Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ инсерционных мутаций, полученных при совмещении различных систем генетической нестабильности у Drosophila melangaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ инсерционных мутаций, полученных при совмещении различных систем генетической нестабильности у Drosophila melangaster"

РГ6. од.

«•< ■ . г российская академия наук

< 0 пиг 1393

институт нолш'лярной биологии км; в.а.знгыьгардта

на правах рукописи УДК 577.24:595.773.4

Ыогила Владислав Анатольевич

МОДЕКШРШЙ АНАЛИЗ ШСЕГЦИОНННХ НШВДЙ, ПОЛУЧЕННЫХ ЕРИ СОБИЩЕНИИ РАЭЮТЙ СИСТЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

нестабильности у тазошьА ыешгооаэрей

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕКеЕРАТ доссэртадаи на соисхакзэ ученой степанн кандидата бяо логических наук

ЙОСКВА - 1933

Работа вшюлкёна в Институте сбцей генетики вн. Н.И.Вавилова РАН, и Институте биологии гена РАН.

Научный руководитель: (

профессор, доктор биологических наук Т-И.ГерасЕмова

Официальные ошоненты: профессор, доктор биологических наук профессор, доктор биологических наук

С.А.Лимборскал 0. П. Самарина

Ведущее учреждение:

Институт биологии развития РАН

Защита диссертаций состоится

"

1993 Г

./Г

ас.

на заседании СпзцсалазироЕзвного совета Д 002.79.01

при Институте молекулярной биологии ш. В. А. Энгельгардта РАН

ио адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией шита ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологик РАН.

Автореферат разослан

»Л? "19°зг.

Ученый секретарь Специализированного созета кандидат хклических наук

Крпцкк

Большинство спонтанных мутаций у Drosophila neJanogaster вызвано гсерцлями мобильных генетических элементов (?innegan and Fawoett, >86; Leigh Brown, 1S83). К настоящему времени обнаружено песколько icTöM генетической нестабильности, йтвегствбнных за спонтанянй гтагенвз у D. melanogaster. ЭТО СИСТЭМН Р-М (Kidwell et al., 1979), -В (Blaokraan et al., 1987) И I~R Дйсгекеза (Bregliano et al., 1980).

каждой из них перемещается мобильные элемента одного класса: ранспозазозависимые р-эленент (Rubin et al., 1983) и hobo ï'amopoulos, 1987), или ретропозон - 1-элбМ9НТ (Baoheton et al., 984). Получены также система, в которых перемещаются етротранспозоны: МДГ4 (lim, 1986; Ким, 1986) и Сталкер (Георгиев и р., 1908, Герасимова и др., 1990).

Влияние мобильных элементов на гоном D. melanogaster ногообразно. Установлено, что они' могут вызывать: I)Возникновение нверсий, транслокаций и делеций как отдельных генов, так и больших частков хромосом. 2) Амплификации последовательностей ДНК. 3) зменение последовательности нуклеотидов внутри или вокруг генов. 4) ¡зменение экспрессия гевов. Последнее осуществляется тремя путями: Ополная инактивация гена в результате ннсэрции мобильного элемента в югулятсрпув зону ют экзоны гена; б)частичная инактивация гена юзяика в результате встраивания в нитрон и герлаяации транскрипции ■ена; в)энхансерзые или вромоторнпэ области семого мобильного >ле?.:ента, встроившегося рядом с началом транскрипции гена или на 5олыгом расстоянии от него, нарушают его экспрессию. По-видимому, ;огут существовать и другие мэхенизш взаимодействия мобильных ¡лэмептоз и генома хозяина. Поэтому, очевидно, актуальной является 5адача исследования шсбрцконннх нутаций, полученных в разных системах генетической нестабильности у г. melanogaster, направленная на выяснение закономерностей как транспозиций мобгльных элементов в цазшзх. системах, так и механизмов взаимодействия мобильных элементов с системой экспрессии тех. генов, в которые они внедрились.

ЦЕЛЬ И ЗЩЯИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью данной работы являлся молекулярный анализ инсерционатх. мутаций, полученных при совмещении двух систем нестабильности: Р-'И—гибридного дасгенеза и системы продленкой нзстабильности, в которой активно перемещался мобильный элемент Сталкер.

В конкретные задачи работы входило: I) молекулярное исследование цепочки близкородственных мутационных.

переходов в система супернестгбпльных мутаций в локусе singed, полученных при наложении двух систем генетической нестабильноста; 2) молекулярное исследование иркроды ряда .нугадай в локусе out и фадотшкчбских. рэвертантов, полученных в этой системе нестабильном!!.

ШЧНМ Н0ВИ2Ш. РАБОТЫ

Исслэдозано сошйствд супзрнестабильных нутаций в локусе singed, характеризовавшееся взаимными переходами аллелей. Показано-, что все эти перехода вызваны изменениями, зз-грзшвгщачи структуру инсерцин Р-элемента в докусе singed. Пргчэм супернастабильный характер исследованных мутаций опрздэлши размеры инсерций, их ориентация в локусе singed а также наличие двойных копий Р-элькеЕта. Исследована природа рада нутаций в локусе out, еознекеих на фона супэрнестабяльностя в локусе singed. Показано, что все out аллэли обусловлены делацлжи разного размера. Делеции возникли в резулы-ж неточного вырезания критического, т.е. ' ' не имэздего ншсакого фввотшжческого проявления Р-элешнта. Делеционнй анализ рэгулятораэй зоны локуса out позволил локализовать регуляторный цис-элемэят (энхансзр), опрадэлякзвй зксггрессиа гена out в крыловом шагшальном диско, йенотшшчэ скиа ревертант, полученный в данной системе нестабильности, сохранил в неизмененной Биде делецшо. Данше молекулярного клонирования, а тага® блот-анализа по Саузерну свидетельствуют о том, что реЕарсия обусловлена внедрением обильного элемента Сталкера днстальнее делевди. Поскольку никаких других изменений в локусе out не было обнарудано, это позволило сделать внвод о том, что именно Сталкер - (мобильный элемент ретровирусного типа) способен почти полеостыэ восстановить функцию гена out в крыловом имагинальном диске, пз-вЕдашму, за счет своих собственных энхансерннх последовательностей.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНёЛЕШЕ РАБОТЫ.

Диссертационная работа посвящэва в основном исследованию фундаментальных проблем механизмов шсерционкого мутагенеза. Полученные даннне, однако, могут представлять определенный практический интерес при • исследованиях, связанных с изучением функциональной рсш шбкльшх элементов и нх влияния на геном в целом и работу отдельны! генов. Как известно, мобильные элементы могут оказывать существенное влияние на работу прилежащих генов. Существуют примеры того, что инсерции мобильных генетических элементов вызывают наследуемые генетические дефекты или неопластическую трансформацию у

г

человека (Kaz.azian at al., 1908; Иогве et al., 1988). Поэтому изучение инсерцконных мутаций и их влияния на работу гэгоз поставляет материал, необходимый для понимания подобных процессов. До сих пор ошсаннке в литературе примеры. спонтанных инсерций мобильных элементов сзидетелъствовачи только об отрицательном вллянш трапспозонов на генв хозяина. В данной работе впервые представлены даннкэ о положительном (компенсаторном) воздействии мобильного элемента Сталкора на экспрессию гена out у Drosophila melanogsster.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основе:» научные результаты диссертационной работа докладывались па конференции молодых ученых Института общей генетики им. Н.К.Вавилова АН СССР (1933, 1989, I9S0), на 6-м Всесоюзном совещании по проблемам биологии а генетики дрозофилы (Одесса, 198Э), Цекяабораторнсм научном семинаре "Шлекуляркые и клеточные основы генетических процессов" ИОГен им. Н.'Л.Вавилова АН СССР (1990), на практических курсах по эмбриогенетике дрозофилы (Tubingen, ФРГ, 1990), на 12-й Европейской конференции по дрозофиле (Кадла,. ФРГ, I9SI), на кзкдукародеой школе по регуляции генов эукориот (о. Специ, Греция, 1992).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация излошна на "126 страницах машинописного текста, вклнчая Ъ таблиц),!7 21 рисунка и фотографик -и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (глаза "Материалы и методы", "Результаты*), обсуждения результатов, еыбодов, а также списка литературы, ншяащвго 1?; источников.

СОДЕРЖАВИЕ РАБОТЫ

Зушциа в локусе singed.

СуперЕОстабпльЕнэ мутации в локусе s.vnged с большой частотой (0,03) воааик&яа только при нажкввпа двух систем нестабильности : р-ii-мОрЕдного ДЕСгэнбза и продленной нестабильности (рис. 1а) (Ладвшценко, и др., 1989). Суперна стабильность в локусе singed изучалась генетически М.Д.Годубевским с созвторгш (1974-85). Исследовались молекулярное основы супэрЕгстабклыюоти вп-аллелей, возникших в условиях гибридного дасгеыеза (Roiha et al., 1983, Hawley ot al., 1988). Однако, в условиях сочетания двух систем нестабильности нзблюдалпсь ранее не описанные явления. Так, супершстгбильность в

локусе einged возникла на фоне ухе существующих супернестабильных мутаций в других локусах Х-хромосомы: yellow, оое1И1евв, white, и др., для некоторых аллелей характерны замкнутые циклы переходов аллелей друг в друга на протяжении многих поколений (рис. 16). Подобное было показано Голубовским на аллелях локуса singed, выделенных из природных популяций, однако в них отсутствовал Р-злемент (Голубовский и др., 1985), а супернестабильше аллели, описанные Энгельсом, в частности вп*. не обладали свойством образовывать замкнутые циклы переходов аллелей друг в друга, но образовывали стабильных производных: полных рэвертавтов вп+ и аллели с экстремальным проявлением признака enez (Engels 1989).

Т. о., при наложении двух систем нестабильности возникал ряд мутаций ь локусе singed, генетические свойства которых существенно отлзчалксь от таковых для ранее онисанных 2 литературе мутаций. В данной работе для молекулярного анализа было отобрано одно из семейств, аллвльше переходы в котором представлены в виде схемы на рис. 1в.

UyaajfDi в лову се cut.

На фоне супврнестабильности в локусе singed в условиях совмещения двух систем нестабильности - Р-М-гибридаэго дасгеваза и продленной нестабильности - часто возникали мутации в других локусах. Так, в X-хромосоме были обнаружены мутации в локусах «hite, yellow, оое1111евв, и др. (Ладвищенко, и др. ,1989). Но особенно часто, с частотой, на порядок цревышащей таковую для других локусов, возникали мутации в локусе out (б.СйхЮ-4). Фенотипически все out мутанты были разделены на три класса. Цричеы эти классы своим проявлением напоминали хорошо известные музейные мутации. Наиболее многочисленный класс мутантов, обозначенный otB, по феноишу напоминал музейные мутации ot6 и ot1®2. Мутации второго го численности февотипического класса напоминали мутации ot pN и обозначены otpNs. Третий класс был обозначен ot110, поскольку мутанты не отличались по фенотипу от музейного otn аллеля. ot11® мутанта были обнаружены двазда: в потомстве enh22a супернестабильного аллеля, а также в виде пучка' из двух самок в гомозиготной по Х-хромосомэ линии, несущей мутацию otpH2e (см. рис. 2). Последние, т.о., являлись рввартантаки и были обозначены ot026 (Ладвищенко, Могила, и др.", 1989).

ис. I. Мутации в локусе singed, а) Получение сутарнвстабильных n-аллелей. б) Схема аллельных переходов в семействе производных 5дернестабильного аллеля впв23. Стрелками указаны типичные алравления мутационных переходов, характерных для аллелей данного енейства. в) Родословная мутантов, исследованных в данной работе.

) РР

13

О j^eoV0 (М') х о" тс, <Р)

о С(1)ВХ, у I z о" у2во1ча0впех\вп+ (мозаик) *-1->

о" ^boW* о* y^oVW*

\

oVao1waGsn823

I

il l I 1

_+ „„hvf h. „„8 „„ex ш1 en sn ВП en

sri

S23

nm

БП БП

M

вав1 Bn+hw1 m+b1 snezu1

у

Рис. 2. Часть родословной, домонсгрирущая возникновение некоторых мутаций в локусе oat.

3^801waG (И') X о" тс 2 (р)

13

зп

а23

ct

hw1

„„h2a „4.3 ВП -»-Ot

вп

ех2

„hw2a

На

ot

H)t

,рН2в_

h.1

ot+pHle

1 t

anex1—нз-t^ s

,h3

en

ote— ¿n+h3

ВП -»• Ot

►Of

п2в

BnB*a ot23e

I L

ot

otP®23® enhff

en

pK5e

hw10

ot

4з

ot

ot +4s

5s

„h22a

fn3s

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Природа супернесааЗальных лувюций в мщсе вЬ^ей.

Поскольку все мутации в локусе были получены при

совмещении двух систем нестабильности, Р-М-гибридного дасгэнеза в продленной нестабильности, вызванной перемещением мобильного элемента Сталкера, возник вопрос об участии Р-элемента и Сталкера в индукции этих мутаций. С помощью блот-анзлиза ш Саузэрну супернестабильных аллелей в локусе вгпаес1,бшш обнаружены вставки различных размеров в области, соответствующей началу транскрипции гена. В табл.1

(

'абл. I. Природа сулернэстабильных вп-аллелей.

аллель размер сайты для эндояуклэаз

вставки ВаиШ МпсИП Эа11 ЕооЫ

„>1 вп 4,55 - + + +

вп 3,75 - + +

„„+М вп 1Д - - +

вп 1.0 - + - +

„„ехи1 вп 1,3 - + - -

в22 вп 0,1/0 + _ _

вп" - 2,1 - + + -

вп 1,3 - + _ -

Ериыбчания:

:) в алхз.ле шав23 паблвдается поликорфхзм: часть хромосом содержат ¡ставку около ОД яш, а друге« часть вставки пе икеет (сл. текст) !) вн.*; бпР1 - контрользна ши.

федстаапеш размзрн всгазох, далучэшых на основаыет давках Олот-яализе. Там ие представлены дгнше по наличшэ ж отсутствии са£тов ¡естсЕкпии для Езкоторкх характерна! зндозуклзаз в это*. вставках. На яс.З ирэдстаменн пзгсоторае ее радаоазтографэв, эта оонованки которых >нля сделаны соответствуйте нызода. Из табл.1 зпдвю, что размеры ¡ставок находятся в пределе* от ОД тин до 4,55 .тпн. ЫйксЕмальнай >аз;лйр вставок - 4,55 таи у суперна стабильного адтяя еам и 3,75 тпн ' оупераестьбзльюго аллзля. впЬиг1 - не соответствует по размеру Р-«¡энэзту (2,9 тпн), превшая последний ва 1.65 и 0,85 тпп, ;соткетств&ЕВо. Бе соответствует размер о тих вставок и Сталкеру (7,5 не). Однако, в них обнарултгется ряд характерах сайтов, похожих на ойфэдаление таковых у Р-элэмента. Более подробный шлэкуллрный ¡наетз показал, что изеерщта в обоих мутантах соответствуют деойпо5 ¡опии Р-элемента (рис.4), причем одна копил Г-элэмзнта полноразмерная, отда как другая делетгрована и содергшт 1,65 и 0,85 тпн [елетированного Р-злемента, соответственно.

Рис. 3. Блот-пйрндазация геномной ДНК различных вп-мутантов с плазмидой psn9. Геномная. ДНК обработана зндонуклеазаыи Hindill (а),(б), EcoRljXbal (в), BanHl (г). Для 'гибридизации использованы следующие лиш&: (а) I-enP1; 2-en+La; 3-en*5; 4-вп?6; 5-enexu1;

9„HR19с1.Шф«19. 7_0regotl R; 8-snp1; (б) I-Oregon R; 2-Bnw; 3-Bnh1; 4-an+h1; 5-ane1; W1"1; 7-Sn+hw1; 8-enexu1; 9-anP1; 10-Oanton S; (в), (г) I-Oregon R; 2-one:m1; 3-CantonS; 4-anh1; 5-en+h1; 6-впв23; 7-Bnhw1; 8-en+hwr.

1 2 3 45 6 78 1 234 56789 10

4 5 6 7 8

/-23 .1 £-22.4 —I9.(

ас. 4. Рбстриктше карты супернестабильных мутаций в локусе einged.

singed (Oregon R)

В X —i—i—

psn9 П IKSR

—1_' И I

BRHRHHH 5ТПН "" " ( t

_h1

hw1

„+Ы

H

-1—r~

X s

X s

fyw/itm

H R

I

Оба зллеля, еп1гн1 и вп'11, относятся к классам аллелей со слабым эоявлениеы мутантного признака и дают- в потомстве яирокий спектр эоизводных. В свою очередь, оба они были подучены в потомстве мутанта

' вРЧ

г 3. Молекулярный анализ последнего показал, что в локусе в1п§е4 зходатся вставка делегированного Р-элемента, размером около 100пн зм. табл. I);- Интересной особенностью мутанта впв2^ является злшорфизм: в части хромосом изменений на уровне Слот-анализа по эузерну не наблюдалось, хотя мутантный фенотип ("щетинки сильно • гарочены, извиты, волоски извиты") был одинаков у всех особей, взятых ля анализа. Следует откатить, что ДНК выделяли только из самцов, что эзволяло контролировать каждую Х-хрсмосому. Еце только у одного

R

Н

R

мутанта, ene1, наблюдался полиморфизм.

Аллель с. экстремальным проявлением признака, впеха1, так ке, как и ревертанты *en+hw1 и an+h1 относится к ''числу наиболее стабильных (производные ^возникали с частотой 0,002, 0,003, 0,001, •соответственно), что отразилось и в сходстве молекулярной структуры вставок (размера, соответственно, Г.Зтпн, 1,0тш, 1Дтш). Эти вставки представляют собой одиночные делегированные копии Р-элемеята, в отличие от их родительских аллелей вп?1*1 и enh1, в которых тестируются двойные копии Р-элвмента, а производные аллели возникали с гораздо большей частотой (0,082 и 0,585, соответственно). Таким образе»!, супернестабильдасть исследованных мутаций в локусе singed связана с наличием двойных копий Р-злемента.

Природа аутций в локусе out.

Все мутации в локусе out, как ухе отмечалось, возникли на фоне суперна стабильности в локусе singed в условиях совмещения двух систем нестабильности. Общая схема. возникновения мутантов и ревертантов представлена на рисунке 2. Поскольку все мутанты, полученные в этой системе напоминали по феютишча скому проявлению известные классические аллвлг (см. описание мутаций, исследованных в работе), то с помощью блот-аяализа по Саузерну бал просктанирован район, соответствующий вставкам ЩГ4 в мутациях ot6 и ot1®2 (Чуриков и др., 1987; Jaok, 1985). Никаких вставок в этом районе не было обнаружено. Вместо этого слева от места, соответствуицэго инсерции ОДГ4 в музейном мутанте ot6, тестировались делеции разного-размера. На рисунке 5 представлен один из радиоавтографов, а в таблице 2 представлены сводные результаты анализа всех мутантов.

Делении обнаружены щи гибридизации с зондом ра.з (Чуриков и др.,1987). Фенотипу otB соответствуют делеции размером от 2.2 до 3 тон, фенотипу ot5®8 - от 1.2 до 1.4 тпн. Фенотипу otm - делеция около 0.5 тпн. У ревертантов наблюдается даобнчная картина: полные ревертанты ot+4e и ot+pHlB не имеют никаких изменений в распределении полос гибридизации в этом районе и неотличимы в этом смысле от контрольных линий Oregon К и y23c1na0ct+. Только в районе, перекрываемом юшеы \а (Суриков и др., 1987), находящейся на расстоянии около 20 тпн справа от далеций, у ревертантов of1"*6 и ot+pNie быд tx^t^jpseH полиморфизм длины ре стршкционных фрагмейгов, что может свидетельствовать в пользу того, что эти мутанты - контаминация исходной линии. Далее возник вопрос: чем обусловлено возникновение

ю

Рис. 5. Природа мутаций з локусе oat. (а) Блот-тибрвдизация по Саузврну геномной ДНК различных ot-мутантов с плазмидой р8.3. ДНК обработана эндонунлеазой BsmHI. 1-ot+tar,enhw1, 2-ct+h1 an111, 3-ot+h1Bn+h1, 4,8-Oregpn H, 5,12-/^3 Vs, 6-ot+B23BnB23, 7-ot4s, 9-ot2B, l0-otpN2B, H-ot"2®. (б) Рестриктная карта части локуса out в координатах H.A.. Чурикова (Чуриков и др., 1937). рЗ.З - плазмида, содержащая EooRl фрагмент локуса, использованный для гибридизации в (а). Треугольник. показывает место инсерцни критического Р-элеменга. Под картой показаны место расположения и размера делений.

7 8 9 10 11 12 кЪ

9.5

- 6.7

- 4.3

2.3 2.0

рв.З

et

H R S R H В RHH BS S R HS

i i i Ii... 1 Ml 4 . i Ы

Н = Hlndlll R = EcoRI S = Sali В = BaraHI

et et

4s 2s

et

et tesj

-ZO О +20

'WT

1kb

Табл. 2. Структура out аллелей.

аллель район р8.3 район рв.4 район Ха

~ АЗтпн норма норма

• й^гворма ' норма полиморфизм

ot2в Л1,8тпн норма норма

о^в А2,5пш норма норма

Д2,2тпн норма норма

А1,эищ норма норма

о1рИ23в Д1,зтпн норма норма

о1;рИ5в д.1,4тпн норма ' норма

кл,2тпн норма норма

о1+рН1в норма норма полиморфизм

огп3в А<о,5тпн норма норма

о^8 А1,Этш V Сталкер • норма

о1п4в Д1.3ТШ V Сталкер норма

Примечание: L - деления, v - шсерцая, "норма" - означает, что в данном районе распределение фрагментов ДНК после рестрикции соответствущимк вндрнуклвазаш совпадает с таковым для линии дикого тина Oregon Rv

делеций? Чтобы ответить на него, были проанализирована нокоторые из исходных линий с супернестабильными мутациями в локусе singed, на фона которых и появлялись out мутанты. В результате блот-аиализа по Саузврну в районе, соответствупцем делецияы у out мутантов, т.е. в районе, перекрываемом зондои рз.з у всох орэдстаЕтгелей одного из семейств супернестабилъных eiuged аллелей были обнаругзны встаьки, рестриктннй анализ которых показал, что это всггвки Р-алекэнта или конструкций из нескольких копий Р-алвмеига (см. рзс. 5, дороккз 1,2,3 и 6). Т.о., в условиях Р-М-гибридного дасген&за критическая, т.е. не имеющая никакого фена гшюте ского проявления копия Р-элбйэата, вырезается, оставляя на своем мэсте да лещи разного размера, что приводит к вознихаовенга out-мутантов (рис.5).

Ревертанты ot02® и otn4s, которые представляют собой, по-видимому, пучек, сохраняют делацшо в 1.3 тпн, такую же, какуэ имеет мутант otpN2e, из которого они и были подучены (рис.2 и 5). Для того,

Рис. 6. Молекулярная природа ревертанта ot1*3. (а) Блот-гибридизация по Саузерну геномной ДНК различных ot-мутантов, -обработанной эндонуклеазой EcoRi, с плазмидой рб.4. I-Oregon R, 2-otpN2e, 3-ot1123, 4-jrBo1waG. (б) Рестршстная карта части локуса out. рб.4 - плазмида, содержащая ЕооИ фрагмент локуса out, использованный для блот-гибридизации в (а). Треугольник под картой показывает место инсерции мобильного элемента Сталкера, обусловившего реверсию otpH2B -»• ot"28, на фоне сохранения делении (показана черным прямоугольником под картой).

12 3 4

М> 10.4

6.4

3.5

Н R S

_J_I_L_

Н = HindHI R = EcoRI S = Sail В = BamHI

рб.4

-1

I-

R H В RHH ES S RE ■J-i-,---i-ш-u-—

~i— -«so

-IZO

cti*2*

ef

n2s

3' Stalker 5'

—i-1-1

-го о «о

) -wу

1Kb

чтоб! выяснить, что обусловило реверсию, был проскринирован протяженный участок локуса out от района делении до начала транскрипции гена, размером около 90 тпн -локус out относится к числу самих больиих локусов Droeophlla aelancgaster и имеет размер около

200 тпн. У ревертантов ot^®

>«Ые

такого полиморфизма,

наблвдавшвгося у ревертантов ot+2B и ot+4B, обнаружено не было, как не • было обнаружено и никаких других изменений в этом районе по сравнению с родительской линией и другими мутантами. Скрининг другое области локуса out, слева от делаций, соответствущей клону Хл (в таблице 2 это район, ' обозначенный рб.4 - по названию плазмида,

A I

Stalker | 5' |

A CV H С H

Г ' ■_l__!_L.

рЗ.З 1-

R = EcoRI S = SacI

V = EcoRV В = BaraHI H = Hlndlll A = БаиЗА С = Clal

Рис. 7. а) Рестриктная карта района локуса cut мутанта ot"2®, в котором находится мобильный элемент Сталкер. рЗ.З и р4.1 - плазмида, содержащие соответствущие фрагмента Сталкера и локуса out. б) Блат-гибридизация по Саузврну геномной ДНК мутанта at"28. ДНК обработана следующими ресгршстазаш: 1-Saol, 2-HindIII, 3-HinciIII + Saol, 4-ClaI,' 5-ClaI + SacI, 6-EcoRV, 7-EooKV + Saol, S-TvuII + Saol, 9-EsoRI + Saol. Гибридизация проведена с илазмкдой рЗ.З, содержащей: центральную часть Сталкера.

V Ш R Н S В R

_1_I_1_1_1_1_I

-1

р4.1 I-Н

i_; 1kb

Б

1 2345Б7ЙЙ

содеркащэй часть- клона Яа), показал наличие встав;м размером около 7 тпа. Поскольку эта вставка - единственное обнаруженное изменение з локусе out у этих ревертантов, мы предположили, что именпо она вызвала этот реверсный переход (табл. 2, рис. 6).

Предварительные данные блат-анализа показали размер вставки -около 7,5 шн, что позволило предположить, что эта кнсерция -

мобильный элемент Сталкер, поскольку ревертавтн Саля получены в условиях совмещения двух систем нестабильности, где подвижными являются Р-элемент и Сталкер. Для того, чтобы однозначно подтвердить предполокениэ о природе инсерции, было предпринято молекулярное клонирование данного района локуса out. Была создана геномная библиотека линии et®23. Часть этого района локуса была переклонированз з плазмзды рЗ.З и р4.1. Рестрпктная карта последних представлена на ' рис.7. Данные кросс-гибридизации с проклонироьанной ранее кашей Сталкера и ресгрикционное картирование вставки, однозначно доказывают, что это мобильный элемент Сталкер. .Для подтвервдешш молекулярной кзрты Сталкера была проведена гибридизация илазмида рЗ.З (рис.7а), содэркащей цзнтрэлшую часть Grappa, с геномной ДНК лтт et1"*25, расщепленной различная! вЕДонуклеазами, подобранными с таким расчетом, чтобы построить карту "усредненной геномной копии" Сталкера. Результаты гибридизации предстазлэнн на рис.76. На рисунке видно, что большинство копий содержит сайт для эвдонуклеазн EindXlI (плазмида р4.1 на рис.76), который отсутствует в копии Сталкера, полученной из yellow (Киселев и др., 1990).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

К настоящему времени накоплено большое количество данных о том, что мобильные элемента, прэдетавляздие собой основу подвитой часта генома (у Drosophila melaaogaeter они составляют 2/3 умеренно повторяющихся последовательностей (Young, 1979)), влияют на функционирование остальной, "стабильной" части генома, представленной мевдалирупцимя генами. Выделяют такие способы влияния мобильных элементов на гены и геном в • целом:, I) Возникновение инверсий, транслокацяй и делеций как отдельных генов, так и больших участков хромосом. Это изменяет способы наследования н рекомбинации. Т Drosophila melanogester это продемонстрировано в основном для Ч транетозазозависишх элементов Р и hobo (bim, IS88; Bogels, 1Э89), однако в такие процессы могут быть вовлечены и рэтротрансгозоны. В частности показано, что классическая мутация Ваг обусловлена дупликацией, на концах которой находится oopia-подобный элемент ВЮ4. 2) Ашлнфгкацая последовательностей ДНК (sins, процессироваяных псевдогвнов (Finnegan, 1989). 3) Изменение последовательности нуклеотидов внутри или вокруг генов (например, в результате неточного вырезания мобильного элемента). 4) Изменение экспрессии генов. Последнее осуществляется тремя путями: а)инактивация гена в результате

ннсерции мобильного элемента в регуляторную зону или экзоны гена (напрвмер, внсерция В104. вызвавшая мутацию wsp1 (Davidson et al-, 1985), инсерция oopia, вызвавшая нутацию wilâab11 (Binghaa et al., 1982, O'Hare, 1984); б)частичная инактивация гена хозяина в результате встраивания в интрон и терминапии транскрипции гена (например, инсервди copia, В104, blood, вызвавшие соответственно мутации wa, wbf,

wbl (Bingham et al., 1986-, Pirotta et al., 1984; Sachar et al., 1985); в)энхансерные или промоторные области самого мобильного элемента, встроившегося рядом с началом транскрипции гена, нарушают его экспрессию (например, МДГ4 в классической мутации у2 (Campuzano et al., 1985; Parkhurst et al., 1986), инсерция B104, вызвавшая мутацию

TJC -t

Antp (Soott et al., 1983) и инсерция gypey, вызвавшая мутацию Hw (Campuzano et al., 1986).

В работе описан новый, обнаруженный впервые случай взаимодействия мобильного гена и уникального гена дрозофилы, который нельзя свести ни к одному из вышеперечисленных типов взаимодействия. Он заключается в том, что мобильный элемент - Сталкер, встроившийся рядом с делецивй в регуляторной области гена out, вызвавшей ясно вцракекннй мутантннй фенотип (мутация otpN2s), полностью компенсировал эту делецию, тем самым привел к почти полному восстановлению функции гена и реверсии фенотипического проявления этого гена к дикому типу (ревертантн ct0^8 и otn4s). Каковы возможные механизмы этой внутригенной супрессии? Ранее генетическими методами локус out был разбит на две группы комплементации (Johnson, Judd, 1979), позднее были идентифицированы некоторые мутации, позволившие выделить шесть групп аллелей (Jack, 1985, Liu et al., 1991). Все исследованные в- нашей работе мутации по месту локализации относятся к зоне локуса, называемой' "зона слабых крыловых мутаций" (Jaok, 1985). Однако фенотипическое проявление большинства из них (классы otB и otpNs) соответствует гакоЕому у "сильных крыловых" мутаций (ot6,otMR2, ot1®^), которые традиционно относятся к другому, хотя к расположенному в непосредственной близости району локуса (Jack, 1985). Чем объяснить такое явное несоответствие литературным данным? Все до сих пор описанные инсерционные "сильные крыловые" ct-мутации были вызваны встройками мобильного элемена ВДГ4, или конструкциями на его основе, например, МДГ4 + хокэй, ЦДР4 + Геркулес (Чуриков н др., 1987), прячем эти шсерции локализованы в пределах довольно большого района локуса занимающего около 20 тпн, в то время, как инсерционные "слабые крыловые мутации" в этом локусе были вызвана инсерциями oopia и ВЮ4 (Jaok, 1985; Чуриков к др., IS87), кластеризованными в пределах

района, размер которого не более 0,5тпн. С другой стороны, известно, что НДГ4 имеет сильные энхансерша последовательности, способные взаимодействовать с энхансерами генов, в которые он внедрился (Campuzano et al., 1985, 1986; Parkhurst et al., 1986), что показано для гена yellow и ASC (см. выше). Наличие же аналогичного по силе энхансера у oopia и В104 по-видимому, исключается. Все эти данные могут свидетельствовать в пользу того, что в данном района локуса out должен находиться тканеспецифический энхансер, определищий работу гена при диффэренцировке крылового имагинального диска на стадии куколки (Liu et al., 1991).

Мутантннй фенотип, индуцируемый двлэциями, объясняется, очевидно, тем, что в данной зоне локуса находятся цис-регуляторные последовательности. О том, что это энхансэрные последовательности, свидетельствует тот факт, что с увеличением размера делеции фенотип становится более экстремальным. Т.е. образуется непрерывный ряд нарушений структуры энхансера, что согласуется с принципом модульной организации энхансерных последовательностей, когда делеции одного или нескольких модулей энхансерной зоны гена постепенно сводят на нет ее функцию (Huler et al., 1988). Т.о., свойства данной системы позволили обойти ограничения, накладываемые большими размерами локуса на * осуществление стандартного подхода для обнаружения регуляторных последовательностей - функционального анализа способности различных делеционвнх производных регуляторной зоны гена влиять на транскрипцию данного локуса.

Блот-анализ и клонирование ревэртанта ot"28 показали, что реверсия обусловлена вставкой полноразмерной копии Сталкера. В пользу того, что это активная, или полноценная копия, могут свидетельствовать литературные данные о том, что перемещаются, как правило полноценные ретротранспозоны (Boeke et al., 1989, 1991, Ильин и др., 1991). К тому se известно, что экспрессия некоторых ретротранспозонов • прямо « коррелирует с их способностью вызвать мутагенное воздействие на те гены, в которые они внедрились. Следовательно, эта копия Сталкера долина быть полноценной, по крайней мере в внхансарной области, чтобы быть способной компенсировать делению тканеспепифического энхансера локуса cut. На рис.7 видео, что 5' ДКП присутствует в этой копюс Сталкера. К тому же Сталкер ориентирован так, что его 5' ДКП находится рядом с делецией. Экспрессия многих ретротранспозонов, и, в частности, oopia-подобных элементов, находится под' строгим клеточным контролем (Parkhurst et al., 1987). Первичная нуклеотидная последовательность Сталкера гомологична таковой у мобильного элемента 412 (Киселев,

Coroes. неопубликованные данные), что также подтварздается проведенной нами кросс-гиОридазацаей проклонированной копии Сталкера с элементом 412. Сталкер, как и мобильный алемент 412 активно транскрибируется на . эмбриональной стадии, пэрзой стадии развития личинки, нэ транскрибируется на второй и третьей стадиях развития личинки и опять начинает транскрибироваться только Еа стадии куколки (Parkhurst et ai.s 1S37). Б то es время локус cut транскрибируется на эмбриональной стадии и стадиях куколки и шлага, тогда как на лкчиночеой стадии транскрипция полностью отсутствует. (Bloohlinger et al., 1998). Т.о., набладаетсЕ замечательное совпадение времени транскрипции Сталкера и локуса out, что может объяснять наблюдаемую супрессив. 5тот механизм Еозмокек, однако только в том случае, если предполагать, что Стажер содержит сильный з&хансер, аналогичный по силе, по крайней нарэ таковому у ВДГ4. К сохалэнЕю в настоящее время недостаточно данных, подтверЕдащих это предположение. Единственная прсклонированнап (помимо нашей) копия Сталкера встроена в вкзон гена yellow, тем самым инактнвируя его (нуль-фенотип, уЪ, к тому же- эта шсерция произошла на фоне мугеции у2 (шсерция М£Г4). Поэтова/ нам представляется возможным и ¿¡рутой вариант механизма супрессии. Он вкратце заключается в том, что ь результате делении в мутанте otpK2B часть энхансерной последовательности осталась ив затронутой н потоку способной все еще связывать факторы транскрипции, но с кеньшеЗ силой. Встраивание Сталкера рядом с энхансерсм в такой ориентации, что 5*дЮ1 находится рядом (известно, что именно в районе 5'ДКП наиболее сильные анхансеры у ретратранспозонов), поставляет свой комплекс факторов транскрипции -в результате происходит просто стабилизация всего комплекса, поскольку известно, что с увеличением количества фасторов транскрипции, связывающихся с энхансервши последовательностями, возрастает сила связывания суммарного комплекса с анхансвром (frankal et al., 1991), а также специфичность всего комплекса (Struhl, 1991). Возможно, что все вти факторы и приводят к наблюдаемой реверсии - т.е. восстановлении функции гена out при дайеренцаровке крилозого нмагинального диска.

Супернестабильизб мутации в локусе singed шзвакн инсерцеяма делетированного Р-элемента ели конструкциями из двух копий Р-элемента, делегированной и полнорвзмераой. В .штературе описаны супернестабильнне мутации в локусе Bingeа (Голубовский,1577; EngelB,I989), однако они по характеру и природа мутагенеза отличаются от исследованных наш (Ладвищенко и др., 1989). Так, Голубовский описал существование замкнутых циклов аллельнкх пароходов, однако в его системе отсутствовал Р-элемент и природа зтой супернестабильности

18

I

¡сталась неизвестной (Голубовстсий др., 1935). Супернбстабильннй io-лзль, описанный Энгельсом (Engsls, IS79), в условиях РЧНгабридного

+ ех г.

ззсгенезз дчвал только стабильных производных - вп и зп . Структура шеля вг? нааотдшэет таковую у на пах аллелей snh1 н snhw: хисзрция звоТ1яой шеи Р-эл&.»нта (Roiha &t ai.,. igaa). Однако, тем не менее, тгблвд-тся существенное отлятае: в впя обе копии до датированы я имеют зуммаршй размер около 2,1тля. В аанем случае одаа из коппй юлноразмерная я суккаркай размер вставки колеблется от ¿,7 до 3,7тпи. Зтабидьнно se реЕортзнтн аналогичны таковым у Энгельса: сохраняются анеерцаэ де.татироввпного Р-аяекзета. Нзйдаэннне нами молекулярные этягчпя, пря условаа постоянно поддергиваемого Р-М-гибрвдного дагенеза, по-вгдшгаму -к обусловили отлетая в характере наблюдаемого мутагенеза супэрнестабплыях аллелей or такознх, характерных для систем ошсанЕРХ Годубовским и Энгельсом.

Структура вставок в наиболее стабильная. производных наиэй системы, srtexu1, 5пмкг1 и Rn+h1, нашшнает структуру вставок в

~ -*- рх

стаоэльнах производных, исследованных Энгельсом: вг.'е вп . Принципиальное отличие заметается в tow, что мутанты в исследованной нака системе Есе не продолжают оставаться шсоконестабгхльнши, и, глазное,- образовывают занхнутне циклы взаимных переходов аллелей .врут в дртга- Сушрнастабильностъ з дохусе singed возникла на ряду с супэрязстабильностью в .аругих лохусах Х-хрсмосома. ТГо-вгдтае>.д этот мокэнт является зоттевш дач соъяспешя свойств данной системы супврнестабалшоста. Нате данные вполне согласуются с гипотезой, вредашагащвЗ, что генная конверсия я эктопические контакта играю? основную роль в процессе певгаецэшя Р-элемента (Gloor et ai., 1991). Так, структура вставок в назавнсшо палучавшх мутгнгах еа и. вп1 очень сходна. То кэ отеосяся }i к ргвертантач вп+11н1 и sn+h'. Естественно предположить, что благодаря эктотачоиам контактам локуса singed с расположенной з другой места Х-хроыосома конструкцией па основе Р-злэмэнта, ырсзсходгт, благодаря конверсии, перенос последовательности ДПК Р-зпемэнта. № жевм ноэдзожировать , этот процесс только рэгнстряруя мутадзи з локусэ singed. Возмонно , что однш из cafc'oa» с которым происходят контакты, является локус cut. Однако, в силу того, что вставки Р-элэмвпта з локусэ out фэнотипически никак не проявляются, это значительно затрудняет молекулярный анализ. Теп. не шнэе, и з локусе out нами были зарегистрированы изменегаш размеров вставок. Так, мутанта ot+hw1 snto1, oi+h1snh1, ot+il1 вп+м (дороют 1-3 на рас. 5а) имеют вставки Р-элемента размером около 3 теп, а мутант ot+e23snB23 (дорохка 6, рис. 5а) имеет вставку около 6

тоа. Именно из последнего и были получены все вп-мутанты, при этом наблюдалась четкая корелляция: размер вставки P-элешнта в локусе out уменьшался, а в локусе singed увеличивался, по крайней мере у двух мутантов: ot+ilw1Bnhw1 и ct+h1Bnh1. По-видимому, такой обмен последовательностями ДНК и обусловил то, что в данной системе супернестабильности взаимные переходы аллелей в локусе singed образуют замкнутые циклы.

вывода.

1. Исследована аа шлекулярном уровне цепочка близкородственных мутационных переходов в система супернестабильных мутаций в локусе einged, полученных при наложении двух разных систем генетической нестабильности.

2.Показано, что все эти переходы вызваны изменениями, затрагивающими структуру инсерции Р-элемента в локусе einged. Цричем сунернестабильный характер исследованных мутаций определяют размер инсерции, ее ориентация в локусе singed а такке "наличие двойных копий Р-элемента.

3. На молекулярном уровне исследована такхе природа ряда мутаций в локусе out и одного из фенотипичесжих ревертантов, полученного в этой системе нестабильности.

4. Показано, что все out-аллели обусловлена делэцшши разного размера. Делеции возникли з результате неточного вырезания критического, т.е. не имеющего никакого фзкотшшческого проявления Р-элемента.

5. Наличие делений в регуляторной зоне локуса out гоззоляот предположить существование регу¿шторного ппс-злвкэнта, затрагиваемого этими делециями и локализовать его в данном районе.

в. Февотшшчбский ревертант, otп2в, подученный в данной системе нестабильности, сохранил в неизмененном вида делециа. Данные молекулярного клонирования, а такке блот-анажза по Саузерну свидетельствуют о том, что ревзрскя обусловлена внедрением мобильного элемента Сталкера дастальнзе делеции. Поскольку никаких .других изменений в локусе out не обнаружено, ато позволяет сделать пывод о прямом участии мобильного' элемента Сталкера в почти полном восстановлении функции гена out в соответствующих тканях.

7. Тагам образом изучение молекулярной природа кнеерцяонных мутаций, полученных при совмещении разных систем нестабильности у Drosophila nelanogaster позволило Сбнврупггь И исследовать ряд модельных систем регуляцзи экспрессии генов singed, и out.

. СПИСОК РАБОТ, ОПУНЛЖОВАИШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. .Moniла В.А., Герасимова Т. И. Внугригенная супрессия: мобильный

о лтгртатт» ПфР rvar» а Л е» илч'ат ттгу тто,->г»»тч.г» vr.ifrrarrr'trrvi'Oü'P'C

■jJiVi'.GIli V/ i Cwutk/p I WA^/Vm^iHiHWt W-» iT.vJil».^ i. ttuuuiw UWU^/U^U 4 L>

шутригенвую далецив в доку се out у Drosophila nelanogaster.//Доклада АН ССОР, 19Э1, Т.321, Ä5, С.1269-71.

2. Mogila V.A., Ladvishohenko A.B., Slmonova O.B., Geraslmova T.I. Intragenic suppression: Stalker, a re trovirua -1 ike trariBpoaable element, oan conpensate for a deficiency at the , out locu.3 of Drosophila melanogaster.// Genetica , 1992, 7.86, No. 1-3, P. 305-311.

3. Ладвищенко A.B., ffonuia B.A., Георгиев П.Г., Буйф E.U., Салонов?. O.E., Герасимова T.II. Супернэстабилыше система у Drosophila malanogaster: анатаз мутаций в локусах out и sieged.// Генетика, 19Э0, Т.26, .W, С. 1133-43.

<

4. Ладвкгакко A.B., Могила В.А. Индукция нехваток в локусе out с гемощью Р-элемента.// 6-е Воесовзпов созэщангэ по проблемам биологии я генетика дрозофилы. Тезисы докладов. Одесса, 1989. С.Е5.

5. Gsrasiinova. 'ГЛ., Y.A.Uosila, y.A.Khätipova, E.H.Euff. Different systems of geastio instability in Drosophila melanogasier// 12th European Drosophila Conference. Abstracts. September 2nd-6th, 1991. Haina, FRG.

«