Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика РБФ-карбоксилазы различных по продуктивности форм хлопчатника. Множественные молекулярные формы фермента

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика РБФ-карбоксилазы различных по продуктивности форм хлопчатника. Множественные молекулярные формы фермента"

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ РАСТЕНИИ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН

На правах рукописи УДК 581. 132. 08

МИРЗОРАХИМОВ Акобир Каримович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РБФ-КАРБОКСИЛАЗЫ РАЗЛИЧНЫХ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ ФОРМ ХЛОПЧАТНИКА. МНОЖЕСТВЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА.

(03. 00. 12— физиология растений)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ — 1992

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики растени АН Республики Таджикистан и на кафедре физиологии растений Таджш ского государственного университета.

Научные руководители — доктор биологических наук

м. а. бабаджанова,

доктор биологических наук, профессор к. а. алиев-

Официальные оппоненты — доктор биологических наук

в. л. кал ер, кандидат биологических наук б. x. расулов.

Ведущее учреждение — Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

Защита диссертации состоится « » 1992 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д 013.08.01 в Институте физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан (734063, Душанбе, ул. Айни, 299/2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Индиры Ганди АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан « » 1992 г-

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

р. и. чернер

I. 0БШ1 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В проблеме управления продукцконнпм процессом растений генетнко-селекшюнное совершенствование фотосинтетического аппарата занимает'в настоящее время ведущее место.

ЕБФ-карбоксияаза (КФ 4.1 1.39) является ключевым ферментом фотосинтетической фиксации COg. К настоящему времени большим экспериментальным материалом доказана роль РЕФ-кар-боксилазн в регуляции интенсивности фотосинтеза и ого адаптационных изменений при постоянно меняющихся условиях внешней среды (smiilie, 1962; Bjorkmann, 1966; Андреева, Авдеева, 1970; Андреева и др., 1982; авторы сборника "Физиология растений", 1982; Мокроносов, 1981, 1983; Еабадаанова и др., 1971, .1978, 1984, 1985; Руке, 1985; Leach, 1985; Jrannir, Larry, 1985; Beelord et al., 1985; Здеардс.Уо-кер, 1986; Говиндаи, 1987). Поскольку ведущая роль фотосинтеза в продукционном процессе не вызывает сомнений, то очевидно, что продуктивность растения в значительной степени может зависеть от реального каталитического состояния РБФ-карбоксилазы. Комплексное же изучение структурной организации и молекулярно-кинстических свойств РБФ-карбоксилазы у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходных и гдутантных форм растений не проводилось.

В связи с этим исследование структурных и функциональных особенностей РБФ-карбоксилазы у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности форм растений представляет особую актуальность.

Нель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структурных и функциональных особенностей ЕБФ-карбоксилазн у различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности исходной и мутантной форм хлопчатника.

Для доссниения поставленной цели необходимо было решить следущие задачи:

- усовершенствовать в соответствии с особенностями объекта методику получения электрофретически гомогенных препаратов 1'ешзкта с высокой активностью;

- подобрать оптимальные условия ГДя проявления аг.т:гэ-

ности РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника;

- изучить молекулярно-кинетические свойства фермента

из листьег хлопчатника сорта 108-Ф и его продуктивного Актанта Луплекс;

- исследовать влияние различных условий наделения РБё-карбоксилазы на проявление множественных молекулярных форм;

- изучить зависимость проявления различных молекулярных форм фермента от возраста и условий шрашвания растений;

- на основании полученных данных выявить структурные и функциональные особенности РБФ-карбоксилазы, характерные для продуктивных форм хлопчатника.

Научная ножзна и практическая значимость •работы. Впервые проведены сравнительные исследования молекул^фно-кинети-\jckhx свойств РБФ-карбоксилазы исходного сорта хлопчатника 108-Ф и его мутанта Луплекс, различающихся по интенсивности фотосинтеза и продуктивности. Установлено, что исходная и гдутантная формы хлопчатника не различаются по величине молекулярной массы РБФ-карбоксилазы и полипептидноцу составу больших и малых субъединиц фермента. Различие в структурной организации фер..:ента из обеих форм хлопчатника обнаружены лишь на уровне взаимодействия субъединиц. РЕй-карбоксилаза исходной и цутантной форм хлопчатника различаются по степени и характеру взаимодействия субъединиц фермента между собой в процессе реакции. Более эффективное взаимодействие субъединиц фермента межлу собой у продуктивного мутанта приводит к возрастанию сродстт ЕБФ-карбоксилазы к субстратам., максимальной скорости числа оборотов и снижению энергии активации. Таким образом, выявлены структурные и функциональные особенности РБФ~кар<5оксилаэы, характерные для продуктивной форш хлопчатника.

Впервые обнаружены три молекулярные форш РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника.' По удельной активности и количественному содержанию множественных форм вдтант Дуплекс превосходит исходный сорт. Установлена зависимость проявления различных молекулярных форы фермента от возраста и условий выращивания растений. Эти данные'дают основание полагать, что изменение олигомерного состояния РБФ-карбоксилазы является одним из механизмов регуляции его активности в хло-ропластах.

Обнаружено, что одтант Дуплекс отличается о^ исходного сорта хлопчатника 108-Ф повышенным содержанием водораствори-глых бол ков, большим количеством ЕБФ-карбоксилазы и увеличе -ниегл ее удельной активности. Полученные данные дают основание предложить в качестве физиологического теста при отборе растений для генетико-селекционкых работ содержание водорастворимых белков в экстрактах из листьев и активность ЕБФ-карбоксилазы на.единицу листовой поверхности или сырой массы.

Апробация результатов исследований. Основные положения диссертации доложены на Международной конференции "Итога и перспективыэнзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе " (16-20 сентября, 1991 г., Душанбе); традиционных апрельских конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского госуниверситета (Душанбе,1987, 1989,1990,1991); конференции молодых ученых (Душанбе, 1986, 1991), совместном семинаре лабораторий молекулярной биологии и генной инженерии и молекулярной энэимолопш Института физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан, лаборатории энзимологии и кафедры физиологии растений Таджикского госуниверситета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. ;

Структура и объем тассерташщ. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего работ, в тс;.'! числе иностранных авторов. Диссертация содержит рисунков, таблиц и фотографий.

ЭЮЖЙШЕНТАЯЬНАЯ ЧАСТЬ .

2. УСЛОШЯ И МЕТОДИКА. ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объекта наших исследований был выбран хлопчатник ( Ооззургит Мгзи1;ш> Ь., семейство ша1уасвае ) сорта 108-Ф и его мутант Дуплекс.

Мутант Дуплекс получен Г.Р.Бикасияном и Л.Д.Усшяоадл (1373) посредством гаыда-облучения дозой 15 кшгсглд сука сэмян хлопчатника сор-га 103-Ф. Мутант Душгзкс превосходит исхода:: сорт та интенсивности фотосинтеза на 20Я в расчэто

как на сухой вес, так и на единицу площади листа во все фазы развития растений (Якубова, 1980; Кононенко, 1982). Урожайность у э^ого п^танта на 4,5-10 ц/га выше по'сравнению с исходным сортом 108-Ф (Насыров, 1975; Пинхасов и др., 1Э81;Яру— бова, 1984).

Хлопчатник выращивался с выполнением всех агротехнических мероприятий в полевых'условиях, на Гиссарской опытной станции Отдела общей генетики хлопчатника и на экспериментальном участке Института физиолог;.;! и биофизики растений АН Республики Таджикистан.

Содержание белка в очищенных ферментных препаратах определяли по методу Jloypil и др. ( Lov/ry et al., 1951) без предварительного осаждения ТХУ (Кочетов, 1981).

Активность РБФ-карбокоилазы определяли радиометрическим методом по включению.HI4C0g в кислотоустойчивый продукт реакции в присутствии субстрата - рибулозо-1,5-бисфосфата. Активность фермента выражали в мкмолъ фиксированной СО2 в минуту в расчете на I № белка.

Для получения внсокоочищенных препаратов РБФ-карбокси-лазы брались лнлья 15-25-дневного возраста 3-4-ый сверху, так так ранее было установлено, что они наиболее активно фиксируют углекислоту (Пикхасов, 1981) и обладают наибольшей активностью рибулозобисфосйаткарбоксилазы-оксигеназы (Бабадка-нова и др., 1984). В связи с большим содержанием в листьях хлопчатника фенольных соединений нам пришлось модифицировать методы получения экстракта из листьев и некоторые стадии очистки фермента .(Алиев и др., 1981).

Гомогенность Ферментных препаратов НВФ-карбоксилазн определяли по методу Дэвиса ( Devis, 1964) аналитическим диск-электрофорезом'в градиенте концентраций ПААГ от 5 до 15%,используя трисглициношй буфер рН 8,4 и силу тока 4 мА на одну трубочку при продолжительности электрофореза 2,5 часа. Гель окрашивали раствором амидо черный 10 Б в течение 10 мин к отмывали 7%-шы раствором уксусной кислоты до обесцвечивания фона. ■

Для определения молекулярной массы ЕБФ-карбоксилазы ис-гользогали электрофоретически гомогенные ферментные препараты. В качестве метчиков использовали белки,- имеющие, различные величины .молекулярной"массы..

Полипептидннй состав субъелитш йетепта определяли по методу Кунга и др. ( к^ ег а1., 1974).

Полученные результаты обработаны статистически (Урбах, 1964; Методы биохимического анализа растений, 1978; Лакин, 1980). Представленные данные достоверны при доверительной вероятности 95-98$.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВАШЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

СРАВНИТЕШОЕ ИССЛЭДОВАНИЕ СВОЙСТВ РБФ-КАШЖСИЯАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА 108-Ф И ЕГО МУТАНТА ДУ1ШЕКС 3.1. Определение молекулярной -массы РБФ-карбоксилазц и полипептидного состава субъединкц фермента

. Ранее было установлено,что вдтант Дуплекс превосходит исходный сорт хлопчатника 108-$ по'продуктивности, интенсивности фотосинтеза,скорости транспорта электронов,фосфорили-рованию,генерации восстановительного потенциала,удельной активности РБФ-карбоксилазы,количеству водорастворимых белков и общей фотосинтезиргующей поверхности растений (Насыров,1975; Бабадаанова,1977;Бабаджанова,П1ясов,1984;Бабаджанова и др., 1985;Якубова,1984). Эти данные дают основание полагать об изменении свойств РБФ-карбоксилазы мутанта Дуплекс.

■ Кинетические исследования влияния субстратов на активность ЕБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его цутанта Дуплекс М017Т выявить различия в свойствах фермента меясду исходаым сортом и мутантом.

Для проведения этих исследований .кип были получены электрофоретически гомогенные ферментные препараты РБФ-кар-боксилазы.

А

Б

Еис.1 А. Электрофорез в 7,5% ПААГ РБФ-кар-

боксилазц.

€Ц)

520 кЛа

5,5 5,3

134 кДа

I Б. График зависимости молекулярной г.ассы (м„м.) белков алек-трофоресэтеской

5,1

подвижности ^ .

, 1а 67 рДа

1а\ 67

Молекулярная moca фермента исходного сорта хлопчатника v 108-Ф и гдутанта Дуплекс оказалась равной 520 кЦа.

Методом изоэлектрического фокусирования карбошшеташи-рованной РБФ-карбоксилазы из Устьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф и цутанта Дуплекс установлено, что больше субъединицы фермента из обеих форм хлопчатника состоят из трех типов полипептидов с различными .'Значениями изоэлектрических точек, тогда как малые субъединицы состоят из дцух типов полипептидов (Алиев и др., 1981). .

Таким образом, исходная и мутштная форт хлопчатника-не различаются по величине молекулярной массы ЕБФ-карбоксилазы и полипептидаому составу больших и малых субъединиц ■фермента. .

3.2. Кйнетичеоше исследования ЕЛЙЯШ1Я субстратов на активность фермента, кооперативные эффекты и сродство к субстратам .

Для кинетических исследований влияния субстратов на активность ИэФ-карбоксилазн листьев обеих (Jop-м хлопчатника использовалось оптимальное количество фермента - 100 мкг белка-фермента в I ж реакционной, смеси.

УА

А

, УА

Б

О

О

I 2 3

1 2 3 4. ISaHI4C0s

Рис. 2. Зависимость активности РБФК из листьев Л;

хлопчатника сорта , 108-Ф (I) и-мутанта Дуплекс (2) от концентращи РШ (А) и JaHI4C03 (Б)

Приведенные на рис.2.Л данные показывает, что кривые зависимости от количества рибулозо-1,5-бисфосфата активности РБФ-карбоксилазы обеих форм хлопчатника имеют гиперболическую форц?. Кривая зависимости от кол чества ЯаН^СОд (рис.¿Б ) в реакционной среде активности ЕБФ-карбоксилазы исходной форг® хлопчатника имеет сигмовдную фюргду, а мутанта Дуплекс - сложную форму; наначальном участке форма кривой гиперболическая, затоы через промежуточное плато активность фермента вновь возрастает, с увеличением количества субстрата. Характеров для ЕЕФ-карбоксилазн обеих форм хлопчатника сложные формы кришх насыщения фермента субстратом сввдетельсигуют о наличии кооперативных эффектов при связывании шлевул С02 о ферментом. Это подтверждается величинами коэффициента Хилла, шещиш различные значения в зависимости от концентрации субстрата, что видно из представленных в таблица I данных.

Таблица I

Величины коэффициента Хилла для углекислоты ЕВФ-карбок-силазы листьев хлопчатника сорта 108-ф и его г^утанта Дуплекс

Объект ¡Концентрация Коэффициент

{ ЯаН14С031 10"% . • Хилла,И •

Хлопчатник}

сорт 108-Ф 0,5-2,5 0,25^0,02

2,5-5 3,33.±р,03

Мутант Дупле!«; 0,5-3,5 0,55^0,02

3,5-5 з,ад,02

Из представленных на рис. 1 результатов видно,что ЕЕФ-карбоксилаза ьу.анта Дуплекс значительно превосходит по активности фермент из листьев исходного сорта. Возрастание активности ЕЕФ-карбоксилазн г.^танта монет быть обусловлено изменениями сродства фермента к субстратам и энергии активации.

В табл. 2 представлены данные о величинах ::онстанты. хаэлиса для обоих субстратов ЕБФ-карбсксилаэц из листьев исходного сорта хлопчатника 103-Ф и его мутанта Дуплекс.

Таблица 2

Величины К м(как)й о 5 ^ ойоих субстратов ЕБ5-карбохсилазн из листьев хлопчатника сорта 108-$ и его мутанта Дуплекс

Объект ; С у б с т р а т ы : Ш, : «ГаЯйС03, "

Хлопчатник^ сорт 108-Ф цутант Дуплекс 0,89+0,01 0,36^0,01 1,75^0,01 . 0,95±0,05

Из приведенных.в табл.2 данных видно, что в сравнении с исходным сортом хлопчатника РЕФ-карбоксилаза ьртанта Дуплекс имеет'Меньшую величину константы Михаэлиса."для рибулозо-1,5-, бисфосфата. и^ГаНСОд, что свидетельствует об увеличении сродства с субстратом фермента листьев мутанта.

Данные, полученные в кинетических исследованиях влияния' субстратов на активность РБФ-карбоксклазы^были использованы для расчета числа оборотов одного активного центра фермента обеих форм хлопчатника. "Число оборотов одного активного центра РБФ-карбоксилазы исходного сорта хлопчатника 103-Ф равно. 2,12 молей продукта, образованного за одну секунду, а РЕФ-карбоксилазы мутанта Дуплекс - 3,12. Таим образом, ЕБФ-кар-боксялаза мутанта Дуплекс в сравнении с ферментом исходного сорта хлопчатника 108-Ф обладает более высоким числом оборотов одного активного центра,

3.3. Елияние температуры реакционной среды ка активность РБ5-карбоксаяазы

Влияние температуры на активность РБФ-карбоксилазы из . листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его тфтанта Дуплекс иссле- ■довали с Интервалом 5°С в пределах от 20° до 55°С. Получен^ ные результаты представлены на рис. £ . Как видно из.приведенных на рис.3'Л данных, характер зависимости от температуры активности РБФ-карбоксилазы из. листьев исходной и вдтантной

V

1,0

и —,,—------- 0

20 30 40 50 60 °С

№

0,06

о

-0,06

3,0 3,1 3,2 3,3 3,4

гд х кг3

Рис.3. Зависимость активности РЕФ-карбок^глазн из

листьев хлопчатника сорта 108-Ф (I) и ¡мутанта Дуплекс (2) от температурь; реакционной среди. А - в координатах V .£ , Б - в координатах Аррениуса

форм хлопчатника различается. Максимальная скорость ЕБФ-кар-' боксилазы исходной формы хлопчатника проявляется при температуре реакционной среды 40°С, как и РБФ-карбоксилаза из листьев огурца (Романова и др., 1985 ; Лгатова к др., 1985),'.. при температурах выше 45°С активность фермента снижается.Ак-" тишость ЕБФ-карбоксилазы цутанта Дуплекс возрастает при повышении температуры реакционной среды от 20°С до 30°С,затем активность фермента сохраняется на одном уровне при температурах от 30°С до 45°С, максимальную активность фермент проявляет при 50°С, при 55°С активность фермента из листьов-мутанта Дуплекс резко снижается. При изображении этих данных в координатах Аррениуса (pic. 5Б ) для РЕФ-карбоксилазы исходной формы хлопчатника получена линия о изломом при температуре 40°С, а дня РЕФ-карбоксилазы мутанта Дуплекс - при температуре 35°С. Наличие точки излома на графиках можно объяснить, по-видимоцу, тем, что при различных температурах меняется величина энергии активации фермента, обусловленная изменениями кокформации его молекулы (Диксон, Уэбб, 1982). Полученные данные использовали для расчетов величин энергии активации Е^^ РБФ-карбоксилази из листьев хлопчатника сорта 108-2 и его"мутанта Дуплекс. Величины энергии активации ЕШ{Т РБФ-карбоксилазы для низко-и высокотемпературных областей приведены в табл.3.

Таблица 3

Величины энергии активации 2акт> ЕБФ-карбоксилазы из ;

листьев хлопчатника сорта 108-4 и цутанта Дуплекс *

Объект : Еакт.» кЕй/маль

Хлопчатник сорта 108-Ф 20°-40°С 40°-55°С

I3,4iP,2 24,2^0,3

вдгант Дуплекс 20°-35°С 35°-50°С

10,4^0,1 . 5,1^0,1

Из приеденных в табл.З данных видно, что РБФ-карбок-силаза из листьев одтанта Дуплекс имеет з сравнении с ферментом из листьев исходного сорта меньшую величину энергии активации и в низкотемпературной, к в г.:сокотешературной области. Различия в величинах энергии активации фермента между исходила сортом и мутантом особенно заметны в шсоко-температурной области.

Полученные данные свидетельствуют о том, что возрастание удельной активности РБФ-карбоксилазн мутанта Дуплекс обусловлено снижением энергии активации фермента.

Величина энергии активации ЕКНсарбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в интервале температур 40°-55°С сравнима с величиной энергии активации фермента из термофильной водородной бактерии -26,9 кДж/моль при 50°-55°С (Ем-нова, 1979).

Таким образом, для РБФ-карбоксилазы из листьев исходного сорта хлопчатника 108-Ф и мутанта Дуплекс наблюдается закономерность: при различных температурах 20°-35°С и 35°-55°С меняются величины энергии активации фермента, обусловленные, вероятно, изменениями конформации ее молекулы.

4. МНОЖЕСТВЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРШ РБФ-КАРБ0КС11ЛАЗД ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА

4.1. Изучение влияния различных условий, выделения ферментативных препаратов и проведения ионообменной хроматографии на прояглвние множественных молекулярных форм РБ5-карбоксилазы из листьев хлопчатника

Вопрос о множественных молекулярных формах РБФ-карбок-силазы дискутируется до настоящего времени, так как эти форш обнаруживаются не всеми лсследоваталями. Для всех работ, б которых бнли обнаружены множественные молекулярные формы РБФ-карбоксилазы, характерно проявление этих форм на стадии ионообменной хроматографии (Gibson, Tabita, I977;Py-сикова и др., 1981; Розанова а др., 1985; Ашуров, Романова, 1987). Показана зависимость проявления различных молекулярных форм РБФ-карбоксилазы из листьев мала от условий шделе-ния фермента (Русанова и др., 1981). ЕГоэтоглу iiaj-ш было нзу-

чено влияние различных условий проведения ионообменной хроматографии на проявление множественных молекулярных форм РБФ-карбоксилазы, наделенной из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его одтанта Дуплекс в фазе бутонизации растений.

На рис. Ч, 5'л Б представлена элюция РШ-карбоксилазы при выделении фермента и проведении ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-цоляшозе при рН 8,0 и 8,5 в линейном и ступенчатом градиенте 1."аС1 от 0 до 0,5 М. Как видно из данных, приведенных на pnc.^/¿^S6, фермент лучше элюируется и имеет болъщю активность при рН 8,5 в линейном градиенте ЯаС1.

Полученные наш результаты хорошо согласуются с данными, полученными Н.Г.Русинозойс сотр. (1981) дая РБФ- кар-боксилазы из листьев маша.

При электрофорезе в 7,5^-ном полиакр:-тамидном геле не наблюдается различий в ферментных препаратах, выделенных из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его мутанта Дуплекс. Независимо от рН, при котором выделены ферментные препараты, РБФ-карбоксилаза 1-го пика имеет одну полосу, а П-го пика - две полосы.

Молекулярная масса формы I (пик I) равна 480 *Да, а формы П (пик П) - 520 кДа. Вторая полоса, обнаруженная при электрофорезе фермента из П-го пика, имеет молекулярную массу 60 кДа. Исходя из величины молекулярной массы, моано полагать, что в ходе ионообменной хроматографии происходит диссоциация некоторой части фермента на субъединицы. Следует отметить, что величины молекулярной массы формы I и формы П РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника совпадают с величинами молекулярных гасс множественных молекулярных форм фермента из листьев маша (Щелкова и др. ,1981).

Таким образом, изучение различных условий наделения ферментных препаратов и проведения ионообменной хроматографии показало, что молекулярные (формы РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника в фазе бутонизации растений наиболее четко разделяются при рН 8,5 и линейном градиенте ЯаС1. Но независимо от условий выделения ферментных препаратов и проведения ионообменной хроматографии наибольшей карбокси-лазной активностью обладает форма фермента с молекулярной массой 520 кДа.■

М/щ

з- ч б <? /с /I и/ и ¡г ¿с и ач и.

Рис.4. Элюция РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф 5ли ПРК ионообменной хроттографии на Шо ДЭАЭ-цоллюяозе: А - рН 8,0;

Б - рН 8,5; линейный (I) и ступенчатый (2) градиент от 0 до 0,5 М (фаза бутонизации растений), Б - электрофорез в 7,5^ ПААГ РБФ-карбоксилазы. I пик - П шт.

£0

белок

М1/МА

0,5

¿Ш/С

*Пз

*■ ч б <? /О а ц П (Г и и Л</ и

п

Ч £ #

п

420

5ЛР

¡0 а >Н //■ // Ао И Ц ¿4

Рис.5, Элиция РБФ-карбоксияазы из листьев хлопчатника цутанта Дуплекс при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюяозе: А - рН 8,0; Б - рН 8,5; линейный (I) и ступенчатый (2) градиент ЛаМ от 0 до 0,5 и (фаза бутонизации растений), Б - электрофорез в 7,Ъ% ПААГ РБФ-катэбоксилазц. I пик - П пик.

£0

4.2. Зависимость от возраста растений и условий их ' выращивания проявления различных молекулярных форм РВФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника

В результате многократных выделений в течение ряда лет (1982-1992 г.г.) ферментных препаратов ЕБФ-карбоксдлазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф установлено, что фермент при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлшозе элюируется по— разному: и одним белковым пиком, и двумя белковыми пиками,обладающими карбоксилазной активностью.

Анализ полученных нами данных показал, что проявление множественных молекулярных форм фермента обусловлено физиологическим состоянием растений, т.е. зависит от фазы развития растений и условий их выращивания. На рис.£ представлен ход алвдии РБФ-карбоксилазы, выделенной из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе развития растений 5-6 настоящих листьев или вегетации. Фермент элюируется в виде одного четкого белкового пика, карбоксилазная активность фракции 7 составляет 1,2 мкмоль С02/шн на I мг белка.

При электрофорезе в 7,5^-ном пояиакрклашдном геле фермент проявляется в виде одной белковой полосы с молекулярной массой 520 кйа.

На рис. ? представлен ход элюции РК^-карбо:»силазы, выделенной из листьев хлопчатника сорта 108-Ф в фазе бутонизации растений. Фермент элюируется в виде дцух частей белкошх пиков. Активность РБФ-карбоксилазы из 1-го пика (фракция 5) оказалась равной 1,2, а из П-го пика (фракция 21) - 1,9 мкмол! GOg/f.raH на I мг белка).

. При электрофорезе в 7,5^-ном полиакрплашдном геле фермент из 1-го пика имеет две полосы, а из П-го пика - 3 полосы (рис.?6).

Молекулярная масса белков 1-го пика ранка: верхней полосы - 480 кДа, нижней - 50-56 кДа. Молекулярная масса белков П-пика составляет 520, 180 и 60 кДа (рис.?3).

Полученные результаты дают основание полагать, что под воздействием различной ионной силы происходит диссоциация молекулярных форм РБФ-карбоксилазы на олигомеры с разной молекулярной массой.

Для изучения влияния условий шращрвания растений на

280 нм

2 4 6 8 12 16

£А£ Б

520 кДа РБФКО 480 кД- РБФКО

443 кДа, аппоферршш ^290 глютаматдегкдрогеназа

270 кДа, бычий альбумин, тотрамзр

68 уДа, бычий альбумин 23,8 кДа, трипсин •

Рас.6. А, Здюцкя РБФ-карбоксклазы из листьев хлопчатника сорта 108-ф при ионообменной хроматографии на ДГАЗ-цалшодоза (фаза 5-6 настоящих листьев); Б - электрофорез в 7,55? ПААГ РБФ-карбоксилазы; Б - график зависимости молекулярной массы (ы.м.) белказ

(к Мг 5 м.м. в кДа от их электрофоретической подв!шюоти -

Тшк '¿г мг/м

t.o

oj ■

.i <■—... I...—.1.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Н^1 ч 520 кДа РБФКО В 480 1сДа НБФКО

5,6

5,2 4,8 4,4 4,0

443 кЦа.алпоферритин ^400 кДа 270 кДаХ290 кДа,глма1.тдегадро-бычий ' ron геназа

альбумин, Ч1ки кДа тетрамер

т

sa-st

smo Б

lí 0 <£¡4

\_У

68 кДа, бычий альбумин ..■60 50-56

8 кДа,трипсин

0,1 0,3 0,5 0,7 0,8 Kf

Рис.7. Элюция РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 1С8-Ф при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлйлозе (фаза бутонизации). Б - электрофорез в 7,5$ ПЛАТ РБФ-карбоксилазы I пик-П пик. В - график зависимости молекулярной массы (м.м.) белков \ijMt) м.м. .в-кДа от их электрофоретичес-

' ' кой п0двиин0сти .

Рис. 8. Л - Элюция РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф при ионообменной хроматографии на ДЭАЗ-целлшозе (фаза бу-тонизавди, осенний, период) Б - электрофорез в 7,5? ПМГ РБФ-карбоксилазы I пик- П пик.

проявление множественных молекулярных форм Б5Ф- -карбоксилазы' • был произведен осенний посев семян хлопчатника в августе, и ферментные препараты выделены в фазе бутонизации растений в октябре.

Выделение и очистку ферментных препаратов проводили в / активирующих условиях при рН 8,5, а для элюции фермента при ионообменной хроматографии использовался линейный градиент КаС1. -

На рис. 8 представлена элюция РБФ-карбоксилазы из лис, тьев хлопчатника сорта 108-Ф. Фермент элюируется в вале дцух четких пиков, причем набольший выход белка отмечается дня 1-го пика. Активность фермента из 1-го пика (фракция отмечена точкой) оказалась равной 2,56, а из П-го пика - 1,64 мкмоль ^¿/мин на I мг белка. :

При электрофорезе в ?,5$-ном полиакриламидном геле фермент из обеих пиков имеет по три полосы. Молекулярная ¡асеа белков 1-го пика равна: верхней полосы - 400 кДа, нижних -40 и 32 кЯа соответственно (рис. $ ). Молекулярная масел белков П-го пика составляет.520, 20 и 16 кДа (рис. Исходя из величин молекулярных масс нинвдх полос, мокно предположить, что они представляют собой большие (32-40 кЦа) и малке (16-20 кДа) субъединицы фермента. . .-■". Полученные результаты дают основание полах „ть, что условия выращивания. влияют на. чувствительность форм фермента - к воздействию ионной силы, вследствие этого происходит дис-' социация молекулярных форм РБФ-карбоксилазы или на олигоме-ры с различной молекулярной массой (летний период), или на больше и шлые .субъедшща (осенний период). Влияние т по-шиенных. температур выращивания в осенний период сказалось на появлении формы фермента с молекулярной массой 400 кДа. Представлявт интерес тот факт, что форш фермента с величи-. нами молекулярной массы 410. и 520 кДа выделены при 0° из клеток термофильной водородной бактерии (Романова и др.,1985), причем наибольшей карбоксялазной активностью обладала также форт фермента с молекулярной тссой 410 кДа. Полученные нами данные дают основание полагать, что изменение слигомарно-го состояния РБ&-карбоксияазы в зависимости от возраста и: условий шращивания растений является одним из механизмов регуляции его актишости в хлоропласте.

аШЮЧЕШЕ

Комплексное изучение структурной организации и кинетических свойств РБФ-карбоксилазы исходного сорта хлопчатника 108-ф и его продуктивного мутанта Дуплекс позволило выявить структурные и функциональные особенности фермента, характерные для продуктивной формы растения. Исходная и мутантная формы хлопчатника не различаются по величине молекулярных масс РБФ-карбоксилазы и полипептидаовд составу ее субъединиц, по степени же и характеру взаимодействия субъединиц между собой в процессе реакции наблюдаются значительные различия. .

РБФ-карбоксилаза мутанта Дуплекс имеет более высокие значения коэффициента кооперативности, что указывает на более аффективное взаимодействие субъединиц между собой. Изменением характера взаимодействия субъединиц между собой обусловлено возрастанием сродства фермента к субстратам, максимальной скорости, числа оборотов и сншш.ле энергии активации.

Установлена зависимость от фазы развития растений хлопчатника проявлений множественных молекулярных форм РБФ-карбоксилазы: в фазе 5-8 настоящих листьев выделена одна фора фермента с молекулярной массой 520 кДа, а в фазе бутонизации две - одна с молекулярной массой 480 кДа, другая -520 кДа.

Изучение влияния различных условий выделения ферментных препаратов из листьев хлопчатника в фазе бутонизации растений и проведения ионообменной хроматографии показало, что молекулярные Форш РБФ-карбоксилазы с молекулярными массами 480 и 520 кДа наиболее четко разделяются при pH 8,5 и. линейном градиенте JlaGI. Но независимо от условий выделе^ ния ферментных препаратов и проведения ионообменной хроматографии наибольшей карбоксилазной активностью обладает форт фермента с молекулярной массой 520 кДа.

Из выращенных при пониженных температурах растений выделены множественные формы РБФ-карбокс.'шазы с молекулярными массам;: 400 и 520 к2а. Наибольшей карбоксилазной активность» обладала форма фермента с молекулярной raccoii 400 кДа, что совпадает с литературными даннкш (Ро:.агюва г др., 1985).

Полученные наш данные дают основание полагать, что из-

менение олигомерного состояния РБФ-карбоксилазы в зависимости от возраста и условий выращивания растений является одним из механизмов регуляции его активности з хлоропласте.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована методика шделения ЕК -карбокси-лазы из листьев хлопчатника, позволяющая получить значительно более активные гомогенные ферментные препараты,чем по ранее применявшимся методикам.

2. Подобраны оптимальные условия для проявления кар-боксилазной активности фермента из листьев хлопчатника.

3. Установлены особенности молекулярно-кинетических свойств ЕБФ-карбоксилазы, характерные для хлопчатника. В сравнении с исходным сортом хлопчатника для ЕБФ-карбоксила-зы продуктивного мутанта Дуплекс характерно более эффективное взаимодействие субъединиц между собой, возрастали-1 сродства к субстратам, максимальной скорости, числа оборотов и снижение энергии активации.

Не обнаружено различий по величине молекулярной массы и полипептидноцу составу субъединиц фермента между исходной и кутантной формой хлопчатника.

4. Изучено влияние различных условий выделения фермент-. ных препаратов и проведения ионообменной хро--атографии на проявление множественных, молекулярных форм РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника.

Показано, что молекулярные формы РБФ-карбоксилазы из листьев хлопчатника наиболее четко разделяются при рН 8,5 и лгаейном градиенте $аС1.

5. Впервые обнаружены три молекулярные формы РБФ-кар-боксилазы из листьев хлопчатника. По удельной активности и количественному содержанию множественных молекулярных форм мутант Дуплекс превосходит исходный сорт. Установлена зависимость проявления различных молекулярных форм фермента от возраста и условий выращивания растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бабадаанова М.А., Мирзорахимов А.К., Алиев К.А. Некоторые кинетические свойства рибулозобисфосфаткарбок-силазы листьев хлопчатника сорта 108-Ф него мутанта Дуплекс // Докл. АН Тада.ССР, 1990,-Т.ЗЗ, JS2. -С. 129-132.

2. Мирзорахимов А.К., Бабадаанова М.А., Влияние температуры и pH на активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы-оксигеназы (РВйКО) из листьев хлопчатника сорта 108-Ф и его цутанта Дуплекс // Тезисы докладов У конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. - Ташкент, 1991. -С.203.

3. Мирзорахимов А.К., Бакаева Н.П., Бабадаанова М.А., Лебедева Г.П. Множественные молекулярные формы рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы из листьев хлопчатника сорта 108-Ф

и его мутанта Дуплекс // Тр. конференции молодых ученых. Проблемы биологии'и химии в Таджикистане, 1991. -С.23.

4. Мирзорахимов А.К., Рубцова Т.В., Фархада З.Н., Бабадаанова М.А., Алиев К.А. Карбоксилазная активность и полипаптидный состав РЪФ-карбоксилазы в связи с продуктивностью растений // Докл. АН Тада.ССР, 1991. -T.I2 (в печати).