Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы

Меркулова, Мария Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БНООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

УДК 577.112:599.323.4'II8.34

МЕРКУЛОВА МАРИЯ ИГОРЕВНА ? Г 5 ОД

Структурные исследования новых секреторных белков из обонятельного / эпителия крысы

1 Ш ¿330

03. 00. 03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор В.М. Липкин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков кандидат химических наук В.Г. Коробко Ведущая организация: Институт белка РАН

Защита состоится « ^ » -¿¿(Я/ь/Жё- 2000 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871 ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в. библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «У//» _2000 г.

доктор химических наук

специализированного совета,

Ученый секретарь

В. А. Несмеянов

Актуальность проблемы. Одной из особенностей восприятия обонятельных стимулов позвоночных является то, что начальным этапом этого процесса является не прямая рецепция пахшего стимула (т.е., непосредственное взаимодействие стимула с рецепторным белком), а так называемые перирецепторные процессы - биохимические взаимодействия между компонентами слизи и молекулами одорантов. Наиболее изученными из компонентов слизи, участвующих в лернрецепторных процессах, являются одорант-связываюшне белки (ОСБ) и ферменты биотрансформации. Достаточно хорошо изучены также структурные (муцины, одьфактомедин) и защитные (лактоферрин, пнзоцим, иммуноглобулины А и М) белки слизи. Но в целом, в настоящее время белковые компоненты периферического отдела обонятельной системы еще недостаточно хорошо охарактеризованы, хотя, именно они определяют защитную функцию слизи, обеспечивают нормальное функционирование обонятельного эпителия и участвуют в первичных процессах восприятия запаха. В связи с этим структурно-функциональные исследования белков слизи обонятельного эпителия представляются интересными и перспективными.

Ранее в лаборатории биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН при исследовании белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом ЗОБ-электрофореза было выявлено два новых водорастворимых белковых компонента, имеющих молекулярную массу ~28 и -45 кДа соответственно, каждый из которых составлял порядка 2% всех белков обонятельного эпителия. Столь значительное содержание этих белков в слизи предполагало их важную роль в обеспечении нормального функционирования клеток обонятельного эпителия, что послужило основанием для последующего изучения их структуры и свойств.

Цель работы. Данная работа является частью совместных исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и лаборатории биофизики

рецепции Института биофизики клетки РАН, по комплексному структурно-функциональному изучению белков слизи обонятельного эпителия.

Целью данной работы было клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК 28-кДа и 45-кДа белков, реконструкция аминокислотных последовательностей белков и выявление возможных функций, выполняемых этими белками.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе установлены 1) нуклеотидные последовательности кДНК 28- и 45-кДа белков длиной 1414 и 1586 п.о. соответственно; 2) полные аминокислотные последовательности 28- и 45-кДа белков, содержащие 223 и 400 а.о. соответственно. Проведен детальный сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 28- и 45-кДа белков со структурами, хранящимися в EMBL и GenBank базах данных, выявивший высокую гомологию 28-кДа белка с пероксиредоксинами и значительную гомологию 45-кДа белка с белками-переносчиками гидрофобных соединений. Показано, что наибольшая концентрация 45-кДа белка обнаруживается в эпителиальных тканях, имеющих непрерывный контакт с окружающей средой и больше, чем другие, подверженных воздействию кислорода. На основании полученных данных было сделано предположение, что 28- и 45-кДа белки входят в состав одной из антиоксидантных систем клетки, функцией которой является защита клеток эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода.

Полученные в ходе работы результаты указывают на возможность их использования для диагностики и лечения болезней органов дыхания и кожи.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит 19 рисунков и 5 таблиц. Список цитированной литературы включает 144 наименования.

Содержание работы.

1. Определение полной аминокислотной последовательности 45-кДа «елка.

Поскольку N-концевой аминокислотный остаток 45-кДа белка оказался модифицированным и закрытым для анхчиза по методу Эдмана, было проведено его ферментативное расщепление лизинспецифичной протеиназой из Lysobacter enzymogenes. Это высокоспецифичная протеиназа, гидролизующая связи, образованные а-карбоксильными группами остатков лизина.

Гидролиз очищенного и модифицированного 45-кДа белка проводили в обычно принятых условиях. Разделение продуктов лротеолиза 45-кДа белка проводили обратно фазовой ВЭЖХ на колонке Ultrasphere CIS (0,46x25 см) в градиенте ацетонитрила в водном растворе 0,1% ГФУ (рис.1). Анализ N-концевых аминокислотных остатков показал, что фракции L1-L5 являются гомогенными и не требуют дальнейшей очистки. С помощью автоматической деградации по методу Эдмана была определена полная аминокислотная последовательность лизинспецифичных пептидов L1 и L2 и частичная -пептидов L3 - L5. Данные о структуре лизинспецифичных пептидов белка 45-кДа, приведены в таблице 1.

На основе структуры полученных пептидов не удалось сконструировать достаточно специфичные олигонуклеотидные праймеры, необходимые для проведения следующих этапов работы. Поэтому для получения дополнительной информации о структуре 45-кДа белка было проведено его ферментативное расщепление протеиназой из Bacillus intermedins, которая, по литературным данным, гидролизует связи, образованные карбоксильными группами глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Рисунок 1. Хроматографический анализ пептидов, полученных при гидролизе 45-кДа белка лизинспецифичной протеиназой, на колонке 0,46x25 см Ultrasphe-re CI8. Здесь, а также на рис.2, элюирование градиентом ацетонитрила в 0,1% ТФУ.

Таблица 1. Аминокислотная последовательность пептидов, полученных при ферментативном расщеплении 45-кДа белка лизинспецифичной протеиназой.

Шифр пептида Аминокислотная последовательность Местоположение в цепи белка*

L1 SEAMLRK 52-58

L2 INYGGEIPK 258-266

L3 LISPEELPAHFGGTLTDPD... 231-249

14 FRENVQD... 19-25

L5 PLVEVYQEFF... 166-175

* - данные приведены на основании полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка, определенной в настоящей работе.

Рисунок 2. Хроматографический анализ пептидов, полученных при гидролизе 45-кДа белка протеиназой из В. inlermedius, на колонке 0,46x25 см Ultrasphere С18.

Расщепление белка протеиназой из В. intermedins и разделение образовавшихся фрагментов проводили в условиях, анатогичных описанным выше (рис.2). При хроматографии было собрано семь фракций (В1-В7). По данным N-концевого анализа фракции ВЗ-В7 представляли собой индивидуальные пептиды, а В1 и В2 содержали смеси нескольких компонентов. Полная структура 5 пептидов (ВЗ-В7) была установлена с использованием автоматической деградации по методу Эдмана и масс-спектрометрического анализа. В случае фракций В1 и В2 удалось исключить стадии дополнительной очистки полученных пептидов, проводя определение их аминокислотной последовательности путем аначиза смеси двух (ВЫ и В1-2) и трех (В2-1 - В2-3) компонентов. Сопоставление полученных данных с данными масс-спектрометрического анализа позволило определить полную структуру всех компонентов обеих смесей (таблица 2).

Таким образом, была определена полная аминокислотная последовательность двенадцати пептидов и частичная - трех, полученных в результате гидролиза белка протеиназами из £. еи-гуто^еле.? и В. ШегтесНиз, что составляет в общей сложности 140 аминокислотных остатка - более трети полипептидной цепи 45-кДа белка.

Таблица 2. Аминокислотная последовательность пептидов, полученных при ферментативном расщеплении 45-кДа белка протеиназой из В. тШгтесНиэ.

Шифр пептида Аминокислотная Местоположение в цепи

последовательность белка*

вы уигэсж 236-241

В1-2 КУЛАН 241-245

В2-1 ОМЭи'КЕ 221-226

В2-2 иЭРЕЕ 231-236

В2-3 увог^рк 5-11

ВЗ УУКХ><ЗУКТ<ЗУЕ 269-279

В4 У/ЬИ 41-43

В5 УИ.РОЕОМ(ЖУОЕЕ 383-396

В6 РРетХЕЕ^УРЕ 174-184

В7 22-40

На основе данных, полученных при определении частичной аминокислотной последовательности 45-кДа белка, были выбраны аминокислотные последовательности для синтеза олигонуклеотидных праймеров. Наиболее подходящими для синтеза олигонуклеотидных праймеров оказались пептид В2-1 и фрагменты пептидов ВЗ и В5. В связи с тем, что взаимное расположение вышеуказанных пептидов в полипептидной цепи 45-кДа белка известно не было, на основе структуры каждого из них было синтезировано по паре соответствующих праймеров: прямой (гомологичный мРНК) и обратный (комплиментарный мРНК) (таблица 3). Синтез праймеров проводили с использованием

аггр.

Таблица 3. Олигонуклеотндные праймеры, использованные для получения фрагментов кДНК 45-кДа белка методом ПЦР.

Шифр пептида, аминокислотная последовательность Нуклеотидная структура № npafi-мера Степень вырожденности

В5 ...DEGMQKY... 3'GATGAGGGIATGCA(a/g) АА(а/0)ТА3' 4 4

"GTATTTTTGCATICCt11 /с) ТС(А/Г,)ТСЗ' 5 4

ВЗ ...DQVK.TQYE " GATCAGGTI АА(а/0-) АС I CA(a/g)TA(t/c)GA 6 8

3,TTCGTATTGIGT(t/c)TTI AC(t/c)TG(a/g)TC3 7 8

В2-1 GNSWK.E >'GGIAA('/c)AG(7c)TGG AA(a/0)GA3' 8 8

^TTCTTTCCAGCTC^/g) TT(°/a/t/c)CC3' 9 8

Все возможные сочетания праймеров (4)-(9) (таблица 3) были использованы для получения фрагментов кДНК 45-кДа белка методом ПЦР с использованием в качестве матрицы амплифицированной фаговой библиотеки кДНК из обонятельного эпителия крысы. Данная библиотека, созданная на основе вектора ^NMl 149 (клонирование кДНК проводили по fooRI-сайту), была любезно предоставлена Н. Breer (Universität Hohenheim, Stuttgart, Germany). Для контроля специфичности синтезируемых фрагментов проводили повторные ПЦР с повышением температуры отаига праймеров. Воспроизводимые результаты получались в случае использования в ПЦР следующих пар праймеров: (8) и (7), (8) и (5), (6) и (5). Соответствующие продукты ПЦР были обозначены А, В и С (рис.4). По данным электрофореза в агарозном геле размер ПЦР-фрагмента кДНК (А) составлял около 180 п.о., (В) - 520 п.о., (С) - 360 п.о. Амплифицированные фрагменты кДНК были клонированы в плазмиду pGEM-5Zf(+). Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сенгера. Все три амплифицированных фрагмента кДНК имели открытые рамки считывания. Открытая рамка считывания продукта ПЦР (А) кодировала

аминокислотную последовательность, включающую установленные ранее структуры пептидов В2-1, В2-2, ЬЗ, Ь2 и ВЗ; (В) - В2-1, В2-2,13, 12, ВЗ, В1-1, В1-2 и В5; (С) - ВЗ, В1-1, В1-2 и В5 (рис.3). На основании полученных данных был сделан вывод, что все три проанализированных продукта ПЦР представляют собой амплифицированные фрагменты кДНК 45-кДа белка.

А.

Б.

ССАААСАаСТОСАААаААОСТТТастаАААСТСАТСАСТССТаА.саА^СТСССТССССАТТТТССССОаАСАСТС 75

0..1м ^ V К Е й Ь I. К 1.1 3 Р Р. К I. Р А Н р а Г. Т [. 25 В2-1 В2-2 и

АСТОАСССАОАТСООААТСССАААТСТТТААССААОАТСААСТАСОСТСОООАОАТТСССААСТССАТОТАЮТО 150

Т Г) Р О ОИРКСЬТК 1 м у г, Г, Р 1 р к Б М У V 50

СОТОАССАООТОААОАСССАОТАТОАОСАСТСООТССАОАТТАОССССООСТССТСССАТСАООТСОААТАСОАО 225

..Я У— -К -I. О .УЕН5У<513КСБ5Н(}УЕУЕ 75 ВЗ

АТССТСТТСССАСССТОСОТССТСАОСТаОСАОТТСТСАТСТОАТООАаСАОАСАТГСССТТТаОАОТТТТССТС 300

11-РРССУ1.И'«<ЗР550аА01СРСУР1. 100

ААОАССААСАТОССООАаАаОСАОААООСАООССАОАТОАССОАаОТОСТААССАОССАОСОСТАСААТОСССАС 375

КТКМСЕ1гОКАСЕМТЕУЬТ$<2В'УМАН 125

В1-1 В1-2

АТСаТСССТСАОСАТСаСАаССТСАССТССАССОАСССТСОТаТСТАТСТССТОСОСТТСОАСААСАССТАТАаС 450

МУРЕООЗЬТСТЕАСУУУЬКРОЫТУБ 150

ТТСаТССАТСССААСААСОТСАОСТТСАСОаТТаААаТОСТТСТСССАОАТОАООССАТОСАОААСТАС 519

РУНАККУ$РТУЕ VLTj.it.-rK £Л~ "В' Л.'.'М'"«ЕКгК-^Й 173

В5

Рисунок 3. (А): Относительное расположение ПЦР-фрагментов А, В и С кДНК 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы. Черный прямоугольник соответствует фрагменту кодирующей области кДНК. Стрелками обозначены положения на цепи олигонуклеотидных праймеров (4)-(9). (Б): Нуклеотидная последовательность ПЦР-фрагмента В кДНК 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы и реконструированная частичная аминокислотная последовательность белка. Участки, соответствующие пептидам с известной а.п., подчеркнуты (Ь2,ЬЗ) и/или выделены серым цветом (В2-1, В2-2, ВЗ.В1-1, В1-2иВ5).

Идентификацию рекомбинантных бактериофагов XNM 1149, содержащих кДНК 45-кДа белка, проводили гибридизацией in situ фаговых бляшек (5x105) со специфическим ДНК-зондом, в качестве которого использовали [сх-32Р]- меченый ПЦР-фрагмент С кДНК 45-кДа белка (рис.3). Кроме того, мы использовали методику Woo, согласно которой реплики снимают на мембрану, пропитанную бактериальной суспензией, что позволяет производить амплификацию фага in situ и существенно повышать гибридизационный сигнал. В результате моноклонизации было получено пять индивидуальных клонов, дающих положительный сигнал - Аг2.2, А.г4.1, \rl7.1, \i22A, Ш5.2 (рис.4).

ipOriji

'Хг35.2 "

;.ri 7.1 ~ч—I-

>.г2.2 IrJlp^—j-

Sacl N'col Гя!

Рисунок 4. Схема строения кДНК 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы и относительное расположение клонированных фрагментов кДНК клонов Хт2.2, Хг4Л, Яг17.1, Хг22.1, Я.г35.2 и ГТЦР-фрагментов А, В и С. Черный прямоугольник соответствует кодирующей области, белые - 5'- и З'-нетранслируемым областям. Стрелками обозначены положения на цепи олигонуклеотидных праймеров (5)-(8), использованных для синтеза ПЦР-фрагментов кДНК.

Для определения нуклеотидной последовательности кДНК 45-кДа белка бьшо решено проанализировать структуру вставок кДНК всех пяти клонов. ЕсоШ-ЕсоШ Фрагменты кДНК из фагов ХЛ.2, Х.г4.1, Х.Г17.1, ?.г22.1, Хг35.2 были субклонированы в плазмиду рЭР65 по £соЮ-сайту для рестриктного и структурного анализа. Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сенгера.

Клон Хг2.2, содержащий вставку кДНК 45-кДа белка с максимальной длиной, имел открытую рамку считывания, кодирующую полную структуру 45-кДа белка (рис.4).

Вставки кДНК остальных проанализированных клонов были короче с 5'-конца, и в них отсутствовала последовательность, кодирующая N-концевую область 45-кДа белка (рис.4).

Нуклеотидные последовательности кДНК 45-кДа белка клонов Хт2.2, Хг4.1, Хг17.1, Я.г35.2 и ПЦР-фрагментов кДНК 45-кДа белка А и В оказались идентичными друг другу и незначительно отличались от нуклеотидной последовательности кДНК клона Хг22.1 в кодирующей и З'-нетранслируемой областях. Эти отличия представляли собой точечные нуклеотидные замены: в положении 1095 - Т вместо С, в положении 1407 - А вместо G, в положении 1447 - Т вместо С, а также вставки: нуклеотида С после С в положении 1214 и олигонуклеотида TCCTCAG после G в положении 1519 (рис.5). Эти отличия не приводили к изменению аминокислотной последовательности 45-кДа белка. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности вставки кДНК клона Хт2.2 и ПЦР-фрагмента С кДНК 45-кДа белка показал наличие двух точечных замен в кодирующей области ДНК. Эти отличия являются существенными и вызывают изменения двух аминокислотных остатков: в положении 354 - Т (АСС) на I (АТС), в положении 355 С (TGC) на R (CGC) (рис.5). Возможно, что одной из причин указанных различий является природный полиморфизм гена 45-кДа белка. Отличия в структуре ПЦР-фрагмента С могут быть обусловлены ошибками считывания матрицы Taq ДНК-полимеразой.

Полученная нуклеотидная последовательность и выведенная из нее аминокислотная последовательность представлены на рисунке 5. Триплет ATG, находящийся в положении 1-3, имеет окружение специфическое для точки инициации трансляции: наличие пурина в положении -3, С в позициях -1, -2, -4 и является, по всей вероятности, инициирующим кодоном. Открытая рамка считывания между нуклеотидными основаниями 1 и 1200 кодирует полную аминокислотную последовательность 45-кДа белка. Все аминокислотные последовательности, выявленные при анализе пептидов, полученных в результате расщепления лизинспецифичной протеиназой и протеазой из В. inlermedius, кодируются

ТСССТТСССТССТСАСТГАСТОСТСАТСАОТСТСАССАСС -I

АТОАаТСОСССАаТТСаАОАССТОАОССССААССАСССАОАОАСССТССССААаТТССОАОААААТаТССАОаАТ 75

МБ О Я V в В . I.'.. Э Р К о А Е ТЬ А К Р Р Р Ы V ' Г) Т1 25 В2-3 М

ОТаСТОСССССССТОССАААСССТОАТОАСТАТТТТСТГСТТСОТТОССТССОАОСТСООААСТТТСАССТАСАО 150

V.. Ь . Р. А Ь Р N Р . О Б У р I. I. К \У Ь Я А I* N Р О Ь О 50 В7 В4

АААТСАОАООССАТОСТССОСААСТАСАТООАОПССаОААОАССАТООАСАТТОАТСАСАТССТТОАСТООСАО 225

К г А м I И к УМЕРЯКТМО[ОН1ЬО\У0 75 1.1

СССССАОАСОТОАТССАОААОТАСАТССССССАССССТОТаТООСТАТОАССССОАССОСТССССТОТОТССТАТ зоо

РРЕУ|(ЗКУМРСС1.СОУОКОССРУ«ГУ 100

ОАСАТСАТСаОСССАСТООАССССАААОСасТОСТПТСТСАОТСАССААОСАОаАССТОТТОААСАСТААСАТО 375

01 [ОРЬОРКвЬЬРЗУТКООЬЬКТКМ 125

АОССАСТаТОААСОТАТССТОСАСОАСТСТОАССТССАОАСАОАССООСТООООАаОААОАТТОАААССАТГОТС 450

ЯОСЕК1ЬНЕСОЬ0ТЕНЬОКК1ЕТ1У 150

АТОАТАТТТОАСТОТОААСаТСГСООАСТОААОСАСТТСТССАААССТСТОатООААатОТАССАСОАаТТСТТТ 525

MIFDCEGLGLKHFWK РГУРУУрРГР 175

ССССТССТТОААОАОААТТАСССАОАОАСССГОААОТГСАТОСТСАТТСТОАААОССАССАААСТОТГССССОТа 600

а'XIX' и.' тькрмь!укаткьрру 200

Вб

СС!СТАСААССТСАТСААСССАТТССТОАОТСАСОАСАСАСОСАООААОАТТСТАаТСТТОССАААСА<КГГаОААА 675

ОУМЬМКРРЬБЕОТЯКК I V V I. 5 225

В2-1

ОААСЮтССТОАААСТСАТСАОТССТОАООААСТОССТОСССАТТГТСССССОАСАСТСАСТОАСССАОАТОСО 750

6 0 1. 1. К Г'1 Ч "Р В Р I РДНГЛПТГТПРГ) о 250 В2-2 и

ААТСССАААТОТТТААССААСАТСААСТАССОТОССОАСАТТСССААСТССАТОТАТСТОСаТОАССАССТСААО 825

N Р К С Ь Т К 1 N У Л г. Р т Р К 5 М У^'^-ТЙ^^В'ХОТГУ1: "К 275

и вз

АСССАОТАТОАОСАСТСООТСЮАОАТГАОССОССССГССТСССАТСАСОТООААТАСОАОАТССТОТТСССАОСС 900

Н8У015ЯС53Н0УЕУЕ1ЬРРС 300

ТОСОТССТСАООТОССАСТТСТСАТСТОАТаОАОСАОАСАТТСОСТТТООАОТТТГССТСААОАССААаАТСОСа 975

CVl.RWQFSSDGADIGFGVFLKTK.Ma 325

САОАОССАОААСОСАОСОСАСАТОАССОАООТОСТААССАОССАОСОСТАСААТССССАСАТСОТСССТСАСОАТ 1050

ЕЯОКАОЕМТЕ К • I. .32Я '*'<}-• Я 3 'лН "Ж МУРЕ О 350

ВЫ В1-2

СЮСАОССТСАЙФС АССОАСССТаСТОТСТАТСТССГСКССП^АСААСАССТАТАОСТТССТССАТСГССААО 1125

ОЗЬШаТЕАСУУУЬКРОКТУБРУНАК 375

ААОСТСАССГТСАСООТТОААОТОСТТСГСССАОАТОАаООСАТССАОААОТАСОАТОАООАОСТСАССССТАТС 1200

к V 8 р т V е '-бгВ:кипя ь т р 1 4оо ■I В5

ТАСаТООАССССССАСТТСТСАОАСАССССАСОСТСТСТТГГСССГСТТСТСТССГТТСАТГССТАААССТОАТС 1275

АТТАСТСООСКЛТАСТСТОТОАСАССАОТССОСАОАССААОАОАТТССССООАСААОАТТТАТСТССТСТАОТСА 1350

ААТГССААААТОАСОАААООТГСаАСОТАТАААОАТТОСААААСАОАААСААССАС0Л.аОААААаАСАОААСАТО 1425

1500 I

СОСААООСССТСССТТСООСТССААААААААААААААААААААААА 1546

Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность кДНК 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы и реконструированная полная аминокислотная последовательность белка. Участки, соответствующие пептидам с известной а.п., подчеркнуты (Ы-Ь5) и/или выделены серым цветом (В1-1-В7). В рамку заключены места отличий структуры ПЦР-фрагмента С и кДНК клона А.г22.1 от структуры кДНК других клонов и ПЦР-фрагментов А и В. Стрелками обозначены положения нуклеотидных вставок в клоне Хг22.1. В З'-нетранслируемой области подчеркнут ГО элемент, сайт полиаденилирования обозначен ромбами.

этой открытой рамкой считывания. Анализ полученных данных показал, что помимо связей, образованных карбоксильными группами глутаминовон и аспарагиновой кислот, протеиназа из 8. intermedins гидролнзует также связи, образованные карбоксильными группами остатков аргинина (пептиды Bl-1, В2-3, В4, В7) и. в меньшей степени, - остатков лизина (пептиды В2-2, В2-3) и метионина (пептиды Bl-2. ВЗ) (рис.5). Терминирующий кодон TAG находится в положении 1201-1203, а на расстоянии 175 п.о. от него в положении 1378-1383 в З'-нетранслируемой области кДНК расположен потенциальный сигнал полиаденилирования (рис.5).

В положении 1457-1546 З'-нетранслируемой области нуклеотиднои последовательности кДНК 45-кДа белка находится ID элемент (рис.5). ID элемент представляет собой короткую последовательность ДНК. умеренно повторяющуюся в геноме грызунов: от несколько сотен копий на гаплоидный геном морской свинки до 130 тысяч копий на гаплоидный геном крысы, предполагается, что они служат энхансерами. активирующими РНК-полимераза П-завнсимую транскрипцию.

2. Анализ аминокислотной последовательности 45-кДа белка.

Реконструированная из нуклеотидной последовательности кДНК аминокислотная последовательность 45-кДа белка содержит 400 а. о. Рассчитанная молекулярная масса белка составляет 46026 Да, что соответствует полученным ранее данным по SDS-электрофорезу. Белок характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных аминокислотных остатков и имеет рассчитанную изоэлектрическую точку 5,73, что соответствует полученным ранее данным по изоэлектрофокусированию.

Выявлена существенная гомология между аминокислотной последовательностью 45-кДа белка и аминокислотными последовательностями некоторых белков-переносчиков гидрофобных лигандов, таких как ретиналь-связывающий белок из японского кальмара,

дрожжевой фосфатидилхолин/фосфатидилинозит транспортный белок ЗЕС14, ретинальдегид- и а-токоферол-связывающие белки млекопитающих, а также аминокислотной последовательностью некаталитического домена тирозинфосфатазы (рис.6).

4 5-кДа

АС004997

ЯАЬВР

ЗЕС14

а-ТТР

СРАЬВР

вадайш---&раь-3*шйв

УСКОШЕОРОкаЗьУСРСЙЕЩКифЕС---------

[мввьокгЕАЮнк^й-Зтмрхц'н Ззц-есвсАшх

ВПИак^СНАУЕьЗкеу-'каьО^РЕЪГОЗ

4 5-кДа

АС004997

ЯАЬЗР

ЗЕС14

а-ТТР

СЯАЬВР

I - з—¡йта- хйВиДиав-

_ _ ^ _ _ ____ ___ _ __ ¡КРСТ^ТУУ

_________ _^-JFy2QVYHKтdкIÍdR^YFEELl|AVNLHEMNKVTSEER^!^NLVWEYisvVQYRL?ACSRiAqH

Я-Н--?К51ЬСЬЬКАСУн|уЬЯЗр4ртазРЧ1^н|зуИ^----УГ1АУ!Э7ЕЯУ31.1ТЗ11.1УО-3-- УЕЗс^-'.аУЙА-----1

2 :—----ЕШРСЕ1£ОАУСЕИ.8К;.2Е-Ч—Е£3с:;:дгс2-----У

__238

ENF¡íaFTMQQAAGLRPSDLKKMVDMÍЗQDЗFgARFSAIHFIHQPWYS,rTт2NVV^gй^KMKLLQRVFЗн¿DDL-[:ЗгFQE|DENI:

45-кДа

АС004997

НАЬВР

ЭЕСН

а-ТТР

СЯАЬВР

УК£МКЗЕУ--ОЕЗЧССГЛЬ301^РМРСРК31СРЕСЕАРЕАГ2МК ЬЕуСакЕЗЗМЕОГ-СаЕМТ-ЗЕ-ГМКЗЕЗУЬЗЗХЗЕТхЗ аОЙЩЙРКУЁЗ—¡¡УУАЕОЬГ-Зркаеуежтаь

45-кДа АС 0 0 4 9 9 7 РА1.ВР

4 00

ёЕМ^ЖакАЗЕЕКМКсЗсАСТРК

||ЕУ03ЕО1НКМ1КСЗТНОЕЬЗАО13

Рисунок 6. Сравнение полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка со структурами, хранящимися в Зй^ЗЗ-РЯОТ и бепВапк базах данных. Условные обозначения: 45-кДа - 45-кДа белок из обонятельного эпителия крысы, ОепВапк, А] 132352; АС004997 - гипотетический белок, человек, ОепВапк, АС004997; ЯАЬВР - ретиналь-связывающий белок, японский кальмар, ЗШгёЗ-РЯОТ, Р49193; ЗЕС14 -фосфатидилхолин/фосфатидилинозит транспортный белок, дрожжи, 3\У153-РЯОТ, Р24280; а-ТТР - а-токоферол связывающий белок, крыса, 5№133-Р1*ОТ, Р41034; СИАиВР - ретинальдегид-связывающий белок, мышь, ОепВапк, АР084638. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, инвариантные в четырех и более последовательностях, серым цветом - аминокислотные остатки идентичные остаткам 45-кДа белка. Прочерки введены для оптимизации выравнивания. Цифры справа означают номера последних в строке аминокислотных остатков 45-кДа белка.

На основании того, что эти белки способны in vitro связывать гидрофобные молекулы (ретиналь, ретинол, токоферол, фосфатидилинозит, фосфатидилхолин), считается, что они являются белками-переносчиками гидрофобных соединений. У всех перечисленных белков, включая 45-кДа белок, присутствует консервативный участок KPFL (у 45-кДа белка - в положении 206-209), который входит в состав лиганд-связывающих участков этих белков. Кроме того большинство из этих белков имеет в составе лиганд-связывающих участков консервативные остатки Е-184, F-198, L-204, К-216, 1-217 (нумерация аминокислотных остатков приведена для первичной структуры 45-кДа белка). На основании сходства аминокислотной последовательности 45-кДа белка с белками-переносчиками гидрофобных соединений, которое прослеживается и в их лиганд-связывающих участках, было сделано предположение, что 45-кДа белок также выполняет функцию транспортировки гидрофобных молекул. В настоящее время проводятся биохимические исследования по определению того, какое вещество или вещества являются лигандами 45-кДа белка.

Первоначально 45-кДа белок был выделен из обонятельного эпителия крысы и предполагалось, что он может участвовать в первичных процессах восприятия запахов. Для подтверждения этого предположения необходимо было выяснить, является ли 45-кДа белок специфичным для обонятельного эпителия или локализован и в других тканях крысы. Ранее в нашей лаборатории для определения локализации 45-кДа белка бьи проведен иммуноблоттинг водорастворимых белков различных тканей крысы (обонятельный эпителий, трахея, легкие, мозг, матка, печень, почки, мышца, кожа) с использованием кроличьих поликлональных антител против 45-кДа белка. Максимальное содержание 45-кДа белка было обнаружено в обонятельном эпителии, несколько меньше -в трахее, легких и коже. Эти ткани были использованы для проведения in situ гибридизации с целью выявления места синтеза 45-кДа белка. В качестве зондов для

экспериментов по in situ гибридизации были получены [33Р]-меченные фрагменты мРНК 45-кДа белка гомологичные и комплементарные его мРНК.

Наиболее высокий уровень экспрессии был обнаружен в слое эпителия, содержащем тела обонятельных, опорных и стволовых клеток обонятельного эпителия, апикальном районе трахеи, поверхностном слое мерцательного эпителия бронхов и легких и эпидермисе кожи (рис.7).

Рисунок 7. Экспрессия мРНК 45-кДа белка в различных тканях крысы, выявленная методом in situ гибридизации. Визуализация в «темном поле» срезов тканей обонятельного эпителия (А), трахеи (В), легкого (С) и толстой кожи (D), обработанных [33Р]-меченной антисмысловой рибонуклеотидной пробой (левая колонка микрофотографий) и [33Р]-меченной смысловой рибонуклеотидной пробой (правая колонка микрофотографий). Масштабный отрезок 100 мкм.

Таким образом, было показано, что 45-кДа белок синтезируется именно в тех тканях, где он выявляется иммуногистохимическими методами, и является специфичным не только для обонятельного эпителия, но и для других эпителиальных тканей, имеющих непрерывный контакт с окружающей средой. Повышенное содержание 45-кДа белка в этих тканях говорит о том, что он играет важную роль в обеспечении их нормального функционирования.

3. Определение полной аминокислотной последовательности 28- кДа белка.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории была определена Ы-концевая аминокислотная последовательность 28-кДа белка, а также структура пяти пептидов, полученных при гидролизе белка лизинспецифичной протеиназой (рис.8,а). При сравнении этих структур со структурами, хранящимися в ЕМВЬ и ОепВапк базах данных, были обнаружены три белка, первичная структура которых содержала гомологичные участки: продукт гена, регулируемого фактором роста кераноцитов мыши (ККО-1), идентифицированный как селеннесодержащая глутатионпероксидаза (ЕМВЬ, У12883); белок 1ЛЛУ4 из печени мыши (ОепВапк, АЕ004670) и гипотетический белок ОЯГб из миелобластомы человека (ОепВапк, В14662) (рис. 8). Поскольку перечисленные выше белки чрезвычайно близки по структуре (а ККО-1 и белок ЬТ\*/4 даже полностью идентичны), то, по-видимому, все они, и в том числе изучаемый нами полипептид, являются видоспецифическими изоформами одного и того же белка.

Выбор аминокислотных последовательностей для синтеза олигонуклеотидных праймеров с целью получения ПЦР-фрагментов 28-кДа белка проводили на основе структуры пептидов, полученных при определении частичной аминокислотной последовательности 28-кДа белка (рис.8, таблица 4). Благодаря тому что были найдены

КЗ

(а) PGGLLL LAPEFAK LIALSIDS

(б) MPGGLLLGDEAPNFEANTT I GRIRFHDFLGDSWGILFSHPRDFTPVCTTEl.GRAAKLA£E£AKRNVKL(ALSIDS 75

(в) MPGGLLLGDVAPNFEANTTVGRIRFHDFLGDSWGILFSHPRDFTPVCTTELGRAAKLAEEE4KRNVKUALSIDS 75

К5 К!

(a) VEDHFAWSK DINAY

(в) VFDHI AW.SKPiNAYNCFFPTEK1.PFPIIDDRNRFI.A [LLGMLDPAEKDEKGMPVTARVVFVFGPDKKLKLSILYP 150

К2 К4

(а) GVFTK YLRYTPQP

(б) ATTGRNFDEILRVVDSLQLTGTKPVATPVDWKKGESVMVVPTLSEEEAKQCFPiiGYEXKELPSGKKYLRYTPQP 224

(в) ATTGRNFDEILRVV [SLQLTAEKRVATPVDWKDGDSVMVLPT I PEEEAKKI.FPICfiVFTKFI PSfiKKYI.RYTPOP 224

Рисунок 8. Аминокислотные последовательности: (а) фрагментов 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы, (б) селеннесодержагцей глутатионпероксидазы из кератиноцитов мьппи (EMBL, Y12883) и белка LTW4 из печени мыши (GenBank, AF004670), (в) гипотетического белка из миелобластомы человека ORF6 (GenBank, D14662). Аминокислотные последовательности, выбранные для синтеза олигонуклеотидных зондов, подчеркнуты. Сверху указаны шифры пептидов.

изоформы 28-кДа белка, удалось установить последовательность расположения этих пептидов в полипептидной цепи исследуемого белка: КЗ, К5, К1, К2, К4. На основе структуры пептидов, расположенных ближе к Ы-концу молекулы белка, были синтезированы прямые (гомологичные мРНК) праймеры (1 и 2), а на основе структуры пептида, расположенного ближе к С-концу молекулы, был синтезирован обратный (комплиментарный мРНК) праймер (3) (рис.8, таблица 4).

Таблица 4. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для получения фрагментов кДНК 28-кДа белка методом ПЦР.

Шифр пептида, аминокислотная последовательность Нуклеотидная структура № прай-мера Степень вырожденности

КЗ ...APEFAK 3 'GC(°/t)CCIGAGTTTGC(u/t)A А(а/0)3' 1 8

К5 К1 ...WSK DINAY 5 TGGAGTAAGGATATIAATG С(°/т)ТА(т/с)3' 2 4

К2 KGVFTK* 5'TTIGTGAA(0/a/t/C)AC(0/a/t/C) СС(т/С)ТТ3' 3 32

♦-остаток лизина был добавлен к М-концу молекулы пептида на основании специфичности использованной для гидролиза белка протеаиназы.

Олигонуклеотидные праймеры (1) и (3) (таблица 4) были использованы для получения фрагмента кДНК 28-кДа белка методом ПЦР с использованием в качестве матрицы той же библиотеки кДНК, что для 45-кДа белка. Полученный после амплификации фрагмент кДНК (фрагмент D) имел длину, соответствующую ожидаемой, рассчитанной на основе данных по структурам гомологичных белков. Амплифицированную ДНК разделяли в 1 % агарозном геле и переносили на нейлоновый фильтр по методу Саузерна для последующей гибридизации с [у-32Р]-меченным олигонуклеотидным зондом (2) (таблица 4) с целью подтверждения специфичности синтезируемого фрагмента. Амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмиду pSp65 по сайту Hindll. Отбор рекомбинантных клонов проводили гибридизацией с [у-32Р]-меченным олигонуклеотидным зондом (2). В результате были получены два клона. Определение нуклеотидной последовательности вставок кДНК этих клонов проводили по методу Сенгера. Анализ структуры вставок кДНК показат их полную идентичность друг другу и высокую гомологию с кДНК белков, обнаруженных ранее при сравнении частичной аминокислотной последовательности 28-кДа белка со структурами, хранящимися в EMBL и GenBank базах данных.

Идентификацию рекомбинантных бактериофагов ЖМ 1149, содержащих кДНК 28-кДа белка, проводили как описано выше гибридизацией in situ фаговых бляшек (5x105) с [сс-32Р]- меченым ПЦР-фрагментом D кДНК 28-кДа белка. В результате моноклонизации было получено четыре индивидуальных клона, дающих положительный сигнал. Для определения нуклеотидной последовательности был выбран клон Хд26.1, содержащий вставку кДНК 28-кДа белка с максимальной длиной (рис.9). EcoRI-icoRI Фрагмент кДНК

лтс " "i : тлл

jIMnj) J

Рисунок 9. Схема строения кДНК 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы клона Ха26.1 и относительное расположение ПЦР-фрагмента D. Черный прямоугольник соответствует колирующей области, белые - 5'- и З'-нетранслируемым областям. Стрелками обозначены положения на цепи олигонуклеотидных праймеров (1) и (3), использованных для синтеза ПЦР-фрагментов кДНК, и зонда (2), для отбора содержащих их клонов.

из фага Ха26.1 был субклонирован в плазмиду pSP65 по ¿ГсоШ-сайту для рестриктного и структурного анализа. Определение нуклеотидной последовательности проводили по методу Сенгера.

Полученная нуклеотидная последовательность и выведенная из нее аминокислотная последовательность представлены на рис. 10. Триплет ATG, находящийся в положении 13, имеет окружение специфическое для точки инициации трансляции: наличие пурина в положении -3, G в положении -6, а также С в позициях -1, -2, -4, -5 и является, по всей вероятности, инициирующим кодоном. Поскольку методами белковой химии была определена шестичленная N-концевая аминокислотная последовательность 28-кДа белка (рис.8), остаток метионина, кодируемый инициирующим ATG-кодоном, отщепляется в процессе пост-трансляционной модификации. Открытая рамка считывания вставки кДНК клона Хз26.\ между нуклеотидными основаниями 1 и 672 кодирует полную структуру 28-кДа белка. Все аминокислотные последовательности, выявленные при анализе N-концевой части цепи и пептидов, полученных при гидролизе белка лизинспецифичной протеиназой, кодируются этой открытой рамкой считывания. Терминирующий кодон ТАА находится в положении 673-675, а на расстоянии 427 и 675 п.о. от него, соответственно в положениях 1102-1107 и 1350-1355 в З'-нетранслируемой области кДНК расположены два потенциальных сигнала полиаденилирования (рис.10).

ОСОССТССТТСГГСССАССатСАССАСТСССОСС -1

АТОССССОАССССТОСТТСТСОООСАССААССССССААСПТОАССССААТАССАССАТССОССАСАТССОСТТС 75

Р П О I II. аоЕАРЫРЕАМТТ10Н1ЯР 24

САСОАТТГССТАООАОАТТСАТСОСОСАТТСТСГТТТСССАСССАССООАСТТГАССССАСТОТОСАССАСАСАА 150

НОРЬ0О5\УО1ЬЕ5НРЯ0РТРУСТТЕ 49

СТТСССАСАОСТОСАААОСТааССССАОАОГПСССААОАООААТОТТА.^СТТОАТТОСТСТТТСА.МЛСАСТСТ " 225

1. й К А А К ' А р р р А К Я N V К I I А I Ч 1 П <; 74

ОТГОАаОАССАТТТТОССТСОАССААаОАСАТСААТОСТТАСААТОаТОСАОСАСССАСАОААААССТАССАТТТ 300

УГПНГАЦГЗК Г) I V А У N О А Л Р Т Е К Ь Р Е 99

СССАТСАТСОАСОАТААОаАСАОСОАССТТОССАТССТОТТаСОСАТСТТООАТССАОСАОАОААООАТаААААА 375

Р11ООК0Я01.А]1.1.ОМ1.ОРАЕК0ЕК 124

СОСАТСССССТОАСАОССССТаТООТАТТСАТТПТОССССТОАСААаАААСТААААСТОТССАТССТСТАСССА 450

ОМРУТА1(УУР1РОРОКК1.К1.51|.УР 149

ОССАССАСОСССАОАААСТПаАТОАОАТГСТСАаАаТСОТТОАСТСССТССАаСТОАСАССАТСАААТССАОТТ 525

АТТОЯЫРОЕ11.КУУ05101.ТА5МРУ 174

ОССАСТССАаТТСАСТОСААСААСаСАОАаАОТСТОАРССТССТТСССАСССТСССТСАЛОАааААСССАААСАА 600

АТРУодаККОЕвУМУЬРТЬРЕЕЕАКО 199

СТтСССТАААСОАОТСТТСАССАААОАОСТСССАТСТСССААОАААТАССТССОТТАТАССССССАОССТТАА 675

Ь Р Р К Г. V Р Т К Е I. Р Б О К К У 1. Н У Т Р Г) Р . 223

ОТСТССОСОААСТООСОСТОСААСТОСТСОАССАОСАСТОССАССТОАООАТСАСАОСТСАСАОСТОСАОТТССО 750

ТАСАуЧАОАТТСТССССТССТСАСАОССОААаТСССОТАСаТСОСТСОСТАТАСТАСТОССТСАТТАААТаОАААТ 825

ОССАССААААСАТТСТСССаАТТСТТГАСТСТСТСССТТССССАОСАТТСТОССССТССАТССАТСАСАОССССС 900

ТОСГОАСТСОСЛТТСТТГСАААСОААТТАТОТОТТООТОАСТССАаССТСТСТаСАСООТСТСТОАТСАОСААао 975

ТАСТСТСАОТаТСООСТССАТаСТАОААТОАТАААСАТСПТТОТАООТТТССАААСТСААТСГГСТОТТАСССА 1050

ТТОТССАОААССАТАААОТСОСаАОАААСТТТСААГТСТОТАСТТТСАОТАААХЛЛДОСАООООАСОТеООСООО 1125

СССООАСАОТТСТСТАТАСОАЛАТССАТООТОАСТТТСТАТСАААСТССОСТТССААаААТОТСТСОААОАСАОС 1200

АСАТОТАСТТССТООАаТТТССАСаТСТОСТСТСТАОТСАТСТатаААТСТСААСТСОССТТАТОАААСАСАССС 1275

АатОАСАТТОТТТаССАСТАААТСТССТАААаСАаТОООТТОССАТТТСТАААТТСТССТСТСТОАСОТТСААСД 1350

ДХДДДАТССТОАТТАОАААААААААААААА 1380

Рисунок 10. Нуклеотидная последовательность кДНК 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы и реконструированная полная аминокислотная последовательность белка. Подчеркнуты последовательности, определенные методами белковой химии. В 3'-нетранслируемой области подчеркнуты сайты полиаденилирования.

4. Анализ аминокислотной последовательности 28-кДа белка.

Реконструированная из нуклеотидной последовательности кДНК аминокислотная последовательность 28-кДа белка содержит 223 а. о. Рассчитанная молекулярная масса

белка составляет 24630 Да. Как и 45-, 28-кДа белок характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных аминокислотных остатков и имеет рассчитанную изоэлектрическую точку 5,72, что соответствует полученным ранее данным по изоэлектрофокусированию.

Анализ данных, полученных при сравнении полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка со структурами, хранящимися в ЕМВ1, и вепБапк базах данных, показал, что 28-кДа белок принадлежит к недавно обнаруженному новому классу тиол-специфических антиоксидантов или пероксиредоксинов. Представители этого семейства в присутствии тиолов способны предохранять белки и другие макромолекулы от повреждений, вызванных действием ряда окислительных систем. В настоящее время известно более 70 представителей данного семейства, обнаруженных практически во всех живых организмах от бактерий до человека и отличающихся высокой консервативностью. На рисунке 11 представлено сравнение полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка с последовательностью некоторых представителей семейства пероксиредоксинов. Единственный в молекуле остаток цистеина 46 входит в состав консервативного для всех пероксиредоксинов участка РТ(Р/Т)УС(Т/Р)ТЕ, составляющего их каталитический центр, и существен для проявления антиоксидантных свойств белка. Поскольку в молекуле 28-кДа белка отсутствует второй консервативный остаток цистеина, то исследуемый белок относится к подсемейству пероксиредоксинов с одним консервативным цистеином (1-Суз - подсемейство) или, согласно недавно предложенной для млекопитающих номенклатуре, к пероксиредоксинам типа V.

Ближайшими гомологами 28-кДа белка (со степенью гомологии более 90%) являются упомянутые выше «селеннесодержащая глутатионпероксидаза» и человеческий белок ОЯРб, а установленная недавно структура белка, идентифицированного как «Са+2-независимая кислая фосфолипаза типа Аг» из легких крысы была полностью идентична

28-кДа

0RF6

PERI

MSP23

NKEF-A

SP-22

YTSA

Ahpc

28-кДа

0RF6

PERI

MSP23

NKEF-A

SP-22

YTSA

Ahpc

28-кДа

0RF6

PERI

MSP23

NKEF-A

SP-22

YTSA

Ahpc

28-кДа

0RF6

PERI

MSP23

NKEF-A

SP-22

YTSA

Ahpc

Рисунок П. Сравнение полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка с последовательностями некоторых представителей семейства пероксиредоксинов. Условные обозначения: 28-кДа - 28-кДа белок из обонятельного эпителия крысы, GenSank, Y17295; ORFâ - lCys-пероксиредоксин, человек, GenBank, D14662; PERI - гипотетический белок, ячмень, GenBank, Х96551; MSP23 - 23 кДа стрессовый белок, мышь, SWISS-PROT, Р35700; NKEF-A - белковый фактор А, усиливающий активность естественных киллеров, человек, SWISS-PROT, Q06830; SP-22 - митохондриальная тиоредоксин-зависимая пероксиредуктаза, бык, SWISS-PROT, Р35705; YTSA - тиолспецифический антиоксидант, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, SWISS-PROT, Q04I20; AhpC - субъединица С бактериальной алкилгидропероксиредуктазы, Salmonella typhimurium, SWISS-PROT, PI9479. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, инвариантные во всех последовательностях; серым цветом - остатки, идентичные у двух и более представителей семейства пероксиредоксинов, включая белок 28-кДа. Прочерки введены для оптимизации выравнивания. Цифры справа соответствуют степени идентичности (в процентах) приведенных аминокислотных последовательностей относительно последовательности 28-кДа.

28-кДа белку. По сходству аминокислотных последовательностей все эти белки можно

также отнести к семейству тиол-спецпфических антиоксидантов - пероксиредоксинов типа

V. Проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что 28-кДа белок не

обладает фосфолипазной активностью.

мЩ- 1—-

МВ-д- 8Т1ЩТУ |®ÏLDSTH - - а- - - KMMwSNGYVj^^iGBK^ŒElAAM MSSGNAKlf7P$|fflKATAVMPDÖQFKD^

MASÖNARläKPSraKATAVa-Dä\FKEVKLSBVK|-KYVVEHFYELBrt A---PAVTQH^HYSKGTAVq-SqEFKElSLDdEKä-KYLVpFYiJLDFT|FVqPT^IIAF

V---AQVQKC^^gKKTAVa-DqVFDEVSLDKYKä-KYVVBAFIRLArtFVdPTBriAF

MSDlNTKIKB-lKNQAFK-NaEFIEVTEKffTEg-RSSVFgFYäAÜEBFÄdPIE£SDV

SDRÂDtMLSCQVlGASvtëHFCH^

SNRÄEDRRSLGCEVLGVävbSQFTflLAWINITPRKE-i--GLGPQNIELLAPVTBRÜSEDY SDKgs£KHDVaCEVVaVSVbSHFSÜLÄWINTPRKN-i--GLGHMNIALLSQLTKQISRDY SEA^KKEEEQGAQVLFA|TD5EYSLLAWTNIPRKE-S--GLGPINlgLLAqTNHSDSRDY |DHYEgLQgLG2DVYSVSTQTHFT0KiiÎHSSS--E----TIAglKYAMjGÜPTGA|JTRNF

E^ÄEKDMGMEkläRiVSVEG

N^VBED EKQAQGQ- L PSfrLHiVGßMVV&aFlJfflS^W№ -

GVSKADB--—uI--SFRGLOIDDKGILRQITINDLP^^V^OIRL!KQAF3FÏDKH-

ÖvIKTDB----QI--AYKGLE^IDGKGVLRQITVNDLPVG(^SVQ^irRLyQAFQYïDEH-

ÖVBLEGP----§L--ALRGLÎaiD5NGVl£HLSVNDLPV©^

fiVßlEEB----SV--ALRGL1|ID|KGVIRHITINDLPVGR^^

DNMREDB----SL--ADEATfiVVDEQGIIQAIEVTAEGläSDASDLßßKIKAAflYVäAHP

91.5%

KgÖ(|ÄNi/M PGScSv IAHGVS D ЕЕДККМ f HQQFETADE^KBGïMFaKV- 52.0%

gevcragwkpu-Sdtikbdvnk—skeySskqk 31.4%

GEVCiAGppQ-lDTIKHNVDD--SSEYBSKHN 31.4%

GEVc|ANHTPE-SPTIK|HPTA--SREY|EgVNQ 27.3%

GTVLBCNWTPSA-ATIKP3VED--SgEYEEAANK 25.1%

GEVCßAKgaESS-ATLAlsED------fiVGSl 24.7%

Проведенные в дальнейшем в лаборатории биофизики рецепции Института биофизики клетки РА.Н биохимические исследования подтвердили принадлежность 28-кДа белка к семейству пероксиредоксинов. Мы предполагаем, что его основной функцией является защита клеток эпителиев от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода. По-видимому, 28- и 45-кДа белки функционально взаимосвязаны. Данное предположение основано на следующих фактах: 1) концентрация 45-кДа белка в обонятельном эпителии эквимолярна концентрации 28-кДа белка; 2) иммуногистохимические исследования, проведенные на световом и электронно-микроскопическом уровнях показали, что во всех исследованных эпителиальных тканях локализация 28- и 45-кДа белков идентична и 3) эксперименты по in situ гибридизации показали идентичность места синтеза этих белков. На основании этих данных было сделано предположение, что анаюгично 28-кДа белку 45-кДа белок входит в состав одной из антиоксидантных защитных систем клетки.

Выводы.

1. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК 45-кДа белка длиной 1586 п.о. Кодирующая область кДНК 45-кДа белка содержит 1200 п.о. и соответствует белку с вычисленной молекулярной массой 46026 Да. Реконструирована полная аминокислотная последовательность 45-кДа белка, включающая в себя 400 а.о.

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК 28-кДа белка длиной 1414 п.о. Кодирующая область кДНК 28-кДа белка содержит 672 п.о. и соответствует белку с вычисленной молекулярной массой 24630 Да. Реконструирована полная аминокислотная последовательность 28-кДа белка, включающая в себя 223 а.о.

3. Сравнение полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка со структурами других белков показало, что 28-кДа белок принадлежит к недавно обнаруженному новому классу тиол-специфических антиоксидантов или пероксиредоксинов; на основании чего было сделано предположение, что его основной функцией является защита клеток эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода.

4. Выявлена гомология между аминокислотными последовательностями 45-кДа белка и белков-переносчиков гидрофобных соединений. Показано, что наибольшая концентрация 45-кДа белка обнаруживается в эпителиальных тканях, имеющих непрерывный контакт с окружающей средой. Предположено, что 45-кДа белок выполняет функцию транспортировки гидрофобных молекул и наряду с 28-кДа белком входит в состав одной из антиоксидантных защитных систем клетки.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Шуваева Т.М., Андреева С.Г., Меркулова М.И., Пешенко И.В., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е., Липкия В.М., Новые секреторные белки обонятельного эпителия крысы, "Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова", 2-12 ноября 1998г., Москва-Пущино. стр.33.

2. Андреева С.Г., Меркулова М.И., Шуваева Т.М., Новоселов В.И., Пешенко И.В., Новоселов С.В., Фесенко Е.Е., Липкин В.М. Структурные исследования секреторного 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы. Биоорган, химия 1998, 24(11): 816-821.

3. Меркулова М.И., Новоселов В.И., Камзалоз С.С. Первичная структура секреторного 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы. IV Путинская конференция молодых ученых. Пущино, 1999, стр. 13

4. Novoselov V.I., Peshenko I.V., Bystrova M.F., Е.Е. Evdokimov V.A., Novoselov S.V., Kamzalov S.S., Shuvaeva T.M., Merkulova M.I., Andreeva S.G., Lipkiл V.M. Fesenko E.E. Novel secretory proteins from rat epithelium tissues. INTAS Symposium: Microbial and Cellular Systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment. Moscow, 26-30 May. 1999, Dialoque-MSU, p.32.

5. Merkulova М.1., Andreeva S.G., Shuvaeva T.M., Novoselov S.V., Peshenko I.V., Bystrova M.F., Novoselov V.I., Fesenko E.E., Lipkin V.M. A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localisation. FEBS Lett. 1999, 450(1-2): 126130.

6. Shuvaeva T.M., Andreeva S.G., Merkulova M.I., Novoselov V.I., Peshenko I.V., Fesenko E.E., Lipkin V.M., Novel 28 kD and 45 kD Olfactory Enzymes: Structure and Functions, J.Neurochemistry, 1999, v.73, Suppl., p. S46A.

7. Новоселов В.И., Пешенко И.В., Попов В.П., Новоселов С.В., Быстрова М.Ф., Евдокимов В.А., Камзалов С.С., Меркулова М.И., Шуваева Т.М., Липкин В.М., Фесенко Е.Е. Локализация пероксиредоксина с молекулярной массой 28 кДа в эпителиальных тканях крысы и его антиоксидантные свойства, в: II Съезд биофизиков России. 23-27 августа 1999, Москва XIII. 1.9.

S. Novoselov S.V., Peshenko I.V., Popov V.I., Novoselov V.I., Bystrova M.F., Evdokimov V.A., Kamzalov S.S., Merkulova M.I., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. Localization of the 28-kDa pero.xiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties. Cell Tissue Res. 1999,298(3): 471-480.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Меркулова, Мария Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

1. БЕЛКИ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Введение

1.2. Строение органа обоняния наземных позвоночных 11 1.2.1. Структура и функции слизи обонятельного эпителия

1.3. Белки, участвующие в перирецепторных процессах

1.3.1. Одорант-связывающие белки 17 1.3.1.1. Запах-связывающие свойства ОСБ in vitro и их физиологическая роль in vivo

1.3.2. Ферменты биотрансформации

1.4. Белки, принимающие участие в рецепции обонятельного сигнала

1.4.1. Белки, специфичные для ресничек обонятельных рецепторных клеток

1.4.2. Мембранные белки обонятельного эпителия, способные эффективно связывать молекулы одорантов

1.4.3. Семейство генов, кодирующих белки, принадлежащие к классу рецепторов, сопряженных с G-белками

1.4.4. Рекомбинантные белки, продукты экспрессии генов, кодирующих обонятельные рецепторы позвоночных

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы"

2.2. Определение полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка 46

2.3. Анализ аминокислотной последовательности 45-кДа белка 58

2.4. Определение полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка 63

2.5. Анализ аминокислотной последовательности 28-кДа белка 67

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ) 71 3.1. Материалы 72

3.1.1. Реактивы 72

3.1.2. Ферменты 73

3.1.3. Штаммы Е. coli и плазмидные векторы 73

3.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы 73 3.1.4.1. Микробиологические среды 73 л J

3.1.4.2. Буферные растворы для денатурации и иммобилизации ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах 74

3.1.4.3. Растворы для гибридизации нуклеиновых кислот 74

3.1.4.4. Растворы для in situ гибридизации на тканевых срезах 74

3.1.4.5. Растворы для выделения плазмидной ДНК 75

3.1.4.6. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК и РНК 75

3.1.4.7. Буферные растворы для приготовления компетентных клеток Е. coli 76

3.1.4.8. Фотографические растворы 76

3.1.4.9. Другие растворы 77 3.2. Методы 77 ~

3.2.1. Протеолиз 45-кДа белка 77

3.2.2. Обратно фазовая ВЭЖХ 77

3.2.3. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 78

3.2.4. Масс-спектрометрический анализ 78

3.2.5. Приготовление агарозного геля 78

3.2.6. Выделение ДНК фага А. 78

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 80

3.2.8. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК 81

3.2.9. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна 82

3.2.10. Перенос и иммобилизация ДНК фага Я. на фильтрах 82

3.2.11. Перенос и иммобилизация ДНК из Е.coli на нитроцеллюлозных фильтрах 83

3.2.12. Ник-трансляция ДНК 83

3.2.13. Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов 84

3.2.14. Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек 84

3.2.15. Извлечение ДНК из агарозных гелей 85

3.2.16. Получение компетентных клеток E.coli 86

3.2.17. Трансформация компетентных клеток E.coli 86

3.2.18. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 87

3.2.19. Клонирование продуктов ПЦР 87

3.2.20. Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера 88

3.2.21. In situ гибридизация на тканевых срезах 89

4. ВЫВОДЫ 92

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 93

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94

ВВЕДЕНИЕ

Эпителиальные ткани млекопитающих имеют непосредственный контакт с окружающей средой и больше, чем другие ткани, подвержены ее деструктивному воздействию. Некоторые из этих тканей, в т.ч. и обонятельный эпителий, покрыты слизью, являющейся первым защитным барьером, обеспечивающим нормальное функционирование клеток эпителия. В слизи находится множество белков, определяющих ее защитные свойства, это антибактериальные белки, иммуноглобулины, ферменты биотрансформации, включая некоторые ферменты-антиоксиданты, защищающие клетки эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода.

Ранее при исследовании белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом SDS-электрофореза было выявлено два новых водорастворимых белковых компонента, имеющих молекулярную массу 28 и 45 кДа соответственно, каждый из которых составлял порядка 2% всех белков обонятельного эпителия. Столь значительное содержание этих белков в слизи предполагало их важную роль в обеспечении нормального функционирования клеток обонятельного эпителия, что послужило основанием для последующего изучения их структуры и свойств. Цель работы состояла в определении и анализе полной первичной структуры 28- и 45-кДа белков.

Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору В.М. Липкину за внимание к данной работе и помощь в ее проведении, кандидату химических наук Т.М. Шуваевой за внимание к данной работе, помощь в оформлении диссертации и проведение экспериментов по определению частичной аминокислотной последовательности 45-кДа белка, C.B. Новоселову за помощь в проведении in situ гибридизации, лабораторию биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН за плодотворное сотрудничество, кандидату химических наук Н.С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов, кандидату химических наук Т.А.

Мурановой, Ю.Ф. Леоновой и Н.И. Хорошиловой за определение М-концевых аминокислотных последовательностей пептидов и белков, кандидату химических наук О.В. Соловьевой, кандидату химических наук И.А. Костанян и кандидату химических наук Т.В. Ракитиной за ценные советы в работе.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Меркулова, Мария Игоревна

4. ВЫВОДЫ

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1,8-АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфоновая кислота а. о. - аминокислотный остаток а.п. - аминокислотная последовательность

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДТТ - дитиотреитол е.а. - единица активности

Ко - константа диссоциации

М - моль мкм - микрометр

2-МЭ - 2-меркаптоэтанол

ОМБ - обонятельный маркерный белок

ОСБ - одорант-связывающий белок

ПААГ - полиакриламидный гель п. о. - пара оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РСБ - ретинол-связывающий белок

ТЕМЕД - N,N,N',N' - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ТФУ - трифторуксусная кислота

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭОГ - электроольфактограмма

A2U - ссги-глобулин

CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмоний]-1-пропилсульфонат dATP - 2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат dCTP - 2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат dGTP - 2'-дезоксигуанозин-5'-трифосфат dITP - 2'-дезоксиинозин-5'-трифосфат dTTP - 2'-дезокситимидин-5'-трифосфат

FAD - флавинадениндинуклеотид

MALDI - масс-спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией MOPS - морфолинпропансульфоновая кислота MUP - основной белок мочи

PBS - изотонический фосфатный буферный раствор SDS - додеци л сульфат натрия UTP - уридин-5'-трифосфат

1.5. Заключение

Применение современных методов молекулярной биологии, биохимии и нейрофизиологии позволило достичь большого прогресса в изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе хеморецепции запахов у наземных позвоночных. Необходимость различения обонятельной системой огромного количества летучих веществ обуславливает участие в хеморецепции запахов множества различных рецепторов, каждый из которых способен взаимодействовать с несколькими веществами. Это одна из особенностей хеморецепции запахов наземными позвоночными. Другой важной особенностью является то, что in vivo рецепция запахов происходит в определенном микроокружении, в слизи обонятельного эпителия - высокоорганизованном и многокомпонентным внеклеточном матриксе. Кроме того, рецепции предшествуют так называемые перирецепторные процессы - взаимодействие молекул одорантов с компонентами слизи. Насколько эти процессы могут влиять на рецепцию и трансдукцию обонятельного сигнала неизвестно. Но вполне возможно, что данные, полученные при изучении лиганд-связывающих свойств экспрессированных в различных системах обонятельных рецепторов, и не отражают того, что реально происходит in vivo, поскольку рецепция лигандов происходит не в естественных условиях. Таким образом, несмотря на значительные успехи в изучении хеморецепции запахов, еще очень многое в этой проблеме остается неясным и требует дальнейших экспериментальных исследований.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Введение

Одной из особенностей восприятия обонятельных стимулов позвоночных является то, что начальным этапом этого процесса является не прямая рецепция пахучего стимула (т.е., непосредственное взаимодействие стимула с рецепторным белком), а так называемые перирецепторные процессы - биохимические взаимодействия между компонентами слизи и молекулами одорантов. Наиболее изученными из компонентов слизи, участвующих в перирецепторных процессах являются одорант-связывающие белки (ОСБ) и ферменты биотрансформации. Достаточно хорошо изучены также структурные (муцины, ольфактомедин) и защитные (лактоферрин, лизоцим, иммуноглобулины А и М) белки слизи. Но в целом, в настоящее время белковые компоненты периферического отдела обонятельной системы еще недостаточно хорошо охарактеризованы, хотя, именно они определяют защитную функцию слизи, обеспечивают нормальное функционирование обонятельного эпителия и участвуют в первичных процессах восприятия запаха. В связи с этим структурно-функциональные исследования белков слизи обонятельного эпителия -ткани, непрерывно контактирующей с окружающей средой, и больше, чем другие, подверженной деструктивному воздействию активных форм кислорода, представляются интересными и перспективными. В лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и лаборатории биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН проводятся исследования белков, участвующих в перирецепторных процессах.

Ранее в лаборатории биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН при исследовании белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом БОБ-электрофореза было выявлено два новых водорастворимых белковых компонента, имеющих молекулярную массу ~28 и -45 кДа соответственно, каждый из которых составлял порядка 2% всех белков обонятельного эпителия (рис.8) [102-105]. Столь значительное содержание этих белков в слизи предполагало их важную роль в обеспечении нормального функционирования клеток обонятельного эпителия, что послужило основанием для последующего изучения их структуры и свойств. Кроме того, 45-кДа белок вызывал интерес еще и потому, что специфически взаимодействовал с антителами, выработанными против синтетического пептида, имеющего аминокислотную последовательность, общую для ОТР-связывающего домена а-субъединиц известных белков (ОАОЕЗОКБИУКдМК [106]) [102,105]. I 3 45 к Да

28 кДа

Рисунок 8. Обнаружение водорастворимых 28-кДа и 45-кДа белков методом БОБ-электрофореза в ПААГ в слизи (1), изотоническом (2) и гипотоническом (3) гомогенате клеток обонятельного эпителия крысы.

В дальнейшем 28- и 45-кДа белки были выделены в индивидуальном состоянии и частично охарактеризованы [102-105], однако их физиологическая роль и место в перирецепторных процессах выяснены не были. Для проведения дальнейших функциональных исследований этих белков было необходимо определить их первичную структуру и на основе полученных данных выявить возможные функции, выполняемые этими белками. Настоящая работа и посвящена определению и анализу полной первичной структуры 28- и 45-кДа белков.

2.2. Определение полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка

45-кДа белок был выделен, как описано в [102]. Для структурных исследований нами использовался препарат, дополнительно очищенный обратно фазовой ВЭЖХ и модифицированный как описано в [103].

Поскольку N-концевой аминокислотный остаток 45-кДа белка оказался модифицированным и закрытым для анализа по методу Эдмана, было проведено его ферментативное расщепление лизинспецифичной протеиназой (endoproteinase Lys-C из Lysobacter enzymogenes, Boeringer-Manheim, Germany) [107]. Этот коммерчески доступный фермент давно и широко используется в работах по определению первичной структуры белков. Это высокоспецифичная протеиназа, гидролиз угощая связи, образованные а-карбоксильными группами остатков лизина. Этот фермент способен осуществлять гидролиз при очень низкой нагрузке (весовое соотношение фермент:субстрат до 1:200) и в присутствии высоких концентраций детергента (например, 2 М хлоргидрат гуанидина; 0,5 % SDS).

Гидролиз очищенного и модифицированного 45-кДа белка проводили в обычно принятых условиях. Разделение продуктов протеолиза 45-кДа белка проводили обратно фазовой ВЭЖХ на колонке 0,46x25 см Ultrasphere С18 (Beckman, USA) в градиенте ацетонитрила в водном растворе 0,1% ТФУ (рис.9). Анализ N-концевых аминокислотных остатков показал, что фракции L1-L5 являются гомогенными и не требуют дальнейшей очистки. С помощью автоматической деградации по методу Эдмана была определена полная аминокислотная последовательность лизинспецифичных пептидов L1 и L2 и частичная - пептидов L3 - L5. Данные о структуре лизинспецифичных пептидов 45-кДа белка, приведены в таблице 2.

Г I

Г( я а.

40 =

Время(мип)

Рисунок 9, Хромато графический анализ пептидов, полученных при гидролизе 45-кДа белка лизннспецифичной протеи -назой. на колонке 0,46x25 см иНга$рЬеге С18. Здесь, а также на рис.10 олюированис градиентом аистоннт рила в 0,1% ТФУ.

--о

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Меркулова, Мария Игоревна, Москва

1. Pelosi P. Odorant-binding proteins. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1994;29(3): 199-228

2. Amoore JE., Specific anosmia and the concept of primary odors. Chem. Senses 1977, 2:267-281

3. Getchell TV, Getchell ML. Regulatory factors in the vertebrate olfactory mucosa. Chem Senses, 1990; 15(2): 223-231

4. Getchell T.V., Margolis F.L., Getchell M.L. (1984) Perireceptor and receptor events in vertebrate olfaction. Progress in Neurobiology, v.23, pp.317-345

5. А. Хэм, Д. Кормак «Гистология» т.4, Москва, «Мир» стр. 206-210

6. Reese TS. Olfactory cilia in the frog. J. Cell Biol. 1965, 25:209-230

7. Bronshtein AA, Minor AV Significance of flagellae and their mobility for olfactory receptor function Dokl Akad Nauk SSSR 1973 Dec l;213(4):987-9

8. Graziadei PP, Graziadei GA Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons. J Neurocytol. 1979 Feb;8(l):l-18.

9. Margolis FL, A brain protein unique to the olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci USA. 1972 May;69(5): 1221-4

10. Farbman AI, Margolis FL Olfactory marker protein during ontogeny: immunohistochemical localization. Dev Biol. 1980 Jan;74(l):205-15

11. Rogers KE, Dasgupta P, Gubler U, Grillo M, Khew-Goodall YS, Margolis FL. Molecular cloning and sequencing of a cDNA for olfactory marker protein. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Mar;84(6); 1704-8

12. Menco BP. Ultrastructural aspects of olfactory transduction and perireceptor events. Semin Cell Biol. 1994 Feb;5(l):l 1-24

13. Kream RM, Margolis FL. Olfactory marker protein: turnover and transport in normal and regenerating neurons. JNeurosci. 1984 Mar;4(3):868-79

14. Okano, М. and Tagaki, S.F., Secretion and electrogenesis of the supporting cell in the olfactory epithelium, J. Physiol. (London), 242, 353,1974

15. Rafols, J.A. and Getchell, T.V. Morphological relations between the receptor neurons, sustentacular cells and Schwann cells in the olfactory mucosa of the salamander. Anat.Rec. 206, 87-101

16. Menco BP. Freeze-fracture, deep-etch, and freeze-substitution studies of olfactory epithelia, with special emphasis on immunocytochemical variables. Microsc Res Tech. 1995 Nov l;32(4):337-56

17. Schwartz Levey M, Chikaraishi DM, Kauer JS Characterization of potential precursor populations in the mouse olfactory epithelium using immunocytochemistry and autoradiography JNeurosci 1991 Nov;l 1(11):3556-64

18. Menco BP. Qualitative and quantitative freeze-fracture studies on olfactory and nasal respiratory structures of frog, ox, rat, and dog. I. A general survey. Cell Tissue Res. 1980;207(2): 183-209

19. Meyer FA, Silberberg A. The rheology and molecular organization of epithelial mucus. Biorheology. 1980;17(l-2):163-8 (227)

20. Winet H, Yates GT, Wu TY, Head J. On the mechanics of mucociliary flows. III. Flow-velocity profiles in frog palate mucus. J Appl Physiol. 1984 Mar;56(3)-.785-94 (228)

21. Pelosi P. Perireceptor events in olfaction. J Neurobiol. 1996 May;30(l):3-19

22. Bai RS, Anholt RR. Formation of the extracellular mucous matrix of olfactory neuroepithelium: identification of partially glycosylated and nonglycosylated precursors of olfactomedin. Biochemistry. 1993 Feb 2;32(4): 1047-53

23. Snyder DA, Rivers AM, Yokoe H, Menco BP, Anholt RR. Olfactomedin: purification, characterization, and localization of a novel olfactory glycoprotein. Biochemistry. 1991 Sep 24;30(38):9143-9153

24. Zielinski BS, Getchell ML, Wenokur RL, Getchell TV Ultrastructural localization and identification of adrenergic and cholinergic nerve terminals in the olfactory mucosa. Anat Ree. 1989 Nov;225(3):232-45

25. Getchell ML, Getchell TV. Immunohistochemical localization of components of the immune barrier in the olfactory mucosae of salamanders and rats. Anat Ree. 1991 Nov;231(3):358-74

26. Meliert TK, Getchell ML, Sparks L, Getchell TV. Characterization of the immune barrier in human olfactory mucosa. Otolaryngol Head Neck Surg. 1992 Feb;106(2):181-8

27. Dear TN, Boehm T, Keverne EB, Rabbitts TH. Novel genes for potential ligand-binding proteins in subregions of the olfactory mucosa. EMBO J. 1991 Oct; 10(10):2813-9

28. Breer H, Raming K, Krieger J. Signal recognition and transduction in olfactory neurons. Biochim Biophys Acta. 1994 Nov 10;1224(2):277-87

29. Pelosi P, Baldaccini NE, Pisanelli AM Identification of a specific olfactory receptor for 2-isobutyl-3-methoxypyrazine. Biochem J. 1982 Jan l;201(l):245-8

30. Tirindelli R, Keen JN, Cavaggioni A, Eliopoulos EE, Findlay JB Complete amino acid sequence of pyrazine-binding protein from cow nasal mucosa. Eur J Biochem. 1989 Nov 20;185(3):569-72

31. Bianchet MA, Bains G, Pelosi P, Pevsner J, Snyder SH, Monaco HL, Amzel LM The three-dimensional structure of bovine odorant binding protein and its mechanism of odor recognition. Nat Struct Biol. 1996 Nov;3(l l):934-9

32. Pevsner J, Hou V, Snowman AM, Snyder SH Odorant-binding protein. Characterization ofligand binding. J Biol Chem. 1990 Apr 15;265(11):6118-25

33. Pelosi P. Odorant-binding proteins: structural aspects. Ann N Y Acad Sci. 1998 Nov 30;855:281-93

34. Avanzini F, Bignetti E, Bordi C, Carfagna G, Cavaggioni A, Ferrari G, Sorbi RT, Tirindelli R Immunocytochemical localization of pyrazine-binding protein in bovine nasal mucosa. Cell Tissue Res. 1987 Feb;247(2):461-4

35. Pevsner J, Hwang PM, Sklar PB, Venable JC, Snyder SH Odorant-binding protein and its mRNA are localized to lateral nasal gland implying a carrier function. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Apr;85(7):2383-7

36. Lee KH, Wells RG, Reed RR Isolation of an olfactory cDNA: similarity to retinol-binding protein suggests a role in olfaction. Science. 1987 Feb 27;235(4792):1053-6

37. Pevsner J, Reed RR, Feinstein PG, Snyder SH. Molecular cloning of odorant-binding protein: member of a ligand carrier family. Science. 1988; Jul 15;241(4863): 336-339

38. Dear TN, Campbell K, Rabbitts TH Molecular cloning of putative odorant-binding and odorant-metabolizing proteins. Biochemistry. 1991 Oct 29;30(43): 10376-82

39. Flower DR The lipocalin protein family: structure and function. Biochem J. 1996 Aug 15;318 ( Pt 1):1-14

40. Sansom CE, North AC, Sawyer L Structural analysis and classification of lipocalins and related proteins using a profile-search method. Biochim Biophys Acta. 1994 Oct 19;1208(2):247-55

41. Cavaggioni A, Findlay JB, Tirindelli R Ligand binding characteristics of homologous rat and mouse urinary proteins and pyrazine-binding protein of calf. Comp Biochem Physiol B. 1990;96(3):513-20

42. Snyder SH, Sklar PB, Hwang PM, Pevsner J. Molecular mechanisms of olfaction. Trends Neurosci. 1989 Jan;12(l):35-38

43. Pevsner J., Snyder SH. Odorant-binding protein: odorant transport function in the vertebrate nasal epithelium. Chem Senses, 1990; 15(2): 217-222

44. Mowbray SL, Cole LB 1.7 A X-ray structure of the periplasmic ribose receptor from Escherichia coli. J Mol Biol. 1992 May 5;225(1): 155-75

45. Koshland DE Jr Biochemistry of sensing and adaptation in a simple bacterial system. Annu Rev Biochem. 1981;50:765-82

46. Lobel D, Marchese S, Krieger J, Pelosi P, Breer H Subtypes of odorant-binding proteins-heterologous expression and ligand binding. Eur J Biochem. 1998 Jun 1;254(2):318-24

47. Carr W.E., Trapido-Rosenthal H.G., Gleeson R.A., The role of degradative enzymes in chemosensory processes, Chem. Senses 1990,15(2):181-190

48. Nef P., Heldman J., Lazard D., Margalit T., Jaye M., Hanukoglu I., Lancet D„ 1989, Olfactory-specific cytochrome P-450: cDNA cloning of a novel neuroepithelial enzyme possibly involved in chemoreception, J. Biol. Chem., 264, 6780-6785

49. Lazard D., Zupko K., Poria Y., Nef P., Lazarovits J., Horn S., Khen M. and Lancet D. Odorant signal termination by olfactory UDP glucuronosyl transferase. 1991, Nature, v.349, 790793

50. Ben-Arie N, Khen M, Lancet D Glutathione S-transferases in rat olfactory epithelium: purification, molecular properties and odorant biotransformation. Biochem J. 1993 Jun 1 ;292 (Pt 2):379-384

51. Lefkowitz RJ, Hausdorff WP, Caron MG Role of phosphorylation in desensitization of the beta-adrenoceptor. Trends Pharmacol Sci. 1990 May; 11(5): 190-4

52. Pelosi P, Maida R. Odorant-binding proteins in vertebrates and insects: similarities and possible common function. Chem Senses, 1990; 15(2): 205-215

53. Dahl AR, Hadley WM, Hahn FF, Benson JM and McClellan RO. Cytochrome P-450-dependent monooxygenases in olfactory epithelium of dogs: Possible role in tumorigenicity. Science 1982,216,57-59

54. Lancet D Vertebrate olfactory reception. Annu Rev Neurosci. 1986;9:329-55

55. Pace U, Lancet D Olfactory GTP-binding protein: signal-transducing polypeptide of vertebrate chemosensory neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul;83(13):4947-51

56. Banger KK, Lock EA, Reed CJ, The characterization of glutathione S-transferases from rat olfactory epithelium. Biochem. J, 1993, 290, 199-204

57. Reed RR How does the nose know? Cell. 1990 Jan 12;60(l):l-2

58. Breer H, Raining K, Krieger J, Boekhoff I, Strotmann J. Towards an identification of odorant receptors. J Recept Res. 1993;13(l-4):527-40

59. Ottoson D Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiol. Scand. 1956, v.35:1-83

60. Bronshtein AA, Minor AV Regeneration of olfactory flagella and restoration of the electroolfactogram following application of triton X-100 to the olfactory mucosa of frogs Tsitologiia 1977;19(l):33-9

61. Rhein LD, Cagan RH Biochemical studies of olfaction: isolation, characterization, and odorant binding activity of cilia from rainbow trout olfactory rosettes. Proc Natl Acad Sci U S A 1980 Aug;77(8):4412-4416

62. Shirley SG, Polak EH, Mather RA, Dodd GH. The effect of concanavalin A on the rat electro-olfactogram. Differential inhibition of odorant response. Biochem J. 1987 Jul I;245(I): 175-84

63. Allen WK, Akeson R Identification of a cell surface glycoprotein family of olfactory receptor neurons with a monoclonal antibody. J Neurosci 1985 Feb;5(2):284-96

64. Anholt RR, Petro AE, Rivers AM Identification of a group of novel membrane proteins unique to chemosensory cilia of olfactory receptor cells. Biochemistry 1990 Apr 3;29(13):3366-73

65. Hempstead JL, Morgan JI A panel of monoclonal antibodies to the rat olfactory epithelium. J Neurosci 1985 Feb;5(2):438-49

66. Strotmann J., Breer H Generation of monoclonal antibodies detecting specific epitopes in olfactory and respiratory epithelia.Cell Tissue Res. 1991 Nov;266(2):247-258

67. Menco BP Qualitative and quantitative freeze-fracture studies on olfactory and nasal respiratory epithelial surfaces of frog, ox, rat, and dog. II. Cell apices, cilia, and microvilli. Cell Tissue Res. 1980;211(l):5-29

68. Chen Z, Lancet D. Membrane proteins unique to vertebrate olfactory cilia: candidates for sensory receptor molecules. Proc Natl Acad Sci U S A 1984 Mar;81(6):1859-1863

69. Chen Z, Pace U, Ronen D, Lancet D Polypeptide gp95. A unique glycoprotein of olfactory cilia with transmembrane receptor properties. J Biol Chem 1986 Jan 25;261(3):1299-1305

70. Chen Z, Ophir D, Lancet D Monoclonal antibodies to ciliary glycoproteins of frog olfactory neurons. Brain Res. 1986 Mar 19;368(2):329-38

71. Menco BP, Farbman AI Ultrastructural evidence for multiple mucous domains in frog olfactory epithelium. Cell Tissue Res. 1992 C)ct;270(l):47-56

72. В.И. Новоселов, М.Ф. Быстрова, E.E. Фесенко. Свойства рецепторных элементов из обонятельного эпителия крысы. Сенсорные системы 1987, 1(1):7-13

73. Fesenko ЕЕ, Novoselov VI, Novikov JV Molecular mechanisms of olfactory reception. VI. Kinetic characteristics of camphor interaction with binding sites of rat olfactory epithelium. Biochim Biophys Acta 1985 May 8;839(3):268-75

74. Новоселов В.И. 1991 Обонятельные рецепторные элементы позвоночных. Докторская диссертация

75. Buck L, Axel R A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 1991 Apr 5;65(1): 175-87

76. Snyder SH. The molecular basis of communication between cells. Sci Am. 1985 Oct;253(4): 132-41

77. Kurihara K, Koyama N High activity of adenyl cyclase in olfactory and gustatory organs. Biochem Biophys Res Commun. 1972 Jul 1 l;48(l):30-4

78. Firestein S, Werblin F Odor-induced membrane currents in vertebrate-olfactory receptor neurons. Science 1989 Apr 7;244(4900):79-82

79. Kobilka B. Adrenergic receptors as models for G protein-coupled receptors. Annu Rev Neurosci. 1992;15:87-114

80. O'Dowd BF, Lefkowitz RJ, Caron MG Structure of the adrenergic and related receptors. Annu Rev Neurosci. 1989;12:67-83

81. Bouvier M, Hausdorff WP, De Blasi A, O'Dowd BF, Kobilka BK, Caron MG, Lefkowitz RJ Removal of phosphorylation sites from the beta 2-adrenergic receptor delays onset of agonist-promoted desensitization. Nature. 1988 May 26;333(6171):370-3

82. Strader CD, Sigal IS, Dixon RA Structural basis of beta-adrenergic receptor function. FASEB J 1989 May;3(7): 1825-1832

83. Kobilka BK, Kobilka TS, Daniel K, Regan JW, Caron MG, Lefkowitz RJ Chimeric alpha 2-,beta 2-adrenergic receptors: delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science. 1988 Jun 3;240(4857):1310-6.

84. Mombaerts P. Molecular biology of odorant receptors in vertebrates. Annu Rev Neurosci. 1999;22:487-509

85. Sullivan SL, Adamson MC, Ressler KJ, Kozak CA, Buck LB The chromosomal distribution of mouse odorant receptor genes. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Jan 23;93(2):884-8

86. Lancet D, Sadovsky E, Seidemann E Probability model for molecular recognition in biological receptor repertoires: significance to the olfactory system. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Apr 15;90(8):3715-9

87. Koshimoto H, Katoh K, Yoshihara Y, Mori K Distribution of putative odour receptor proteins in olfactory epithelium. Neuroreport. 1992 Jun;3(6):521-3

88. Menco BP, Cunningham AM, Qasba P, Levy N, Reed RR Putative odour receptors localize in cilia of olfactory receptor cells in rat and mouse: a freeze-substitution ultrastructural study. J Neurocytol. 1997 0ct;26(10):691-706

89. Nekrasova E, Sosinskaya A, Natochin M, Lancet D, Gat U Overexpression, solubilization and purification of rat and human olfactory receptors. Eur J Biochem. 1996 May 15;238(l):28-37

90. Krieger J, Schleicher S, Strotmann J, Wanner I, Boekhoff I, Raming K, De Geus P, Breer H Probing olfactory receptors with sequence-specific antibodies. Eur J Biochem. 1994 Feb l;219(3):829-35

91. Nef P, Hermans-Borgmeyer I, Artieres-Pin H, Beasley L, Dionne VE, Heinemann SF Spatial pattern of receptor expression in the olfactory epithelium. Proc Natl Acad Sci USA.1992 Oct l;89(19):8948-52

92. Ngai J, Chess A, Dowling MM, Necles N, Macagno ER, Axel R Coding of olfactory information: topography of odorant receptor expression in the catfish olfactory epithelium. Cell.1993 Mar 12;72(5):667-80

93. Raming K, Krieger J, Strotmann J, Boekhoff I, Kubick S, Baumstark C, Breer H Cloning and expression of odorant receptors. Nature. 1993 Jan 28;361(6410):353-6

94. Ressler KJ, Sullivan SL, Buck LB A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactoiy epithelium. Cell. 1993 May 7;73(3):597-609

95. Kudrycki K, Stein-Izsak C, Behn C, Grillo M, Akeson R, Margolis FL Olf-l-binding site: characterization of an olfactory neuron-specific promoter motif. Mol Cell Biol. 1993 May;13(5):3002-14

96. Strotmann J, Wanner I, Krieger J, Raming K, Breer H Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 1992 Dec;3(12):1053-6

97. McClintock TS Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 1997 Sep;48(2):270-8

98. Zhao H, Ivic L, Otaki JM, Hashimoto M, Mikoshiba K, Firestein S Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 1998 Jan 9;279(5348):237-42

99. Novoselov VI, Peshenko IV, Evdokimov VJ, Nikolaev JV, Matveeva EA, Fesenko EE Water-soluble GTP-binding protein from rat olfactory epithelium. FEBS Lett. 1994 Oct 24;353(3):286-8

100. Пешенко И.В., Новоселов В.И., Евдокимов B.A., Попов В.И., Николаев Ю.В., Шуваева Т.М., Липкин В.М., Фесенко Е.Е. Выделение и биохимический анализ нового секреторного 28-кДа белка из обонятельного эпителия крысы. Сенсорные системы 1996; 10(3):97-109

101. Peshenko IV, Novoselov VI, Evdokimov VA, Nikolaev YuV, Shuvaeva TM, Lipkin VM, Fesenko EE Novel 28-kDa secretory protein from rat olfactory epithelium. FEBS Lett. 1996 Feb 26;381(1-2):12-14

102. Novoselov VI, Peshenko IV, Evdokimov VA, Nikolaev JV, Matveeva EA, Fesenko EE 45-kDa GTP-binding protein from rat olfactory epithelium: purification, characterization and localization. Chem Senses. 1996 Apr;21(2):181-8

103. Mumby SM, Kahn RA, Manning DR, Gilman AG Antisera of designed specificity for subunits of guanine nucleotide-binding regulatory proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jan;83(2):265-9

104. Jekel PA, Weijer WJ, Beintema JJ Use of endoproteinase Lys-C from Lysobacter enzymogenes in protein sequence analysis. Anal Biochem. 1983 Oct 15;134(2):347-54

105. Leshchinskaya IB, Shakirov EV, Itskovitch EL, Balaban NP, Mardanova AM, Sharipova MR, Viryasov MB, Rudenskaya GN, Stepanov VM Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19. FEBS Lett. 1997 Mar 10;404(2-3):241-4

106. Lathe R Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data. Theoretical and practical considerations. J Mol Biol. 1985 May 5;183(1):1-12

107. Takahashi Y, Kato K, Hayashizaki Y, Wakabayashi T, Ohtsuka E, Matsuki S, Ikehara M, Matsubara К Molecular cloning of the human cholecystokinin gene by use of a synthetic probe containing deoxyinosine. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Apr;82(7):1931-5

108. Ohtsuka E, Matsuki S, Ikehara M, Takahashi Y, Matsubara К An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions. J Biol Chem. 1985 Mar 10;260(5):2605-8

109. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5463-7

110. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual /ed. Nolan C./ Second edition.-Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989

111. Woo S.L.C. A sensetive and rapid method for recombinant phage screening.- Methods enzymol., 1979, v.68, p.389-395

112. Забаровский Е.П., Турина O.B. Быстрое выделение фага X. Мол. биология 1988, 22:1451-1455

113. Kozak М Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem. 1991 Oct 25;266(30): 19867-70

114. Cavener DR, Ray SC Eukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Res. 1991 Jun 25;19(12):3185-92

115. Kim J, Martignetti JA, Shen MR, Brosius J, Deininger P Rodent BC1 RNA gene as a master gene for ID element amplification. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Apr 26;91(9):3607-11

116. Weiner AM, Deininger PL, Efstratiadis A Nonviral retroposons: genes, pseudogenes, and transposable elements generated by the reverse flow of genetic information. Annu Rev Biochem. 1986;55:631-61

117. McKinnon RD, Shinnick TM, Sutcliffe JG The neuronal identifier element is a cis-acting positive regulator of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jun;83(l l):3751-5

118. Sha B, Phillips SE, Bankaitis VA, Luo M Crystal structure of the Saccharomyces cerevisiae phosphatidylinositol-transfer protein. Nature. 1998 Jan 29;391(6666):506-10

119. Crabb JW, Goldflam S, Harris SE, Saari JC Cloning of the cDNAs encoding the cellular retinaldehyde-binding protein from bovine and human retina and comparison of the protein structures. J Biol Chem. 1988 Dec 15;263(35):18688-92

120. Kennedy BN, Huang J, Saari JC, Crabb JW Molecular characterization of the mouse gene encoding cellular retinaldehyde-binding protein. Mol Vis. 1998 Sep 4;4:14

121. Sato Y, Arai H, Miyata A, Tokita S, Yamamoto K, Tanabe T, Inoue К Primary structure of alpha-tocopherol transfer protein from rat liver. Homology with cellular retinaldehyde-binding protein. J Biol Chem. 1993 Aug 25;268(24):17705-10

122. Gu M, Warshawsky I, Majerus PW Cloning and expression of a cytosolic megakaryocyte protein-tyrosine-phosphatase with sequence homology to retinaldehyde-binding protein and yeast SEC14p. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Apr l;89(7):2980-4

123. Меркулова М.И., Новоселов C.B., Камзалов C.C. Первичная структура секреторного 45-кДа белка из обонятельного эпителия крысы. Материалы IV Пущинской конференции молодых ученых: Молекулярная биология и биохимия, биотехнология, Пущино, 1999, стр.13

124. Munz В, Frank S, Hubner G, Olsen E, Werner S A novel type of glutathione peroxidase: expression and regulation during wound repair. Biochem J. 1997 Sep 1;326 ( Pt 2):579-85

125. Iakoubova OA, Pacella LA, Her H, Beier DR LTW4 protein on mouse chromosome 1 is a member of a family of antioxidant proteins. Genomics. 1997 Jun 15;42(3):474-8

126. Benton WD, Davis RW Screening lambda gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science. 1977 Apr 8; 196(4286): 180-2

127. Chae, H.Z. and S.G. Rhee. A thiol-specific antioxidant and sequence homology to various proteins of unknown function. Biofactors 1994; 4:177-180

128. Chae HZ, Uhm ТВ, Rhee SG Dimerization of thiol-specific antioxidant and the essential role of cysteine 47. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Jul 19;91(15):7022-6

129. Jin DY, Chae HZ, Rhee SG, Jeang KT Regulatory role for a novel human thioredoxin peroxidase inNF-kappaB activation. J Biol Chem. 1997 Dec 5;272(49):30952-61

130. Peshenko I.V., Novoselov V.I., Evdokimov V.A., Kamzalov S.S., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. Identification of 28 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium as tiol-specific antioxidant. Free Rad.Biol.& Med. 1998, 25, 654-659

131. Новоселов В.И., Пешенко И.В., Новоселов С.В., Камзалов С.С., Быстрова М.Ф., Евдокимов В.А., Николаев Ю.В., Фесенко Е.Е. Протекторные свойства 28-кДа пероксиредоксина определяются его пероксидазной активностью. Биофизика 1999, 44, 568-570

132. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой., 1982, Медицина, Москва

133. Gordon, R.Y., L.S. Bocharova, I.I. Kruman, V.I. Popov, A.P. Kazantsev, S.S. Khutzian, and V.N. Karnaukhov. Acridine orange as an indicator of the cytoplasmic ribosome state. Cytometry 1997, 29:215-221

134. Hayashi, S., I.C. Gillam, A.D. Delaney, and G.M. Tener. Acetylation of chromosome squashes of Drosophila melanogaster decreases the background in autoradiographs from hybridization with 1251.- labeled RNA. J Histochem.Cytochem 1978, 26:677-679

135. Singh, L. and K.W. Jones. The use of heparin as a simple cost-effective means of controlling background in nucleic acid hybridization procedures. Nucleic.Acids.Res 1984, 12:5627-5638o i 5 lit-00

Информация о работе

Меркулова, Мария Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы