Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Секреторный 28 КДА белок из обонятельного эпителия крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Секреторный 28 КДА белок из обонятельного эпителия крысы"

Р Г б од

\ 3 МАИ ^ На правах рукописи

Евдокимов Вячеслав Александрович

СЕКРЕТОРНЫЙ 28 КДА БЕЛОК ИЗ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ КРЫСУ

Бпохемия 03.00.04

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г.Пущина - 1996 -

Работа выложена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.И.Новоселов.

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук

Камзолова С.Г. кандидат биологических наук Щипакина Т.Г.

Ведущая организация-

Институт биоорганической химии РАН

Защита состоится си-^^А ^^ в !к1*с часов на

заседании Диссертационного совета Д 200.23.01. при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г.Пущино, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦВИ РАН, Пущно.

Автореферат разослан " Ь " 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

""" Т.И.Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тега. К настоящему времени общепризнано, что первичные процессы восприятия запаха происходя? в поверхностном слое обонятельного эпителия, в котором локализованы агутики и булавы обонятельных рецспторных клеток, шпфОЕКЛли опорных клеток и непосредственно сема слизь.

В последнее время каштЩяшрован ряд спегш'х-шых для этой области обонятельного эпителия белков, пмзвдпх различные предполагаемые функции. Во-первых, это семейство кандидатов в рецептор-ные белки, которые, скорее всего, являются членами большого класса обонятельных рецепторкых молекул [Впек L.,Azei H.199Í; Бгеег, ВоеКпоГГ 199П; во-вторых, несколько видов звпахсвягававдих белков, локализованных как з обонятедыюЗ слизи, так и на внекшей поверхности мембран обонятельных клеток [Pelóse, 'laida 19951; и в третьих, обнаружен целый ряд специфических белков, Функции которых предполагаются, но пока не выяснены [Anholt et.al.. 1990; Alien, Akeson 1935; Eovoselov et.al. 19941. В то не время, изучение процессов, происходящих в обонятельном эпителии от момента сорбции пахучего вещества слазь» до начала его взакодействая с рецептором находится в самом начале. Так как прямой контакт обонятелышх рецепторных телэтак с охрунащей средой не происходит да ж у HaceiccMiiX и рыб. то следует особо ответить роль именно слизи в осуществлении этого контакта, в обеспечения нормального функционирования всего обонятельного эпителия. В слизи работают механизмы, лекеше в основе механической и биохимической защити клеток, сорбции и десорбц?;и запаха, транспорта запахов к различных веществ, удаления (деструкция) необратимо связавшихся с рецептором запахов, ионного баланса и др.

Цель работы. Данная работа посватана обнаругению спещйиче-ских белков слизи, изучении их свойств и выяснению их возможного участия в процессе перзрецегацш запаха и гязподеятельности обонятелышх клеток.

Научна:: пов";гна ps''ot:i.

I. Впервые идентк&аЕров'ВД и гиделен водорзстворэт&г секрггоу-1Шй 28кЯ'д белок. пошй пр^лсгФэтель пъгжю «"Зпаругеппого нового класса иэсодзрчягпх селе.! глутгшишерок&ша.

I

2. Дана характеристика физико-химических и иммунологических свойств данного белка.

3. 28кДа белок локализован в обонятельной слизи, на поверхности мембран жгутиков, в апикальной части рецепторных и опорных клеток и в бокаловидных клетках обонятельного эпителия. Данный белок синтезируется опорными и бокаловидным»! клетками и секретируется в слизь обонятельного эпителия.

4. Предполагаемой функцией 28кДа белка является нейтрализация перекисных соединений в обонятельной слизи, защита клеток от возможных повреждений, связанных с перекисным окислением липидов мембран.

Практическая ценность. Полученные в диссертационной работе теоретические и методические результаты могут быть использованы для более глубокого понимания молекулярных, механизмов обонятельной рецепции, особенно при анализе событий, происходящих в обонятельной слизи. Использованные в работе методические подходы могут быть также применены для выявления других белков, связанных с защитными функциями различных тканей организма.

Апробация работы. Основные результаты, полученные при выпо-лнешш настоящей работы, докладывались на семинарах лаборатории биофизики рецепции ИБК РАН, на ежегодной Конференции Института биофизики клетки РАН (1995г), на VII Всероссийском Симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" (Ккэсква, 1992), на Международной Конференции "Mechanisms oi sensory chemoreceptlon In vertebrates" (Пущино, 1992), на VI конгрессе ECHO (Бирмингем 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 214 наименований. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка 28кДа белка. Для выделения белка использовались крысы линии Вистар. Крыс декалитировали, извлекали обонятельный эпителий. Затем ткань двавды промывали ШЕ.рН 8.0, 4°С,

-омогенизировали в этой среде, центрифугировали 5мин 500xg. Полугенный супернатант центрифугировали при 20000xg 20мин, затем диа-шзовали 12часов против раствора A:12mM Trls/HCl, 1шМ MgClg, 1тМ [ТТ.рН 7.8). Диализованный экстракт хроматографировали на колонке )ЕАЕ - Sepharose, Pharmacia. Бежи элюировали линейным градиентом faCl (0-500гпМ) в растворе А. 20°С. Фракции. содержащие белок 28 [Да, концентрировали и разделяли на колонке Sephacryl S-200,Phar-lacla; белки элюировали буфером: 25m!tf Trls/HCl, tOOraSf NaCl, 1шМ !gCl2, liriti ДТТ. pH7.8. Для приготовления супернатанта изотониче-:ких гомогенатов тканей ("водорастворимые белки различных ткэ-йй") использовали ткань обонятельного эпителия, мозг, печень, ¡егкие, почки, скелетные мышцы.

Приготовление поликлональных антител. Иммунизацию кроликов [ровели, как описано у Хинч iHlnsch et al 19891. Проводили инъек-ию в подушечки задних лап кролика смесью антигена (2.00 мкг нати-«ого бежа) с полным адыовантом Фрейнда (Sigma,США). Через"' 30 лей повторно инъецировали внутрикожно в спину 200мкг антигена с :еполным адьювантом Фрейнда. Спустя Юдней брали 30-40мл крови, 'Тделяли сыворотку и определяли титр по методу системы "ELISA".

ДЦС-электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез проводили о методу Лэммли fbaemml1,1970]. Окрашивание белков в геле про-одили 0.1% Кумасси R-250 или серебром по методу Окли [Oakley et 1. 19801. После ДЦС-электрофэреза белки переносили на нитроцел-юлозу Hlbond С (Amersham). Нитроцеллюлозные мембраны блокировать 1% овальбумином и проводились стандартные иммуноферментные еакции. В качестве вторичных антител использовали антикроличьи нтитела с конъюгированной пероксидазой хрена. Образовавшийся ко-илекс визуализировали при помощи 3',3-диаминобензидина и HgO^.

Изоэлектричеекое фокусирование (ЮФ). Аналитическое изоэле-трофокусирование проводили на коммерческих полиакриламидных ластинах "Amphollne pagplate, рН 4.0-6.5 (1KB)" при Ю°С. онцентрация акриламида - 5%,процент поперечной сшивки - 3%, онцентрация амфолинов - 2.2%. Гель окрашивали серебром по методу если [Oakley et al., 1980].

Иммуногистохимия. Перед выделением обонятельного эпителия, елую ¡срысу перфузировали физиологическим раствором,затем 1% рас-вором формальдегида. Выделенную ткань постфиксировали 4Ж раство-ом глутаральдегида. На уровне световой микроскопии иммуногисто-

3

химические исследования проводили на парафиновых срезах (5-10мкм) по стандартным методикам. Окрашивание проводили при помощи З'.З-дааминобензидина и 11,02. В случае иммуногистохимических исследований на уровне электронной микроскопии ткань заливали смолой LR White "Polysclence (CSA)" и полимеризовали при 37°С в течение ночи: в качестве вторичных антител использовались антитела,меченные 15нм частица,ж коллоидного золота (Sigma, США). Отмытые срезы окрашивали в уранилацетате и цитрате свинца обычным способом. Исследования проводила на электронном микроскопе JEM-100В фирмы JEOL, Япония.

Определение места локализации синтеза белка. Изолированный обонятельный эпителий инкубировали 60шн, 37°С в среде Хенкса при (ГООгуЖЛ среды на одну турбиналь), содержавшей ^S-L-метионин (1мхКи/мкл). После инкубации среду отбирали, а выстилки гомогенизировали в среде Хенкса. Гомогенат и инкубационную среду центрифугировали дважды ЗОмин 20000g. Супернатанты анализировали посредством ИС-электрофореза. Радиоавтограф получали с помощью рентгеновской пленки Dx-ray ORTO.

Измерение глутатион-зависимой пероксидазной активности. Из-керения проводились спектрофотометрически по кодифицированной методике Шячи [ShicM, Demar 1990] при 25°С. Стандартная смесь (2 мл) содержала :50mM Trls-HCl ,pîl 7.2:1 itíí EDTA: 1 is!l Ш3;0,2шМ NADPH: 1шМ востановленный глутатиоя; Ш глутатион-редуктазы; 0.25/пМ ЯрО^ или 1.5ra5í гидропероксида кумена. Концентрацию бежа определяли по БредЕорду [Bradford. 1976] (стандарт-бычий сывороточный альбумин).

Результаты исследования и их обсуждение.

I. Общая характеристика белкового состава обонятельного эпителия млекопитающих.

Чтобы охарактеризовать состав белков обонятельного эпителия, были получены различные препараты ткани обонятельного эпителия и проанализированы с помощью аналитического ДДС электрофореза. На рис Л представлен МО электрофорез различных препаратов обонятельного эпителия, содержащих белки с молекулярными весами 67кДа, 45кДа, 28кДа, 18кДа. Эти белки совпадают по молекулярной массе с описанными раннее белками [Pevsner et al 1986, 1990: Pelosl 1994:

4

Рис Л ДДС-злектрсфорез в полиакркламидном геле белков обонятельного эпителия крысы а)инкубационная среда (водорастворимые белки слизи) б Нгаотонический гомогенат (водорастворимые белки) в )гипотонический гомогенат (внутриклетсчные водорзст-воржые белки) г) экстракт в 0,3 % тритоне Х-100 (белки мембран клеток)

Чоуозе1оу ег а1 1994; Новоселов и др.13'35]. Для некоторых из этих зелков были приведена достаточно полные характеристики. В частности, в нашей лаборатории раннее бил охарактеризован 45кДа белок Тезепко е1; а1 1995, Новоселов и др.1995, Коуозехоу а! 994], хотя его функция и не была определена. Обращает на себя шимание большое кшивггество белка с молекулярной массой 28кДа ;28кДа белок). Данный белок обнаруживается в инкубационной среде рис.1.а) и его количество возрастает в супернатанте изотошнес-:ого гомогената обонятельного эпителия (рис.1,6). При последующей шогенизации оставшегося осадка ¡слеток в гипотоническом растворе оличество этого бежа утишается (рисЛ.в) и он полностью отсу-ствует в мембранах клеток (рис.1,г).

По оценкам денситогр&чмы при сканирования электрофорезшх елей, если допустить, что использованные на?,и красители Кумасси -250 и 0-250 окрашивают все белки равномерно, количество 28кДа злка составляет не менее з% от всех водорастворим« белков обо-ятельного эпителия. Тем самым 2.8кДа белок является одним из павных белков поверхностного слоя обонятельного эпителия. Быяв-знный 28кДа белок до сих нор не был описан и данная работа и

5

6745"

30-

; Г1 •

; ; ! • • 7П Г :

а б

Рис.5 Хроматография на ДЭАЭ-Сефарозе изотонического экстракта обонятельного эпителия крыса. Электрофорез полученных фракций.

20 срракции

В

д п и и м • • • • • ■ • , а $ч

<"" ^

¿3 С= М Г» х I П -"5 ~ « — / ' !

& 0

" «шчэ«, ¿¿£9 20 ^ 14

А - хроматография нз Сефа-криле Б-200 фракций, полученных после хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе

В - ДДС-электрофорез полученных фракций.

6 7 8 9 10 Ц 12 /3 14 1$ /6 ¡7

П

посвящена исследованию его свойств и его роли в перирецепции. Так как основная масса 28кДа бежа выделяется при гомогенизации ткани в изотоническом растворе (рис.1,6), данная процедура была использована при препаративном выделении 28кДа белка, использование изотонического раствора частично предотвращает- разрушение эпителиальных клеток, что уменьшает чрезмерное загрязнение препарата цитошгазматическими белками.

2.Выделение и очистка 28кДа белка в обонятельном эпителии крысы.

Полученный изотонический экстракт белков обонятельного эпителия хроматографировали на ДЭАЭ-сефарозе (рис.2). Присутствие 28кДа белка в фракциях определяли посредством ДДС-электрофореза. Данный белок оказывается в значительной степени очищенным уже после хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе (рис.2). Далее, для получения чистого препарата, фракции, содержащие 28кДа белок, очищали гелъ-фильтрацией на Сефакриле Б-2СЮ (рис.3). Как видно на этой хрома-' тограмме, молекулярная масса нашего нативного белка порядка 60кДа. в то время как на ДДС электрофорезе он имеет молекулярную массу 28кДа. Это позволяет предположить, что 28кДа белок в натив-ном виде образует димер. На рис.4 представлены различные стадии очистки 28кДа белка. Выход очищенного 28кДа бежа составлял порядка 15-20мкг на обонятельную выстилку одной крысы. А, учитывая

Рис.4. ДДС-электрофорез в полиакриламидном геле фракций, полученных на различных стадиях очистки 28кДа бежа

1) изотонический экстракт бежов обонятельного эпителия крысы

2) 28кДа белок после очистки хроматографией на ДЭАЭ-Сефарозе

3) 28кДа белок после очистки хроматографией на Сефакриле Б-200

1 2 з

неизбежность потерь при его выделении и локализацию 28кДа бежа в поверхностном слое обонятельного эпителия (см.ниже), можно ожидать, что количество 28кДа белка в поверхностном слое обонятельного эпителия значительно выше.

Изоэлектрическая точка нативного 28кДа белка по данным изо-электрического фокусирования составила 5.1-5.2 при 10°С; таким образом он является кислым белком.

3.Антитела к 28кДа белку.

Степень очистки 28кДа белка позволила выбрать для дальнейших исследований в качестве основного инструмента иммунологические методы как наиболее простые, доступные и эффективные в современных условиях методы исследования. После иммунизации кроликов были получены поликлональные антитела протиьочищенного нативного 28-кДа бежа (далее "10^"). не давали перекрестного ответа ни

с нативным 45кДа белком в этой тест-системе, ни с денатурированным- на иммуноблоттингах, что весьма существенно, так как хрома-тографическая фракция Сефакрила Б-200, использованная как антиген, могла содержать 45кДа белок в качестве незначительной примеси. На рис.5 (см. ниже) видно, что несмотря на присутствие на им-муноблоттинге в сравнимых количествах бежа 45кДа, Г^д с 1ШМ не реагируют. Тагам образом, к 28кДа белку были произведены антитела, которые можно было использовать для дальнейших исследований.

4. Тканевая специфичность 28кДа белка.

Для выявления тканевой специфичности 28кДа бежа, обнаруженного в изотоническом экстракте обонятельного эпителия, были использованы аналогичные изотонические экстракты других тканей крысы. На рис.5 видно, что 1££28 выявляют 28кДа белок или его возможные аналоги в большом количестве в обонятельном эпителии, в меньших количествах в легких, в существенно меньших количествах в печени и в почках и в следовых количествах в скелетных мышцах и в мозге. Отдельно нужно отметить, что предварительные эксперименты с использованием электронной микроскопии обнаружили данный белок в бронхах, но не выявили его в альвеолах легких и в кишечнике.

5. Видовая специфичность 28кДа бежа.

Для выявления видовой специфичности крысиного 28кДа бежа

9

1 2 3 4 5 6 7

28кДа

к-/

Рис.5. Тканевая специфичность 28кДа белка. Изотонические экстракты белков.

1) очищенный 28кДа белок.

2) обонятельный эпителий,

3) печень, 4) легкие, 5) почка. 6) скелетная мышца, 7) мозг. Иммуноблоттинг против Разбавление первичных антител 1:1500.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 6. Видовая специфичность 2вкДа белка. Изотонический экстракт белков обонятельного эпителия. I) крыса, 2) мшпь,

3) морская свинка,

4) кошка домашняя.

5) лягушка травяная,

6) скат морская лисица,

7) скорпена морской окунь. Иммуноблотинг против 1^28 • Разбавление первичных антител 1:1500.

10

были проведены эксперименты по идентификации аналогов бежа 28кДа при помощи ишуноблоттингов с IgG2g на животных 1 обонятельный эпителий которых менее зависим от контакта с воздушной фазой,-хрящевых и костистых рыб,земноводных,а также на различных млекопитающих- Белки, сходные по молекулярной массе с 28кДа белком обонятельного эпителия крысы, не были обнаружены ни у представителей костистых и хрящевых рыб, ни у земноводных, ни у млекопитающих из отряда Хищных, ни у представителей отряда Грызунов семейства Свинковых. Особо нукно отметать, что их нет даже у мышей, род которых составляет с крысами одно семейство, - Мышиных (рис.6). Эти данные,вероятно, характеризуют 28кДа белок как белок с очень высокой видовой специфичностью (см.раздел "Обсуждение").

6.Локализация 28нЯа белка в обонятельном эпителии.

Для выявления локализации 28кДа белка были проведены имму-ногистохимические исследования на уровне световой микроскопии. Как видно на рис.7,а используемая методика фиксации обонятельного эпителия позволяет хорошо сохранить слизь и локализованные в ней компоненты структур клеток (стрелками показаны слизь, звездочками- булавы обонятельных нейронов). На рис.7, б,в представлены результаты иммуногистохимического выявления 28кДа бежа на уровне световой микроскопии с помощью IgG2g: данный белок локализован в слизи и в апикальной части клеток обонятельного эпителия.

Для выявления ультраструктурной локализации были проведены иммуногистохшические исследования на уровне электронной микроскопии. Для этого применяли первичные антитела IgG28 и вторичные, меченные коллоидным золотом. Было показано, что 28кДа белок лока-жзован fia мембранах жгутиков, в апикальной части рецепторных и спорных клеток и в бокаловидных клетках. В бокаловидных клетках он собран в секреторные гранулы. Тагам образом, можно было бы предположить,что 28кДа белок является секреторным бежом, синтезируется в клетках обонятельного эпителия и в виде секрета транспортируется в слизь.

7.Синтез 28кДа бежа в изолированном обонятельном эпителии.

Для дальнейшего определения свойств и характеристик 28кДа белка вашю было определить синтезируется ли он непосредственно в клетках обонятельного эпителия, или же он поступает туда из вне,

II

Рис.7.Иммуногистохимическое выявление 28кДа белка в обонятельном эпителии крысы; световая микроскопия, а) полутонкий срез обонятельного эпителия; окраска - Азур П-метиленовый синий б,в) локализация 28кДа бежа в обонятельном эпителии крысы, первичное антитела 1:200. Вторичные антитела 1:100 (антикроличий кокьюгат с пероксидазой хрена). В качестве пероксидазного субстрата использовали 3',3-диамино-бензидин.

12

674330-

Л 2

1 2

Рис.8. Включение З-ме-тионина в водорастворимые белки изолированного обонятельного эпителия крысы. А) окрашивание Кумасси 45 Л-250

Т5

Б) автограф Б-метиошш

1. Белки слизи

28

(инкубационная среда).

2. Изотонический экстракт обонятельного эпителия.

например, Еместе с секретами гелез, локализованных вне обонятельного эпителия. Мы попытались непосредственно выявить синтез нашего белка путем включения ^Э-метионина в белки изолированной обонятельной выстилки крысы.

На рис.8 видно, что меченный 28кДа белок присутствует как в изотоническом экстракте обонятельного эпителия так и в инкубационной среде. Это говорит о том.что синтез 28кДа белка происходит в пределах клеток обонятельного эпителия и белок секретируется в обонятельную слизь,переходя оттуда в инкубационную смесь. Не исключено. что синтез 28кДа бежа может происходить и в других слизь-содержапдах тканях, таких как легкие, слезные железы и др.

Нужно также отметить, что мы наблюдали увеличение количества 28кДа бежа в инкубационной среде для стимулированного хлороформом обонятельного эпителия. Причем отношение количества включенного г-метионина к количеству бежа в стимулированных и в нестимулированных хлороформом пробах было равным, что указывает на усиление хлороформом выброса секреторных бежов, но не синтеза, что согласуется с литературными данными о секреторных бежах [Окапо, Takagi 1974; Се1;с11е1 1974]. Все вышесказанное дает право

13

предположить, что 28кДа белок действительно является секреторным белком, то есть он синтезируется опорными или бокаловидными клетками и секретируется в слизь обонятельного эпителия. Дальнейшая наша работа была посвящена вопросу о функции 28кДа белка.

8. Определение первичной структуры 28кДа бежа и нахождение его гомологов.

Мы решили определить первичную структуру 28кДа бежа, чтобы затем по банку данных найти аналоги, указывающие на функцию нашего бежа. Определение первичной структуры проводилось в лаборатории В. М. Липкина в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Непосредственно работы по определению первичной структуры провела к.х.н. Т.М.Щуваева.

На сегодня получено 4 пептида по 6 аминокислот каждый (один из них- с N-конца интактного белка). Была найдена в GEN банке всего одна аминокислотная последовательность, совпадающая с четырьмя нашими пептидами, причем, ее N-конец совпадал с N-концом 28кДа бежа [Nomura N., Mlyajlma N., Kawarabayashi Y., Tabata S.,1993, неопубликованные данные, GenBank, регистрационный Jé DI 4662]. К сожалению, найденная аминокислотная последовательность была определена декодированием кДНК полного гена культуры человеческих миелобластов и функция этого продукта гена была неизвестна. Применяя выявленную в GEN банке последовательность как базисную. было найдено 6 ее гомологов (длиной от 115 до 232 аминокислот); их фрагменты (длинной от 129 до 20 аминокислот) обладали высокой степенью идентичности (69-48%). Лишь у одного бежа из шести (длина фрагмента 129 аминокислот с идентичностью 69%). выделенного в 1995 году из нематод Onchocerca volvulus [Chandrashekar R., Curits K.S., Well G.J. 1995, неопубликованные данные, PIR Bank, регистрационный Л U310521, был определен класс, к которому принадлежит данный белок- класс тиол-специфических фе-рментов-антиоксидантов. К тому же, молекулярная масса этого бежа совпадала с молекулярной массой нашего белка. Наконец, в PIR-банке была найдена не полностью прочитанная последовательность бежа с неизвестной степенью гомологии, но его N-конец полностью совпадал с N-концом нашего белка, а 26 из 29 его прочитанных аминокислот были идентичны продукту гена из миелобластомы человека. Этот белок являлся несодержащей селен глутатионпероксида-

14

зой из цилиарного тела глаза быка. Причем, все свойства этой пе-роксидазы резко отличны от свойств раннее известных пероксидаз [БМсМ Н., Бетаг Л.С. 19901.

Все эти данные подводили к решению о необходимости проверки наличия глутатионпероксидазной активности у 28кДа бежа.

Э.Глутатионпероксидазная активность-28кДа бежа.

Механизм действия глутатионпероксидаз представлен на рис.9. Причем, субстратами для глутатионпероксидаз могут являться как гидрофильные, так и гидрофобные перекиси.

Нами были проверены оба класса субстратов (на примере Н^Оо и гидропероксида куменз). Было обнаружено, что 28кДа белок раз-

СБНРх

2 СБН + Н202 <-> ОЗ-Бй + 2 Н^О

СЗНРх

2 СБН + ЙООН <-> СЗ-ЗС + Н20 + НОН

Рис.9 Механизм действия глутатконпероксидазы (СЗН-Рх), где СЭН - востаяовленный глутатион, СББО - окисленный глутатион, ШОН - органические пероксиды.

лагает как гидрофильные, так и гидрофобные перекиси (из всех глутатионпероксидаз этими свойствами обладала только несодержащая селен пероксидаза из цилиарного тела быка). 28кДа белок обладал низкой удельной активностью: 1,9 и 2,9 мкмоль*мин-1*мг-1 для Р^О^ и гидргтояероксида кумена соответственно против 100-200 мкмоль* мин-1*мг-1 известных пероксидаз. Необходимо отметить, что глутатион был необходим для данной реакции и на прохождение этой реакции не влияло добавление или отсутствие дитиотрейтола. Низкая удельная активность 28кДа бежа подтожнула нас к проверке других глутатион-зависимых ферментов-антиоксидантов.

Согласно литературным данным обонятельный эпителий содержит большое количество глутатионтрансфераз. Измерение глутатионтранс-феразной активности 28кДа бежа показало, что данной активности у 28кДа бежа нет. Более того, как показал анализ фракций при хро-матографлровании изотонического экстракта обонятельного эпителия

15

на ДЭАЭ-сефарозе, трансферазная активность выявляется в фракциях, в которых отсутствует 28101а белок.

Низкая удельная активность наблюдалась и в случае несодерасащей селен глутатионпероксидазы из цилиарного тела быка. Однако, эта активность как при разложении гидропероксида кумена. так и при разложении была все юз выше чем активность нашего фермента. Следовательно, эти ферменты не идентичны. Таким образом, 28кДа белок, вероятно, является новым представителем недавно обнаруженного нового класса несодержацих селен глутатионпероксидаз, а его основной функцией, по - видимому, является нейтрализация перекисных соединений в обонятельной слизи и защита мембран клеток от возможных повреждений, связанных с перекислим окислением липидов мембран.

10. Обсуждение результатов.

Данная работа била посвящена выделению и описанию некоторых свойств обнаруженного нами нового водорастворимого секреторного бежа из обонятельного эпителия крысы (28кДа белок). Его молекулярная масса на ДЦС-электрофорезе- 28кДа, в нативном около 60кДа, р1- 5,1-5,2. Совокупность полученных результатов свидетельствует, что 28кДэ белок является новым представителем недавно обнаруженного нового класса несодеркащих селен глутатионпероксидаз.

Анализ аминокислотной последовательности 28кДа бежа, и, особенно, найденных нами его гомологов выявил, что Н-конец этой последовательности обладает сильно выраженной гидрофобностью. Подобные последовательности были отмечены в литературных данных [Б1оЬе1 1980, СагоП 1985). Так, известно, что не менее 5 стоящих вместе гидрофобных аминокислотных остатка из первых 20 аминокислотных остатков Н-терминалк белков являются характерным признаком для очень многих белков, которые попадают в эндоплазматичес-кий ретикулум. Эти данные дают возможность еще раз косвенно подтвердить секреторный характер 28кДа белка.

28кДа белок в нативном виде имеет молекулярную массу порядка 60кДа, он, вероятно, образует дикер. Это тем более вероятно, что по данным, полученным посредством гидролиза, данный белок содержит 2 цистеина.

В опытах по видовой специфичности перекрестный иммунный анализ с использованием кроличьих взаимодействующими с

16

высоким титром как с натившм так и с денатурированным 28кДа белком, не выявил общих иммунных детерминант у 28кДа бежа крысы и белков рыб, земноводных и млекопитающих. Такая необычно сильно выраженная видовая специфичность, возможно, объясняется довольно близким эволюционным родством донора 28кДа белка (крыса) и реципиента (кролика). Антигенные детерминанты бежа донора являются значимыми для антигенраспознавдих клеток реципиента только тогда, если они расположены в вариабельной части белка Ше1с1г11п 1974]. То есть, поликлональше ГеО^д могли быть произведены на одну группу рядом стоящих антигенных детерминант и, при кммуноблоттинге с белками, аналога?® 28кДа белка у других животных (например, у мы-си), могли не отражать видоспецифичности целого бел1са.

Опыты по тканевой специфичности предполагают более широкое распространение аналогов 2.8кДа белка в слизь-содержащих тканях, что мелеет свидетельствовать о том, что данный белок может 1!меть функцию не связанную с обонянием.

Таким образом, главной функцией 28кДа белка, по-видалому, является нейтрализация гидрофильных и гидрофобных перекисных соединений в обонятельной слизи. Эти соединения могут возникать в слизи из-за непосредственного ее контакта с атмосферой. А так как данная пероксидаза нейтрализует гидрофобные перекиси, то ее функцией можно считать и защиту мембран клеток от возможных повреждений,связаных с перекисным окислением липидов мс-мбран.

С другой стороны, 28кДа белок, как пероксидаза, тлеет очень низкую удельную активность. Это. по-видимому, компенсируется большим количеством дашюго белка в обонятельной слизи. Действительно, 28кДа белок составляет не менее 355 от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительные количества глутатионпероксидазы- 28кДэ белка в обонятельной слизи, в бокаловидных и опорных клетках обонятельного эпителия свидетельствует о его существенной роли, по крайней мере, в обонятельной рецепции.

В дальнейших исследованиях предстоит уточнить физико- химические свойства 28кДэ белка: его количество в обонятельном эпителии, его молекулярную массу; выяснить, относится ли он к глобулярным белкам, образует ли он в нативном виде димер, а также возмо-

17

зкность гликазилкрования нашего белка, на что косвенно указывает небольшое несоответствие в массе меаду нативным и денатурированным белком (если считать, что белок бОкДа- димер 28кДа белка).

Будут продолжены исследования ферментативной активности 28-кДа белка: определение субстратов, кофакторов, ингибиторов и активаторов, условий оптимальной активности и т.д.

Должны начаться работы по клонированию ДНК, кодирующей данный белок и определение его полной первичной последовательности.

Необходимо определить присутствие 28кДа белка и наличие секреции его аналогов в других животных и тканях (железах, слизистых поверхностях).

И,наконец,нужно определить точное место данного белка в схеме взаимодействий в обонятельной рецепции, то есть выявить возможные связи 28кДа белка с другими компонентами обонятельного эпителия, такими как запах-связывавдими белками, "ольфактомеда-ном", биотрзнсформационшш энзимами, обонятельными рецепторами, ГТФ-связывавдим 45кДа белком и т.д.

ВЫВОДЫ

1. Нами был идентифицирован и выделен водорастворимый секреторный 28-кДа белок, новый представитель недавно обнаруженного нового класса не содержащее селен глутатионпероксидаз, который содержится в обонятельном эпителии в значительных количествах и составляет не менее 3% от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия.

2. Выделенный белок выявляется при ДДС-электрофорезе как мономер с молекулярной массой 28кДа, в нативном виде имеет молекулярную массу около бОкДа; его изоэлектрическая точка-5.1-5.2.

3. 28-кДа белок или его возможные аналоги иммунологически выявляются в большом количестве в обонятельном эпителии, в меньших количествах в легких, в существенно меньших количествах в печени и в почках, и в следовых количествах в скелетных мышцах и в мозге.

4. 28-кДа белок из обонятельного эпителия крысы обладает высокой видовой специфичностью. Белки, сходные по молекулярной массе с данным белком обонятельного эпителия крысы, иммунологически не выявляются у представителей:костис.тых и хрящевых рыб; земноводных; млекопитающих из отряда Хищных, отряда Грызунов семейства

18

Свинковых и семейства Мышиных.

5. 28-кДа белок локализован в слизи, на мембранах жгутиков, в апикальной части рецепторных и опорных клеток, в бокаловидных клетках обонятельного эпителия.

6. Данный белок синтезируется опорными и бокаловидными меткам! и се!сретируется в слизь обонятельного эпителия. Его синтез и, соответственно, секреция происходят, по крайней мере, в пределах обонятельного эпителия.

7. По базе данных Gen-банка найден полный продукт гена из культуры миелобластов человека с полной идентичностью с расшифрованными для 23-кДа белка пептидами. Используя данный продукт гена в качестве базисного по базе данных PIR-банка определена принадлежность 28-кДа белка я классу тиол сне шфгее ских антиоксидантов.

8. Пероксидазная ферментативная удельная активность 28-кДа белка составляет 1.9 и 2.3 мкмольлмюГ1*^-1 для субстратов Н,02 и гидрпопероксида кутлена соответственно.

9. Основной функцией 28-кДа белка, по-видимому. является нейтрализация перекисных соединений в обонятельной слизи' и защита мембран клеток от возможных повреждений, связпных с перекисши окислением липидов мембран.

Список публикаций по материалам диссертации.

1. Попов В.И., Николаев Ю.В., Евдокимов В.Л., Пешегасо IT.В., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. Надмолекулярная организация рецепторного аппарата обонятельного нейрона. Тезисы VII Всероссийского Симпозиума "Механизмы сенсорной рецепции", Москва. 25-27 февраля 1992.

2. Николаев Ю.В., Евдокимов В.А., Быстрова М.Ф., Попов В.И. Надмолекулярная организация обонятельного рецепторного аппарата крыса: локализация рецепторных элементов и ГТФ- связывавших бежов, ассоциированных с рецепторами. Сенсорные системы, 1992 т.6, № 3, стр.128-130.

3. Новоселов В.И., Крапивинская Л.Д., Пешенко И.В., Евдокимов

В.А., Фесенко Е.Е. ГТФ-связывагацие бежи, ассоциированные с обонятельным? рецептора,™ позвоночных. Сенсорные системы. 1992, т.6, Ä3, стр.133-140.

4. Новоселов В.И., Пепенко И.В., Евдокимов В.А., Николаев Ю.В.,

19

Попов В.И., Матвеева Е.А., Фесенко Е.Е. Некоторые свойства ГРФ - связывающего оелк а из обонятельного эпителия крысы. Сенсорные системы, 1995 т.9, J6 4, стр.85-94. Ь. Пешенко И.В.«Новоселов В.И.,Евдокимов В.А.,Попов В.К..Николаев Ю.В..Шуваева т.м.,лнпкен в.ы.,Фесенко Е.Е. Выделение и биохи игческий анализ нового секторного 28-кДз белка из обонятельного эпителия крысы. Сенсорные системы, 1996, в печати.

6. Kovoselov v.,Peshenko l.,Hlkolayev J.. Evdokimov v..Fesenko E. Specific Proteins from Olfactory Epithelium of Vertebrates. Abstracts of Symposium "Molecular mechanisms of sensory reception". Puahchlno, Leceaber 1992.

7. Kovoselov V.I., Peshenko I.Y., Evdokimov V.J., Nikolaev J.V., ' Elatveeva E.A., Fesenko E.E. Eater-soluble GTP-biiidIng protein

Iron rat olfactory epithelium. TEBS Lett.. 1594. 353. 286-268. 9. Fesenko E.E., Kovoselov V.I..Peshenko I.V., Evdokimov V.A.. Nikolaev J.V., Fopov V.I. and Katveeva E.A. ^ Specific Rater-soluble 45-KBa GTP-blndIng and 28-kDa Ca2+-bindlng proteins fro® rat olfactory epithelium Abstract, б Congress ECRQ, Blrralnhar». august 1995. IQ.Peshenko I.v., Kovoselov V.I., EvdokUsov V.J., Nikolaev Y.V., Shuvaeva Т.К.. Llpkin V.M..Fesenko E.E. Novel 28-kD secretory protein irom rat olfactory epithelium. FEBS Lett., 1996, v.381. 12-14.

II.Kovoselov V.I., Peshenko I.V.. Evdokimov V.J., Nikolaev J.V., Katveeva E.A., Fesenko E.E. 45-KBa GTP-blndlng protein froa rat olfactory epithelium: purification, characterization and localisation. Chemical Senses 1996 v.21, Л 3, 286-288.

25.03.95 г. Зак.6964Р, Тип.80 якз. Усл.печ.д. 1,25

Отпечатано на ротапринте в ОНИ ГЩ РАЧ