Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Способы выделения и характеристика изоферментов альдолазы и сорбитодегидрогеназы из некоторых органов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Способы выделения и характеристика изоферментов альдолазы и сорбитодегидрогеназы из некоторых органов крупного рогатого скота"

\\

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ИОГЖССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСШЮ И 3ЛОДКАМ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ икенн К. И. СКРЯБИНА

На правах рукописи

КАРУС Аво Деоевот

СПОСОШ ВВДШНШ И ХАРАКТЕРИСША ЙЗОФЕРМЕНТОВ АНЬДОДАЗЫ И СОРБтШГЩРОГЕНт ИЗ НЕКОТОРЫХ ОРГАНОВ КРУШЮГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

ЛУч /Ш

Работа вшюлвева в Московской ордена Трудового Красного Знамени Бе«вринариой шсздеьш шиш К.И.С1фябаяа

Еаучшй рукаьодгдель: Заслуженный доять науки РС2СР, доктор .бнологглзсках наук, цро^ассор Малахов Л. Г.

(фаргашшо скюноктш доктор шдацапскйх ту;:,

лрофоссор Рудаков В.В. гхвддаг бксшяшсках яаук,

старей научай, согрудп;:;: Л. Л.

Воткал отпаяю вдш. ~ ЗседашиЛ ордена Трурохосо

Крлоиолх) Знаниях; госу/др-^ся^лл . на: нгссь.ут

£Оггр;дпгли::: гфсиаратса '

ЗО

г:ч ьас сдач;;;;: сг-:»и;: п л:,! л■ о £; а:.; о;/ п.с ссс,

А'.осор'лГ!,:; ц^х-ой с^ехмлп; до;ко1;& '¿^ч; "р'- •

гокс-ко!; о\а?-лй ог:, ¡ли^ки-о .Снагд;;::: ло •. 1 _;:\>у-,

„и.!'.Сця.(ГСМ7.-;, .

¿л.Сг.га-гпз^ро.^кюго согагг; С^ Н.А.

шз! 3

ТА ал |

¡ссертаци^ I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Альдолаза и сорбитолдегидрогеназа являются одними из ключевых ферментов разных путей метаболизма углеводов в клетке. Исследование их активности позволяет характеризовать состояние углеводного обмена как в отдельных органах, так и на уровне целого организма, кроме того, поскольку изофарментный спектр сыворотки крови становится похожим на изоферментные спектры поврежденного органа, знания об изоферментных спектрах разных органов и сыворотки крови в норме могут быть использованы в . целях диагностики.

В ветеринарии и аивотноводетве пока имеется мало данных об изоферыентах..Особый интерес представляют органомецифические ферменты такие как сорбитолдегидрогеназа и печеночная и ыыпечная альдолаза. Сведения о физико-химических и биологических свойствах этих ферментов в органах сельскохозяйственных кивотных, в той числе крупного рогатого скота» носят.фрагментарный характер. Имеются лишь единичные работы по выделению альдолаа из скелетных мышц быка ( Еепз1па е* а1,1967) и сорбитолдегидрогеназ из печени быка (Судовцов, Жарцухыыадова, 1987). Работы по выделению и очистке алвдолазы и сорбитолдегидрогеназа из печени и сердца коров практически полностью отсутствуют, физико-химические характеристики ферментов не определены. Разработка эффективных методов выделения и очистки альдолазы и сорбитолдзгиирогеназы может открыть новые возможности для получения биологически активных препаратов и их применения в медицине и ветеринарии.

Цель и задачи исследования. Основной целью наших исследований являлось выделение и очистка до гомогенного состояния альдолазы и сорбитолдзгидрогеназы из сердца и печени коров, определение физико-химических и биологических свойств ферментов из этих источников, а также определение общей активности и изоферыент-ных спектров этих ферментов в сердце, печени и сыворотке крови коров черно-пестрой и красной эстонской пород. |

Для достижения указанной цели было необходимо решить слодую-• щие задачи: I) разработать способ выделения и очистки и получмь препараты альдолазы и сорбитолдегидрогеназы из сердца и почоип коров, свободные от белковых и ¡¡изкоаолакулярьых примесей; исследовать физико-химические и биологические своисгва аль.. долез и сорбиголдегидрогеназ из поречисленнис х'иае источниког;

3) исследовать породные различия активно с гя и изоферментных спектров альдолазы и сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови, сердце и печени коров черно-лесгрой и красной эстонской пород.

йаучная новизна работы. Впервые получены очищенные препараты и определены изоферментные спектры альдолазы и сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крова, сердца и печени здоровых коров черно-пестрой и красной эстонской пород.

Определена молекулярная масса, удельная активность, максимум активности в зависимости от рН среды и температуры для очищенных альдолаз и сорбитолдегвдрогеназ из сердца и печени коров. ' Определены аминокислотный состав и влияние некоторых эффекторов .(ЭДТА, С12) на акгивноеть сорбитодцегидрогеназы.

Практическая ценность работы. На основе результатов исследований разработаны модифицированные методы выделения, очистки и определения биологических и физико-химических свойств альдолазы и сорбитолдегидрогеназы аз сердца и печени коров. Полученные данные об изоферментных спектрах этих ферментов могут быть ■■ использованы в диагностических целях для определения поврежденного органа. Результаты диссертационной работы отражены в проблемной лекции доцента ЭСХА Швшгаа Р. "Энзимы углеводного обшиа", предназначенной для студентов ветеринарного,' зооинже-нерного и агрономического факультетов.

Кроме того, результаты исследований могут быть использованы как исходные в ветеринарной биохимии для характеристики углеводного обмена с.-х. животных.

Адробатад.па^оуы. Основные положения работы доложены на конференции "День науки зооинаенерного факультета ЭСХА, посвященной ведущим эстонским ученым в области животноводства", Тарту, ЭСХА, июнь 1989; научной конференции молодых ученых и специалистов НВА, Москва, ИВА, сен,:.хбр 1988, 1989.

Публкщия результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 2 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 стр. иашинописного текста и состоит аз введения , обзора литературы , собственных исследований , обсуждения результатов , выводов , рекомендации до использовании научных выводов и списка литература , вкличагщего 139 работ ( 50 отечественных и 89 зарубежных авторов ). Диссертация

иллюстрирована 17 таблицами и 26 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕХОЗДШЯ

Экспзриыантальнне исследования проводились на базе кафедры органической и биологичоской химки Московской ЕзторпнарноП академии им.К.И.Скрябина. Часть работы проводилась на база Эстонской сельскохозяйственной академии. Каториалоц исследования' • слуаили сыворотка крови, ткани почеии д саркца 44 ¡шшичаски здоровых коров 1-4 лактации icpacaort эстонской а ч.орно-пестрой пород. Для проведения опытоз предварительно в крупной форма Вазула совхоза "Соотага" Тартуского района Бстонской ССР провели осмотр и клиническую оценку здоровья гакгаруюцих г.ориз 1-4 лактации совместно с зетврачон совхоза .и сформировала 8 групп здоровых коров по принципу аналогов (порода, возраез- а лактациях, одинаковое' содер^анпа и кормление), Кровь у коров брала за д ень до убоя из ярзикой вены чарзз 4-5 часов посла узренного зораленяя. Сизорогку огдэлаяа рт $орцон!ш:: элементов крови ценгрчфук'.рох'аы'лзи з день взятия крова. Кровь дор;-алй при Т° S3°C з гвпзянв 1-2 часов и -цвагрегировали при 8000 з 2343ига SO usgys з получениям аагенолизарованноя ctisoposira ♦ !1асорг.глоа для «сслвдованая служили гакгв гкзна сердца п пзч-э-зги;: короз. Прэлубозаай общий ¡маната скаЗ осмотр прозодада согггэогао с дэтзрачади совхоза и Тзргускох-о лясозочбяячга» Поо-ла у бол куши а знутроаапв органы пододаия«» еплотиш: подергались 2'дагальаоау звгэризарасау осмотр у ;зззрачо:д кенвзмра» . Ткани езрдцз л лзчааа брали uopai 10-13 .»ищу* после забоя ка-зоених ¡13 lapiycKca доеозгобазьев л дезгазяядп з а&боразорао на холоду, гомоггннзпро^адл и лр'лг>о^сдд;:п слС-рэнтк ímwji и сердца о

¿Л, L-ososu гадэлоапя "л водск» ааьдояазы из езрддз а пвчззз короз

.. иотот ассхэдоЕзяая £зрлоага

Зшяденво формата из езрдо'шоз истцы и вечзна проводили но «егоду Скоуаса С Зсарза ,1981) в йьквЗ молода ц:ш* Для asuro цадзеку гкаа» (nesoa.'t п сердца) изиазстаза, добавляли 30 !.•'•' тркс-НСХ бусэра рН 8 ¡0 (150 ил на 100 г кзивльченисп ткаик) и-гомогенизировали. з гомогенизглоро роторного тиг.а при SOCC oC/t,:v-2 р>за ул-íQ азк-зи-л , Го^о^с-.лг :..-... ч-я/.-з >t с.:.,,:

б

марли и центрифугировали при.ЮОООе в течение 80 пин для удалений нерастворимого материала. В супернатанте определяли общий белок, активность альдолазы» иаоферментный спектр альдолазы в подвергали фракционированному высаливанию при полощи сульфата аммония (4Ъ-?0 % нашцания). Общий белок определяли по биурето-вой реакции (сыворотка крови и экстракт сердца и печени ) идя спектрофотомегрическиы методом (Дарбре, 1989) по поглощению при • 280 и 260 вы (в ходе очистки ферментов). Активность альдолазы определяли по модифицированному методу Сибли, Леннинджер 1еу, Ье1т1а5ег ,1949). Иаоферментный спектр альдолазы определяли гистохимический методом (Лойдд и др.,1982) после электрофореза в вертикальной блоке 7,5 % полиакриламидного геля. Осадок, полученный при высаливании, растворяли в минимальной объеме 20 и11 трис-НС1 буфера рН 8,0 и обессоливали на колонке с сефа-денсой с-25 (1,8 х 10 си). Подученный препарат пропускали через колонку с ДЗ&Э-целлюлозой (2 х 15 си), уравновешенной против 20 мМ трис-НС1 буфера рН 8,0 и элюировали тем же буфером (80 ил/час). Фракции, содержащие активный фермент, объединяли и провели .хроматографию на колонке с 1Ш-цезш>лозой (2 х 15 см) в 20 мМ Еа-фосфатном буфере. Для эдюирования альдолазы пользовали аффинное зширование добавлением 0,2 мЫ натриевой соде фруктозодифосфата и полученный препарат альдолазы перекристад-лизовы^али. Бее операции по выделению и очистке альдолазы провели при 4°С. •

2.2. Нэтоды выделения и очистки сорбитолдагидрогёназы'

из сердца и печени коров

Цегода исследования фермента

Выделение фермента из сердечной мышцы и печени проводили по методу Обрайан ( 0'2г1еа ег а!., Ъ83) в нашей модификации. Для этого экстракты ткани готовили вышеописанным методой и в экстрактах определяли общий белок, активность сорбитолдегидро-. гоаазы по методу Герлаха ( Сег1асЬ. Н1Ъу ,1974), изофериент-ный спектр сорбигоддегидрогеназы модифицированным методой Су-довцова (Судовцов, Еармухамедова, 1987) и в экстракты добавляли дизиотреатог до 0,1 мЫ концентрации для стабилизации сорби-толдагицрагеназы. Б хода дальнейшей очистки все растворы.содержали 0,1 мМ дитнотрейюд. Босле фракционирования при гоноши сульфата аммония (40-70 £ васыд.) в обессоливания на колонке с

сафадексом 0-25 (1,8 х Ю см) провели хроматографию аа колонка с ДЗАЭ-целлглозой <2 х 15 см) в 20 мИ трис-HCI буфере рН 8,0 и на колонка с КМ-цедлюлозой (2 х 15 си) в ступенчатом градиенте концентрации Ка-фосфатного буфера рН 6,2 (20-50-70 мМ). Полученный препарат сорбитолдегвдрогеназы пэрекрясталлизовали. Все операции по выделению и очистке сорбитолдегидрогеназы провели при

О чйстоте полученных препаратов ферментов судили: I) по данных электрофореза в 7,5 % лолиаарнламвдном геле и 2) по данный гель-фильтрации на колонке с сефадексом е -200 (I х 50 си).

Молекулярную кассу фериентов определяли галь-филырацией на сефадексе <¡~2ü0 (I х 50 см) я методом электрофореза в денатурирующих условиях (0,1 % додецилсульфат натрия з 15 % разделяющем геле). Препараты фермента для электрофореза с додецилсуль-фатом натрия выдерживали 5 мин при температуре ЮО°С в присутствии 1,5 1» В-меркапгоэганола.

Определение оптимумов рН и температуры адьдолазы и сорбитолдегидрогеназы проводили: I) путем инкубации фериентов с субстратом при различных значениях рН (6,5 - 9,5) субстратной смеси ври температуре 3?°С; 2) путем инкубация ферментов о субстразюя при оптимальном значении рН в температурных пределах от 20 до

Влияние ЭДНА и 2blCI2 на активность сорбитолдегидрогеназы определяли измерением активности сорбитоадегидрогеназы в отсутствии и присутствии ЭДЕА {kZ-ЗФ мкМ) и ZnCI2 (I70-68Ú мкЫ)..

Аминокислотный состав'сорбитолдегидрогеназы определяли на аминокислотном анализаторе AAA-88I (lüJcxoteeina ,ЧССР). Образцы белка гидролизовали в вакууме б Н HCI в течение 24 часов- при Ци°. Аминокислоты разделялись на коленках Ostión- ьокл 0803 0,8 X 62 см) и Ostión lgks U802 (0,7 х 6 си) в цитратном буфере и обнаруживались с помощью нингидринового реагента. Интенсивность окраски измеряли колориметрически при длине волн 370 нм. Стандартом для расчетов служила стандартная смесь аминокислот (до 100 нМ)* . '

Все полученные данные обработаны с использованием метода . вариационной статистики (Лакин, 1990). Достоверность реэульта-; тов определяли по таблицам Стьюдензадлв мьлых выборок.

2.3. Результаты. исследования

'2.ВЛ® Активность и изоферлентаио спектра альдолазы и сорби-юлдзгидрогевьзц ь сиворотко крови, по чан л к сердца

Данные об активности альдолазы к сорбитоддегидрогеназы в сыворотке крови, сердце и г пачзни приведены е таблица I. Из таблицы видно, что активность альдолазы в сыворотке крова не шеег однозначной тенденций к повьааншо или уиевыизниэ с возрастай. Шшимальная активность альдолазы в сыворотке крови наблэдала во »юрой лактации у коров черно-пестрой породи (283 + 52 пкаг/мл) и в гратьей ланхацми у коров красно;-: эстонской порода (¿67^19 цкат/нл). Активность сорбиголдегйдрогаиаэы в сыворотке крови достоверно уцеиызаогся в третьей лактациа у обеих пород (23,0^-3,6 п 35,8+5,1 пкат/ил) и в четвертой лактации у коров красной эстонской порода (13,4 + 1,8 пкат/цл). В сердце черно-пестрой породы активность альдолазы уывньвзлась иь второй и третьей лак-тьциях (3,61 х 1,5 ¡1 7,7 + 0,6 шшт/мл бежа соответственно), а у коров красной ьсмиской породы в тратьей и четвертой дакта- . циях (12,0 1,и и 12,4 ± 1,4 пгмх/иг бздка соответственно). Акгивносгь сорбкгохсагидрогенааи в сердца достигла шшиаука в 5рв«ьви лькгацка (у обеих пород) (4,0 ± 0,5 пкат/иг у красной эстонское порода и 5,2 ± 0,7 пкаг/иг белка у коров черно-пестрой пород«). Б г.эчени коров краевой зстоаскос породы активность, вльдогазк достала ыишшуиа в -ретьей лактации (5,2+0,5 шеаг/цг),

а у ¡¿иров черло-пистрой породи активность альдолазы в печени в •гечание первых трах лактации практически но изменялась. Активность сорбитолдагпдрогоназы б печени коров черно-пестрой породы достигай! каксииуыа в третьей лактации (102,0.£б,4 пкаг/иг). В дочени коров краской эстонской породы активность сорбмголдегв-дрогонаэы тахле уьаяачаваатся к третьей лактации (68,0^3,0 шсьт/иг).

ывпду активность*) альдолазы иа разных источников ке суцз-¿твует достоверной корреляций (?<0,95). Было устаьовлеко, что иакду активностью сороитоддегидрогеиазк в сыворотка крови и в сердце, а ?аклб келду актилнос'жйа» сорб»ииядег:'дрогеназы в сыворотке крови к яачеиа суцесгвуег слабая достоверная связь, равные 0,36+0,14 (Р>0,95). Нами установлена средняя полокнгель-ьая корреляция иеяду активностями альдолазы к сорбитолдегидрогели в сарде, ¡аьнав 0,47*0¿1а (Р> С,99) и в печени 0,31^0,14 (Р>0895).

Таблица I

Активность альдолазь и сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови, сердце и печени коров

Красная эстонская порода_ ! • Чврно-абс?рая_пр_в.рда_

зоэраст !кол-во!активность {возраст I кол-во(активность з лакт. 1коров ¡^.ерцантб 1в лакг. 1короз ¡фермента ¡.1±м

Алыголйзя лкат/ыл пкат/мл

' i 5 367+23 i 8 306 * 32

г Г О 333 + 63 2 5 283 + 52

3 5 26? ± 19 3 5 361 + 28

5 «7 ± 26 4 5 383 ± 34

'). жтгвнат пкьт/ыя: пкат/ял

¿(3,2 + 2,3 1......... ъ 44,6 ±7,0

■ 2 б 46,8 ¿3,2 2 5 47,2 + 3,6

3 5 23,0 ± 3,6 3 5 35,8 ± 5,1

4 5 13,4 * 1.8 4 5 41.6 ±3,9

Саптта

Альгользя шат/мг пкаг/мг

i 5 18,51 1,7 i 8 17,5 ±2,0

2 б 20,1 ± 1,7 2 5 9,6 ± 1,5

'3 5 12,04 1,0 3 5 7,7 ± 0,6

4 5 12,4 ± 1,4 4 . & 21,9 ± 2,6 '

0 о р о л I о л да г и др о г з н а з а п к г г / и г; пкат/ш?

I 5 10,4 ц 1,0 I 8 6,0 ± 0,9

2 б 7,3 ± 0,8 2 ' 5 6,2 ± 1,0

3 5 4,0 ± 0,5 3 5 5,2 ± 0,7

4 5 5,4 ± 1,2 4 5 9,4 ± 0,7

Иэчань

Альдолззз пкат/иг пкат/иг

X 5 хи,1 1 л а 7,4 1 0,Ь

2 6 ' 7,4 0,9 г 5 7,6 ± 0,9

3 5 5,2 + 0,5 3 5 7,6 ± 1,0

4 5 6,6 ^ 0,3 4 5 10,2 £ 0,2

[лригеназа пкы/иг: пкст/цг

> УЧ,4 1 < ,3 ""11 "" И 61,3 £ 6,1

2 . 6 65,3 8,3 2 5 78,8 + в ,8 '

• 3 5 68,8 1 3,0 3 5 . 102,0 +6,4

4 5 25,4 4 У,8 4 5 94,'+ ± _____

В экстрактах сердца содержится одни изофариент альдолазы с относительной электрофоретической подвижностью 0,415. В экстрактах печени содержится также один изоферыент альдолазы с отн. элекгрофоретической подвижностью 0,117. Данные ой изофер-.меитах альдолазы в сыворотке крови приведены в таблице 2. Из таблицы видно, что в сыворотке крови содержатся только оба эти изоферыента. ,

Таблица 2

Изофериентный спектр альдолазы в сыворотке крови коров

Изофермент I Красная эстонская порода 1 Черно-паотрая порода I п « 21 1 х ±ш % I п д 23 I х ±л %

А^ (0,415) 37,9 ± 2,4 35,2 ± 2,5

В^ (0,117) 62,1 ± 2,4 ... 64,8 12,5

Данные о содержании отдельных иаоформ сорбиюлдегидрогена-зы приведены в таблице 3. ^

Таблица 3

Изофераентный спектр сорбитоадегидрогеназы в сыворотке ... крови, сердце и печени коров

I Сыворотка крови I ; Печень I Сердце __!_% 1 Й I ¡о

0,049. 4,8 ±0,3 - -

0,138 4,2 ±0,5 5,3 ±0,5 -

0,177 27,9 ± 1,3 3,7 ± 0,4 .'Г -

0,235 50,5 ± 1,9-^ 86,4±0,9 97,3 ± 0,4

0,240 5,4 ± 0,5 ' Г 4,7 ± 0,6 2,7 ± 0,4

0,300 3,6 ± 0,4 . - -

0,362 3,6 ± 0,4 . . . - . -

В экстрактах сердца выявлены два изофермента сорбитодда-гидригбиазы (огн. злектрофр. подв. 0,235 0,240) и в печени четыре изофермента (отн. эл. подв. 0,138; 0,177$ 0,235} 0,240). В оьгворотке крови коров выявлены семь изофори сорбитолдегидро-хч.:;ааы (0,049; 0,138 ; 0,177; 0,235; .0,240; О.ЗОО-.^Збг), Изо-.

спектр'сорбитолдегидрогейьзы не зависит от породьГи

■ Результаты очистки альдолаэы ив сердечной и печеночной ткани коров представлены в таблице 4. Как следует из данных табли- • цы, фракционирование при помощи сульфата аммония и хроматография на ДЭАЗ-целлюлозе позволили отделить значительную часть балластных белков, но сопровождалось заиетными потерями активности фермента, вследствие чего его удельная активность повысилась лишь в 4,8 и 2,6 раза при выходе 42 и 7 % для альдолаэы иа сердца и печени соответственно.

Таблица 4

Очистка альдолаэы из сердца и печени коров

Стадии очистки (Активность !нкат 1Уде льная ! !активность! !пкат/мг 1 Белок иг 1 Очистка 1 ! х ! ! ! Выхс %

С е р д ц е

Исходный экстракт 27,9 15,2 1841 1.0 100

Фракц.сульф. амм. 16,3 39,7 411 2,6 58

ДЗАЭ-целлюлоза 11,6 66,0 176 4,3 42

Kil-целлюлоза 4,7 2360 2,0 155 17

Перекристаллизация 3,8 . 2400 1,6 158 14

П е ч е н ь

Исходный экстракт 114 7,5 15200 1,0 100

Фракц.сульф.аимония • 55 9,0 6Г20, 1,2 48

ДЗАБ-целлйлоза 8,0 19,6 "408 2,6 7

2Ш-целлюлоза 2,0 43,5 46 5,8 1,8

иврекристаллизация .1,0 46,3 22 6,2. 0,9

Наибольиу» очистку давала хроматография на КМ-целлюлозе в сочетании с аффинным злоированием. После перекристаллизации удалось получить электрофоретически гомогенный белок. Степень очистки составила при этом 158 и 6,2 раза для фермента из сердца и печени коров, выход 14 и 0,9

Результаты очистки сорбитолдегидрогеназь из сердца и печени коров суммированы в таблице 5. Из данных, представленных в таблице, следует, что после фракционирования при помощи сульфата аммония и хроматографии ча ког'нке с ДЭАЭ-целлюлозой очистка • фермента составляла 14 и 13 раз при выходе 62 и 48 $ для сор-битолдегидрогенаэы из сердца и печени соответственно. Хроцыо-графив на КИ-цвллилозе провели в ступенчатом градиенте фис^ат-

його буфера (20 иМ; 50 ыМ; 70 iíM). Очистка фермента на этой зга-пе составляла 120 и 209 раз при выхода 18 и 34 % из печени и сердца. В результате перекристаллизации удалось получить препараты сорбитолдегидрогеназы из сердца и печени ^оров, очищенные в 1740 к 209 раз.

Таблица 5

Очистка сорбитолдегидрогеназы из сердца и печени коров

Стадии очистки !Акгив- !ность !икат •¡Удельная ! ¡активность! !пкат/иг ! Белок иг i Очистка! ! х 1 ' ! Выход QÍ А

Сердце

Экстракт 14 5,8 2400 I 100

Фракционирование

9,7 17,4 560 3,0 69

ДаАЗ-целлюлоза ' 84,0 104 14 62

Ki-целлилоза 4,8 1210 4 209 34

Не рекристаллизация 0,6 20100 . 0,06 1740 4,3

П е ч нь

Экстракт 206 51,3 4010 I 100

Сракц.сульф. аыы. 140 143 980 2,8 68

ДсЗЛЭ-целлалоза 99 662 150 IB 48

KLí-целлюлоза 37 6210 б 120 18

Перекристаллизация 4,3 10700 0,4 209 2,1

В итоге очистки была подучена злоктрофоретически гоыогеннкэ препараты сорбитолдегидрогеназы , с относительной эвектрофороти-

43CKÜÍ1 ПОДБкШЮСГЬЦ 0,23е«.'

Результаты наикх исследований подтвергсдают представления о тон, что аньдолаза я сорбитолдегидрогеназа являются олигоиер-' «ыаи белками. Лодекулярнвя пасса субьединиц адьдолазы была 40000 + 3QOO Дальтон я нативного балка 160000 ± 6000 Дальтон, го ес£ь иолакула альдолази является гетрамероа. Молекулярная иасса субхсдкш'.ци сорбитолдегидрогеназы была 26700 ¿ 1200 Даль-тин ц нативного ф«р.лента II2000 ± 6000 Дальтон, то есть «оленухе. сс^бигоддегкдрогеназы тькжо явлг.зтся тетракероа.___

Cnituyu ]¡ii ддя проявдег.яя ыаксЬаальног активности ильдола-üu сердць й печенк коров равен 7-6 а 7,4 соответственно.

«

Qnimiyu сорбитолдегидрогенааы из сердца и печени равен 9,0 для пршлои и 7,2 для обратной реакции. Температурный опциями аль-додазы из обеих органов составил 37-41°С и.сорбиголдэгидроге-назы кз обеих органов 82-85°С.

Результаты исследований относительно влияния ЭДГА на активность сорбитолдагидрогеназы подтвердили ее принадлежность к ин-гибигораи фермента. При агои ЭДТА действует как конкурентный ингибитор. Исследования влияния ZaCIg на активность сорбитол-дегидрогеназы показали, что активность фаркента повивается при увеличении концентрация ZaCIg и достигает максимума при концентрации 320-350 икЫ. При дальнейшей повышении концентрации. 2a CI2 скорость раакцш уменьшается, 2-е. при высоких концентрациях zaCI2 действует как ингибитор.

Аминокислотный соот&в сорбитолдегидрогеьазы из сердца и печена воров приведен в таблице 6. Нами отмечено, что сорбигол-дэгидрогеназа из сердца и печена коров отличается по содержанию аиинокислот от церыента из печени овец и человека ( Jeffrey et al. ,1981; Uaret, JUuia. ,1988).

Таблица б

Аминокислотный состав сорбиголдегидрогенази из сердца а лечена коров

Аминокислота • 1 Количество остатков на субъединицу ' I сорбитолдагидрогеназы (М = 26700)

Аспарагиновая к-та 2?,0 ± 1,2 (27)

Глутаминовая к-та 33,1 t 0,2 (33)

Серии - 16,3 i 1,0 (16)

Глицин . 27,0 i 1,4 (27)

Аргинин 15,4 ± 1,0 (15)

Траонин 19,4 ± 0,8 (19)

Алании . ' 25,1 ± 0,2 (25)

Тирозин. 7,0 ±0,6 ( 7) .

Валкн 20,5 ± 0,8 (21)

Ыатаонив 2,7 х 0,1 ( 3)

йзолейцшг 13,2 ± 1,3 (13)

Лейцин : 30,4 ± 0,9 (30)

Фенидалания - . II,Г ¿0,4 (II)

Лизин 25,0 i 0,8 (25).

выводы

1. Показано, что активность аяьдолазы в сыворотка крови коров черно-пестрой и красной эстонской пород не имеет достоверных породных различий.

2. Активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотка крови не ииеет породных различий в первых трех лакгациях, в четвертой лактации активность сорбиюлдегидрогеназы в сыворотке крови коров красной эстонской породи достоверно нике.

3. Разработаны модификации способов выделения и очистки аль-додазы и сорбитолдегидрогеназы из сердца и печени коров.

4. В печени коров содеркится только изофермент В^ альдола-зы, з сердце - только изофермент А^. В сыворотке крови содержатся изофераенты А^ и В^.

5. В сердце коров содержатся два изофераента сорбитолда-гидрогэназы и в печени четыре изофериента. В сыворотке крови коров черно-пестрой и красной эстонской пород содержатся семь

из оферентов.

6. Изоферыентньй спектр сорбитолдегидрогеназы в печени, сердце и сыворотке крови здоровых коров не зависит от породы и -

'"возраста, что особенно важно в клинических исследованиях. Относительная активность иаоферывнтов сорбитолдегидрогеназы равнялась: в сердце - 0,235 - 97,3±0,4 ¡&, 0,240 - 2,7±0,4 в печени - 0,138 - 5,В±0,5 %, 0,177 - 3,?i0,4 0,235'-'86,4i0,9 0,240 - 4,7 ± 0,6 в сыворотке крови' - 0,049 - 4,8 ± 0,3 %, 0,138 - ¿±0,5 0,177 - 2?,9±1,3 %, 0,235 - 50,5±1,9, О,¿40 - 5,4±0,5 0,300 т 3,6*0,4 % 0,352 - 3,б±0,4 $.

7. В результате йсследаваний'фйзико-хинических свойств аль-долазы из сердца и печени коров установлено, что: а) молекулы

'альдолаз А^ й В^ являются тетраыераии с молекулярной массой 160000 ± 6000 Да/субьединица - 40000 ± 8000 Ла.} б) олтимуы рЯ фермента 7-8 и 7,4 из сердца и печени соответственно, оптимуа темперьтуры - 3?-41°С. ' " -

8. В результате исследования флзико-хмических свойств сор-'октолдегидрогевазы из сердца и печени коров установлено, что:

a) иолЕкуаа сорбитолдегидрогеназы является тетрааерой_,с молекулярной ыассоа II2000 х 6000 JIa /субьеладица 26700 ± 1200 Да);

b) опгиауи рН ферконта 9,0 «ля пряыой и 7,2 для обратной реак-■

цял; в) оптимум температуры 32~35°С; г) ЭДТА юггпбяруег ахттз-посгь сорбпгоддоглдрогенази; д) £.*~С12 увзлзгашает активность сорбптолдегидрогеназы в налах концентрациях (до 350мкМ Н^С^).

РЕКОМЕЦДАДИИ ПО ИСПОЛЬЗОЗАКШ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

I» Разработашко способ;.! ззвделепзя альдолазн и сорбитол-дегсярогеяази рекомендуется использовать для препаративного

згаеявкан Э1';сс фергонтов из печена а сердца.

2. ГЗэдкфлхшрогай способ определения пзофэрмепгов сорбитод-даптфоговжп ( подучено удостосерешсв 1а рационализаторское хц-г'ужзякз 151 01' 04.12.ОЭ г.),

3. Рвзулызтя исследования по нзучвгш азтшзяооиг л кзо-герг.г.глпл спо^тров швдагезц я сорбяталдектдрогеназы з са-гогот::с> пзогп, сорита я печет: рекочондуется лепользогать з ' 1гд?т»-оЛ а гибкой работе по лзучеЕп» углеводного обцока у г.">г.-г;з.

Стгсок адуактакяшшх по теш дзссерггаш

2, .'..Л, :стзгго-:г*.;,глссг.аа харак-.'зрь'ст^ка ссрФгтоя-I:ип г-кдолопгсД г;. тчоях л с^рло'пга^г зеорел / ,"со:« --'Г^ гг-дегпя: тзт. К,И.Скряблаа. - П. ,1900» - 10 с. -" ■1. Т::ГЛ;'а Л'!. ; сорля ГлЕОГПОГОдегко (сиолокгчзсхко

С; 1С .:•). •< 21? Г-0-90. Опубл. 1330, - 5 8. - С, 5,

I' 7-ус Г:'- С;; п::г;:.:«:осгп: л ггз офертой ¿ах уБ5Л л СбДГ в с;. г: нотага крупного рэг*атого слога

// :;гугл со05пг;о!:огцо?о Эстонской

о?; •а.-г.:о"озя;:г;г "\:нс;1 гсл"-г,е:-?:л„ ппозлг;о:пт"о эстонским

:;--'Ггт.! п ейлг'ог: зпготзогодзтза. - Тарту, 11569.С. 44-45.--0 а :-сас;;сг:оч яп:а;э),'

. Ш;ш?.саио в пзпать 24.X0.S0. Г^лаз ССС - ••Ърж? бОгЗОДб Тпрэк цо

"осквз, Тяпографгя ЕчСХНЛ.1-