хлоропластов,обработанных Био—гО, но существенно падает в хлоропластах, обработанных атразином А/А=0,42), свидетельствуя об ии-гибированни электронного транспорта между двумя ФС. Существенной особенностью действия Био-'^О на ЭТЦ ныяется увеличение скорости затухания сигнала Р7001" после выключения света ^„„„„=707 ны

¿1 о к о

11111

1о> аа 70? а то,

- го -

(рис.8, кривая 2), уменьшение зависит от концентрации Био-40:

оно изменяется от 24,3 сек при концентрации до 7,8 сек

при концентрации Уменьшение означает, что Био-40

выполняет роль допоро электронов к Р700+ непосредственно или

посредствсяпереносчиков донорнс:1 стороны ФС1. Таким образом, одно из мест взаимодействия Био-40 с ЗТЦ - донорная сторона '¡>21.

Донорный эффект Био-40 по отношению к Р700+ может маскировать эффект ингибировэния ЭТ между ФС, поэтому были изучены изменения кривых медленной индукции люминесценции листьев пшеницы (кривые 1-4, рис.9,Л), овсюга (кривые 1-4, рис.9,Б) и сурепки (кривые 1-4, рис.9,В), обработанных Еио-40 и Био-50 в концентрациях 6 к (кривые 2,3, соответственно). Для сравнения приведены данные для листьев, обработанных атразином (Ю"^). В отличие от кривых медленно!! индукции люминесценции лисгьов, обработанных атразином, кривые для листьев, обработанных Био-40 н Био-50, характеризуются уровнем Ф0, практически равным контрольному (кривые I), увеличением (для однодольных растений) уровня изменяемой (Дф ) компоненты флуоресценции и характерным изменением кинетики спада ДФ: она немонотонна и замедлена по сравнению с контролем. Отношение ДФ/Ф0=1,3 - 1,5 (в контроле пколо I) за счет увеличения Л Ф. Эго свидетельствует о небольшом уменьие-нии скорости оттока электронов от ¡>СП, накоплении восстановленного акцептора ФОН за счет частичного ингкбированкл электронного транспорта между ФС. Действительно, в листьях, обработанных атра-зином-класскческим ингибитором электронного транспорта мевд ФС (кривая 4 на рис.9А), в 1,5 раза увеличивается ЛФ, растет уровень Ф0,-отношение ДФ/Ф0- равно 1,4 - 1,5 .

Для листьев двудольного растения сурепки характерно сохранение уровня Ф0, равного контрольному, немонотонность кинетики затухания Дф и уменьшение интенсивности Дф. Последнее свидетельству-

Рис.9. Кинетика !Ш листьев контрольных (кр.1): А-растений пшеницы, Б-ов-сюга, 3-сурепки и обработанных 540-40(2), Био-50(3) и агразиноы (4) при комнатной температуре, ^-начальный уровень флу оре^ченции, £ î>-nepe-менная флуоресценция. Стрелками обозначены моменты включения выключения ( } ) света с]Хб=ь00-700 нм (интенсивность Ю^эрг гаГ^сек-1).

зт о влиянии Био-40 и Био-50 на накопление восстановленной формы втори.-ного акцептора ."»CII, или, зозможно, на деградацию реакционных центров ■?СЦ. 3 цзлом данные свидетельствуют о проникновении Био-^О и Бло-50 в ' листьях одно- и двудольных растений при ин{шьтрации, различном действии их на ЭГЦ листье" одно- и двудольных растений, незначительном (по сравнению с агразином) ингибировамш электронного транспорта в листьях однодольных рзстенли и донорных свойствах относительно реакционных центров ?С1 хлоропластоз.

В глазе У изучено методом ЭПР спиновых зондов влияние гербицида 4,о-дшштро-орто-крезола (ДНОК) на ЭГЦ и структуру мембран j хлоропластах пиеницы.

ÀhOK а суспензии хлороплаотоэ не влияет на вращательные ды1;:.енлл спиновых; зондов Ijg 3 « -tj . Ij - c%» парамагнитные фрагменты которых погружены в тилакоидные мембрг. а на различные глубины. Следовательно, гербицид ДНОК не оказывает влияния па состояние основной массы липидов мембран хлороплаотов. 3 то ке время наолюдаюгоя некоторые изменения в спектрах ЭПР

V.

J4

к.

VU

А

! I

I I

•ЩИ

зонда САТд при введении в суспензию хлореплаетов ДКОК. При этом с увеличением концентрации ДНОК уменьшается параметр А/В (рис.10), что указывает на большую солюбчлизацчю САТ^ в мембранах хлоропластов по сравнению с контролем. Спиновые зонд САГ^

А/В

20

10

0,2

0,6 1,0 (ДНОЮ.мМ

1,4

Рис.Ю. З.люлиости параметра Л/3, характеризующего распределение спинового зонда САТ^ пелду гидропонной и полярной, фазами в суспензии хлоро-нласгоя гпсеншда.

имеет постоянны!! положительный заряд и,поэтому его

проникновении в мембрану оп-

ределяется поверхностным зарядом. Таким образом, ь присутствии ДНОК поверхностный заряд мембраны хлорэпластоз становится более отрицательным.

В заключение отметим, что гербицид ДйЭК, ье оказывая влияния на липидную структуру мембран, модифицирует их поверхностный заряд, некозалантно и обратимо связываясь с одним из компонентов ЭГЦ, и одновременно ингибирует ЙЦ в хлороплао^ах пиеницы.

О

ВЫВОДЫ

1. Для класса сим-триазинов, по данным о фотовосстановлэнки центров Р700, значения р находятся в интервале 1,1 -2,8, причем ингибиторный эффект обусловлен блокированием электронного транспорта. Но обнаружено усиления уте .ки протонов в присутствии этих ГЦ или изменения отнесения АТФ/2ё .

2. Выявлены различия в кривых медленной индукции флуоресценции листьев пшеницы, сурепки и овсюга в присутствии тсрбутриня. По этим данным, электронный транспорт на уровне акцепторов

ФОН в листьях овсчга менее чувствителен к тербутрину, чем в листьях пшеницн. Вакуумная инфильтраци: раствора гербицида обеспечивает более сильный ингибиторныи эффект, че ■ пассивная обработка растения. Б листьях овсюга и сурепки электронный транспорт сильнее подавляется атразином, чем диуроном.

3. По данным измерений термолшинесценцш,, диурон сильнее подавляет транспорт электронов з листьях пшеницы, чем тербутрин. Характер влияния ГЦ на полосы ТЛ указывает на то, что эти с ди-нения подавляют реакции на акцепторной стороне ФС II и на уровне кислород-выделяющего комплекса. Пик ТЛ в области О - 30°, наблюдаемый после обработки ГЦ, вероятно, обусловлен рекомбинацией зерядов восстановленного акцептора и состояния $р КВК.

Лонтрел и его аналоги - гербициды ряда галоидзамеи'.енпнх пиридинов - слабо инги^чруют транспорт электронов в акцепторном комплексе ФО II, а такае вблизи ФС I. На кривых медленной индукции флуоресценции лонтрел вызывает немонотонные эффекты затухания в листьях пшеницы, и в меньшей степени - сурепки. Эти эффекты отсутствовали.б листьях овсюга.

5. По данным ТЛ, лонтрел и его аналоги способствуют нчкоп-

ленига состояний $ 3 КВК. Выявлены различия зффектоь галоид-

замещсшшх пиридинов на ТЛ овсюга, сурепки и пшеницы, а таюзе

сезонные вариации для сурепки.

Результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Байрамов Х.Б., Грибова З.П., Столярова Л.Г., Кузнецов Ю.В. Влияние Био-40 и Био-50 на функциональное состояние злект-рон-транспортной цепи высших растеиий//Сбор.иат.Всесоюзной конференции^Химил и технология пиридинсодертащих пестицидов". - Черноголовка. - 1988. - вып.1. - с.234-237.

2. Байрамов Х.Б., Антоновский В.Л., Грибова З.П. Сравнительное изучение ...етодом ЭПР и спектрофотометрически механизма действия сим-триазинов и лонтрела на хлоропласты рэстений/ДП Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине". - Звенигород. - 1989. - с.17-18.

3. Музафаров E.H., Грибова З.П.^ Антоновский В.П., Тихонов А.Н., Байрамов Х.Б., Керимов Т.М. Сравнительное изучение влияния сим-триазинов на протонно-электронный транспорт и фотофос-форилирование в хлоропластах гороха и бобов//Физиология и биохимия культурных растений.-1989. -т.21. - № 4. -с.393-399.

4. Солнцев М.К., Грибова З.П., Караваев В.А., Байрамов Х.Б., Ташиш В. Сравнительное изучение действия диурона и тер-бутрина на термолюминесценцию листьев пшеиицы//ИзБестия АН СССР. Сер.биол. - 1989. - 1й 6. - с.936-940.

5. Солнцев М.К., Грибова З.П., Байрамов Х.Б., Та :иш В. Действие функционально замещенных галоидпиридинов на запасание световой энергии в листьях культурных и сорных растений//Известия АН СССР. Сер.биол. - 1990. - fi»6. - с.687-693.

6. Антоновский В.Л., Байрамов Х.Б., Гольдфельд М.Г., Грибова З.П., Карапетян Н.В., Рахимбердиева М.Г., Керимов Т.М.