Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Специфический водорастворимый ГТФ-связывающий белок из обонятельного эпителия крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Специфический водорастворимый ГТФ-связывающий белок из обонятельного эпителия крысы"

"РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БЙОвМЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

Пешенко Игорь Владимирович'

УДК 612.68

СПЕШШЧЕСКШ ВОДОРАСТВОРИМЫЙ ГТФЧШЯЕИВАШИИ БИТОК ИЗ ОБОНЯТЕШЮГО ЭПИТЕЛИЯ КРЫШ

Биохимия 03.00.04

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 1995

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, Новоселов В.И.

Оф&щиальные оппоненты : Доктор биологических наук.

Камзолова С.Г.

кандидат биологических наук, Щипакина Т.Г.

Ведущая организация - Филиал Института биоорганической химии РАН

Защита состоится 1ЭЭ5 г. в -тУ час на

заседании Специализированного Совета Л 200.23.0I. по защите докторских диссертаций по специальности "биохимия" при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г. Пущина. ПЕК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, Пущино .

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

аытчго ттсгт/лотч. фо>ш ио тгт1л ттотлоио пол^фьт

/ц« а д и^л-'ллч/^ л и 1 ииш а ни 1 v ^ и у и^^ии^

посвященные органам обоняния, появились еще в середине прошлого века, обоняние до скх пор является одним из наименее понятых видов сенсорной рецепции. Все предложенные к настоящему времени модели трансдукции сигнала в обонятельной рецепторной клетке включают в качестве ключевого компонента регулятсрнке ГГФ-свяэывапцие белки (О-белки), причем обнаружение двух запах-зависимых систем вторичных мессешшеров подразумевает участие по крайней мере двух разных типов С-белков ГЬапсег, 1956; ВоейтоГГ ег а1., 1990]. В то не время отсутствуют прямые доказательства связи конкретных О-белков с другими компонентами системы передачи сигнала в обонятельной рецепторной клетке. Таким образом, особая роль С-белков в качестве связующего звена мевду рецептором и эффектором делает их изучение весьма перспективным для понимания молекулярных механизмов обонятельной рецепции. Однако, рассматривая место регуляторных ГТФ-связывапцих белков в системах трансдукции сигнала, не следует ограничивать внимание только в-белками. В обонятельном эпителии некоторых животных были обнаружены другие ГТФ-связыващие белки, ассоциированные с запах-связывашими гликопротеидами ШоУОзе1оу ег а1.1989; Гезейсо et а1. 19881. Хотя по ряду формальных признаков эти белки нельзя было отнести к классическими С-белкам, некоторые их свойства, тем не менее, указывали на регуляторные функции данных белков.

Цель работы. Цель» данной работы было идентифицировать и исследовать по возможности все ГТФ-связыващие белки (не только в-белки) из обонятельной рецепторной клетки и попытаться определить их функции.

Научная новизна работы.

1. Впервые в обонятельном эпителии крысы был обнаружен специЯи-чесний водорастворимый ГТФ-связыващий Селок (белок 45кДа).

2. Показана видовая и тканевая специфичность бежа 45кДа. Аналоги белка 45кДа обнаружены в обонятельном эпителии хомяка и морской свинки.

3. Белок 45кДа локализован в цитозоле обонятельных жгутиков и обонятельной слизи, и составляет значительную часть (порядка г%)

всех водорастворимых белков обонятельного эпителия.

4. Белок 45кДа взаимодействует с поликлональиныи антителами, выработанными против синтетического пептида, соответствующего участку аминокислотной последовательности. общему для а-субъедзниц всех известных О-белкоЕ.

5. Обнаруженный ГТФ-связывавдий белок был выделен в чистом виде. Он существует в растворе в виде мономера и выявляется яри ДДС-электрофорезе как полипептид с молекулярной массой около 45кДа. Изоэлектрическая точка белка - 5.2-5.3.

6. Белок 45 кГа эффективно связывает ГТФ.

Практическая ценность. Полученные в диссертационной работе теоретические и методические результаты могут быть использованы для более глубокого понимания молекулярных механизмов обонятельной рецепции, особенно при анализе событий, происходящих в обонятельной слизи. Использованные в работе методические подходы могут быть такие применены для выявления других ПФ-связыващих белков в различных тканях организма.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении настоящей работы, докладывались на семинарах лаборатории биофизики рецепции ИБК РАН, на еЕе годной Конференции Института биофизики клетки РАН (1994 г.), на YII Всероссийском Симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Москва, 1992), на Международной Конференции "Mechanisms of sensory chemoreceptlcn In vertebrates" (Пуыино, 1992),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы (Гл.1), описания материалов и методов, использованных в работе (Гл.2), изложения полученных результатов и их обсуждения (Гл.З), выводов и списка литературы из 205 наименований. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Приготовление антигена. Аминокислотная последовательность синтетического пептида, соответствующая общему для а-субъединиц всех типов G-белков участку ( CGAGESGKSTIVKCSiK ), была взята из [Mumby et al., 1966]. Пептид был синтезирован в ФИБХ РАН.

Кояывгащга пептида с ш осуяествлялась га N-кснеи. как описано в [Tarara et з!.. :933J.

" Пркго:тоз.летите " вояпушзльгяг гятятелг ^1уягояя«-ярй*ян«яг---зрозодаа.кал огакзяз ylIFIascfc st al., . Д.чтхгел (203 чкг; смешивали с полным адьявантом Арейвдз в соотношении 1:1 (ойшиа ооvi» i ил i а провопила внутржоад*» аиьекиюк з спин? s 15-20 точках. Через ?С лвев право sí', ли повторяло явиугатюго ;20С ккг згпсзк:«*, mrozxri ■«жяг.пзтг: Зройпэт. Tepe? 10 сяе* irw а^утем;«:;; Срк-Ж ил кроки яг оталллл "¡/зпрптгг;1,

ьэделекие обонятельных и'утйков. крыи декаинхиройала, сптгрииято pni-oBVin по.ппптк й извлекали обонятельный эпителий. I 1ГУ-.ИОТО ^VHWli П^й 1»к'|иГ»гй« В flSCT&ÜO ¿»"Jiütíbu tüul'úw^'^

ffiodlfied Eagle's Medium, ШЕ), pH 8.0, при 4°с. Затем ткань дважды промывши тем ке раствором. Обонятельные кгугакп получали обработкой обонятельного эпителия 10 sil Са2+ fAnholt et al.. 1986] в ВНЕ двавды по 20 мин. Дециллированнь® обонятельный эпителий отделяли центрифугированием в течение 5 мин при IOOQxg. Супернатант, содержащий жгутики, центрифугировали в течение 15 мин прл I200Gxg. Супераагант собрали ("Са2+-экстрактн). а осадок, содержаний а'ушш. прошш лватда Ей. ТТревяггас агутада суспендировали в 10 пМ Тг.1з/НС1, 3 пй MgGL,, 1 Ш ЭД7&., рН 3.0 я центрифугировала 30 мнн при 20000xg. Супернатант собрали ("шгго-золь згутаков"), а осадок ("мембраны жгутаков") прошли два раза тем ке раствором. Во всех экспериментах использовали только свежевнделешше ягутшш. В случае удаления обонятельных кгутиков кратковременной обработкой детергентом, обонятельные выстилка крысы, морской свинки и хомяка осторожно прошва ли DME, рН 3.0, 4°С. Жгутикн удаляли кратковременной ( 1-5 мин) обработкой 0.33 раствором Тритона Х-100 в ШЕ. Затем тритоновые экстракты центрифугировали двакды по 20 мин при 2CC00xg.

Выделение и очистка белка 45 кВа. крыс декапиткровали, вскрывали носовую полость я извлекали обонятельный эпителий. Обонятельный эпителий собирали в ШЕ, рН 8.0, 4°с. Затем ткань таяли промывали ШЕ и гомогенизировали при помоют стеклянного гомогенизатора Эльвейхекка-Поттера в том se растворе. Гомогеяат центрифугировали 5 мин при 50Qxg, супернатант повторно двакды центрифугировали при 20000xg, затем диализовали в течении ночи трогав раствора А при 4°с (раствор А: 12 шМ Trls/HCl, 1 mM

MgCl2, 1 шМ Ш. рН 7.8) для уменьшения ионной силы. После диализа экстракт наносили на хроиатогрэфическую колонку (305 х 12.5 им), заполненную гелем ДЭАЭ-сефароза (DEAE-Sepharose. Pharmacia) и предварительно уравновешенную раствором А. Белки элшровали линейным градиентом Nací (0 - 500 вм) в растворе А при 18 - 20°С. Длина градиента 750 мл. скорость элюции 0.7 мл/мин. Фракции, содержащие белок 45к0а, после концентрирования далее разделяли гель-фильтрацией на колонке с гелем Sephacryl S-200 (820x16 мм). Колонку элшровали буфером: 25 ИМ Tris/HCl, 100 mH NaCl, 1 mM HgCl2, 1 пЯ ДТТ. рН 7.8. скорость элюции - 0.6 мл/мин, t°- 4°С. фракции, содержащие белок 45Ю>а, собрали и при небходимости концентрировали.

ДДС-электрофорез и иммуноблотинг. Электрофорез в полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДЦС) проводили ш методу Лзммли ГЬаештП, 1970]. Окрашивание белков в геле проводили 0.1% Кумасси R-250 или серебром по методу Окли [Oakley et al.. 1980]. После ДДС-электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозу Hlbond С (АшегзЬаш). Блоты блокировали 1Ж оваль-бумином в течении ночи при 4°С и проводили стандартные иммуно-ферментаые реакции. Инкубация с первичными антителами длилась 1-2 часа при 20°С. В качестве вторичных антител использовали антикроличий ч-глобулин с коньюгированной пероксвдазой хрена. Образовавшийся комплекс визуализировали при помощи 3' ,3- диами-нобензидина.

Иммуногистохимия. Перед выделением ткани обонятельного эпителия крыс перфузировали IX раствором формальдегида в 20 мМ фосфатном буфере, содержащем 0.15 Ы NaCl. Выделенную ткань постйпссировали 41 раствором глутаральдегида. Иммуногистохими-ческие исследования на уровне световой микроскопии проводили на парафиновых срезах (10 мкм) по стандартным методикам, используя в качестве вторичного антитела антикроличьи антитела с присоединенной пероксидазой хрена [Kuhar, 1978]. В качестве пероксидазного субстрата использовали 3',3-диаминобензидин или З-амино-Э- эталкарбозол.

Изозлектрическое фокусирование (ИЭФ). Аналитическое изозлектрофокусирование проводили на комерческих голиакриламид-ных пластинах "Amphollne pacíate, pfí 4.0 - 6.5 (1KB)". Концентрация акриламада - 5í, процент поперечной. сшивки - 3%. ,

концентрация ам$олинов - 2.2*. Гель окрашивали серебром ш методу Окли [Oakley et al.. 1980J.

фото-аф$инное метение. Непосредственное фотоаф&шное

_оа_

мечение белка [а- РЗГТФ проводили в соответствии с [Antonoff et al.. 19Y61. Образец (10-30 мкг белка) разбавлялся до 200 мкл буфером ( 25 ЕМ Trls/HCl, 100 за NaCI, 1 яМ MgOl,. 1 шМ ДГТ, рН

ор <~ -

7.5), содержащем 7 мкКи fa- PJ-ГТФ и другие добавки (см. "Результаты и их обсуждение"). После предварительной преинкубации без ультрафюлетового облучения в течение 10 мин. образец помещали в кварцевую кювету и подвергали ультрафиолетовому облучению при 253.7 нм в течение I часа с расстояния 10 см. Реакцию останавливали добавление ТХУ конечной концентрации 2056. Далее афЕинно-меченые белки выявлялись посредством ДКС-электрофореза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Одним из наиболее важных свойств обонятельной рецепторной клетки является то, что в ответ на запах меаду взаимодействием пахучего стимула с рецептором и генерацией электрического потенциала существует промежуточная стада: связывание рецептора с запахом запускает механизм вторичных мессендаеров. Это было показано как при изучении кинетических характеристик электрического ответа обонятельной клетки на стимул, так и в прямых биохимических экспериментах. Сейчас в обонятельном нейроне обнаружены две такие системы: одна действует с участием цАМФ. другая - с участием инозитслтрифосфзтов. Не исключено, что имеются и другие системы. Важным моментом при этом является то, что обе системы функционируют с участием регуляторных ГТФ-связыванщх белков (G-белков). Кроме того есть основания предполагать. что, если существуют другие, неизвестные пока пути транедукции сигнала, то они тоже скорее всего функционируют с участием G-белков или их аналогов. Соответственно, как при поиске других систем транедукции сигнала, так и для выяснения самого механизма передачи сигнала, основной упор логично было бы сделать на выявление различных ГТФ-связывапцих белков в обонятельной рецепторной клетке.

Для решения этой проблемы было использовано одно из харак-

тервых свойств С-Оелков: все они обладают некоторой структурной гомологией. Б частности, участок связывания 1*ГФ а-субьединицей б-белков относится к одному из наиболее консервативных фрагментов их аминокислотной последовательности. Более того, этот участок присутствует таете и в некоторых других ГТФ-связыващих белках, что в данном конкретном случае оказалось даже желательным, поскольку получив к нему антитела, можно фактически иметь инструмент для выявления многих ГТФ-связыващих белков, а не только О-белков. После синтеза соответствующего пептида, были получены антитела к такому участку ( антитела к а-субъединице О-белков), которые были использованы в дальнейших исследованиях.

В настоящее время общепризнано, что обонятельные рецептор-ные элементы и компоненты системы трансдукшш сигнала локализованы в поверхностном слое обонятельного эпителия, а именно в районе булавы и обонятельных жгутиков. Поэтому на первом этапе именно они стали предметом исследования. Жгутики выделяли из обонятельного эпителия посредством так называемого "кальциевого шока" [АпИоИ ей а1.. 1986]. Процедура кальциевого шока состоит в повышении концентрации ионов кальция до 10 шМ, при которой происходит отделение хемосенсорных жгутиков от обонятельной рецепторной клетки. При этом жгутики остаются практически целыми, поскольку сама процедура проводится в изотоническом растворе. На рис. 1А приведены результаты тестирования экстрактов, полученных на различных стадиях выделения обонятельных жгутиков, при помощи антител к а-субьединице О-белков. Первое, на что было срззу обращено внимание, зто то. что антитела выявляли в мембранах и цитозоле обонятельных жгутиков разные белки. Что касается мембран, то тут ничего нового к тому, что уже описано в литературе найдено не было, тогда как относительно водорастворимого бежа с молекулярным весом 45кДа в литературе какие-либо сведения отсутствовали. Поэтому в дальнейшем основное внимание было сосредоточено именно на нем.

Выявленный белок, который далее в тексте будет упоминаться как "белок 45кДа". обнаруживался практически на всех стадиях выделения жгутиков, причем он экстрагировался из ткани даже при очень мягких промывках обонятельного эпителия изотоническим раствором. Исходя из этих данных, можно было . предположить, что он локализован в цитозоле жгутиков и постепенно выходит в

б

А

4 3 2 1

Б 2 1

Рис. 1. №®|уноблотинг различных экстрактов обонятельного эпителия крысы против специфических антител к а-субъедашцам б-белков.

A) Экстракты, полученные на различных стадиях выделения обонятельных хгутиков: 1) промывка обонятельных выстилок

2+

раствором Дулбеко; 2) иСа -экстракт"; 3) цитозоль изолированных жгутиков; 4) мембраны изолированных хгутиков.

B) Тритон Х-100 экстракты обонятельного эпителия крысы: 1) 1-минутная обработка; 2) 5-минутная обработка

Разбавление первичных антител- 1:150

Рис. 2 Иымуногистохидаческий анализ обонятельного эпителия кры-гы. Первичное антитело: антитела против а-субъединшхы 0-белков.

Т

раствор вследствие неизбежного повреждения жгутиков в процессе иг выделения. В пользу этого же предположения говорили и результаты экспериментов по кратковременной обработке обонятельного эпителия детергентом (рисЛБ). Кратковременная обработка эпителия раствором Тритона Х-100 (I мин), по-видимому, приводов только к удалению слизи и частичному разрушению жгутиков, в результате чего экстрагировался главным образом белок 45кДа. тогда как более продолжительная обработка (5 мин) вызывала также экстракцию мембранных белков и на иммуноблотах выявлялась полоса соответствующая полипептиду из мембран обонятельных жгутиков (рис. 1А).

То, что белок 45кДа локализован в поверхностном слое обонятельного эпителия подтвердили и иммуногистохимические исследования с использованием антител против а-субъединицы С-белков (рис.2). Антителами интенсивно окрашивался только поверхностный слой в котором локализованы обонятельные жгутики.

Белок 45кДа обладает тканевой специфичностью. Цри помощи антител были протестированы другие ткани крысы: мозг, как образец нервной ткани, печень, богатая (Ьбелками и ткани, имеющие хорошо развитый эпителий - легкие и соскобы слизистой оболочки кишечника. Поскольку белок 45кДа является водорастворимым, эти ткани обрабатывались без использования детергента. Как видно на рис. ЗБ, аналогичные белки не были найдены в других тканях, что говорит о тканевой специфичности белка 45кДа.

Аналоги белка 45кДа обнаружены в обонятельном эпителии других видов млекопитавдих: при помощи антител против а-субъединиц в-бежов в обонятельном эпителии хомяка и морской свинки были обнаружены аналоги белка 45к1а (рис. ЗА).

Для дальнейшего изучения свойств белка 45кИа он был выделен в чистом виде. В качестве источника для выделения белка 45кДа использовали экстракт обонятельного эпителия крысы, полученный при обработке обонятельной выстилки изотоническим раствором. Полученный экстракт хроматографировали на ДЭАЭ-Сефарозе в градиенте хлорида натрия. Белок 45кДа элюировался с колонки в виде отдельного пика в значительно очищенном виде, однако для его дальнейшей очистки фракции, содержащие белок 45кДа, далее подвергали гель-фильтрации (рис.4. 5). Выход очищенного белка 45кДа составлял порядка 15-20 мкг на обонятель-

А Б

3 2! 321

«м'м^'*."« " «ж» • • , —

— 36

Рис. 3

А) Видовая специфичность белка 45кДа: 1) крыса; 2) хомяк; 3) морская свинка. 1-минутный тритон Х-100 экстракт обонятельного эпителия

Б) Тканевая специфичность белка 45кДа: 1) водорастворимые белки печени; 2) водорастЕовдаае белки мозга; 3) нСа -экстракт" обонятельного эпителия крысы.

Иммуноблотинг против специфических антител к а-субъедини дам С-белков Разбавление первичных антител 1:150.

ную выстилку одной крысы. Учитывая потери при выделении, а также тот факт, что белок 45кДа локализован в поверхностном слое обонятельного эпителия, можно предположить, что локальная концентрация белка 45кДа в ткани на самом деле значительно шве. По приблизительным оценкам белок 45кЯа составляет примерно 2% от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия и тем самым является одним из йсновшк бежов обонятельного эпителия.

Очищенный белок 45кДа представляет собой водорастворншй белок и выявляется при электрофорезе в присутствии додецклсуль-фата натрия как полипептид с молекулярной массой около 45кДа. Приблизительная оценка молекулярного веса нативного белка методом гель-фильтрации указывает, что он существует в растворе в виде мономера. Его изоэлектрическая точка была определена и оказалась в районе 5.2- 5.3 единиц.

В последувдем были определены некоторые функциональные свойства обнаруженного белка. Сказалось, что белок 45кДа эффективно связывает ГТФ. Фотоаф!инное связывание меченного ГТФ ингибировалось немеченным ГТФ, в то время как АТФ не оказывал ингибируицего влияния, что говорит в специфичности связывания ГТФ белком 45кДа (рис. 6), В изотоническом и тритоновом экстрактах обонятельного эпителия кроме белка 45кДа выявлялся также еще один ГТФ-связываший белок с молекулярной массой

9 |:1 Ц МИИй^ мы II

Ъ6

66 67 68 69 7О И 72 73 74 7£ Т6 77 Номер фракции

Рис. 4 Хроматография на ДЭАЭ-сефарозе изотонического экстракта обонятельного эпителия. Электрофорез полученных фракции

А^ао

0.05

аоч

о.сз.

О. <32

0.01

Номер фракции

г? - »... ^

¿8 ВО 32 .VI ль 29 51 35 55 37

Номер Фракции

й Рис-5

Хроматография на Сефа-

5 ! 1ГПГ1 по г" _ '> ^ v > п е/т ттг^

73-76, собранных при хроматографии на ДЭАЭ-Сефарозе.

Электрофорез полученных фракций.

I 2 345678

Рис. 6. Фото аффинное течение белка 45кДз цри помощи [Р1-ГТФ.

«

1) Тритоношй экстракт обонятельного эпителия. 7 мкКи [ РЗГТФ

2) Изотонический экстракт обнятельнаго эпителия, 7 мкКи [^2Р]ГГФ

•»о

3) Очищенные белок 45кДа, 7 мкКи [¿хП-ГТ®.

4) Очищенный белок 45кДа, 7 мкКи Ц-Р1-ГТФ, 5 нМ ДТФ

5) Очищенный белок 45кДа, 7 мкКи ц£р]-ГТФ, 5 МЫ АТФ

6) очищенный белок 45кДа, 7 мкКи [¿ХР1-ГГФ, 5 нК ГТФ

7) очищенный белок 45кДа, 7 мкКи [^гр]-гтФ. 5 ИХ ГТ®

8) Очищенный белок 45кДа, 7 мкКи [Р]-ГТФ, без облучения УФ

примерно 55-56кДа (рис, 6). Это мог бить тубулин или обнаруженный ранее в обонятельном эпителии крыш ГТФ-связывапаий белок 55кДа ГОотозеЮт ег а1.1969: РезепКо а1. 19885.

Очищенный белок 45кДа обладает также ГГФ-азной активностью, которая составляла 10 ншль/мг/мин. Кстати, эта величина ПФ-азной активности типична для известных 0-белков.

Повшпенный интерес к белку 45кДа вызывает тот факт, что он содержится в обонятельном эпителии в значительных количествах и составляет примерно 2% от всех водорастворима белков обонятельного эпителия. Несмотря на то. что нам удалось выделить и частично охарактеризовать белок 45кДа. его функции тем не менее остаются невыясненными. Семейство ГТФ-связыващих белков доволь-

во многочисленно и наиболее изученными его членами являются (а) факторы, участвуйте в биосинтезе белков; (б) регулягорные 0-белки: (в) протоонкогенные газ-белки (г) ряд низкомолекулярных ГТФ-связываюиих белков, включащих в себя продукты гей, гор. rho и др. генов, известных как "малые G-белки"; (д) тубулин; (е) некоторые ферменты, такие, как сукцинат тиокиназа и фосфоенолпи-руват карбоксикиназа. Из всех перечисленных белков характеристиками. близкими к характеристикам белка 45кДа, могут обладать только G-белки, точнее их а-субьединицы. Действительно, по некоторым формальным признакам можно предположить, что белок 45кДа является а-субьедишцей одного из регуляторных G-бежов. возможно Gg (GoiI). а-субъединица которого имеет молекулярный вес порядка 45кДа CJonea, Reed, 19891. Самым сильным аргументом в пользу этого предположения является способность антител против а-субъединиц G-белков выявлять белок 45кСа. Кроме того, GQlf так «г. как и белок 45кДа. локализован в поверхностном слое обонятельного зютелия и есть данные, что а-субъедшшш G-белков. в принципе, могут обнаруживаться в цитоплазме клетки CManla-Parnell, Farboan. 1990; Spiegel, 19681. С последним Фактом хорошо согласовывалось обнаружение белка 45кДа в Са2+-экстракте обонятельного эпителия и цитозоле обонятельных жгутиков. Первоначально возникло предположение, что основная часть белка 45кДа содержится в жгутиках и выходит их них при разрушении жгутиков кальциевым или осмотическим шоком. Однако, когда белок 45кДа был выделен в чистом виде, нами не были обнаружены ß- и т-субъединицы. как это было в случае единственного водорастворимого Г-белка фоторецепторной клетки - транеду-цина. Можно было предположить, что в условиях наших экспериментов ß/7-комплекс остается прочно связанным с мембраной. Хотя в самом данном факте нет ничего удивительного, поскольку это является общим свойством ß/7-комплекса всех известных G-белков (за ислючением транедуцина), казалось чрезвычайно странным почти полная диссоциация белка 45кДа от гипотетического ß/7-комплекса. К тому же ничего подобного, по крайней мере в таких масштабах, не наблюдалось у других G-белков. что подтверждается и нвшими собственными экспериментами при выявлении тканевой специфичности белка 45кДа. Вскоре было установлено, что на самом деле в обонятельном эпителии содержалось значительно больше белка 45кДа, чем

его можно было извлечь процедурой кальциевого шока, причем белок 45нДа хорошо экстрагировался из ткани при гомогенизации ее в изотоническом растворе. При этой процедуре клетки остаются практически неповрежденными и кажется маловероятным, что такие значительные количества белка 45кДа могут выходить из относительно целых жгутиков. В связи с этим остается сделать вывод, что белок 45кДа или по крайней мере большая его часть, локализована в слизи обонятельного эпителия, либо слабо связана с внешней стороной мембраны жгутиков или других клеток обонятельного зпитела-я. Соответственно, в этом свете, предложенная выше гипотеза, которая отводилз белку 45кДа роль а-субъедишщы С-белка, скорее всего неверна. Тем не менее, была предпринята попытка рнбозили-рования белка 45кДа холерным и коклшным токсинами, однако, по предварительным данным белок 45кДз, вероятно, не является субстратом этих токсинов и следовательно по этому признаку его нельзя отнести к О-белкам. № также попытались определить первичную структуру белка 45кДа, но попытка использовать стандартную процедуру с использованием секвенатора потерпела неудачу ввиду того, что что К-конец белка 45кДа оказался закрытым, что, кстати, является характерным для известных С-белков.

Электронно-микроскопические исследования, проведенные в лаборатории (Попов и др.19921, показали, что обонятельная слизь обладает сложной структурой, подобной цитоскелету клетки. Такой цитоскелет в клетке обычно образуют тубулин- или актиноподобные белки. Учитывая большое содержание белка 45кДа в слизи, разумно было предположить, что он может являться одним из главных компонентов этого цитоскелета. Более того, по молекулярному весу и изоэлектрической точке белок 45кДа подобен актину, хотя субстратом для актина является АТФ, а не ГТФ. При определенных условиях актин легко полимеризуется, образуя характерные нитевидные структур!, которые хорошо выявляются электронной микроскопией. Были сделаны попытки аналогичным способом провести полимеризацию белка 45кДа» однако электронно-микроскопический контроль не выявил образование нитей. Более того, белок 45кДа обладал глобулярной структурой.

Таким образсял. невозможность на данном этапе работы отнести белок 45кДа к какому-либо относительно хорошо изученному классу белков сильно усложняет задачу определения его функции. 1итера-

турные данные, касающиеся белковых компонентов, локализованных с внешней сторона мембраны клеток обонятельного эпителия и в слизи, скудны. Из водорастворимых белков обонятельного эпителия хорошо изученными являются только запах-связнвещие белки 'OED. ОбттзруЕешшй недавно так называемый "ольфактскедан" также составляет значительную долю от белков обонятельного зпителия._В отличие от оелка 45кДа для экстракции "ёльфактомеяива" требуется детергент. Однако, "ольфактскедан" см ебнаруязн также в обоня-тедьпов сдизя и секреторных гранулах опорных клеток, из которых он, пс- вшшмсму, попадает в слизь „ далее ассоциируется с мймераасй обонятельных клеток. Исходя из этого, можно предположить, что, хотя "олтлактсмедта" является относительно гидрофобным связан с ««шбрааой непрешо. Таким сбразса, можно :;ix;cj;!v.raiTi- яекатсрув аналогию между "аюфактомвдаш" и белком 45кДа. Возможно белок 45кДа, подобно "ояъф^кт^^елпд,'"' z GBF. üwvikuyo*«:« ? S CCI5U UüÜöEOiLVi'H'.H H9 ПСЕЗрХЗССТЬ ОбОНЯ-;\j зшп-едия. Пока нам не удалось определить место синтеза белка 45кДа, что является одной из задач будущих исследований.

ЗАНЛШЕНИЕ

Присутствие обнаруженного нами ГГФ-связыванцего белка 45кДа в значительных количествах в обонятельной слизи, а также цитоплазме жгутиков обонятельных рецепторных клеток свидетельствует о тем. что пн яоявен ягрзть существенную рель в обонятельной psiwntmK. образом, выявление функции беля? 45кДа является ;гср*хгтештой задачей предстоящих исследований. Как зам пред-.тыгяегся. эожкатю несколько зодхсгов. с едзей сторспн, явдуздгоге шеокоиктйичдах антител против белка 45кЯа с целы, таъшат ;\и> трас, тунгу рией локелвзгащи оелка 45кЯ& в обенятел»-йой рецептешей клетке, место его синтезе и утилизации. Совкеие-ш;е иммунологических и электрофизиологии ских методов иожет прояснить его возможное место в системе транедукцви сигнала. Другим подходом может быть определение его аминокислотной последовательности к дальнейший поиск в банках данных, гоиологкч-1Ш белков с уге известными функциями. Как уже отмечалось, первая попытка определить первичную структуру белка 45кДа потерпела неудачу. Одной из возможных причин могло быть то, что N-конец белка 45кДа закрыт для анализа. В этом случае задача

определения аминокислотной последовательности белка 45кДа сильно усложняется. Один из возможных вариантов заключается в том, что первоначально белок 45кДа будет расщеплен на более короткие фрагменты, затем после определения аминокислотной последовательности этих фрагментов, будут синтезированы олигонуклеотидвые зонды при помощи которых можно будет выявить ген, кодирующий данный белок. Однако эта работа потребует значительного времени и больших материальных затрат.

В заключение следует отметить следующий важный момент. В нашей работе для идентификации в обонятельном эпителии ПФ-связывапцих белков использовались антитела к консервативной части аминокислотной последовательности ГТФ-связыващих белков. В результате этого был обнаружен ГГФ-связывапций белок, локализованный исключительно в обонятельном эпителии. В классической схеме, применяемой в молекулярной биологии, для решения аналогичной задачи при помсш олигонуклеотидных зондов проводится поиск участка ДНК. кодирующего искомый белок, с последующим выделением этой ДНК и экспрессией ее в соответствующую систему для синтеза данного белка. Этот путь требует больших затрат и в настоящее время в случае обонятельной рецепции пока не принес успеха. (Обнаружение генов ~ кандидатов в обонятельные рецепторы - до сих пор не привело ни к выделению самих рецепторов, ни к выявлению участков локализации различных рецепторов в обонятельном эпителии). Таким образом, выбранный нами путь при относительной простоте оказался достаточно эффективным и позволил не только обнаружить в обонятельном эпителии белок 45кДа, но и доказать его тканевую и видовую спеца&гшость, определить его локализацию, а также контролировать процесс его выделения.

ВЫВОДЫ

1. Нами был идентифицирован и выделен спещфический водорастворимый ГТФ-связыващи& белок из обонятельного эпителия крысы (белок 45кДа), который содержится в обонятельном эпителии в значительных количествах и составляет примерно 2% от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия.

2. Белок 45кДа обладает тканевой специфичностью и обнаруживается только в обонятельном эпителии. Лналога белка 45кДа не

найдены ни в тканях богатых С-белками (мозг, печень), ни в эпителиальных тканях (легкие, кишечник).

3. Аналоги белка 45кДа обнаружены в обонятельном эпителии млекопитающих (хомяк и морская свинка).

4. Белок 45кДз локализован в поверхностном слое обонятельного эпителия, а также в цитоплазме жгутиков обонятельных рецеп-торных клеток.

5. Белок 45кДа взаимодействует с антителами, выработанными против синтетического пептида, соответствующего участку с аминокислотной последовательностью, общей для а-субъединиц всех известных С-бедков (антитела против а-субьедишща О-белков).

6. Выделенный белок существует в растворе в виде мономера и выявляется при ШС-электрофорезе как полипептид с молекулярной массой около 45кДа. Изоэлектрическая точка белка 45кДа: 5.2-5.3

7. Методом фотоаффинного мечения показано, что белок 45кДа непосредственно связывает ГТФ.

список публикаций по материалам диссертации

1. Попов В.И., Николаев Ю.В., Евдокимов В.А., Пешенко И.В., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. Надмолекулярная организация рецепторного аппарата обонятельного нейрона. Тезисы VII Всероссийского Симпозиума "Механизмы сенсорной рецепции", Москва, 25-27 февраля 1992.

2. Новоселов В.И., Крапивинская Л.д., Пешенко И.В., Евдокимов

В.А., Фесенко Е.Е. ГТФ-связывавдие белки, ассоциированные с обонятельными рецепторами позвоночных. Сенсорные системы. 1992, Т.6, стр.138-140.

3. Новоселов В.И., Новиков Ю.В., Николаев Ю.В., Пешенко И.В.. Фесенко Е.Е. Метаболизм рецепторных элеменов обонятельного нейрона позвоночных. Сенсорные системы, 1992. т.6, стр.131-133.

4. Novoselov V., PeshenKo I.. Nlkolayev J., ЕтйоМлют V., Fesenko E. Specific Proteins Ггои Olfactory Epithelium of Vertebrates. Abstracts or Symposium "Molecular mechanisms oi sensory reception". Pushchlno.•December 1992.

5. NoYoselov V.I., Peshenko I.V., Evdoklmoy V.J., Nlkolaev J.V.. Matveeva E.A., Fesenko E.E. Water-soluble GTP-blndlng protein Ггои rat olfactory epithelium. FEES bett.. 1994. 353. 286-288.