Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфичность встраиваний P элемента в локус генов бтш70 D. melanogaster и влияние инсерций на функционирование этих генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Специфичность встраиваний P элемента в локус генов бтш70 D. melanogaster и влияние инсерций на функционирование этих генов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта

на правах рукописи

Шилова Виктория Юрьевна

Специфичность встраиваний Р элемента в локус генов бтшЮ £>. melar¡ogasíer и влияние инсерций на функционирование этих генов

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 г

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник О. Г. Зацепина

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор М. Б. Евгеньев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Пасюкова Е. Г.

(Институт молекулярной генетики РАН)

доктор биологических наук Георгиева С. Г.

(Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН)

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится « 200«$ г. в « < » часов на

заседании Диссертационного совета Д002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан « ^ »

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

рицын А. М.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования адаптация организмов к воздействиям внешней среды — перелазам температуры, в частности, тепловому шоку (ТШ), химическим реагентам, инфекциям и т. д. -представляет значительный интерес для современной биологии. Наиболее универсальной генетической защитной системой, найденной у всех изученных на сегодняшний день организмов, является система генов теплового шока. Кодируемые ими белки (БТШ) выполняют в клетке функции молекулярных шаперонов, предотвращая денатурацию и агрегацию белков. Считается, что главную защитную функцию выполняет высококонсервативное семейство генов, кодирующих белки теплового шока массой 70 кДа (БТШ70). Гены теплового шока очень чувствительны к любым изменениям, затрагивающим их структуру, - мутации, делеции, инсерции мобильных элементов чаще всего негативно сказываются на функционировании этих генов. Соответственно, в большинстве случаев изменения, затрагивающие гены бтш70, элиминируются естественным отбором, а их высокая консервативность поддерживается механизмом внутри- и межлокусной конверсии (ЬЬ-Ного^сг Р., 1981).

Одним из вопросов, привлекающих исследователей, является рассмотрение закономерностей эволюции этого семейства. В литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что эволюция системы генов бтш70 могла идти как путем увеличения числа генов (Гарбуз Д.Г„ 2002), так и путем инактивации некоторых их копий вследствие внедрения мобильных элементов (МЭ) (Ьегтпап О,, 2003; £а&ер!па СЮ., 2001), Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции. Имеются данные, что гены бтш70, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ из-за конститутивно декоцденсированного состояния хроматина таких районов ДНК.

В данной работе была предпринята попытка ответить на вопрос ~ являются ли гены бтиЛО «горячими точками» инсерций МЭ. Исследовали перемещение конструкции ЕР%у2, полученной на основе Р элемента, на модельной системе £>. те1апо£аз1ег. Выявление мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтш70 позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль мобильных элементов в процессах микроэволюции и

адаптации. Р элемент является одним из наиболее хорошо изученных эукарнотическнх транспозонов; в раде работ используется его способность перемещаться в близкорасположенные сайты с увеличением числа копий и сохранением стартового элемента. Такие особенности локальных перемещений можно использовать ln vivo для получения транспозиций в гены 6тш70 методом Р-инсерционного мутагенеза.

Цель работы

Целью данной работы было: выявление специфичности встраивания р элемента в локус, кодирующий белки БТШ70 у дрозофилы; исследование влияния инсерций Р элемента на функционирование генов бтш70; рассмотрение роли различных семейств генов ТШ в адаптации к гипертермии.

Задачи исследования

1) Разработать экспериментальный подход для регистрации и точной локализации инсерций конструкции на основе Р элемента (EPgv2) в район генов, кодирующих БТШ70 Drosophila melanogasíer.

2) Локализовать инсерции EPgy2.

3) Исследовать влияние инсерций EPgy2 на функционирование генов 6тш70 на уровне транскрипции и трансляции.

4) Рассмотреть влияние инсерций EPgy2 в гены бтш70 на термоустойчивость и плодовитость потомства трансгенных линий.

5) Изучить вклад низкомолекулярных белков теплового шока (нмБПЦ) в формирование термоустойчивости на примере трансгенных линий и представителей других видов Drosophila.

Научная новизна и практическое значение работы

Основываясь на описанных в литературе экспериментах по Р-инсерциониому мутагенезу, мы использовали систему скрещиваний, позволяющую получать локальные инсерции Р элемента. В данной работе нами была продемонстрирована возможность использования локальных транспозиций конструкции EPgy2 для выявления предпочтительных сайтов встраивания, с точностью до отдельного нуклеотида.

В работе были выявлены «горячие точки» встраивания конструкции EPgy2 в гены теплового шока. Все ннсерции произошли в промоторную область генов бтиЛО локуса 87А (бтшЮАл н бтшЮАЬ), кроме того, более половины полученных транспозиций было зафиксировано в положения -96, -97 выше старта инициации транскрипции этих генов. Следует отметить, что в природных популяциях DrosophUa совсем недавно (Walser J.C., 2006) получены сходные результаты по наиболее предпочтительным сайтам встраивания полноразмерного Р элемента (2,9 т.п.о.) в гены 6тш70. Т.о., можно считать, что на нашей модельной системе мы вскрыли закономерности, характерные и для природных популяций. Изучение влияния инсерций на экспрессию бтш70 выявило снижение уровня транскрипции у трансгенных линий по сравнению с контрольными. В работе удалось выявить закономерность уменьшения уровня экспрессии в зависимости от места встраивания: чем ближе к старту транскрипции произошло встраивание мобильного элемента, тем значительнее снижается уровень транскрипции гена. Результата одномерного электрофореза показали, что в большинстве случаев уровень синтеза белка, как и синтез РНК, в трансгенных линиях ниже, чем в контрольных. С другой стороны было показано, что инсерции EPgy2 приводят к небольшому повышению термоустойчивости при средних температурах. Проведенные исследования участия разных белков теплового шока в формировании термоустойчивости дают возможность предположить важную роль в этом процессе нмБТШ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены: на международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Ереван, 8-11 сентября 2005); на мездународной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 28 июня — 2 июля 2006); на ежегодных научных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2005,2006).

Объем и структура диссертации Диссертация оосгоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 99 страницах машинописного текста, содержит _2_ таблицы и 22 рисунка. Библиография включает 168 источников.

Результаты и обсуждение

Характеристика системы скрещиваний для получения ннсерцпй конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом /'-иисерционного мутагенеза

В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций EPgy2 в л о кус генов теплового шока, примененная Тимаковым н соавт. при изучении малых генов ТШ (Timakov В,, 2002), с некоторыми изменениями.

В основе разработанного подхода лежат два положения. Первое основывается на известной способности Р элемента к локальным перемещениям с сохранением копии стартового элемента (Tower, 1993; Zhang, 1993). Второе положение основано на особенностях использованной для мутагенеза конструкции EPgy2 (рис. 1). Данная конструкция имеет размер 10908 п.о. и интересна тем, что содержит в своем составе, кроме последовательностей, необходимых для транспозиций (5' и 3' участки Р элемента, включая концевые инвертированные повторы), маркерный ген mini-white, отвечающий за светло-оранжевую окраску глаз дрозофил.

5'P-clcinciit __, TP-element

[OAGWG»M-U*S «rt»»nc» r[

Рис. 1. Схема конструкции EPgy2. Общий размер конструкции 10908 п.о. Стрелками показано направление транскрипции генов. Указанные 5'- и 3'-участей Р элемента включают концевые инвертированные повторы и прилежащие области (Bellen HJ., 2004; http'J/Üybase.bio.ind ¡ana.edu/. bi n/fbidq.htmI ?FB tpOO15947).

Для экспрессии этого гена характерен «дозовый эффект» - увеличение интенсивности окраски глаз насекомых от оранжевой до ярко-красной при увеличении числа копий гена в геноме дрозофилы (Timakov, 2002). Благодаря такому свойству гена mini-while возможен отбор по фенотипу трансгенных мух, содержащих дополнительные копии EPgy2. Ген транспозазы в конструкции отсутствует, поэтому в исходных лабораторных гомозиготных линиях не могут происходить бесконтрольные перемещения Р элемента.

Из центра (Bloomington Drosophila Stock Center) были получены две лабораторные линии D. melanogaster №15616 и №15904 (обозначенные далее как US-4 и US-2), содержащие исходную конструкцию EPgy2 в локусе 87А на расстоянии 8 и 5 т.п.о. соответственно от старта транскрипции гена бтшЮ АЬ в разной ориентации (рис.2). Также была получена линия №1429 (обозначена далее как Д2-3), несущая ген транспозазы Р элемента.

5' EPgy2 з*

CG3I21I «лвитоа* бтш70аь CG32S! виг

СС12213 СС1Ш?

1кь <; . . I

1" ЕР&2 5'

Рис. 2. Расположение исходной конструкции ЕР&2 в линиях Ш-4 (в положении +243 относительно старта транскрипции гена С012213) и 115-2 (+33 относительно старта транскриции гена аиг) О. те!апо$а$1ег. Стрелками указано направление транскрипции генов.

ГО ? $ у уу/у п;ЕР&2?ЕР&2 * <56 +/Г; ТМЗ,8Ь Л2-3/В/(ЗЯ) С7 (линия Ш-2, Щ-4) \ {линия Д2-3)

П $ 9 ^ и-/> и> х ¿<$ у *>/};ЕР&2/ТМЗ, ЯЬ Л 2-3

(линия 1 )н1,у\*/7с3}а>) ^ (мозаичные глаза)

индивидуальные скрещивания

Г2 %% у к/у п х $$уме/У;ЕР&2/+

(линия £>/(1(светло-желтая окраска глаз)

<$<3 у к/У;ЕРцу2*/+

^ усиленная окраска глаз (оранжевая или ярко-красная) предположительно транспозиции ЕР%у2 дальнейшая индивидуальная проверка, и, в случае отсутствия расщепления по интенсивности окраски глаз, выведение

Рис. 3. Генетические скрещивания, проведенные для получения локальных перемещений конструкции ЕР&2. Указан генотип исходных и трансгенных линий, а также основные принципы построения генетического отбора. Знаком * отмечены самцы с дополнительными копиями ЕРцу2 в геноме

Самок из линии иЗ-4 или и£>-2 скрещивали массово с самцами из линии ¿2-3, несущими ген транспозазы (рис.3). У особей Р], несущих в гетерозиготе этот ген, происходит интенсивное перемещение конструкции ЕР^у2 как в половых, так и в соматических клетках. Фенотипически их можно отличить по мозаичной окраске глаз,

обусловленной содержанием разного числа копий гена mini-white, входящего в состав конструкции, в отдельных клонах клеток глазных имагинальных дисков. Таких самцов F] индивидуально скрещивали с белоглазыми самками лабораторной линии Df(l) (у w/y н>) и анализировали их потомство по признаку окраски глаз. Появление дополнительных копий EPgy2 в геноме самцов F2 фиксировалось по более интенсивной окраске глаз, от темно-оранжевой до ярко-красной. Таких самцов Fj также скрещивали индивидуально с самками линии Df(l) чтобы отобрать случаи внедрения EPgy2 в ту же хромосому, в которой находилась исходная конструкция. Об этом свидетельствовало отсутствие расщепления по окраске глаз в их потомстве. От этих самцов были получены линии для дальнейшего анализа, Для линий, выведенных из US-4, нами показано, что общая частота перемещения конструкции составляет 7,5%, для линий US-2 — 4,9%, Некоторые линии, в которых по результатам дальнейшего анализа выявили инсерции в гены бтт7% были выведены в гомозиготное состояние.

Идентификация инсерциП EPgy2 методом Саузерн-блот анализа

Анализ проведенных скрещиваний позволил отобрать линии с дополнительными инсерциями EPgy2 в той же хромосоме, что и стартовый элемент. Для того чтобы определить, произошло ли встраивание EPgy2 в какую-либо из шести копий гена бтшЮ, был проведен Саузерн-анализ геномной ДНК трансгенных линий. При обработке геномной ДНК D, melanogaster парой рестриктаз BamHI/Hindlll образуется набор фрагментов разной величины, специфичный для разных копий гена бтш70 (рнс. 4 а, б, в). Использование данных рестриктаз и последующая гибридизация с зондами к 5' и 3' участкам гена бтшЮ позволяет выявить изменения, происходящие с разными копиями гена бтш70 (рис. 4 а, б, в).

Поскольку конструкция EPgy2 содержит на 5' и З'-концах сайты для рестриктазы Hindlll (рис. 4 г), то появление инсерций в генах бтш70 в гетерозиготных линиях фиксировалось как появление низко молекулярного дополнительного фрагмента гибридизации. При этом наблюдалось уменьшение интенсивности гибридизации той копии гена бтш70, в которую произошло встраивание. При выведении линий в гомозиготное состояние, картина гибридизации становится более четкой: полностью исчезает фрагмент, соответствующий копии гена с инсерцией EPgy2t и увеличивается интенсивность гибридизации нового фрагмента. Нами не было зафиксировано ни одного случая внедрения конструкции в 3'-кодирующий или фланкирующий участок

бтгиЮ (рис. 4 б); все встраивания произошли в 5'-район генов бтъиЮ, расположенных в локусе 87А—бтш70 Аа, Ab.

Рис.4в

«»чршм _3.3t.ivo. ВЬ + ее —2.5 т.п.о. Ал —2.1 т.п.о. Ва •*Н —1.Вт.п.о. АЬ

t

tt í t

Рнс.46

Phi. 4 в

Рнс.4г

Н 2 Т.П.О.

Рис. 4. Саузерн-анализ геномной ДНК линий с дополнительными копиями конструкции EPgy2 (рестрикция BamWVHindyW), а. Гибридизация с 51-фрагментом гена бтш70 D. melanogasíer. Стрелками показаны линии, несущие инсерцни EPgy2 в разных копиях бгти70 (Аа и АЬ). Справа указан молекулярный вес фрагментов гибридизации, специфичных для разных копий бтгиЮ. б. Гибридизация с 3*-фрагментом гена бтш70 D. melanogasíer. Одинаковый характер гибридизации для всех линий свидетельствует о том, что инсерции EPgy2 в 3'-участок генов бтш70 отсутствуют, в. Схема сайтов рестрикции BamHl и Hindlll генов бтиЛО, расположенных в локусе 87А (бтш70 Аа, АЬ) и 87С (бтш70 Ва, ВЪЬ, Bb, Be) (Gong and Goüc, 2004 ); сайты рестриктаз BamHl и Hindlll обозначены серыми треугольниками, г. Рестрикционная карта конструкции Epgy2. Размер EPgy2 составляет 10908 н.п.

Нами было зарегистрировано 31 встраивание EPgy2 в гены бтш!й из 375 локальных перемещений конструкции для линий, выведенных из US-4, и 14 иксерций для линий, полученных из US-2 (из 160 проанализированных локальных перемещений). Дальнейшая локализация инсерций EPgy2 проводилась методами ПЦР и секвенирования полученных ПЦР фрагментов (см, ниже). В нескольких случаях проведенный нами Саузерн-анализ трансгенных линий выявил нестандартные

фрагменты разного размера, гибридизующиеся с зондом к 5*-району гена бтш70. В результате дальнейшего анализа было показано, что появление дополнительных фрагментов гибридизации в десяти трансгенных линиях связано с перестройками геномной ДНК: вместе с конструкцией ЕРёу2 происходило также перемещение прилежащего участка ДНК размером от 700 п.о. до 9500 п.о.

С помощью Cayзерн-анализа было выявлено, что все инсерции EPgy2 происходят в 5'-районы геиов бтш70 локуса S7A. Для точной локализации места встраивания были проведены полимеразные цепные реакции с разным набором праймеров и секвенирование полученных фрагментов. На рис. 5 изображена схема расположения генов и соответствующих праймеров в локусе 87А (праймеры показаны маленькими стрелками в направлении от 5' к З'-концу).

Рис. 5. Схематическое изображение праймеров, использованных для локализации инсерций ЕРду2 в генах бтиЛОАъ и бтш70АЬ в трансгенных линиях. Праймеры показаны маленькими стрелками под соответствующими номерами; все стрелки указывают направление транскрипции (от 5' к 3' концу).

В начале, для подтверждения результатов Саузерн-гибридизации, для всех линий была поставлена ПЦР с праймерами из 5' гена бтш70, направленными внутрь и наружу гена (номер 1, 2), и из инвертированного повтора конструкции (номер 5). Были получены положительные результаты для праймеров № 5 и 2, т.о. конструкция встраивается в регуляторную область бтшЮ, Ориентация ЕР^2 и точная локализация были установлены с помощью ПЦР с внутренними праймерами из 5' и 3' концов ЕР&2 (К® б, 7) и праймером из гена бтшЮ №2. На рис.6 приведен пример ПЦР для нескольких разных линий.

Точная локализация полученных инсерций EPgy2

EPgy2

7 EPgy2 5

123 4 5 6789 10 И М

Рис. 6. Локализация инсерций и ориентации конструкции EPgy2 методом полимеразной цепной реакции, а. - амплифицированные фрагменты геномной ДНК трансгенных линий, синтезированные с помощью разных праймеров. Праймеры 2-7: 1 —линия 3111а, 2 - Slid, 3 - 11 lila, 4- lila, 5 - 1341b; праймеры 2-6: 6 - lila; праймеры 5-53: 7 - 3 Ша, 8 - 5IId, 9 - 1 lilla, 10 — Ша, 11 - 1341b. б. — схематическое изображение встраивания EPgy2 в промоторную область гена б/ш«70Аа и праймеров, использовавшихся для локализации инсерции.

На дорожках 1-5 представлены результаты ПЦР для пяти разных трансгенных линий с праймерами из 5'-конца бтшЮ (№2) и из З'-конца EPgy2 (№7). Разный размер синтезированных фрагментов свидетельствует о разных местах встраиваний.

Саузерн анализ показал, что инсерции EPgy2 происходят в 5'-регуляторную зону генов бтш70 Аа и АЬ. Для подтверждения транспозиции в ту или иную копию гена бтшТО были поставлены ПЦР с праймерами из 5'-кодирующей части бтшЮ наружу (последовательность идентична для обеих копий гена бтш70 Аа и АЬ) и праймерами из 5' и З'-участков EPgy2 (№6 и 7). Соответственно, синтезировались фрагменты размером 2.5 и 0.5 т.п.о. В качестве примера приведена картина ПЦР для линии Ша (на рис. б а. дорожки 4, б). Секвенирование показало, что фрагмент размером 2.5 т.п.о. соответствует межгенному участку, примыкающему к гену бтш 70 АЬ (см. схему на рис, бб.) Т.о., рассмотренная инсерция произошла в регуляторный район гена &т«70Аа.

Использованный нами метод Р-инсерционного мутагенеза был основан на способности Р элемента к локальным перемещениям с сохранением копии стартового элемента. Для подтверждения того, что в трансгенных линиях с дополнительными

инсерциями ЕР§у2 стартовый элемент остался на месте, были проведены ПЦР с праймерами из концевого инвертированного повтора конструкции и из гена, ближе всего расположенному к стартовому элементу (С018347 для иЗ-4 и аиг для \JS-2). Как видно из рис. 6 а. (дорожки 7-11), у разных линий синтезируются фрагменты одинакового размера, т.о. потери исходной конструкции не происходит. Данная реакция была поставлена для всех проанализированных линий, не было выявлено ни одного случая потери исходной конструкции ЕР^2.

ПЦР с праймерами из инвертированного повтора конструкции (Х°5) и из гена бгтиЮ, направленными внутрь и наружу гена (№3, 4, 1), было подтверждено, что ни в одном случае не происходит инсерций в кодирующую и 3'-фланкирующую области бтшЮ. Также нами не было зафиксировано ни одного случая встраивания ЕР&2 в локус 87С, содержащий четыре копии гена бтш70 (бтш70 Ва, ВЬ, БЬЬ, £с). Возможно, это объясняется удаленностью этого кластера генов от стартового элемента.

Анализ трансгениых линий, полученных из иЗ-4 и иЭ-2 показал, что во всех случаях транспозиции ЕРёу2 происходят с переворотом по отношению к стартовому элементу (рис.7), преимущественно в промоторную область генов бтшЮ между -28 и -240 п.о. выше старта транскрипции. Проведенный анализ выявил «горячие точки» встраиваний ЕР&2\ 59% всех инсерций для Ш-4 и 40% для иБ-2 происходят в одну и ту же область промотора - выше -96 и -97 п.о. от старта транскрипции. Результаты по локализации инсерций ЕР%у2 в гены бтгиЮ трансгенных линий представлены в табл. 1.

Встраивание ЕР^у2 исключительно в 5'-область генов бтшЮ можно объяснить свойствами Р элемента и особой организацией промоторной области генов теплового шока. Из литературы известно, что предпочтительным местом встраивания Р элемента являются регуляторные области генов (ЗргасН^, 1995), преимущественно несколько сотен п.о. от старта транскрипции генов (Ыао, 2000). Данная работа подтверждает эти факты: даже несмотря на более близкое расположение З'-конца бтшЮАЪ к стартовому элементу (см. рис. 2, 7), инсерции зафиксированы только в 5'-области генов. Интересно, что более 80% инсерций в линиях и5-2 произошло в бтшЮ Аа - ген, наиболее удаленный от стартового элемента (рис.7). В линиях, полученных из и8-4, транспозиции носят более обычный характер (57% в б/нш70Аа и 43% в бтиЛО АЬ).

линия Ша 21а* Slid ЗОПЬ 3111а 481а 6011а* 611b 861 9911а*

локализация -97 -97 -96 -135 -96 -240 -96 -97 -230

ген Аа Аа Аа АЬ Аа Аа Аа Аа Аа

линия 1051g 11111а 12111 1231а 1341b 1631а 1691* 1771 1791 1841

локализация -96 -97 ? -135 -28 -97 -97 -96 -97 ?

ген Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа

линия 1861Ь 2441а* 2461 2531а 2531b 25811 2841а 2881а 2881b 2881с

локализация -42 ? -135 -97 -97 -135 -97 -40 -40 -40

ген Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа Аа

линия 288Id 2881е 2881k 295II 3091b 310II 33211* 33211b* 3691 377II

локализация -40 -40 -40 -97 -42 -137 -97 -97 -144 -174

ген Аа Аа Аа Аа АЬ АЬ АЬ АЬ Аа АЬ

2.

линия аЗИ* а91Ь а211Ь* 0331b а341 а791а а 1961а A200I 01981

локализация -97 -229 -200 -97 -96 -135 -135 -96

ген Аа Аа Аа АЬ АЬ Аа АЬ АЬ

линия а! 981 а2501а а 13811а 14811а о196Н о2271 (X120I* а!211*

локализация -160 -135 -97 -96 -40 -135

ген Аа Аа Аа Аа АЬ АЬ

Табл. 1. Сводная таблица локализации сайтов инсерций EPgy2 в гены бтш70 трансгенных линий, выведенных из исходных линий US-4 (1.) и US-2 (2.). Знаком * обозначены линии с перестройками геномной ДНК. В строке «локализация» обозначены сайты внедрений конструкции EPgy2 в гены бтш70 относительно старта транскрипции.

Промоторные районы генов бтш70 обладают рядом свойств, делающих их уязвимыми для инсерций: в них отсутствует нуклеосомная организация и хроматин находится в деконденсированном состоянии. «Горячие точки» встраивания EPgy2, нуклеотвды -96, -97 выше старта транскрипции генов бтш70, также располагаются в особой области промотора. In vtvo ДНК промоторных областей б«ш70 находится в связанном состоянии со многими белками (GAF, TBF и др.), поддерживающими «открытую» структуру хроматина. Белки GAF способны взаимодействовать друг с другом таким образом, что хроматин как бы оборачивается вокруг нескольких GAF (Georgel, 2005), при этом определенные участки ДНК оказываются «открытыми». Нуклеотиды -96, -97 находятся в центре такого участка ДНК (с -80 по -lit п.о.),

образованного GAF. Подтверждением открытой структуры этой области является чувствительность к воздействию ДНКазы! (Farkas G., 2003). В про моторной зоне бтш 70 существуют и другие аналогичные структуры, но гораздо меньшего размера (между -109 и -100 п.о. располагается второй ДНКаза1-чу вствительн ы й сайт (Weber, 1997)).

Известно, что Р элемент предпочтительно встраивается в районы ДНК с повышенным содержанием CG-пар (Liao, 2000). Нами был выявлен 8-нуклеотидный сайт дупликации в месте инсерций EPgy2\ CGGCGCAC при транспозиции в положение -97 выше сайта инициации транскрипции и GGCGCACT при транспозиции в положение -96. Т.о. предпочтительное встраивание EPgy2 в ¿'-область бтш70 и наличие «горячих» сайтов инсерций можно объяснить совокупностью многих факторов.

57*/»

исходная конструкция

ЕРцу2

US-2

исходная

конструкция EPgy2

-240

е-

б. .

-174

I

ft

-144-137

-^(12)

-42(2) -28

II

■EHHHi—вшем-

Хб) -К

+1

-229

•200

I I

-н

-135(4) -97(3)

■ВНН-О—«и

-160

t

-96(3)

-40

ПИ

Рис. 7. Результаты анализа трансгенных линий, а. Процент встраивания конструкции EPgy2 в гены йгиш70Аа и бтшЮАЪ в трансгенных линиях, полученных из US-4 (слева) и US-2 (справа); указана ориентация новых копий EPgy2 относительно исходного элемента, б. Сайты инсерций EPgy2 в генах бтиЛО (суммарно для &мш70Аа и бтиЛОАЬ) для линий, полученных из US-4; цифрами указан нуклеотид, выше которого произошло встраивание (относительно старта транскрипции гена бгтиУО); в скобках указано число зафиксированных инсерций в данный сайт, в. Аналогичные результаты для линий, выведенных из US-2. Условные обозначения: Т — ТАТА-бокс, Н — HSE (heat shock element), G — сайт для связывания GAF (GAGA-factor).

Большинство инсерций EPgy2 . в промоторкые области единичны; мы зафиксировали лишь два случая двойного встраивания - в линиях а1981 и 3011b. В обоих случаях двойное встраивание выявлено по результатам Саузерн-гибридизации. Методами ПЦР и секвенирования полученных фрагментов было установлено, что в линии а1931 произошло внедрение EPgy2 в разные места 5*-регуляторных районов генов бтш70 (выше -160 п.о. гена Аа и -96 гена АЬ). В линии ЗОПЬ инсерции были зафиксированы выше -96 п.о. от старта транскрипции генов бтш70 Аа и АЬ. Получение гомозиготной линии ЗОПЬ давало возможность исследовать влияние большой вставки (20 т.п.о.) на морфологию пуфа, образующегося в локусе 87А, содержащем гены бтш70Аа и АЬ. Особое расположение генов бтш70 Аа и АЬ в виде сближенных инвертированных копий важно для быстрого начала транскрипции этих генов в условиях ТШ, поэтому изменение морфологии пуфа может иметь существенное влияние на характер функционирования генов бтш70, Интересный результат был получен при рассмотрении связывания фактора транскрипции HSF при тепловом шоке с промоторной областью генов бгтиЮ. По результатам иммун©флуоресцентного окрашивания хромосом, проведенного в лаборатории С.Г. Георгиевой, было установлено, что при активации транскрипции генов ТШ происходит изменение структуры пуфа в локусе 87А линии ЗОПЬ по сравнению с контрольной линией Oregon R, В контрольной линии две инвертированные копии гена бтш70, расположенные в локусе 87А, при тепловом шоке образуют одиночный пуф, тогда как в линии ЗОПЬ этот пуф становится двойным (рисунок не приводится), т.о. происходит физическое отдаление двух копий гена бтшЮ локуса 87А друг от друга. Также нами был исследован характер распределения РНК-пол и меразы II в локусах генов ТШ 87А и 87С. Анализ не выявил изменений в линии ЗОПЬ по сравнению с контрольной линией. Результаты исследования последствий внедрения EPgy2 на уровне транскрипции и трансляции подробно изложены ниже.

Успешность получения транспозиций EPgy2 в локус генов бтшЮ связана с активностью используемой транспозазы в клетках зародышевого пути и с экспрессией генов бтш70 на ранних стадиях сперматогенеза (Lakhotia, 2002). В наших экспериментах инсерции происходили как на ранних премейотических стадиях гаметогенеза, так и на постмейотических стадиях, Премейотическое встраивание конструкции EPgy2 доказывается выявлением идентичных инсерций у нескольких потомков в каждом из двух индивидуальных скрещиваний, из которых, соответственно,

были выведены группы линий 2881 (а, Ь, с, d, е, к) и 332 (II и ПЪ). Во всех остальных случаях были выявлены единичные потомки индивидуальных скрещиваний, содержащие дополнительные копии EPgy2, что говорит о преимущественном встраивании на постмейотнческой стадии.

Нами были также поставлены ПЦР для выявления возможных инсерций EPgy2 в близлежащие гены в локусе 87А. В четырех случаях для линий, выведенных из US-2, были зафиксированы ннсерции в разные положения кодирующей области гена CG3281; при анализе линий, выведенных из US-4, были выявлены 2 случая транспозиции EPgy2 в гены аиг и CGI8347. При этом преимущественного встраивания в промоторные области этих генов обнаружено не было.

Влияние инсерций Epgy2 на уровень транскрипции бтиЛО

Инсерции МЭ могут по-разному влиять на экспрессию генов. Последствия внедрения МЭ особенно важны при исследовании генов бтш70 — основного семейства генов, обеспечивающего адаптацию организмов к определенным экологическим условиям. Из экспериментальных работ (Zatsepina OG, 2001; D.N. Lerman, 2003; Lerman D.N,, 2005; Michalak P., 2001) известно, что в природе встречаются популяции Drosophila, содержащие инсерции МЭ в промоторных областях генов бтш70. Описанные инсерции нарушают нормальное функционирование тех копий генов бтш70, в которые произошло встраивание. Представляло интерес оценить влияние встраиваний EPgy2 в гены бтм70 на уровень транскрипции этих генов.

В результате проведенной Нозерн-гибридизации (рис. 8) нами было зафиксировано снижение уровня синтеза тотальной мРНК бтш70 в гомозиготных трансгенных линиях ЗОПЬ (двойное встраивание в гены Аа и АЪ в положение -96), 1341b (встраивание в положение -28 в район ТАТА-бокса) по сравнению с контрольной линией US-4. Как видно из рис. 8, после получасового ТШ при температуре 37°С суммарное количество тотальной мРНК бтшЮ (имеется ввиду транскрипция генов группы бгти70А — Аа, АЬ и группы 6imи70В — Ва, Bb, ВЬЬ, Вс) составляет 75 — 85% от уровня транскрипции бтш70 в контрольной линии US-4. После 12-часового периода восстановления уровень тотальной мРНК бтш70 трансгенных линий составил 30—40% по сравнению с контрольной. Количество синтезированной мРНК бтш70 оценивалось денситометрически, в качестве контроля был использован ген актина. На нижней части

рис. 8 приведена картина гибридизации РНК линий 118-4, ЗОНЬ, 1341Ь с ПЦР-зондом к центральной части гена актина.

Контроль ТШ ТШ+12ч

12 3 4 5 678?

актин

мРНК бтш 70

ч- о о

г; qq

IS I 3

ц S Д ■ч:

о о о о

Рис.8. Уровень синтеза тотальной мРНК бтш70 в трансгенных линиях. 1-3 контрольные условия+25°С; 4-6 ТШ(+37°С 30 мин); 7-9 через 12 ч после ТШ. 1,4,7 - US-4; 2, 5, 8 - 1341b; 3, 6, 9 - 3011b. Верх рисунка - гибридизация с Cla/BamHI фрагментом гена бтш70 D. melanogaster; низ — гибридизация центральной частью гена актина D. melanogaster.

Снижение уровня синтеза РНК в трансгенных линиях было подтверждено методом количественного ПЦР в реальном времени (quantitative real time PCR) с праймерами, позволяющими различить группу генов бтш70А и бтш70В. На рис. 9а приведена картина экспрессии генов бтш70А после 30-минутного ТШ при температуре +37°С и 30 мин восстановительного периода при температуре +25°С, нормализованных относительно рибосомального гена гр49. Проведенный эксперимент позволил выявить зависимость снижения синтеза мРНК от места встраивания (рис. 96). Промоторные области бтш70 особенно чувствительны к инсерциям в область HSE (heat shock element); эта последовательность обладает свойствами термоиндуцнбельного энхансера и служит местом связывания факторов транскрипции генов Т1П - HSF. У D. melanogaster в регуляторной области генов бтшЮ содержится 4 HSE (Jachansan А., 1987). Мутации, затрагивающие HSE, или встраивания между этими элементами, особенно между HSE1 hHSE2, могут существенно снижать уровень транскрипции гена.

Нами было показано, что при инсерции EPgy2 в район ТАТА-бокса (положение -28) уровень транскрипции двух генов локуса 87А, йш«70Аа и Ab, составляет лишь 44% по сравнению с контрольной линией (уровень синтеза мРНК в линии US-4 принят за

100%); при инсерции в район -42 эти гены функционируют только на 51%; при двойном встраивании в положение -96 (линия ЗОПЬ) - на 52%. Согласно полученным данным можно предположить, что при встраивании ЕР&?2 в ТАТА-бокс (положение -28) и в положение -42 (между ТАТА-боксом и Н5Е1) один из генов группы бтш70А перестает транскрибироваться; при двойном встраивании, скорее всего, существенно нарушается транскрибирование обеих копий гена бтш70.

относительное количество мРНК бтиЛОК

Ш-4 Ш1Ь 1861Ь ЗОПЬ Ша 11111а «341 33111 1231а 31011

6.

31% 71% 57%

5!% 44%

-240 -174 -137 -135 -97 -42 -28

г—I ■!— I 1—ц—1 I лттН

1 Н5Е4 Г" I ШЕЗ 1Т А Н5Е1 Ц Н5Е1 М ТАТА | '

-144 -96

97%

Рис. 9, а. Относительная экспрессия генов бтш70А (Аа и АЬ) в трансгенных линиях, определенная методом количественного ПЦР в реальном времени. В качестве контроля представлена линия 1)5-4. РНК была выделена после ТШ (+37°С 30 мин) и последующего периода восстановления (+25°С 30 мин), б. Процент синтеза мРНК бтш70А трансгенных линий относительно контрольной (принят за 100%) линии иЗ-4. Цифрами указан иуклеотид относительно старта транскрипции гена бтш70, выше которого произошло встраивание.

Наиболее критичными оказываются встраивания между Н8Е1 и ТАТА-боксом. При инсерциях в область -134, -144 п.о. от старта транскрипции уровень синтеза РНК составляет соответственно 81 и 97%. Таким образом, чем ближе к старту транскрипции происходит встраивание, тем существеннее снижение уровня синтеза РНК генов бтш 70.

Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях

Влияние инсерций EPgy2 на уровень трансляции генов бтш70 в траксгенных

линиях было оценено по результатам одномерного и двумерного электрофореза белков.

Количественная оценка накопления и иду ци бель но го БТШ70 после ТШ была

получена с помощью иммуноблоттинга с соответствующими антителами (7 FB),

Результаты для некоторых трансгенных линий представлены на рис. 10.

1,40 1,30 1,20 1,10 1,00 0,90 0,S0 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

б.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

Рис. 10. Количественный анализ накопления БТШ70 в линиях с инсерциями EPgy2 в гены бтш70. л. Относительная концентрация БТШ70 (ось ординат) в трансгенных линиях сразу после ТШ (37°С 30 мин) и через 30 мин после ТШ. б. Иммуноблоттинг белков, выделенных из мух трансгенных линий, с моноклональными антителами 7 FB, узнающими индуцибельный БТШ70 D.melanogaster. 1- 4 контрольные условия +25°С; 5 - 8 ТШ (+37.5°С 30 мин); 9 -12 ТШ (+37.5°С и 30 мин восстановления). 1, 5,9 - US-4; 2, б, 10 - Ша; 3, 7, 11 - ЗОИЬ; 4, 8, 12 - 1341b. Концентрация белков была выверена по концентрации актина (окрашивание соответствующего участка геля Кумасси G250) -низ рисунка.

После 30 мин ТШ при температуре 37°С в линиях ЗОИЬ и 1341b наблюдается более низкий уровень индукции БТШ70 по сравнению с US-4. После получасового периода восстановления разница в уровне синтеза БТШ70 между линиями становится меньше.

30 мин восст.

Методом двумерного электрофореза белков, выделенных из слюнных желез личинок 3-го возраста и меченных радиоактивным метноннном (и5-[1,]-метионин), было установлено, что паттерн белков БТШ70 в трансгенных линиях не изменен (рис, 11) по сравнению с контрольной линией и5-4,

US-4 1341b ЗОПЬ

Рис. 11. Результаты двумерного электорофореза белков, меченных 358-[Ь]-метионином. Стрелками указаны белки теплового шока массой 68, 70 кДа и группа нмБТШ соответственно у двух трансгенных линий (ЗОПЬ, 1341Ь) и у контрольной линии и$-4, содержащей только стартовую конструкцию.

Т.о., проведенный анализ показал снижение уровня трансляции бтшЮ, что согласуется с пониженным уровнем индукции мРНК бтиЛО в трансгенных линиях по сравнению с контрольной.

Базальная и индуцированная термоустойчивость трансгенных линий

Термоустойчивость является свойством целого организма, обеспечивая адаптацию к изменяющимся температурным условиям внешней среды. В нашей модельной системе были получены инсерции EPgy2 в главное семейство генов ТШ, бтш70, отвечающих за адаптацию организма к различным температурным условиям (Zatsepina O.G., 2001). Представляло значительный интерес оценить влияние инсерций EPgy2 в гены бтшЮ на базальную и индуцибельную термотолерантность. В качестве контроля были использованы линии US-4 и US-2, несущие исходную конструкцию EPgy2,

Для определения термоустойчивости к кратковременному ТШ использовали трансгенных мух линий Ша, ЗОПЬ, 11111а, 1231а, 1341b, 310II, содержащих инсерции

ЕР%у2 в разных положениях относительно старта транскрипции генов 6тш70 (-97, -96 (двойное встраивание), -97, -135, -28, -137 п.о. соответственно). Для мух, постоянно содержащихся в термостате при +25°С, определяли 1/Г50 (температуру, при которой выживает 50% особей) и критическую температуру выживания (температура, при которой выживает менее 1% особей). Т1П проводили в водяном термостате при разных температурах в течение 30 мин. Число выживших мух определяли через 48 ч после ТШ. Как видно из рис.12, все трансгенные линии имеют более высокую термоустойчивость при средних температурах по сравнению с контрольной линией; наиболее видимые различия наблюдаются в интервале температур от 39 до 39.5сС. При зтом встраивание ЕР&2 не влияет на критическую температуру выживания, которая составляет 40-40.5°С

Рис.12. Выживаемость имаго трансгенных линий при тепловом шоке. Указан процент мух, выживших через 48 ч после ТШ.

Индуцируемой термотолерантностью называют способность организма лучше переносить действие высоких температур после предварительного воздействия слабого TILI (35 - 36°С) (Feder М.Е., 1999). В нашем эксперименте мухи подвергались слабому ТШ при 35°С в течение 30 мин; сразу после этого был дан ТШ высокой интенсивности (рисунок не приводится). Нами не было выявлено влияния инсерций EPgy2 в гены бтиЛО на индуцибельную термоустойчивость. Таким образом, несмотря на снижение уровня синтеза мРНК и белка БТШ70 вследствие внедрения EPgy2, термоустойчивость трансгенных линий существенно не меняется.

Определение плодовитости потомства трансгенных линий

Инсерции мобильных элементов по-разному проявляются на уровне целого организма. Известно, что они могут влиять на одно из самых важных свойств всех живых существ - способность даваггь плодовитое потомство. Поскольку данное свойство является одним из главных факторов действия естественного отбора, представляло интерес оценить последствия внедрения ЕР%у2 на фертильность трансгенных линий. В нашей работе была описана линия 19811а, содержащая две инсерции конструкции ЕР%у2 в разные положения двух копий генов бтш70. Было обнаружено, что эта линия не может существовать в гомозиготном состоянии. Более детальный морфологический анализ показал, что это связано с недоразвитием семенников у самцов, т.е. с нарушением репродуктивной системы и неспособностью давать потомство. Для других линий подобного явления не было зафиксировано, поэтому эксперимент по оценке плодовитости потомства был проведен на гомозиготных трансгенных линиях. Условия опыта были подобраны согласно данным работ (ЗМЬегтапп К., 2000; Ьегшап РК, 2003; ОтеукЬ Ж., 2004). В эксперимент были отобраны мухи, находящиеся на одной и той же стадии развития, четырех трансгенных линий ЗОПЬ, 11111а, 1341Ь, 3691 (с инсерциями ЕР%у2 соответственно в положения -96 генов бтшЮ Аа и АЬ; -97 б/иш70Аа; -28 бтш70Аа; -144 бтш70Аа) и линии Ш-4 (контроль). Поставили серии индивидуальных скрещиваний (одна самка х два самца) и исследовали фертильность мух трех-, шести- и девятидневного возраста. Были проведены исследования репродуктивной способности самок в нестрессовых условиях (постоянное развитие при +25°С) и самок, перенесших тепловой шок (в этом случае девственные самки были подвергнуты ТШ при температуре 37°С в течение 30 мин и скрещены с нестрессированными самцами). Подсчет потомства проводился после вылупления всех куколок. Для каждой линии было поставлено 12 независимых скрещиваний; подсчет потомства и статистическая обработка полученных данных дали следующие результаты - рис. 13. Как видно из этого рисунка, в ряде случаев у нестрессированных трехдневных мух обнаруживается меньшее число потомков по сравнению с контрольной линией (иЗ-4). Также нами была зафиксирована задержка развития всех трансгенных мух по сравнению с контрольной: вылет потомства от индивидуальных скрещиваний в линии Ш-4 начинался на 2-3 дня раньше, чем в линиях с инсерциями ЕР§у2 в гены бтш.70. Кроме того, у некоторых трехдневных самок в

Рис.13. Определение фертильности трансгенных линий. Столбиками обозначено число потомков трансгенных линий от индивидуальных скрещиваний (1 самка х 2 самца) 3-, 6-и 9-дневного возраста,

трансгенных линиях было мало (менее 10 шт.) или совсем не было потомков. Проведенные эксперименты позволяют заключить, что ннсерции EPgy2 в гены бтшЮ не оказывают существенного влияния на плодовитость насекомых, хотя в большинстве случаев наблюдается тенденция к снижению фертильности трехдневных нестрессированых трансгенных мух по сравнению с контрольной US-4, что может быть вызвано, например, задержкой созревания ооцитов либо формирования яичников. У самок, подвергнутых ТШ, не было выявлено аналогичных тенденций. В исследовании [Lakhotia, 2002] обнаружена экспрессия генов бтшЮ в л о кусе 87А на ранних стадиях сперматогенеза Drosophila, в то время как гены в локусе 87С неактивны. В литературе нет четкой информации о роли 6miu70 в оогенезе. Исходя из наших данных, можно предположить, что экспрессия бтш70 влияет на созревание ооцитов либо развитие яичников. Однако данное предположение требует дальнейших исследований.

Вклад нмБТШ в термоустойчив ость Литературные данные и проведенные нами эксперименты позволяют утверждать, что в формировании термальной адаптации принимают участие несколько факторов. Результаты двумерного электрофореза, представленного на рис. И, показывают, что после получасового ТШ происходит интенсивное включение метки в группу белков основного семейства БТШ (БТШ70), а также в группу нмБТШ, что свидетельствует о синтезе этих белков в ответ на тепловой стресс. Из рада работ известно, что большой вклад в термоустойчивость вносит семейство низкомолекулярных белков ТШ. Так, еще

в 1987 году Евгеньевым и соавт. (Евгеньев М.Б., 1987) был изучен ответ на ТШ у двух видов шелкопряда - тутового (Bombyx morí) и непарного (Lymantria dispar). Тутовый шелкопряд, обитающий в странах Юго-Восточной Азии, является одним из наиболее термоустойчивых видов насекомых, известных на сегодняшний день, и способен к синтезу БТШ при температурах до 48°С. Непарный шелкопряд, обитающий в умеренном климатическом поясе, является термочувствительным видом и перестает синтезировать БТШ уже при 40°С. Было показано, что в условиях интенсивного ТШ клетки тутового шелкопряда характеризуются интенсивным синтезом одной из форм нмБТШ. Нами был изучен синтез нмБТШ у видов Drosophila с разным уровнем термальной адаптации - D, virilis (термоустойчивый вид), D. lummel (термочувствительный вид), D. melanogaster Oregon R (лабораторная линия, ответ

а

4.0 -3.5 -

* 3.0

12S

2 2.0 3 и

i 13 I1"0

Hi

g 0.5 <J

О

Ш250С П37.5"С, 1м

□ 37.5°C, 3 ч D ЗЭ.О^С, 1 ч

□ 39-O^C, 3 ч ■ 40.0°C, 14

□ 40.0eC. 3 n

Oregon R

Oregon R 37,5°C

D. virilis 9 37.5°C

f- ■ ' nsp М-Г7.....

, l[sp' ''.: : s ■ ■ íil-ÍI "t* . .. '

¡4V,;; —-

D. ftwintíí 200 37.5°C

f»'. ''' *--WP 3Í - Í7 ^

■ ä itsp ' . — .

С : /Л

■■ -1 m " •• .. . ■■ 2

25 кДа 21 кДа

Рис, 14. Результаты исследований нмБТШ разных видов Drosophila. а. Содержание нмБТШ у разных видов Drosophila в зависимости от значений ТШ и времени восстановления. Значения даны относительно концентрации нмБТШ у Oregon R при 37.5°С и 1 ч восстановления, б. Двумерный электрофорез белков, выделенных из слюнных желез личинок, меченных [м8]-Ь-метионином в течение 1 ч после ТШ (37.5°С 30 мин).

которой на тепловой шок хорошо изучен). Количественное определение содержания нмБТШ у всех трёх видов методом Вестерн-блоттннга с последующим денситометрированнем автографов выявило более высокое содержание нмБТШ у D. virilis по сравнению с D. lummei и D. melanogaster как при контрольной температуре (25°С), так и при ТШ различной интенсивности (рис,14 а). При этом спектр изоформ нмБТШ Oregon R D. melanogaster значительно отличается от сходных друг с другом спектров изоформ нмБТШ у линий D. virilis и D. lummei (рис.14 б). Повышенная экспрессия нмБТШ у исследованных организмов коррелирует с их более высокой термоустой чивостью.

Двумерный электрофорез линий с инсерциямн EPgy2 в гены бтш70 показал включение метнонина JiS в нмБТШ, причем паттерн белков трансгенной линии ЗОПЬ (двойное встраивание EPgy2 в гены бтг«70Аа и бтш70АЪ) отличается от контрольной линии и других трансгенных линий. Причины наблюдаемых изменений паттерна нмБТШ нуждаются в дальнейшем исследовании.

Выводы

1. Выявлено, что промоторы генов бтш.70 являются предпочтительной областью встраивания конструкции EPgy2.

2. В промоторных областях были зарегистрированы "горячие точки" встраиваний конструкции £Pgy2 — положения -96, -97 от старта транскрипции генов бтш70, что связано с особенностями структуры этой области промотора.

3. Установлено, что инсерцин EPgy2 в промотор генов бтш70 приводят к снижению уровня синтеза мРНК бтш70 и белка БТШ70.

4. Проведены эксперименты по исследованию влияния ннсерций в гены бтш70 на уровне целого организма: обнаружена лучшая выживаемость мух при средних ТШ и незначительная задержка развития трансгенных линий.

5. Изучена роль нмБТШ в термоустойчивости у различных видов дрозофилы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации статьи

1. Shilova VY, Garbuz DG, Myasyankina EN, Chen B, Evgen'ev MB, Feder ME, Zatsepina OG. Remarkable site specificity of local transposition into the Hspld promoter ofDrosophila melanogaster // Genetics. 2006;173(2):809-20

2. Zatsepina OG, Karavanov AA, Garbuz DG, Shilova V, Tornatore P, Evgen'ev MB. Use of surface-enhanced laser desorption ionization-time-of-flight to identify heat shock protein 70 isofomis in closely related species of the virilis group of Drosophila// Cell Stress Chaperones, 2005; 10(1): 12-6

3. Шилова В.Ю., Гарбуз Д.Г., Евгеньев М.Б., Зацепина О.Г, Низкомопекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у разных видов Drosophila// Молекулярная биология, 2006, Т.40,Х»2, с.271-276

4. Shilova V.Y., Garbuz D.G., Evgen'ev М.В. HSP70 Of D.melanogaster Are "Hotspots" For P element Insertions// Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution: Abstr., Papers by Young Scientists. - Dubna: JINR, 2005, P.248 - 250

тезисы

1. Shilova V.Y., Evgen'ev M.B., Miasniankina E.N., Garbuz D.G., Zatsepina O.G. HSP70 genes of D. melanogaster are "hotspots" for P element insertions. 2005, P 91-92 (Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution, Yerevan, September 8 - 11, 2005)

2. Шилова В.Ю., Гарбуз Д.Г., Мяснянкина E.H., Евгеньев М.Б., Feder М.Е., Chen В., Зацепина О.Г. Горячие точки встраивания Р элемента в гены бтш70 Drosophila melanogaster // Материалы международной конференции «Генетика в России и мире», стр. 216 (Москва, 28 июня-2 июля 2006г)

Заказ № 10/10/06 Подписано в печать 02.10.2006 Тираж 100 экз. Уст, п.л, 1,5

ООО "Цифровичок", тел, (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шилова, Виктория Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Белки и гены теплового шока: общая характеристика

1.1.1. Гены теплового шока

1.1.2. Основные семейства БТШ

1.1.3. Механизмы регуляции ответа на тепловой шок

1.2. Структура кластера генов бтш70 у Diptera

1.3. Мобильные элементы как возможный фактор эволюции генов ТШ

1.4. Особенности Р элемента и его использование в инсерционном мутагенезе

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Линии Drosophila

2.2. Модель генетического анализа

2.3. Выделение геномной ДНК из мух

2.4. Гибридизация геномной ДНК по Саузерну

2.5. ПЦР-анализ

2.6. Выделение фрагментов ДНК

2.7. Секвенирование ДНК

2.8. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени (qRT-PCR) 43 2.9 Выделение мРНК из мух и ее анализ методами электрофореза и Нозерн-гибридизации

2.10. Лигирование фрагментов ДНК

2.11. Трансформация компетентных клеток Е. coli

2.12. Выделение плазмидной ДНК

2.13. Одномерный электрофорез белков

2.14. Вестерн-блоттинг

2.15. Двумерный электрофорез белков

2.16. Включение метионина- S в белки слюнных желез Drosophila

2.17. Определение термоустойчивости мух

2.18. Определение фертильности трансгенных мух 48 2.19 Иммунофлуоресцентное окрашивание транскрипционых факторов 48 2.20. Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика системы скрещиваний для получения инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтшЮ методом Р-инсерционного мутагенеза

3.2. Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот анализа 53 3.3 Точная локализация полученных инсерций EPgy

3.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтшЮ

3.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях

3.6. Анализ инсерций EPgy2, сопровождающихся перестройками геномной ДНК

3.7. Базальная и индуцированная термоустойчивость трансгенных линий

3.8. Определение плодовитости потомства трансгенных линий

3.9. Вклад нмБТШ в термоустойчивость

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфичность встраиваний P элемента в локус генов бтш70 D. melanogaster и влияние инсерций на функционирование этих генов"

Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования адаптации организмов к воздействиям внешней среды - перепадам температуры, в частности, тепловому шоку (ТШ), химическим реагентам, инфекциям и т. д. - представляет значительный интерес для современной биологии. Наиболее универсальной генетической защитной системой, найденной у всех изученных на сегодняшний день организмов, является система генов теплового шока. Кодируемые ими белки теплового шока (БТШ) выполняют в клетке функции молекулярных шаперонов, предотвращая денатурацию и агрегацию белков. Считается, что главную защитную функцию выполняет высококонсервативное семейство генов, кодирующих белки теплового шока массой 70 кДа (БТШ70). Гены теплового шока очень чувствительны к любым изменениям, затрагивающим их структуру, - мутации, делеции, инсерции мобильных элементов чаще всего негативно сказываются на функционировании этих генов. Соответственно, в большинстве случаев изменения, затрагивающие гены бтшЮ, элиминируются естественным отбором, а их высокая консервативность поддерживается механизмом внутри- и межлокусной конверсии (Ish-Horowicz D., 1981).

Одним из вопросов, привлекающих исследователей, является рассмотрение закономерностей эволюции этого семейства. В литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что эволюция системы генов бтш70 могла идти как путем увеличения числа генов (Гарбуз Д.Г., 2002), так и путем инактивации некоторых их копий вследствие внедрения мобильных элементов (МЭ) (Lerman D., 2003; Zatsepina OG., 2001). Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции. Имеются данные, что гены бтшЮ, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК.

В данной работе была предпринята попытка ответить на вопрос - являются ли гены бтшЮ «горячими точками» инсерций МЭ. Исследовали перемещение конструкции EPgy2, полученной на основе Р элемента, на модельной системе D. melanogaster. Выявление мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтшЮ позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль мобильных элементов в процессах микроэволюции и адаптации. Р элемент является одним из наиболее хорошо изученных эукариотических транспозонов; в ряде работ используется его способность перемещаться в близкорасположенные сайты с увеличением числа копий и сохранением стартового элемента. Такие особенности локальных перемещений можно использовать in vivo для получения транспозиций в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза. Целью данной работы было: выявление специфичности встраивания Р элемента в локус, кодирующий белки БТШ70 у дрозофилы; исследование влияния инсерций Р элемента на функционирование генов бтш1§\ рассмотрение роли различных семейств генов ТШ в адаптации к гипертермии. В соответствии с целями были поставлены следующие задачи:

1) Разработать экспериментальный подход для регистрации и точной локализации инсерций конструкции на основе Р элемента (EPgy2) в район генов, кодирующих БТШ70 Drosophila melanogaster.

2) Локализовать инсерции EPgy2.

3) Исследовать влияние инсерций EPgy2 на функционирование генов бтшЮ на уровне транскрипции и трансляции.

4) Рассмотреть влияние инсерций EPgy2 в гены бтиПО на термоустойчивость и плодовитость потомства трансгенных линий.

5) Изучить вклад низкомолекулярных белков теплового шока (нмБТШ) в формирование термоустойчивости на примере трансгенных линий и представителей других видов Drosophila.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шилова, Виктория Юрьевна

4. ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что промоторы генов бтшЮ являются предпочтительной областью встраивания конструкции EPgy2.

2. В промоторных областях были зарегистрированы "горячие точки" встраиваний конструкции EPgy2 - положения -96, -97 от старта транскрипции генов бтшЮ, что связано с особенностями структуры этой области промотора.

3. Установлено, что инсерции EPgy2 в промотор генов бтшЮ приводят к снижению уровня синтеза мРНК бтшЮ и белка БТШ70.

4. Проведены эксперименты по исследованию влияния инсерций в гены бтшЮ на уровне целого организма: обнаружена лучшая выживаемость мух при средних ТШ и незначительная задержка развития трансгенных линий.

5. Изучена роль нмБТШ в термоустойчивости у различных видов дрозофилы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шилова, Виктория Юрьевна, Москва

1. Васильева Л.А., Ратнер В.А., Бубенщикова Е.В. Стрессовая индукция транспозиций ретротранспозонов дрозофилы: реальность явления, характерные особенности и возможная роль в быстрой эволюции// Генетика, 1997. Т 33(8), С1083-1093

2. Гарбуз Д.Г., Молодцов В.Б., Великодворская В.В., Евгеньев М.Б., Зацепина О.Г. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода Drosophila!I Генетика, 2002. Т 38(8) С 1097- 1109

3. Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. Структура и свойства малых белков теплового шока (slisp) и их взаимодействие с белками цитоскелета// Биохимия, 2002. Т 67 (5) С 613-623

4. Евгеньев М. Б., Шейнкер В. Ш., Левин А. В. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. I. Синтез белков теплового шока в клетках культуры различных видов шелкопряда и гусеницах. // Молекулярная биология, 1987. Т 21, С 484 -494

5. Евгеньев М. Б., Мнджоян Е. И., Зеленцова Е. С., Шостак Н. Г., Лёзин Г. Т., Великодворская В. В., Полуэктова Е. В. Мобильные элементы и видообразование// Молекулярная биология, 1998. Т 32(1), С 184-192

6. Лозовская Е. Р., Евгеньев М. Б. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома// Молекулярная биология, 1984. Т 20, С 142 185

7. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке// Цитология, 2000. Т 42(4), С 323 342

8. Ульмасов X. А., Каррыева Б. Ч., Караев К. Стрессовые белки и адаптация// Ашхабад, «Ылым», 1993.212с.

9. Фаддеев М.А. Элементарная обработка результатов эксперимента: Учебное пособие. //Изд-во Нижегородского госуниверситета, 2002. 108 с.

10. Хлебодарова ТМ. Как клетки защищаются от стресса?// Генетика, 2002. Т 38(4), С 437-452

11. Шилова В.Ю., Гарбуз Д.Г., Евгеньев М.Б., Зацепина О.Г. Низкомолекулярные белки теплового шока и адаптация к гипертермии у разных видов Drosophilall Молекулярная биология, 2006. Т 40(2), С 271-276

12. Aguilar-Mahecha A, Hales BF, Robaire В. Expression of stress response genes in germ cells during spermatogenesis // Biol Reprod. 2001; V 65(1), P 119-27

13. Anxolabehere D. P transposable element in Drosophila melanogaster. horizontal transfer // С R Seances Soc Biol Fil., 1992. V 186(6) P 641-55

14. Arhipova I.R., Lyubomirskaya N.V., Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposones// Austin, Texas, 1995: R.G. Landes company. 134 p.

15. Ayme A, Tissieres A. Locus 67B of Drosophila melanogaster contains seven, not four, closely related heat shock genes // EMBO J., 1985 T 4, VI1, P 2949 2954

16. Bailey J.A., G. Liu and E.E. Eichler. An Alu transposition model for the origin and expansion of human segmental duplications// American Journal of Human Genetics, 2003. V 73, P 823-834

17. Balakrishnan K., A. De Maio. hsp70 binds it's own messenger RNA as part of gene expression self-limiting mechanism // Cell stress& Chaperones, 2006. VI1 (1)

18. Becker J., and E. A. Craig. Heat-shock proteins as molecular chaperones// European Journal of Biochemistry, 1994. V 219, P 11-23

19. Beckmann Richard P., Lovett Michelle, William J. Welch. Examining the Function and Regulation of HSP70 in Cell Subjected to Metabolic Stress// The Journal of Cellular Biology, 1992. T117(6), P 1137-1150

20. Bellen H., C. J. O'Kane, C. Wilson, U. Grossniklaus, R.K. Pearson, W.J. Gehring. P-element mediated enhancer detection: a versatile method to study development in Drosophila!I Genes Dev., 1989. V 3, P 1288-1300

21. Bettencourt BR, Feder ME. Hsp70 duplication in the Drosophila melanogaster species group: how and when did two become five?// Mol Biol Evol., 2001. T 18, V7, P 1272 1282

22. Bettencourt B.R., and M.E. Feder 2002a. Rapid concerted evolution via gene conversion at the Drosophila hsp70 genes // Journal of Molecular Evolution, V 54, P 569-586

23. Bettencourt B. R., I. Kim A., A. Hoffmann and M, E. Feder, 20026. Response to natural and laboratory selection at the Drosophila hsp70 genes// Evolution, V 56, P 1796-1801

24. Bienz M., H.Pelham. heat shock regulatory elements function as an inducible enhancern in the Xenopus hsplO gene and when United to a heterologous promoter// Cell, 1986. V 45, P 753 -760

25. Bingam P.M., Kidwell M.G., Rubin G.M. The molecular basis of P-M hibrid dysgenesis: the role of the P-element, P-strain specific transposon family. // Cell, 1982. V 29, P 995-1004

26. Boutanaev A. M., A. I. Kalmykova, Y. Y. Shevelyou and D. I. Nurminsky. Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome!! Nature, 2002. V 420, P 666-669

27. Bucheton A., Busseau I., Teninges D. I elements in Drosophila melanogaster!I Mobile DNAII, 2002, P. 796-812

28. Bush KT, Goldberg AL, Nigam SK. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance// J. Biol Chem., 1997. V 272(14), P 9086-92

29. Busseau I.A., Pelisson A., Bucheton A. I elements of Drosophila melanogaster generate specific chromosomal rearrangements during transposition// Mol. Gen. Genet., 1989. V 218 (2) P 222-228

30. Cervera J. Induction of self-tolerance and enhanced stress protein synthesis in L-132 cells by cadmium chloride and by hyperthermia// Cell Biol Int Rep., 1985. V 9(2), P131-41

31. Chen Q, Ma E, Behar KL, Xu T, Haddad GG. Role of trehalose phosphate synthase in anoxia tolerance and development in Drosophila melanogaster!I J. Biol. Chem., 2002. T 277, V5,P3274 3279

32. Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction// Anal. Biochem. , 1987. V 162, P 156-159

33. Chun-Yang Fan et al. Mechanisms for regulation of hsplO function by hspAO// Cell stress&Chaperones, 2003. V 8 (4), P 309-316

34. Clark Jonathan B, Pyong C. Kim, and Margaret G. Kidwell Molecular Evolution of P Transposable Elements in the Genus Drosophila III. The melanogaster Species Group //Mol. Biol. Evol., 1998. V 15(6), P 746-755

35. Cooley L, Kelley R, Spradling A Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements//Science, 1988. V 239(4844), P 1121-8

36. Corces V., Holmgren R., Freund R., Morimoto R. and Meselson M. Four heat shock proteins of Drosophila melanogaster coded within a 12-kilobase region in chromosome subdivision 67B// Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1980. V 77(9), P 5390-5393

37. Coveny Angela M,1 Tammy Dray 1,2 and Gregory B. Gloor3The Effect of Heterologous Insertions on Gene Conversion in Mitotically Dividing Cells in Drosophila melanogaster //Genetics, 2002. V 161, P 249-258

38. Daborn P. J, J. L. Yen, M. R. Bogwitz, G. Le Goff, E. Feil et al. A single P450 allele associated with insecticide resistance in Drosophila!I Science, 2002. V 297, P 2253-2256

39. Daniels SB, Chovnick A P element transposition in Drosophila melanogaster. an analysis of sister-chromatid pairs and the formation of intragenic secondary insertions during meiosis.//Genetics, 1993. V 133(3), P 623-36

40. Delmas F,, Trocheris V, Murat J.-C. Expression of stress proteins in cultured HT29 human cell-line; a model for studing environmental aggression// Int. J. Biochem. Cell Biol, 1995. V 27, P 385 391

41. Dix DJ. HsplO expression and function during gametogenesis// Cell Stress Chaperones, 1997.V2(2),P.73-77

42. Dooha Kim et al. A Constitutive Heat Shock Element-binding Factor Is Immunologically Identical to the Ku Autoantigen.// The Journal of Biological Chemistry, 1995. V 270(25), P 15277- 15284

43. Dreher D, Vargas J.R, Hochstrasser D, Junod A.F. Effects of oxidative stress and Ca2+ antagonists on molecular chaperones in human umbilical vein endothelial cells// Electrophoresis, 1995. V 16(7), P 1205-14

44. Drnevich JM, Reedy MM, Ruedi EA, Rodriguez-Zas S and Hughes KA. Quantitative evolutionary genomics: differential gene expression and male reproductive success in Drosophila melanogaster!! Proc. R. Soc. Lond, 2004. P 2267-2273

45. Evgen'ev MB., Zelentsova H., Mnjoian L., Poluectova H., Kigwell M.G. Invasion of Drosophila virilis by the Penelope transposable element// Chromosoma, 2000. V 109,P 350 -357

46. Evgen'ev MB, Kolchinski A, Levin A, Preobrazhenskaya AL, Sarkisova E. Heat-shock DNA homology in distantly related species of Drosophilall Chromosoma, 1978. T 68(4), P 357 -365

47. Evgen'ev MB., Zatsepina OG., Garbuz D, Lerman D., Velikodvorskaya V, Zelentsova E, Feder ME. Evolution and arrangement of the hsplO gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila //Chromosoma, 2004. V 113(5), P 223-32

48. Farkas G. et al. Chromatin organization and transcriptional control of gene expression in Drosophilall Gene, 2003. T 253, P 117-136

49. Feder M. E. and Hofmann G. E. Heat-Shock Proteins, Molecular Chaperones, and the Stress Response, Evolutionary and Ecological Phisiology // Annual Review of Physiology, 1999. T 61, P 243-282

50. Feder ME, Hofmann GE. 1998. Evolutionary and ecological physiology of heat-shock proteins and the heat-shock response: a comprehensive bibliography, http ://www. annure v. org/sup/material .htm

51. Feder ME, Blair N, Figueras H. Natural thermal stress and heat-shock protein expression in Drosophila larvae and pupae// Funct. Ecol., 1997. V 11, P 90-100

52. Fernandes M, Xiao H, Lis JT. Fine structure analyses of the Drosophila and Saccharomyces heat shock factor-heat shock element interactions// Nucleic Acids Res., 1994. V 22,P 167-73

53. Frydman Judith. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones// Annu. Rev. Biochem, 2001. T 70, P 603 649

54. Gabai V.L., Sherma M.Y. Molecular biology of thermoregulation: interplay between molecular chaperones and signaling pathways in survival of heat shock// J. Appl. Physiol, 2002. V 92,P 1743-1748

55. Gebauer Mathias, Matthias Zeiner and Ulrich Gehring. Interference between proteins Hap46 and Hop/p60, which bind to different domains of the molecular chaperone hsplQ/hsclQH Mol. Cell. Biol., 1998. V 18 (11), P 6238 6244

56. Georgel P.T. Chromatin potentiation of the hsplO promoter is linked to GAGA-factor recruitment // Biochem.Cell Biol., 2005. V 83, P 555-565

57. Georgiev GP.Mobile genetic elements in animal cells and their biological significance//Eur J Biochem.,1984. V 145(2), P 203-20

58. Gilmour D. S., G. H. Thomas and S. C. Elgin. Drosophila nuclear proteins bind to regions of alternating С and T residues in gene promoters// Science, 1989. V 245, P 1487-1490

59. Gloor Gregory В., Jessica Moretti, Joanne Mouyall and Katherine J. Keeler2Distinct P-Element Excision Products in Somatic and Germline Cells of Drosophila melanogaster// Genetics, 2000. V 155, P 1821-1830

60. Golovnin A, Georgieva S, Hovhannisyan H, Barseguyan K, Georgiev P. P element-mediated duplications of genomic regions in Drosophila melanogaster 11 Chromosoma, 2002. V 111(2), P 126-138

61. Gong W. J., and K. G. Golic Genomic deletions of the Drosphila melanogaster HsplQ genes// Genetics, 2004. V 168, P 1467-1476

62. Hahn JS, Hu Z, Thiele DJ, Iyer VR. Genome-Wide Analysis of the Biology of Stress Responses through Heat Shock Transcription Factor// Mol Cell Biol, 2004. V 24(12), P 52495256

63. Hartl D.L, Lohe A.R, Lozovskaya E.R. Regulation of the transposable element mariner// Genetica, 1997. V 100, P 177-184

64. Jachansan Amin, R. Nestril, P. Schiller, M. Dreano, R. Voellmy. Organization of the Drosophila melanogaster hsplO regulation unit// Mol. Cell. Biol, 1987. V 7(3), P 1055 1062

65. Jachansan Amin, Jayakumar Ananthan, R. Voellmy. Key features of Heat Shock Regulatory Elements// Molecular and Cell Biology, 1988. V 8(9), P 3761 3769

66. Kapitonov V. V., and J. Jurka Molecular paleontology of transposable elements in the Drosophila melanogaster genome// Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. V 100, P 6569-6574

67. Karpov V. L., О. V. Preobrazhenskaya and A. D. Mirzabekov. Chromatin structure of hsplO genes, activated by heat shock: selective removal of histones from the coding region and their absence from the 5' region// Cell, 1984. V 36, P 423-431

68. Kazazian H.H. Mobile elements: Drivers of genome evolution// Science, 2004. V 303, P 1626-1632

69. Kidwell M. G., Damon R. Lisch Transposable elements as sources of genomic variation// in Mobile DNAII, edited by N.L. Craig et. al., 2002. ASM Press, Washington

70. Kidwell M. G., Kidwell J. F., Sved J.A. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. a syndrome of abberant traits including mutation, sterility and male recombination// Genetics, 1977. V 36,P 813-833

71. Kidwell M. G. The evolutionary history of the P family of transposable elements// J. Heredity, 1994. V 85, P 339-346

72. Kidwell M. G. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster. The relationship between the P-M and I-R interaction systems// Genet. Res., 1979. V 33, P 105-117

73. Konstantopoulou I, Nikolaidis N, Scouras ZG. The hsplO locus of Drosophila auraria (montium subgroup) is single and contains copies in a conserved arrangement// Chromosoma, 1998. T 107, V 8, P 577-586

74. Mccollum A., E. Ganko, P. Barrass, J. Rodriguez and J. Mcdonald. Evidence for the adaptive significance of an LTR retrotransposon sequence in a Drosophila heterochromatic gene// BMC Evolutionary Biology, 2002, 2:5

75. McGarry, Т. J. and Lindquist, S. The preferential translation of Drosophila hsplO mRNA requires sequences in the untranslated leader// Cell, 1985. V 42, P 903-911

76. Marchler G, Wu C. Modulation of Drosophila heat shock transcription factor activity by the molecular chaperone DROJ1 //EMBO J, 2001. V 20(3), P 499-509

77. Marsano, R. M,, R. Caizzi, R. Moschetti and N. Junakovic. Evidence for a functional interaction between the Baril transposable element and the cytochrome P450 cypl2a4 gene in Drosophila melanogaster 11 Gene, 2005. V 357, P 122-128

78. Maside X, Bartolome C, Charlesworth B. S-element insertions are associated with the evolution of the HsplO genes in Drosophila melanogaster/У Curr. Biol, 2002. T 12, V 19, P 1686- 1691

79. Mehlen P, Schulze-Osthoff K, Arrigo A.P. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death// J Biol Chem, 1996. V 271(28), P 16510-16514

80. Michaud S, Marin R, Westwood JT, Tanguay RM. Cell-specific expression and heat-shock induction of Hsps during spermatogenesis in Drosophila melanogaster/ /J Cell Sci, 1997. V 110, P 1989-97

81. Molecular Chaperones and the Heat Shock Response. Cold Spring Harbor, New York, 1998. 299p.

82. Morimoto Richard, Tissieres Alfred, Georgopoulos Costa. The Stress Response, Function of the Proteins, and Perspectives// Stress Proteins in Biology and Medicine, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. P. 1 32

83. Morrow G, Heikkila JJ, Tanguay RM. Differences in the chaperone-like activities of the four main small heat shock proteins of Drosophila melanogaslerll Cell Stress Chaperones, 2006.1. V 11(1), P 51-60

84. Nacheva, G. A., D. Y. Guschin, О. V. Preobrazhenskaya, V. L. Karpov, К. K. Ebralidze et al. Change in the pattern of histone binding to DNA upon transcriptional activation // Cell 1989.1. V 58, V 27-36

85. Nakai, M.Tanabe. HSF4, a new member of the human Heat Shock Factor family which lacks properties of a transcriptional activator// Molecular and cellular biology, 1997. VI. P. 469 -481.

86. Nassif N W.R. Engels DNA homology requirements for mitotic gap repair in Drosophilall Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1993. V 90, P 1262-1266

87. Nassif N, J. Penney, S. Pal, W.R. Engels and G.B. Gloor. Efficient Copying of Nonhomologous Sequences from Ectopic Sites via P-Element-Induced Gap Repair// Mol and Cell Biol., 1994. V 14 (3), P 1613-1625

88. Nelson R. John, Thomas Ziegelhoffer, Charies Nicolet, Margaret Wemer-Washburne, and Elizabeth A. Craig. The Translation Machinery and 70kd Heat Shock Protein Cooperate in Protein Synthesis// Cell, 1992. V 71, P 97 105

89. Neupert Walter, Franz-Ulrich Hartl, Elizabeth A. Craig, and Nikolaus Pfanner. How Do Polypeptides Cross the Mitochondrial Membranes? // Cell, 1990. V 63, P 447 450

90. Norris Carol E., Philip J. dilorio, R. Jack Schultz, and Lawrence E. Hightower. Variation in Heat Shock Proteins within Tropical and Desert Species of Poeciliid Fishes// Mol. Biol. Evol., 1995. V 12(6), P 1048- 1062

91. O'Brien, Lis J.T. RNA polymerase II pauses at the 5'-end of the transcriptionally induced Drosophila hsp70 genet I Mol. Cell. Biol., 1991. V 11 (10), P 5285-5290

92. O'Brien Т., R. C. Wilkins, C. Giardina and J. T. Lis. Distribution of GAGA protein on Drosophila genes in vivo// Genes & Dev., 1995. V 9, P 1098-1110

93. O'Farrell P.H. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins.// J. Biol. Chem., 1975. V 250, P 4007-4021

94. O'hare, K., and G. M. Rubin. Structures of P-Transposable Elements and Their Sites of Insertion and Excision in the Drosophila melanogaster Genome.// Cell, 1983. V 34, P 25-35

95. Ohno A., Miller E., Fraek M., Rucker S., Beck F.-x., Thurau K. Ketoconazole inhibits organic osmolyte efflux and induces heat shock proteins in rat renal medulla. 1996// Kidney Intern. 50: 110- 118

96. Patriarka E. J., Maresca B. Acquired thermotolerance following hsp synthesis prevents impairment in mithohondria ATP-ase activity at elevated temperatures in Saccharomyces cerevisiae// Exp. Cell. Res.,1990. V 190, P 57-64

97. Petrov D., Schutzman J., Hartl D., Losovskaya E.R. Diverse transposable elements are mobilized in hybrid dysgenesis in Drosophila virilis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995. V 92, P 8050-8054

98. Pile Lori A. and David A. Wassarman Localizing transcription factors on chromatin by immunofluorescence // Methods, 2002. V 26, P 3 9

99. Pinsker W, Haring E, Hagemann S, Miller WJ. The evolutionary life history of P transposons: from horizontal invaders to domesticated neogenes // Chromosoma, 2001. V 110 (3), P 148-58

100. Quesneville H, Anxolabehere D. A simulation of P element horizontal transfer in Drosophila //Genetica, 1997. V 100(1-3), P 295-307

101. Rabindran К Sridhar, Haroun J Raymond, Clos Joachim, Wisnievski Jan. Regulation of Heat Shock Factor trimer formaion: role of the conserved leucine zipper// Science, 1993. T 259, P 230-234

102. Rio D.C. P Transposable Elements in Drosophila melanogaster!I Mobile DNA II, 2002, chapter 21. P 484- 518

103. Robertson Hugh M, Christine R. Preston, Randall W. Phillis, Dena M. Johnson-Schlitz, Wendy K. Bern and William R. Engels. A Stable Genomic Source of P Element Transposase in Drosophila melanogaster// Genetics, 1988. V 118, P 461-470

104. Rubin DM, Mehta AD, Zhu J, Shoham S, Chen X, Wells QR, Palter KB. Genomic structure and sequence analysis of Drosophila melanogaster HSC70 genes// Gene, 1993. T 128, V 2, P 155-163

105. Russnak RH, Candido EP. Locus encoding a family of small heat shock genes in Caenorhabditis elegans: two genes duplicated to form a 3.8-kilobase inverted repeat// Mol. Cell. Biol, 1985. T 5, V 6, P 1268- 1278

106. Sambrook J, Frisch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 1989// New York, Cold Spring Harbor Press

107. Sanchez Y, Taulien J, K. A. Borkovich and S. Linquist. Hspl04 is required for tolerance to many forms of stress// The EMBO journal, 1992. V 11 (6), P 2357 2364

108. Sanchez Y, Parsell DA, Taulien J, Vogel JL, Craig EA, Lindquist S. Genetic evidence for a functional relationship between Hspl04 and Hsp70// J Bacteriol, 1993. V 175 (20), P 64846491

109. Schlenke, T. A, and D. J. Begun. Strong selective sweep associated with a transposon insertion in Drosophila simulans //Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. V 101, P 1626-1631

110. Schirmer EC, Glover JR., Singer MA, LindquistS. HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions// Trends Biochem Sci., 1996. V 21(8), P 289 296

111. Shopland L.S., Hirayoshi K., Fernandes M., Lis J.T. HSF access to heat shock elements in vivo depends critically on promoter architecture defined by GAGA-factor, TFIID, and RNA-polymerase II binding sites// Genes Dev., 1995. V 9 (22), P 2756-2769

112. Silbermann R and Tatar M. Reproductive costs of heat shock protein in transgenic Drosophila melanogaster I I Evolution, 2000. V 54, P 2038-2045

113. Spradling, A. C., D. Stern, A. Beaton, E. J. Rhem, T. Laverty et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes// Genetics, 1999. V 153, P 135-177

114. Terlecky S. R., Chiang H. L., Olson T. S., Dice J. F. Protein and Peptide Binding and Stimulation of In Vitro Lysosomal Proteolysis by the 73-kDa Heat Shock Cognate Protein// The Journal of Biological Chemistry, 1992. T 267, V 13, P 9202 9209

115. Timakov В., X. Liu, I. Turgut and P. Zhang Timing and Targeting of P-Element Local Transposition in the Male Germline Cells of Drosophila melanogaster!I Genetics, 2002. V 160, P 1011-1022

116. Tower, J., G. H. Karpen, N. Craig and A. C. Spradling. Preferential transposition of Drosophila P elements to nearby chromosomal sites.// Genetics, 1993. V 133, P 347-359

117. Tsukiyama, Т., P. B. Becker and C. Wu. ATP-dependent nucleosome disruption at a heat-shock promoter mediated by binding of GAGA transcription factor //Nature, 1994. V 367, P 525-532

118. Tsuno K., Yamaguchi O. Chromosomal rearrangement In(2)TY and linkage maps of the second chromosome of Drosophila virilis!! Jpn. J. Genet., 1991.V 66, P 49-58

119. Uma S, Thulasiraman V, Matts R. L. Dual Role for HSC70 in the Biogenesis and Regulation of the Heme-regulated Kinase of the Alpha Subunit of Eukaryotic Translation Initiation Factor 111 Molecular and Cellular Biology, 1999. T 19, V 9, P 5861 5871

120. Udvardy, A, E. Maine and P. Schedl. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains //J Mol Biol, 1985. V 185, P 341-358

121. Ulmasov KA, Shammakov S, Karavaev K, Evgen'ev MB. Heat shock proteins and thermoresistance in lizards// Proc Natl Acad Sci USA, 1992. V 89, P 1666 1670

122. Viera J, Viera C.P, Hartl D.L, Losovskaya E.R. Factors contributing to the hybrid dysgenesis syndrome in Drosophila virilisll Genet Res, 1998. V 71, P 109-117

123. Vogel JL, Parsell DA, Lindquist S. Heat-shock proteins Hspl04 and Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation// Curr Biol. 1995, V 5(3), P 306-17

124. Weber JA, Taxman DJ, Q. Lu and Gilmour DS. Molecular architecture of the hsplO promoter after deletion of the TATA box or the upstream regulation regionII Molecular and Cellular Biology, 1997. V17, P 3799 3808

125. Wu C. Heat Shock Transcription Factors: Structure and Regulation// Annual Review of the Cellular and Development Biology, 1995. V 11, P 441 469

126. Xing, H. Y., D. С. Wilkerson, С. N. Mayhew, E. J. Lubert, H. S. Skaggs et al. Mechanism of hsplOi gene bookmarking //Science, 2005. V 307, P 421-423

127. Xu Y, Lindquist S. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. V 90 (15), P 7074 7078

128. Yang S.-H., Hussenzweig A., Li L. et al. Modulation of thermal induction of hsplO expression by Ku autoantigen or its individual subunits// Mol. Cel. Biol., 1996. T 16, V 7, P 3799-3806

129. Yanhong Shi, Morimoto R. Molecular chaperones as HSF 1-specific transcriptional repressors// Genes and Development, 1998. T 12, P 654 666

130. Zelentsova E., Poluectova PI., Mnjoian L., Lyozin G., Veleikodvorskaja V., Zhivotovsky L., Kigwell M.G., Evgen'ev MB. Distribution and evolution of mobile elements in the virilis species group of Drosophilall Chromosoma, 1999. V 108 (7), P 443 456

131. Zhang, P., and A. C. Spradling. Efficient and dispersed local ^-element transposition from Drosophila females// Genetics, 1993. V 133, P 361-373

132. Zhong M., Orosz,A. and Wu,C. Direct sensing of heat and oxidation by Drosophila heat shock transcription factor// Mol. Cell, 1998. V 2, P 101-108

133. Zhong M., Kim,S.-Y. and Wu,C. Sensitivity of Drosophila heat shock transcription factor to low pH// J. Biol. Chem., 1999. V 274, P 3135-3140