Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительно генетико-биохимическая характеристика продуктов двух гомологичныъ эстеразоподобных генов Dr.virilis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительно генетико-биохимическая характеристика продуктов двух гомологичныъ эстеразоподобных генов Dr.virilis"

р V ь и»

2 ^ Ш Ш

РСОТИШЯ ШДЗ.Ш НАУК ИНСТИТУТ ЖЖШЙРЗШ БИОЛОГИИ ИИ. ЗКГЕЛЬГАРТА.

Но ттарог лууг^'и/м» иСЗ ^" " • "УЗ •

УДК 575.577.13

КОПАНЦЕВА Марина Робертовна.

СРАВНШЕЛБШЯ ГЕНЕТЖО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. ПРОДУКТОВ ДВУХ ГОМОЛОГИЧНЫХ ЭСТЕРАЗОГОДОНЖ ГЕНОВ ВЯ.УШШЗ.

03.00.15 — гзнэт^ЙСЗ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии развития ИБР РАН ш.Н.К.Кольцова и в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот ИМБ РАН км.В.А.Энгвльгарта.

Научные руководители:

доктор недвдинских наук прсфзссор Норочхин Л.й. кандидат биологических наук Саттеев П.В.

Официальные озшонэнты:

доктор биологических наук Митрофанов В.Г. кандидат биологических наук Бородин A.M.

N

Ведущая организация:

Институт Общей Генетики РАН

Защита состоится „]?-« iллс^ 19Э5г. в „/¿7 «часов на заседании специализированного ученого совета Д002.85.01 по защите . диссертаций на соискание ученой степени доктора доктора наук при Институте биологии развития им.Н.Е .Кольцова РДЩП7334, Москва ул.Вавилова;26). •

С дассеотацизй kcsho ознакомиться в библиотеке Института биологии

Tia^u'i'i'Ha mi И If ТГ/>т.?»лт>о ТМИ" jJUuuaiJiA i. - i. ч

¿втореферат разослан - Р—« Cx^Ja^ 1995г.

Учений секретарь Специализированного совета

канлвдат биологических наук У) , ~~ Е.Н.Протопопова

L

*

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Регуляция эктиезости газов эукариот в процессе клеточной детерминации и тканевой диффэревцировки является одной ее наиболее важных и интересных проблем в современной генетики. Удобными и хорошо изученными маркерами терминальной дифферзкшфовки органов полового трактз самца являются ткане-специфичестсие эстерззы различных видов Drosophila (Корочкин,1Э77, 1983,-^еррэг & Richmond, 1980 ).

К настоящему времени у Dr.virills клонировано 2 эстерззо-по-дсбннх гена - est-S и est-X и определена их яуклеотядная последовательность ( Езиколопов и др.,1989; Sergeer et al.,1991 ). эти ганы сбнаружигзют знзчитзльнуз гс?голсгии структурных областей,

СХС285 ИКТрОН—3K30HEC3 C7IX}SH23 2 0ДКН2КСВ09 НЗПрЗВЛб117*0 "^рЗЧСК— рипцки. Два эстеразо-подобннх гена у Dr.aslanogaster - est-б и est-P, таклсе структурно-гомологичных друг другу". "Сшш описаны' у ' Oakeshatt et al.,1990 ). При сравнении нуклэотвдных последовательностей генов est-S и est-б была обнаружена 50% гомология кодирующих областей ( Sergeev et al.,1991 ). В связи с этим естественным является предположение о том, что эти гены являются родственными как в эволвдчонном так и в функциональном отношении.

Характеристика белковых продуктов генов est-S и est-X у Dr. Yirllis проведена только для белка E3t-S ( Кспакцева и др., 1990; Таыарана к др.,1331 ), в то время кзк балок Est-X до настоящего времени не бал иденти^шдирсвзн и охарактеризован. Кроме того,существуете зкспзркмзктгльныз данные с2яде?злъстзу2т сб отсутствии

ч

гканеспещфкескойч-31:Спрэссии гена est-X на уровне транскрипции, что отличает его от гктквяости гена est-S,'- котошЗ-язлявтся геном

ч *

с выраяеннсй ткгнв ппецифячб ской функцией. Анализ ткгнвЕсго расп-

z

ределения спацгфиеского бедка Est-X может быть важным моментом в изучении активности гена и механизмов se регуляции. Кроме того идентификация s харзктзриззция белкового продукта гена est-X псз-ecjist подоЗдта к изучении функции и возможного. участия этого бел-кз s осуществшнии специфической активности половой системы Dr. vlrilis. Существование у Dr.melanogaster схожей ген-ферментной системы позволяет осуществлять сравнительные исследования и получать экспериментальные данные о путях эволвдии к молекулярной дивергенции гоаологичных генов и соответствующих белковых продуктов у DroBophila.

Цела и задачи исследования. Целями настоящей работа являлось идентификация и характеризацкя белковых продуктов генов est-S и eBt-X у Dr.virilis, анализ тканевого распределения специфических белков Est-S и Est-X, определение характера наследования специфических злвктрофоретических вариантов белков Est-S и Est-X к изучение возможного -участия йзлкоз Est—S и Est-X в- осуществлении специфических функций самЛЕЫкосящих луковиц { с.л. ) Dr.yirilis. Исходя из этого конкретный задачи настоящего исследования состоят в следующем:

I. О шзшщы) антисыворотки к полипептиду, синтезирупцемуся в составе гибридного белка в клетках E.coli, идентифицировать бел-, ковый продукт гена ost-X в электрсфоретическом спектрв белков . Br .vlrilis.

«г. Исследовать органо-, стадиэ- и шлоспациничность синтеза специфического Est-X белка у Dr.virilis-

#3 Исследовать виды-близнецы группа Dr.Yirilio с целью поиска возможного кзееидового полиморфизма белка Est-X по электрофора ти-

*7Qnxeryllt TrtTOWwongnnr ti {}223ДЗЛ32?Ь AuwuiCTSp 'PQr*r<отггчт>отуаe^ gn»WT je—

ризптов у К322ЗД0ЕНХ гибридов. . „

A t£«awm»<»x. lynw^nouuti » %r%r* TVr» WQT orinfroq+oi» r*r\тглттауоттгг rfrnop_

-c . »iWJF шли i^/lMlUi ULUMA tHJ-O- |IHUi.l*UVQUll l^i r Kg^lUà.

мент гена est-S, с целью анализа регуляции тканесдацифицеской экспрессии возможными цис-элементами гена est-S.

5. Изучить состав натинных секреторных комплексов с.л. Dr.vi- . rilis с целью поиска в них продуктов генов est-X и est-S.

Научная новизна к практическая ценность работы. В результата проведенной работы с помощью а^уисыворотки к белкомому продукту гена est-X, зкспрессироваиного в клетках.E.coli в- составе гибридного белка с р-галактозидазой, показана экспрессия гена в клетках с.л. Br.firills, а также в других ткзнях сзицов, девст-' взнных--самок и личинках 3-го возраста, ¿наяализ 12 нидоз-йпигне- ч цов группы Dr.Yixilis продемонстрировал присутствие йелкз Est-X с.л всех исследованных видов. иЫл сбнарузкен и охарактеризован генетически детерминированный межвидовой полиморфизм по электро-форетической годвиеностй-белка Est-X. Впервые показано ишунохи-мическое сходство белков Est-X. и Est-S у. Dr.Tflrilis и Est-б у Br.melancgaster. Показана тканзгашцзфкчэская экспрессия гена est-S в трансгенных мухах Dr.nelanogaster, несущих фрагмент гена est-S. Dr.Tlrilis. Методом нативного электрофореза исследован спектр секреторных белков с.л. Dr.virilis и обнаружено присутствие продуктов генов est-X и est-S в составе ферментативных кош- _ • лексов S- и р-зстзргз.

Предложенные в данной работе модификации мзтодов изучения бзлков s нуклзинсвнх кислот у DrosopMla ггсгут бить рекожндсва-

■mj V mrmfwryxtrr тг{*гтг\ тгг гугюатттт D поа нцичщ ттrt Arvnqerr

III* li II HI jAJimi^J uuuwuuu^inluuj Ы '• * ■ - - 1 " ■ 1 ■ ' " ....... ...... f ( JJ 1 " ' ' ' * ™

ССДЕР1ЙНИЕ РАБОТЫ

I.Получение ЛНК ffpansETOB гена Est-X для поаг.едукдсго клонирования в зкспрессирукцихся векторах

ц

• Est-S Est-X

HR RR H H H . R R R

I I_I I_I i I_Л1 I_

i i i i i i г srksssfc

P RV P P RV P N

a

-b

pESb -

H - HindIII R - Eco RI P - Pßt I RV - Eco R7

Рис I. Физическая и транскрипционная карта плазмщш pVE9, содержащей гены Est-S и Est-X Drosophila viril 1б ( Ениколшов и да.,1989 ). Указаны фрагменты гена Est-X и фрагмент гена Est-S, использованные для получения в клетках E.coli гибридных белков EXg, EXg, KXg и ESb.

s

йяззмада pVE9, содзраащая гены est-S и est-X Dr.virilis ( Eniîralopo? et al.,1983; Сергеев и др.,1989 ), была любезно предоставлена Е.В.Свртеэвым (ШБ РАН, йоснва). Ранее из плазмиды pVE9 был изолирован фрагмент гена est-S ' для его экспрессии в ' клеткзх E.coli.( Татарина, 19ЭО ). Одной из задач данной работы являлось создание генно-инженерных конструкций для экспрессии в E.coli гзпа Est-X, который расположен на расстоянии приблизительно I т.н.о. at гена est-S ( рис Л ). Для этого путем последовательного субкловирсвэкия из гзнскясго фрагмента

HlJIf Tir» Tri тИ 1 -f а /"олттт* ттп |мл г ^aoutt '41 tir /чгЛТтоталаттта . о i ffnwuü

(i-lu.. ul. 1 < M .—Uишш иимшмикиш i^Jii UJU^IVIWUiiiU» Ъ. \

800 n.o. ), b ( длина 900 п.о. ) и с ( дайна 550 п.о. ). Эти 4 геномные субсегменты были фланкирована следущими сайтами рестрикционнкх зндонуклоаз: Pst I - Pst I ( суб{рагкент а ), Pat I - Hind III ( субфашент b ) и Hind III - Hind III ( субфрагмент с ). Клонирование этих субфрагментов осуществляли в

V

векторе pSP64, ■ используя стандартные процедуры- ( Маниатис -и-др., 1934 ).

2.Создание генно-ингенарвых конструкций для экспрессии гена est-X в клетках E.coli.

Для получения белкового т^сдуктз генз ssî—X Нш^и выбран метод экспрессии исслздузхсго фрагмента ДНК, в составе гибридного гена, в клетках В.coli ( Harston, 1985 ). 3 качестве векторов для создания рекокбияантных конструкций была вкбрана серия плезмвд рТО ( pUFSSO, pUE29t и pUB292 } ( Rüther, ISiLler-Hill, 1983 ). Штзгади данной серии используются для получения в клетках 2.coli гаторологичннх белков, синтезируемых в виде гибридных белков с р-галактозидазой. 3 трех указанных плазшдах расположение полилинкерной последовательности относительно 1ас2-кодируо-

тот»*"* тгггог»т»тга «ми?пол trwrfaa тцтоял«пт*иииасг •ттпг»тю7тпт>от»а тгс.ттг*»»»!.

U J 1UW4MU iUUWUWf 14U <UMUU<1 4 W «U^WMtWl 1t . «1 »ц^ц-if ■ . .

могет быть Еведенз в один аз векторов серия е той зсз рамкэ считывания, что к laaZ. Несмотря на то что ш располагали информацией о первичной последовательности всех трех^ субфрагмантов гена est-X ( а, b и с ), мы провели анализ их кодирующей способности по всей трем рамкам считывания. Лигирование ДНК фрагментов с расщепленными соответствувдими ферментами векторами и трансформацию клеток E.coll проводили по общепринятым протоколам { Ыаниатис в др.,1984 ). В качестве клеток хозяев для экспрессии рекомбияантшх плазмид использовали штамм ВМН71-18 ( Messing et а!., 1977 ). Отбор кланов со естзекзми вугной

wwotppottwif rvviHO^'CоTjovn тпгтаи • ovonijfso 1гими 'пал'"сплит ifinaf™

W^lUJUiMyUtt ¿WIK ииыший /l^lJlUl .

uatr>pno rrnr* го т*опсттаггтгаттсг Qu'r'liurv тттта'зшгтхтт r* namncfrrmtrr raw-

IUVU1WU UUWM1U 1>«Д t - • ......1 I * '-"1 f МЦ«»|Д U i.

риктзззми: для фрагмента a - Sac I и Bam H I, для фрагмента b -Hae III и Xho и для фрагмента с - Xba I. ' ' Способность отобранных трансформантов к эффективному синтезу гибридных белков проверяли методом электрофореза в полиарилимид-ном геле в присутствии ДСН, сравнивая электрофоре тичо скиэ спектры белков до г после индукции гена lacZ изощхлшлтиогалактопира-нозидом.Кроме этого, экстракты ивдуцпроваяных и- неинду-цированных трансформантов тестировали на присутствие перекрестно реагирующего материала , методом ик?4уноблотингз с использованием кроличьей гиткенворотка к суммарным белкам с.л. Dr.Tlrilis Послэдниз эксперимента били . енполнзны а связи с жгзкцимися данника о присутствии ¡¿РНК гена est-X в клзткзх с.л. Br.Ylrilis ( Сергеев и др.,198Э ). В результате проделанной работы мы отобрали по одному наиболее интенсивно экспрессирулцамуся клону для каздого из трах, фрагментов гена est-X. Учитывая обозначения гвна, из которого происходят изучаемые фрагменты и

номзра отобранных трзнсформантов мы дели отселектированным рвжшбинантным плазмидам следующие обозначения: рЕХд - ( .фрагмент а ), рЕХ5( фрагмент b ) и рЕХд ( фрагмент о ). Гиб- ■ рздЕнв белки, которые кодировались этими плазкздами, были обозна-

ттогтт.г vov fY W тх VY _

'tI г I ■ (ЫШ JXM^ I 1C^ ML U^Q WW4S XUW * V LUVUUU я

Получив штаммы E.coli, продуцаруяцие фрагменты белка гена est-X, мы осуществили очистку соответствуодих гибридных белков. Использованный метод очистки гибридных белков бал основан на изоляции "тел включения" из индуцированных ИШГ бактериальных клеток и низкой растворимости гибридных белков в водно-солевых v растворах ( Гловер,1989 ). Изолированные "тела включения" растворяли в Ш мочевине или 0,5% ДСН. При понижении концентрации солюбилизирупцих агентов гибридные белки вследствие низкой рас-воримости выпадали в осадок, тогда как сопутствующие белки .E.coli оставались в растворенном состоянии. В результате нескольких таких перэосаздекЕй ин сумели получить злектрофорети-

namrof ттаялтщ^ J* та. ттгдтпапофи тг..-г>т> иу _ и*г _ nr VY_ ттп iraumng о irav— UUUM ■ ■ .............. • «4WUUWU ^U UW^IUWU ul | ■—Г u iMip UU I.' • ' • * ' ----- UiUUVh

трсфореза в полиакраламядном геле- s присутствии ДСЯ. К очищенным гибридным белкам были получены кроличьи антисыворотки, которые позволили нам проанализировать экспрессии белкового продукта ге- . на est-X в различных тканях Br.Yirilia.

З.йгцукохкническая идентификация белкового продукта гена eat-X в сешшшюсищих луковицах Dr.Yirilis. В иммуноипгаческих экспериментах по анализу белков EXg, .ЕХд и EXg мн показали, что эти гибридные белки реагирует с антисн-ворсткой к общим белкам с.л. Dr.Yirilis. Контрольные

ъvflттаjjrnjfiTj'rTj ттгухгояитт OTCyTC^SIIS ИЗРЗУн)5СТНО

угг"гг?rr*TTQTV^ WOTQTWO па t> тттпттплУ^рошщг StTFFP

Л. ¿-^¿'J »«ЦЦ A UM4 A I-/ U U.LU * Lll-i • V " " - T7 л Udv-/ A

ЕМН71-18, содергзда слззмиду рОЯ 292 без вставка гетеродогаякой ДНК. Эта эксперимента сзидетэльстзувт об экспрессии гена ез1;-Х, по крайней паре, в с.л. Вг.т1гИ1а и находятся в хорошем соответствии с данными ш анализу мРНК этого гена • ( Сергеев и др., 1989 ).

При иммунохимическом анализе белков ЕХд, ЕХ^ к ЕХд с помощью антисыворотки к общим белкам с.л. Вг.т1гШб ш обнаружили, что использованная антисыворотка эффективно реагирует- с ЕХд и ЕХд, а с гибридным бзлком Е^ реагирует существенно ,слабев . Это может быть следствием неравномерного по длине белка распределения антигенных детерминант продукта гена ез^Х. Некоторое

>

подтверждение этому предположению ш подучили при анзлизе антисывороток к счищенным гибридным белкам ЕХд, ЕХд и ЕХд, При рав-тп-ту роЗиВДуЙипТ КрСЛИПЪЯ ЯТТТУСН^гТрОТ^! К {#ЗЛКЗМ ЕХд " КХа р521*К— рогали интенсивнее, чем антиснворотка к белку Е^ с использованными для иммунизации антигенами . - - .. -

Гибридный белок ЕХд содержит больную часть предполагаемого белкового продукта ев^Б гена Ег.т1гШб, кроме того, полученная к этому белку антисыворотка обладала .высокой активностью и - спе-• цифичностью. В связи с этими причинами данная антисыЕоротка была использована для анализа экспрессии белкового продукта гена ев^Х у Вг.тйгШз.

Иммунохимячзский гшализ экспрессии белкового продукта гена ез*-Х Вг.т1х111в проводился параллельно с анализом экспрессии гена ез1-3. Ген ез1-Б распоясгва рядом с геном ез*-Х ( рис.1 ) и кодирует белек на

тельности продукту гена ез^Х ( Енинолепов и др., 1989 Для анализа белка гена ев^Б мы использовали кроличью антисыворотку к гибридному.белку ЕзЬ, который содержит большую часть белка,

э

кодируемого геном еэ'Е-Э ( рис.1). В наших экспериментах белки с.л. трех-, пяти- и пятнадцатидневных самцов Вг.у1г111в разделяли в стандартном 7,5й полиакрилагядном геле в присутствии ДСН, а затем выявляли окрашиванием на общий белок и иммунохимичэски, используя антисыЕоротки к гибридным белкам ЕХд ж Е5Ь. Было показано,что обе использованные антиснворотки реагируют с одной белковой фракцией ( молекулярный зе с 63 кД ), которая, начиная с 5 дня онтогенеза саща имзго Сг.тахШе становится главный белковым компонентен с.л. Этот рз-

^гттс.'по'г» т* ста гп гтпа ниггууро тгг>а •а&шпж ткзттг»»т*от*о /^гготтоттогтега ттгаV/—

и ^ <1 ^ 1 и 1 "" ' ; , 1 ■■ ' ■ ■ ^и^ци ■ " - I -1 ■• ч ' • '■" иллиим^

ттсттгпггу -с,аг*гхи Ла тп,-г»т*тт"«г ттп/^тпр*"т,/~»т> тчаигур оа^_Т т* о г* « п

1-л ич< ч^ч^П и^^кЛи^и^. имиД; ач Ж ими С ий<| Л #1 Си • ъ) и «

цов Вт.у1г111а, что являлось вполне ожидаемым по результатам сравнительного молзкулярного анализа этих двух генов { Сергеев и др., 198Э ). Хотя и не-являлось исключенным то, что это результат перекрестной резкции антисывороток, полученных к двум высокогомологичным белкам-. - ... _ . -

4.Анализ ткйЕеспецифнчности и полоспецифичноста экспрессии

белковых продуктов генов ев1;-5 и еа*-Х. Для исследования вопроса о тканеспецифичности а полоспецифич-ности экспрессии белков генов ез-1-Х и ез!-3 Dr.Yiri.li3 мы разделили белки с.л. самцов Dr.Ylrl.lis, самцов без с.л. и девственных самок того гз возраста, что и самцы, в 7,53 полигкрглакиднем ге-лз в присутствии ДСН. После злектроблоттингз, перенесенные на мембрану белки проявляли антисывороткой к ЕХд а в наралелльных экспериментах антисывороткой к ЕЗЬ . Антисыворотка к гибридному белку ЕЗЪ реагировала исключительно с белком с вдле-лярвым весом 53 из с.л. Вг.т1г111в, но не с белками самцов

"л

Ег.т1г111о с. удаленными с.л. и не с белками девственных самок. Напротив антисыворотка к белку ЕХд выявляла белок с молекулярным

/о

весом 63 кД как в с.л. самцов 1)г.71гШ5, так в самцах без с.л. и в девственных самках. Хотя в двух последних случаях количество, выявляемого антиснвороткой к ЕХд, антигена существенно меньше, чем в экстрактах из с.л. самцов вг.у1г111в.

Обнаруженное отсутствие вырахзннсй ткане- и 'полспзцифмностк экспрессии белкового продукта гена ез!-Х находится в полном со-072аТСТ2И2 С 222ДИ32 ряп?¡^¡одатош!р Т^рзН^»^^-ГТЗ Т'ЗЛЗ

ез^Х. Эта РНК была обнаружена как з с.л., так и в самцах Сг.у1-г111в с удаленными с.л. Кроме того детектируемое количество РНК гена Ез^Х было выявлено в суммарной РНК девственных самок Ш?.т1г111з. В токе время, транскрипция гена ез1-3 была ограничена исключительно клетками с.л. самцов Dr.viri3.l8 ( Ениколопов и др., 1989 ).

5.Белковая фракция РЕВ к ее полиморфизм у различных видов группы Вг.т1г1118.

Белковая фракция, соответствупцая молекулярному весу 63 кД в полизетилзыидасм геле в присутствии ДСН и выявляемая антисаво-

плчп^сип* V тплКтил пит* Латгалл 1?Т_ тг "ЖЬ вопоакФ«! ттпооошттгяттш

^/и иъшии м * ........Д, ■ ■■1-... ч мйо 44. лши иЦЦиУКЩ^ ««ЦОШ ММШ

пснентом дафференцироЕанннх с.л. сзмцое 0г.т1г111з. Ранее эта фракция была нами описана у Вг.у1гШб как РЕВУ!. (Лвдвиг,1Э84). У 12 исслэдозанных нами видов группы Вг.т1г111б были обнаружены такгв мажорные бзлковш фракции РЕВ в области молекулярных весов 61 - 65 кД. В с.л. самцов 0г.1ишз1, Сг.у1г111б, &Г. 1юташех1сааа, йг.капесо1 внутривидовых различий по молекулярному весу фракции РЕВ нами обнарузано не было. "У этих видов белок РЕВ представлен одной единственной полосой после электрофореза в присутствии ДСН. У , Иг.Уехала "и . Вг.атеПсала белковая фракция РЕВ представлена двумя подфракцяями с аолекуляр-

li

Н2КИ SSCSMH 63 2 SI КД CCOTSSTCTBSEHO . У- зздоз относящихся к фядадз Bontana ( Dr.ezoana, Dr.littoralia, Dr.borealis, Dr. ilsvciscnians, Dr.lacicals и Dr.jsontana } урЗКцйЯ P i^H также представлена двумя субфракциякя 65 кД 2 SI кД, причем первая субфракция в количественном отношении преобладает над второй(рис.З).

«Для' каздого вида группа Dr.vtrilis было проанализировано не менее 10 индивидуальных с.л. и показано отсутствие внутривидо- . вого полиморфизма по молекулярному весу белков фракции РЕВ. Это позволило нам, в частности, сделать заключение о том, что две субфракцги белка РЕВ у Dr.anserlcana и Dr.tехала, а также у видов фолзды Montana, не являются аллельными вариантами.

Кммунахимзческий анзлиз белковых фракции РЕВ у видов Dr.aT.e-ricana,. Dr.texena, Dr.ezoana, Dr.littoralis, Dr.borealis, Dr.ilaTOEcntana, Dr.lacicola и Dr.Montana провздвнннй с помощью 22ТИСЫВС23ТХЦ x 5sдку ESti показал, "ТО с использован—

ной антисывороткой реагирует только одна субфракция с большим молекулярным весом . Днтисыворотка к гибридному белку ЕХд выявляла у вышеперечисленных видов обе субфракцшз белка РЕВ. У видов Dr.vtrilis, Br.lunmei, Br.kanekoi и Ог.потшпех1свпа обе антисыворотки веявлели единственную белковую фракцию, которой и представлен материал РЕВ посла электрофореза в полиакриаламид-еом геле в присутствии ДСН .

Для экспериментальной проверки предположения о том, что белки генов e'st-X и sst-S у Dr.virilia, а также у Dr.luasi, Вт. кале ко 1 и Сг.пота,вех1сапа, совпадают по подвижности при стан-

тгатутгпм ттп vr^wiv"vrvi«aa и ттп *тт*оттт*т»о*л»7тао*« т*оттл "Sf тттж/**,»т><^п»гэт»т* 11/ 'IT

«^«.(AJijv'jAJWI' U MW1.H ...^f.^J.l ini.i.11,1 [U. . WMU, U iW. /4 4.

\

uu u'jtiauu TT7T ттг>тэт»о тттуттяитоцця oTriiT^wwTwno.iG» -rrr\ftowm r> moowana—

" ' . . и ........ I .1 111 П j UW1U4IIUI I ■ Г - ■ ! ■ ■ ^ umu.k.^lut^MuUU f 1Ч.Щ Ы

•ещий гель мочевину до концентрации • БМ. Результаты

HL

■p»*/-» O fVrQV^n Aü irvrvО ЛОисГОиОАЛСПТТГГ Wtrvr^'OT/TT ТУИГТТГУ»

1 MWa« 1 fl «1 Г1Ч I If VMrf U^U^i * ** '■*'■■ ■ -*- ' — ' t И1,Ц> <Ы

В.группа viril Is: 1- D.americtna, 2 - D.texana, * 3 - B.lunmei, 4 - D.Tirilis, 5 - D noTamexicana, б - D.kanskoi.T - B.montana,8 - D.flavomontana, 9 - B.borealis, 10 - D.littoralis, 11 - D.laci-p.lacicola, 12 - B.esoana.

УЗ

электрофореза белков . с.л. самцов ргзлнчных ввдов группы Вг.т1г111в в полиакри- ламидном гале в" присутствии ДСН/8М мочевины подтвердили наше предположение .Добавление 8М мочевины в ■ полиакрилаглэдный гель привело к разделении зоны РЕВ на две_ субфрзкцна такте и у тех. видов, у которых в стандартных условиях электрофоре 2а зона РЕВ представлена одной фракцией. Субфрзкциа белка РЕВ .выявленные в условиях элэктрсрсфорэза в

ттг» тпуятгртт.ття^.т^т*?Г!ГЭДЗ 3 ПмИСУТСТ2И32 ДС2/5М МОЧ^ЭЕИИЗ бКЛИ обозначены как РЕВ711 и РЕВУ 12. Так как нашей целью являвтсяизучуние белков .гомологичных продуктам генов езгБ и ез1;Х,выявление этих субфракций осуществлялось икцунохимическими методами,с покопти антисывороток к гибридным белкам ЕХд и ЕБЬ.

ймкунохнмический анализ белков с.л. различных видов группы Вг.у1г111в после электрофореза в присутствии ДСН/8М мочевины показал, что только с актиснвороткой к гибридному белку ЕХд выявляются обз субфракции РЕВ, ( РЕВУН и РЕВУ12 ) в то время как с аитисывороткой к гибридному белку ЕБЬ • реагирует только одна из двух - РЕВУН. Учитывая то,что в условиях стандандартпого электрофореза по Лемкли, две субфрзкции РЕВ у В.гиег1сгпа,Въехала и у видов филздн НонЬапа таким гз образом ведут себя в отношении этих антисывороток,как и РЕВУН РЕВУ!2 в условиях электрофореза с мочевиной »разумно предположить ,что эти пары, субфракций гомологичны друг другу- Неожиданным результатом анализа белков РЕВ разных видов группы Вг.у1г111в в полиакрклакидном геле . в присутствии ДСН/8М мочевины оказалось исчезновение межвидовых различий в подвиености субфракций РЕВ по срзЕнениа со стандартным электрофорезом в присутствии ДСН. Эти изменения в подвижности могут быть результатом . изменения связывания ДЖ с белками в присутствий кочевины.что

подтверждается набладением за изменением; алектрофоретического спектра белков с.л. В.у±г111з в ходе электрофореза в ступенчатом градиенте мочевины, (рис.3)сформированном перпендикулярно обычному

■СГОТТПОтаТПЬИТЛП Иломлчпхлгытг. Т10«ЭТГО ПаТЗТЖа РТ?П Т>Г* -рЧ "1 ■{ П Т7Г> 7ТТза

. .. .1 .. ....... I .ццщч.уичшшД 1млЛ \■' и диУ ¡Л, в | ¿А 1 I ХД ии Дыи

1 V

субфрзкции в полизкриламиднсм геле в присутствии ДСЗ/8Ы мочевины позволила нам проанализировать распределение субфракций РЕВУН и РЕВУ 12 ■ в экстрактах девственных самок Вг.71г111в и самцов с удаленными с. л. Проведенный иммунохимический анализ с помощью ' антисыворотки к гибридному белку ЕХд выявлял в экстрактах самцов 1)г.71г111б без с.л. и девственных самок белок соотвзтотвукщий по подвижности в электрофорезе РЕВУ12 и нэ детектзфовал присутствие других антигенов в области миграции РЕВУН .Кроме этого с помощью ЗЕТисыворотки к ЕХд з экстрактах из личинок 1>г.у1г111з 3 возраста детектировался бе- лон, соответствующий по молекулгфному еэсу РЕВ? 12- в полиакрил2М2д- .ном гале в присутствии -ДОН/ЗМ мочанина. -Таким образом совокупность зксперикзнтальнкх данных по анализу фракции РЕВ у 1)г.т±г111в в различных элэктрофоротических системах и с помощью антисывороток и .к белковым продуктам генов еа^-Х и ев-1-Б позволяет сделать три заключения. Во первых, при стандартных условиях электрофореза белковые продукты этих двух генов мигрируют у ряда видов В.группы у1г!11з в одной зоне. . Во вторых, включение мочевины в шлиаотиламидный гель позволяет электрофоре- тичаски разделить эти два-балка,обнаружив при этом равенство по подвижности белков РЕВУН • и РЕВУ12 у всех исследуемых евдое В третьих, продукт гена ев1-Б ( РЕВУН ) является оргавоспзцифа- ческим и полспзцифпескиа белком, в то звемя как йелкозкй продукт гена. ез^Х ( РЕВУ 12 ) кроме с.л. тзкеэ обнаруживается девствзнЕых сакках,в самцах Br.Tiril.is с

Ч&вличение кгонцентРяции

моче.е>ины

Рис.3. Электрфорез белков оемяЕнносящей луковицы В.т1г111з в денатурирующих условиях в градиенте концентрации мочевины перпендикулярному направлению электрофореза .*

4 Ь

удаленными с.л. ,а также в личинках 3го возраста.

6.Изучение характера наследования вариантов белков фракции РЕВ у межвидовых гибридов. Для изучения характера наследования различий по ыодзкулярно-ку весу белков P2BV11 и РЕВ? 12 у видов труппы Br.rírllis, был шзЕ8дзн биохимический анализ гибридов ( ) от ызееидового скрещивания Dr.ylrilis и Dr.novamexicana, а такие потомства ( ?2 ) от возвратного скращивания • и Lrr. Tirilla. Белки РЕВУН и РЕВ712 выявлялись с помощью антисывороток к гибридным, белкам ЕХд и ESb после злектрофозеза в полиакриламцдном тела в присутствии ДСН. Анализ полученных данных позволяет нам сделать вывод о генетической детерминации различий по молекулярному весу белков PEBVií и РЕ8712, а также об отсутствии сцепления соотЕвтствущих геноЕ с полом. Как было показано нами ранее знтисыЕоротка к гибридному белку ЕХд выяляат крсмз PEBV12 также и белок . PEBV.il, поэтому,, чтобы достоверно.

ттттосгпат'Г- оуяттсртпп рапа oa+«.Y ( rta тт/w РТ?Ш7< О \ о тпт-Гттт тг атг

«MMUUUWMUm * WM4 uи « U ^ WWMWU Л. < Д « м* / U 4 4МЫМ>ЦиА,

?2» ^ проанализировали аммунохамическа экстракты аз девственных се- мок от этого скрещивания. В этом случае мы выявляли только Сел- ковый продукт гена est-X, что позволило избегать сложностей, связанных с перекрестной реакцией антисыЕоротки к гибридному белку ЕХд с белком PEBV11 гибридных самцов.

7.2рансгенные нузн.

В результате проведенных экспериментов по клонировании и иммунохимической идвнтгсТккаЦии продуктов генов est-S и est-X наш было установлено, что эти гены находятся под разным гене-ТЯЧ5СК2М коетползм, ТНК КЗК ЗКСПП5ССИру#2ТСЯ в разных тканях има_

w TV *г(МИо й ntií"iv\auiQQ хэтлана rmwin wmmoTro TOTmwcmnoQn

. i/ ЛЛЛ, t . U I « ■ I » . W UUUiWIüj^U ¿WMWU^ IMj ШШД

г»Лттог»ч»г. т*от7о oo+_Q / Согчтопт i 009 TOQQ\ tT*TV* TTQ nr\ пои т>л»т»хлчгсгг*г»»г»х.

VWMlUWiU iUlUi WU« и y UWA^VWl I «W^Mf ^•/WU/f XAU UUU LIUWIMUII mU ЛтЛи

осуществить ряд экспериментов по исследовании особенностей экспрессии этого гена р видах, далеких друг от друга, в Dr.virillB и Dr.melanogaster и в эволюционном отношении сравнить их.

Предварительно мы исследовали спектр белков с.л. и п.с.п. ( парагонии и семявнносящиэ протоки ) Dr.Tlxllis и Dr.raelanogas-

I

ter в отношении их антигенной специфичности к антисывороткам, полученным к белковым продуктам генов est-S и est-X, так как мо-лекулярно-биологические данные свидетельствуют о наличии в половой системе Dr.nelanogaster eat-6 - белка, обнаруживащего по многим,критериям большое сходство с белком est-S ( SergeeY,1993; -Ludslg,1994; ). При иммугохимическом анализе п.с.п. Dr.sslano-

«гоа+рт» *пл тттж rta itfW V» *яг% narrtr namtni толпм CQ vit vr%n>nt4uft

«ÇA nul UUULl^J -"-TV [ • I Ov^tuM U 'О^ШШН UU UL/tn LAJ *SHr i^W itfjWHI

специфически выявлялся антиснворотками к гибридным белкам и ESb . В этой области располагается описанный у Dr.ice lanogaoter полипептид эстеразы б, имеющий молекулярный вес 63 кД. ( Richmond., 1972 ).Обнаружение структурно-родственных генов в этих двух видах делало проблему изучения их взаимной регуляции еще более интересной.

Для осуществления экспрессии -был использован 5'-концевой фрагмент гена est-S размером 1200 п.о. и содержащий последовав, тельность активного центра эстеразы и регуляторную область гена, заниманцув 450 п.о. Введение этого ДНК фрагмента осуществлялось на ранних стадиях эмбриогенеза Dr.selanogaster Dl{1) в составе взктора CaSpeR/Pirotta at all 1985/, содержащем в свозм составе ген white вместе - с регуляторной областью, который использовался в качестве маркера для выявления трансгенных мух. Полилинкерная последовательность вектора CaSper ' располагается up streamperyJiH- торной регуляторной области гена

а

тгшие и, таким образом, последняя не участвует в работе конструкции. Йнтронные знхансероподобные последовательности а данной конструкции тают отсутствовали. Таким образом со стороны конструкции регуляция осуществлялась только.. 5"-концевой областью, индуцирующей экспрессию гена ев-Ь-Б в с.л. у Вг.7±гШ.в. У трзнсгэнных мух 5-6 дневного возраста методом иммунобло- тинга с помощью. антисыворотки к гибридному белку ЕЗЪ нам удалось выявить экспрессию фрагментов ез!-3 белка с

ч

ггодекулярным весом 25-30 «Д ( дяина кодирупдей области ДНК

ест225сй 800 2.0 ^ только в с»л с2мц03 (рис«.4)» 05н2тзч/23к«*3

искгыгхцт-хгтгтг Лтпат^яетФПт» Лртга т»агю **

отсутствием стоп-кодонов у исследуемого фрагмента и сбросом РКК-полиыеразы СС-богатыми районами 5'-рэгуляторной области гена *1Ше или/к/Еаличием нескольких стоп-кодсаов в спейсерной области

(

полицистронной м-РНК. Одновременно в половой система трансгенных самцов Вг.ие1апо§аБ1ег выявляется и 1в\-6. При этом ее количество увеличивается с возрастом имаго, тогда как экспрессия введенного ДНК фрагменте гена евг-Б не зависит от возраста трансгенного самца начиная с 4 дня рззЕития, когда имеется полностью сформированные с.л. Интенсивность экспрессии ез1;-5, по-видимому, зависит от количества копий ДНК введенного фрзгкзнтз .встроенных в гзвсм трзЕсганных особей (Банкиров ж др.1994 ).Одним результатов дащюго эксперимента явлается факт отсутствия связи меаду интенсивностью экспрессии гена кМДе и фрагмента гена ев!3 ,что говорит о различном регуляционном генетическом контроле над экспрессией двух находящихся в одной генетической конструкции генов (рис.5).

Осеовным выводом из этих экспериментов на нзш взгляд является тот факт, что в данном случае никакого влияния на экспрессию

4Э

1 2 3 4 5 6 789 10 1112131415

1

©

-Е 5Г-5 V/

Рас. 4. йгмуноблоттинг различных от да лое генитализз

Тр2ЕСХ*ЭНН2*Х С2МСХ д! СЗГЛЦОВ 1) ТП*? Т^ТЮ^^Я 1 15 — с-л«в«т11*илз 'по

ТТЛ чч*п»о

с.п. ,4 - пзрагонии,5 семенияки 112 В Ее1агю^гег;

6,11,13 - гениталии самцов различных трансгенннх линий; 7,12, 14 - самца этих линий без гениталиев; 8 - гениталии оплодотворенной самки 1:57 ;9, - голова, 10 - туловище самки г57 без гениталиев.

го

Г-

РЪВъ

1 — ' * л?

е 5 Т- 6 л: е

£/7- 5"

Г^ - л1»- -

^ см ь^Л

изменение окряс/Си . \ •

от- Ё/зе^но-/Ьо^оДого^о л^Ьл^иого

Рис.5, йммуноблоттинг гениталиев трансгенных самцов В.тй1апо£азгег с различным:! мутациями гена иМЛе _

I

после правления иммунной сыеогсшсой анти-ебь.

-1

в

2. 1

фрагмента гена est-S не осуществлялось ни со стороны генетического окружения Dr.melanogaster ни со стороны вектра CaSpeR. Регуляция во времени нами не была детально изучена, но строгой корреляции со. стадиеспецифичностью экспрессии гена est-б мы не оСнэрузгали. Другим eszhhm результатом мы считаем выявление иммукохимического сходства Eet-X и. Est6" и окончательного доказательства его существования мэзду Est-S и Eat-Х.Тзкям образом,учитывая аолзкулярно-биоясгичзсхиз данные /Ениколопов и др. 1989; Sergeev et all 1992; Oakescbot et all 1993/, мы моием гозорять о гомологии даух мультигенных семейств генов Dr.vlrilis и Dr.Eelanogaster.

8.Изучение углеводных компонентов

Из анализа первичной структуры генов est-S и est-X извасно, что онз.содергзт соответственно -2 а I сзйтз потенциального - гли-козилирования по Я-типу бэлкоЕ," которые кодируются этими генами. Для выявления возможных углеводных компонентов в белках PE5V11 и PESV12 мы использовали метод электроблсттинга с последующая дз-

ТЙКЦИЗЙ П2р32ЭС5ЕН2*Х бЭЛКСВ т^ «опошля! Угагу oqpoci ттттог;ц А^

КонканаЕалин А специфически связывает концевые остатки маннозы и глюкозы в гликоцротеинах и позволяет эффективно детектировать гликозилированные белки.

Нами было обнаружено, что все описанные нами структурно-сходные белки PEBV11 и РЕ8712 в с.л. Dr.virilis и Est-б в п.с.п. Dr.melanogester связывавт 112^-Конканавалин А, то есть являются гликопротвинами. Кроме PE3VI1 и PEBV12 в с.л. Dt.tI- rilis не выявляется более никаких гликопротеинов, тогда как в п.с.п. K2K у Br.ffielanogaster так и у Dr.Ylrilla выявляются дру- гие

г г

гликозилирозанные полипептиды.

Гликозилировзние белков генов ев!-5 а ез!-Х у Вг.т1г111з и Ез1-6 у 1)г.те1ащ£аз1ег - еще один аспект их структурного -сходства. Он отражает не только наличие в структура этих белков сайтов гликозшироЕания, но и особенности белкового "созревания", протекащзго у них сходяам образом, что, по-видимому,

пЛ^^и^татютат» »ппшю ■11/ м г /ЫттгтттгЛ

иьг^мшмн/ш ' " '111.1 .1 л ■ «¿^ 1 11 Ч ',11.«* »

9.Изучение кативного состояния секрета с.л. Dr.virilis.

Значительная часть секрета с,л. D.группы vlrllls находятся з водонераствордаом состоянии , выразащемся в" том, что после центрифуги- рования гомогената с.л. Dr.ylrilts в PBS при lOOOOOg в течении I часа значителы:ая"часть белков РЕВ была обнаружена в надрсадоч- ной жидкости. При исследовании гомогената ,с.л. и выделенного секрета методом градиентного центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы и анализе фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН/8М мочеЕины, мн обнзругвли оба белка, PSB711 а РЕВ712, по тайней мзрз в трех фракциях грздезнта.Склон- ность к агрегации балки FEBV11 PEBV12 проявила и в условиях кзтивного

электрофореза,т.к. после анализа электрофоретическо спектра белков из нативного геля в трубках во втором направлении в присутствии SDS и Ш мочевины оба белка обнаруживались в составе наиболее высокомолекулярного» агрегате .проявляющего эстеразную активность.НатиЕНЫй спектр балков с.л. B.Ylrilis после разделения в градентном полиакрил аыиднои геле представлен на

рис.18.Наиболее Еырагенная зстеразнвя активность связана с наиболее внсотголзкулярным агрегатом.как и в электрофорззе в трубках.который списан как З-зстергга/Ксроткин и

др.1989/.Описанный в этой жз работе фермент (3-эстераза выражен значительно слабее.поэтому.чтобы выявить полипептидный состав белковых фсзкций, проявляющих зстзразвую активность,были здектрсфорзтячзсгск рзздздзны как бзлки с.л. так и целого самца. .Исследование вырезанных из геля белковых полос с эсте- рззной активностью показало, что белковый комплекс,соответствую- ющий эстеразе Б в с.л. 1)г.71г111в по электрофоретической под-важности, состоит, как из РЕБ711 так и из РЕВУ12 белков, а фракция^ соответствующая {3-эстеразе в целом самце - РЕВ712 белку и выявляется антисквороткой к гибридному белку ЕХд.

« Таким образом нами показано, что белки РЕВУН, и РЕВУ 12 образуют в нагишом состоянии высокомолекулярные агрегата и что специфической ферментативной активностью эстеразы Б обладает высокомолекулярный гетерогенный комплекс, в который входят-

н

белковые продукты обоих эстеразных генов. Белковая фрзк- ция

А—олтчат^'з'ти «о л тпшпоотгпвв т воятлшлгт» о воот»гучМгв птта ^лт^л

^ ииш^иии^ <1иъмш^ыишшиЛ им ии^'шимхи «и «

спектра самца с удаленными с.л., напротив, обнаруживает только одну белковую полосу в денатурирующем геле, соответствушаую белку РЕВУ11 и выявлявдуюся антисывороткой к гибридному белку ЕХд. Наши экспериментальные данные указывают на то, что продукт гена Ез*-Х сохранил в эволюции свою ферментативную функцию, а продукт гена Ез*-Б, несмотря, на присутствие в нем активного эстеразного центра частично ее утратил. Для функционирования бедка гена Е^-Б как фермента ему необходим продукт гена Ез1-Х.

10.Заключение

Обобщая полученные данные, можно предположить, что в ходз

ЗВОЛ22ЦИ2 ПРОИСХОДИЛИ 213и1525НИЯ СТрОЗНИЯ ^^^ —ут^г^ —мтг^'тт^ ** - ез1-3, ез^Х и ез*~б, коррелирующие с функцией органов, в кото-

TiT-TV г\тпя гра-патп. аи-лттпоолстгппгурро Пхгттст ттгч n"vr\nnrpx>v г\Лта"Пгь тпхтгvrn»

UUU IWUU^U U.U UAW^UlkJJ KJ ÍÜÁtinjU

-зкзонкого строения, иккунохимичзсксго и биохимического сходства иг продуктов эти гевы произошли путем дупликации, родительского гена с посладущвй дивергенцией' прокэторных областей, приобретших различную временную и тканевую спещфгчность. Консерватизм структурных областей обусловлен стабилизацией. необходимостью стабилизации третичной структуры выше упомянутых генов для выполнения ферментативных функций.' Но дяя ■ успешного в®ш-нения программы развития, по-видимому, достаточно было одного гена с такой функцией, одинакового экспрессирующегося в различных тканях видов у^уин» Br.Ytrilis. Возможность осуществления тканзспецифической зкспресии сделало более актуальными для раз-

omma тг Яптхгсптттттггпглтзаттпа лптчштмио ' < г п-.оЛгц^Tn'ju.i тггюггтгу ATf.*wmtrx— UI^^lUl .. imi^lull lll^uu ti I п.. lllltli '.1.Ц и^лииии II IIU ^Jj Л. JUL WWMJUU

ческих особенностей, кроме наличия активного центра эотерзз. Сильно гликозилзровавный продукт гена est-S может принимать участие зз сплсдотворзнии сдмки { Eaccetti,1S72 ), а также в дое-; ханизмз видовой изоляции, так как он передается самке при оплодотворении ( Ксианцева к др., 1990 ). Зга изоляция мояет быть основана на специфическом взаимодействии углеводов с лектино-подобными белками. Сильное гликозилирование разветвленными оли-госахарамя, по-видимому/гюшает проявлению ферментативной функции, поэтому для ее осуществления в белковые комплексы с.л. Dr. Yirilis, обладающие зстеразной активностью, входит субьеданицз esí-X, которая самостоятельно осуществляет свою ферментативную

jTmutfiron 2 друп^х тканях самца «i самки т^т.у^^и 1 о Факт сбразо_

вания двух родственных самостоятельных ганоЕ подтверздзется и ^результатами скрвщивзния и анализом распределения генетических вариантов у ви£ов группы Dr.Yirilis. Тгзсая функциональная дивер-гзецкя нзблщзется и в случав белков Est-б е семявкносящам про-

2 5-"

ТОКе йг.те1апо£^ег. Это, на наш взгляд, свидетельствует о биологической значимости выявленных в настоящей работе законамер-ностей. • ••

ВЫВОДЫ

1.Получены и охарактеризованы антисыворотки к белковому продукту гена ез^Х 1)г.т1г1118 - белку Ез^Х.

2.Продемонстрирована экспрессия гзнз ез*-Х в семявынссящих луковицах сзмцсв 0г.71г1Нз и других тканях самцов, з тзкгз в дзвст-

вотплтт пц»ииуот т»г»"эг»е»г»ч»е* *

¿лу Ч. И1Л цишГы I л ишЛиЛ и иииуии х и *

3.Покзззно присутствие белкового продукта генз ез1-Х в семяЕыно-сящих луковицах у 12 вадо^-близнацов группы Вг.т1г1118. Выявлен генетический межвидовой^ полиморфизм по молекулярному весу белка Еа^Х у изученных ..видов. . —<' . ... . ...

4.Продемонстрировано иммунохимическое и физико-химическое сходство продуктов структурно-гомологичных генов ев^Х, ез1-Б у Вг.т!-г111з'и ез^-б у Dr.meLsnogaater. Bca три белка охарактеризованы

5.Проведен имаунохимический анализ трннсгенных мух Бг.пеХапозаз-гет с Еклвченным в геном фрагментом генз ез1-Э и показан синтез белка в се,мявыносящих луковицах трансгзнннх мух.

6.Проведено исслздовзниз нативного злзктрсфоретического спектра -белков сэмявынЬсяпщх луковиц и целых мух Вг.т1г1118 и обнаружено

присутствие продуктов генов ее^-Э и ез^-Х в ферментативных комплексах Б- и р-эстераз.

Z6

Основные результаты диссертации изложены в слвдуших печатных работах 1 .Ладваг M.S. ,Фадиновз М.Р. .КорочкинЛ.К. Генетико-баохимическиз . свойства белка EB-I у D.Tirllis. - Доклады Академии Кзук 1984 T.27S,с.220-222.

2.Лкдаиг M.S. .Филинова М.Р..Хайновская A.M., Корочкин Л.И. Новый маркер терминальной дайэренцировки гениталиев дрозофилкд. Онтогенез 1Э84.Т.15 Н 4 с.473

3.ЕогосЫ&п I., Ludwlg К., Pillnova М. A model ot the analysis oi molecular genetic bases of cell differentiation. -Genetics, 1984, V.10T, N3, pt-2 (suppl), s.58.

4.ЛКЩВИГ M.S..Филинова M.P.,Хайновская A.M..Корочкин Л.К. - Новый .белек гениталиев дртз.ейгллы. -Молекулярные мехзнизмы генетических процессов .Молекулярная генетика,эеолецкя и молекулярно-генетичес-кие основы селекции.Москва IЭ35г с 195—203

5.Kcrochkin L. .ludKig М. .РШнота М.,?о1уакотг Е. - Scea solecu-lar-genstic aspect of cellular differentiation in Brosophilla.-Sowiet Scince Reviews .P.Pliysiology .Genetic P-iology,1 S87.pp.411-466.

6.Корочкин Л.И., Кокоза В.А.,Копанцэва М.Р.,ЛгщвигМ.З. Молвкулярно-гвнетические основы сегрегации клеток у Дрозофилы. -Материалы 5 съезда ВОГИС т.1 C.I3S,Москва 1987г.

7-Ншанцеа М-Р., Тамарина Н.А.,Лвдвиг M.S.

Молвкулярно-генетические свойства секреторных белков семявыносязей л^тсовицы Brosophilla. - Онтогенез, 1Э88г. т.18,

! ' с.439

в.ТгмариЕа H.A., Лэдвиг M.S., Копанцева М.Р., Успенский И.И., Ениколопов Г.Н., Короткий Л.И. Тканеспецифяческие белки генита-лязв дрозофилы. - Онтогенез, I98S, т.14, JS, c.60I-SIQ. 9.успенский И.и.,Лэдвиг М.З.,Кспннцззз LLP.Дзмаринз н.А.,Цзт-рян В.А.,Коротки Л.И. Белок РЕЗ-ткннвспзци^иеский маркер семявнносящай луковицы Drosopbilla melanogaster. - Тезиса докладов 6 Всесоюзного совещания по проблемам биологии и. генетики дрозофилы., Одесса,1939г. с.87.

Ю.Таызрина Н.А.,Лддвиг М.З.,Копанцева М.Р..Успенский И.И., Цат-рян В.А.Дорочкин Л.И. Сравнительный анализ магорных белков семявыносяЕзк. луковиц разных видов дрозофилы. - Тезисы докладов 6 всесоюзного совещания по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса,1989г., с. 84-85.

И.Корочкин Л.И., Ениколопов Г.Н.,Лвдниг М.З.,Копанцева М.Р./Га-марина Н.А.,Кузкн_Б.А.,Евгеньев М.5.,Хзчуцяц Р.К,,Успенский И.И.. .

Цл ъаггтт wciT'iun _ ■поггапгтталггтла апттаФтз mvr*m\ar»r*vm г»ат1гчт> т> т»огтт*п» отторг

•■¿«¿¿¿¿¿IS J. t US АЛЛ. IW WAhkXU UUUgUAU UllUU^U «->>_< ¿UX Ц Utrfi/ 4-» & и!Ш*ШШ1л.

дрозофилы- Тезисы докладов 8 симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов". Иркутск. 1Э89г с.16-17. ^

12.Korochkin L-, laxtlwls И., Yenitolopov G., Tanarina N., Khechumi^n R., TJspensky I., Jtopantseva M., Evgeniey H., Knzin B.7Bakaeva Т., iinjolan I., Malevantchuk 0. Molecular genetic mechanisms oi tl3sue specific esterase Isozymes and protela

expression in Drosophila. - 6th International Congress . on

i ^

Isozymes, Toyama, Japan, 1989, Abstracts, p.19.

13.Koroch3iin b.,budwlg !i.,Yenicolopor G.,Kbecfcuinijn R..Kopantsera S.,Eafcae?a T.,T3inarina Ii.,Knzln B. Genetic regulation of tissue specific esterase protein expression in Drosophlla. - Genora 1989,7.31 ,p.489.

14.Ioiisrig 5f.,Tamarina Я., Kopantsera й.,изрепзку1.,1тзпот A.,

и

Z2"£Tl2il W HOTvCbldn 'Х-. CC2p2T2iiYe ££ПЗмЪС finfl ЫССНйЩжСЗЛ. caracterisation oi РЕВ - ths malar protein component oi а ejaculatory bulb 'In different Drosophila species.- Cell differentiation and Development 1989,7.27,supl.,509^

15.Korochkin- I.,YeniKolopov G.,Ludwig U.,Ташаг1па if.»Eopantseva M, Kvztn B.,Eugeniev M. ,Khechnmyan R.,Uspensity I.. Molecular-genetic mechanism of tissue specific esterase izosyroe and protein expression In Drosophila. - Isoayme Bulletin 1929 Y.22, Supl. p.14.

16.Eorochkin Ь..Yenikoiopov G.,Ludwig i£., Tamarina N.,Kop3ntze= vaH. ,Eugsniev 5£. ,НЬес1шщуап R. .Malevancinic 0. .Eolecular-genetic

- ч

tSYestigatioii of tissue-spesllic expression oi seme genes in Bro-

SOD*liX& It SJT0I>62*1 Dl*020pili3-^S тюоррту^ь 50Hf2T*SHCS M2Xfcr*°iXi.S

' N

1939,:Afcst.-Karcsille,Prance, 1989,p.60. ,: ; -

17.Нопавцава Ы.Р., Лвдвиг M.S., Успенский И.й.,' "тамарина Н.А.,' Цатряя В.А., Корочюш Л.И. Бедки семявыносящшс. луковиц различных видов Drosophila. Журнал общей биологии, 1990, т.51, " JH,с.125-140 ^

18.УспвЕский И.И., Лвдвиг- Ы.З.„Копанцева М.Р. Дамарина Н.А.,Цатрян В.А. ,Корочкин Л.К. Белок семявыносящей луковицы РЕВ у Drosophila Е21гшзазгег:Стадавспецифачвосгь и половой диморфизм. - Онтогенез 1990.т.21,с.747-751.

19.KorochfcSn Ь., badirlg If., Yenifcolopov G., Ташайпа N., Kbechu- щуап Й., Sopantssva Ц., EvgenieY К., Knain В., Bafcaera Т., Iva- пет А., Zii&yanoY S. Molecular ^snetic mschanisins of tissue-speci- fie esterase isozyme and proteins In Drosophila. -Progress In clinical and bbol.res. y.344, Isozymes: Structure, function and use in biology and medicine., Eds.: L.I.Qgita, C.llliaritertl., N.Y.:ffilly bis's, 1990, p.339-400

20.1udwlg Й.2., Uspenslgr I.I., Ггапот A.I., Kopantseva M.B., DianoT O.K., Tamarina Ii.A., КогосШл L.I. Genetic control and expression oi the major ejaculatory bulb protein (PEB-me) in Drosophila melanogaster. - Biochemical genetics, 1991, v.29, N5/6, p.215-239.

21.Короткая Л.Я., Сергеев П.В., Башкиров В.Н., Панин В.М., Габвто- ва Л.В., Марганец К., КшандеЕа М.Р., Шостак Н.Г., Павлова Г.В., Барский В.Е., Дзитоева С.Г., Гслубева М.В., Асдззуков А.Р. Ткзнэ- специфическая экспрессия гена estS у трансгенннз дрозофил — ik— ттятут. РАЫ, / в печати. / 22.Sargee? ?. Дсрзйзета Ы.,РагЛл 7.,BashteiroT Georgia? G.,XorochMn. Expression of estS gene D.Tirili3 in. D.melanogaster.-FSBS Letter/in,pres3/.

Подписано к Отпечатано на ротапринте в Производственной комбинате Литературного фонда

печати

Формат бумага 30x42/4 Объем п. л. ; Зак. ) ^ Тир. 100 :