Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обонятельные рецепторные элементы позвоночных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Обонятельные рецепторные элементы позвоночных"

АКАДЕМИЯ НШ СССР ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

НОВОСЕЛОВ Владимир Иванович

УДК 612.88

ОБОНЯТЕЛЬНЫЕ РШЕПТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ПОЗВОНОЧНЫХ

(03.0a.02 - "Биофизика")

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степэяи доктора биологичвсних наук

Цущино - 1991

Работа выполнена в Институте биофизики клетки АН СССР

Научный консультант, доктор биологических наук, профессор Е.Е.Фесенко.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Д.И.Ращупкин Доктор биологически! наук С.Л.Аксенцев Доктор биологических наук О.В.Гсдузжя

Ведущее учреждение - Институт анолюцконной физиологии и биохими им. И.М.Сеченова.

Защита состоится "_"_1991 г. в _час. на заседани

Специализированного совета Д006.05.01. по защите докторских дис сертаций по специальности, "биофизика" "ври Институте фотобиологи: АН БССР по адресу: 2200733, г.Минск, ул.Ф.Скорины 27, Циститу фотобиологии АН БССР.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотоби логии АН БСССР (г.Минск, Институт фотобиологии АН БССР).

Автореферат разослан "_"_ X99I г.

Учений секретарь Специализированного совета,

к.б.н.

Л.М.Шейко

- -iiV' > f

■■ . . ----- !

• г )

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

iKT2альносгь_проблвкы. Обоняние занимает особое место среди mx видов сенсорный рецепции, особенно у хивогных-макросмати-. Например, у собаки при исследовании окружзщей среда обоня-ьний вход преобладает над зрением. Обоняние обеспечивает поиск а, сигнализирует об опасности, наконец, играет важную роль ь в -размножении (знаменитые шлоше аттрактанты). Одновременно зяние представляет собой один из наиболее сложных видов зоркой рецепции. Это определяется уникальными свойствами обо-зльного анализатора, в первую очередь его" исключительной ствительностью и способностью различать огромное количество личных запахов. В то же время обоняние является и наименее ченным видом сенсорной рецепции, хотя оно интенсивно исследу-д с середина прошлого века [см.обзор Zippel, 19891. Первичным актом восприятия запаха является связнввние пахучего пула с хемочувствительннм участком обонятельной рецепторной тки. Следствием этого взаимодействия является развитие транс-мвционных процессов в обонятельной клетке, приводящей в конеч-итоге к ее физиологическому ответу на стимул. Ясно, что переленные выше уникальные свойства обонятельного анализатора во гом определяются его первичными сенсорными элементами - обоня-ьными рецепторннми молекулвми. Соответственно, решение пробле-и их идентификации и изучение свойств этих рецепторов во гом позволит объяснить и чувствительность обонятельного анали-ора, и его способность различать огромное количество различных ахов. Ныли предприняты многочисленные попытки выделить и нтифицировать обонятельные рецепторные молекулы [см. Lancet, 6; Snyder et al., 1983; Reed, 19901, однако полученные ультаты часто были настолько противоречивы, что это позволило в сформулировать пародоксальный вопрос: "Действительно ли мы чаем обонятельную рецепцию?" [Shirley, Hobtnson, 1988]. Таким азом,в настоящее время вопрос о природе обонятельных рецепта молекул приобрел первостепенное значение и от его решения многом будет зависеть дальнейший прогресс в области молеку-шнх механизмов обонятельной рецепции.

Цель и основные задачи исследования. Цель работа заключала« идентификации обонятельных рецепторных молекул разных кла< позвоночных (млекопитапцих и рыб), изучении их свойств и тош выяснить их связь с элементами системы трансдукции сигнал обонятельной рецепторной клетке. В связи с этим были поставле] решены слвдупциэ проблемы:

1. В обонятельном эпителии, крысы м рыб были идентафщиров! специфические мембранные зшах-связыващиэ гликопротеиды 0 для крысы и ер98 для рыб).

2. Данные глилряротеиди отвечали всем общепризнанным крите; принадлежности к обонятельным . редепторныы белкам (способа аффективно связывать пахучие вещества, локализация, тканевв видовая специфичность, взаимодействие со специфическими реаге; ами и др.) и являлись наиболее вероятными "кандидатами" в об< тельшв рвцепторные молекулы.

3. При связывании пахучего стимула с запах-связыващими гл протеидами £р88 крысы или &р98 рыб с последними ассоциирова ГТФ-связывающие белки 55 или 56 кДа соответственна. При происходила активация ГТФ-азной активности белков 55 или 56 : Данные белки не выявлялись специфическими антителами на изввс Й-Селки и, по-видимому, образуют .особый класс ГТФ-связыв белков, ассоциированных с обонятельными рецепторннми молеку позвоночных.

4. Синтез обонятельных рецепторных молекул был существ выше, чем других белков обонятельной клетки и стимулиров пахучим стимулом. Эта стимуляция запахом была специфи определенный запах стимулировал синтез соответствую рецептора.

Научная новизна. Впервые установлено, что обонятельными ре тертыми молекулами являются специфические мембранные глико твиды вр88 для млекопитающих и gp98 для рыб; изучены их осно характеристики (сродство к пахучему стимулу, локализация, воз ная связь с элементами системы транедукции сигнала в обонятел клетке и их метаболизм).

Научно-практическая ценность. Результаты работы дают в представление о природе обонятельных рецепторных молекул, позволяет по-новому подойти к исследованиям в области молекз

механизмах обонятельной, рецепции. Результаты могут представь интерес при исследовании других видов рецепции.

|пЕобащя_раОоткЛ По результатам исследования опубликовано 35 эт. 'Материалы диссертации были доложены на I Всесоюзном био-ачэском съезда (Ыосква, 1982); II и III Всесоюзном совещании химической коммуникации животных" (Москва 1883, 1987); III и V этско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структу-и функция" (Ташкент 1983; Рига 1988); II Конгрессе по сравни-ьноа биохимии и физиологии (Батон Руж, США, 1988); Симпозиуме морецепция водиых кивотрых (LOMCON, Нокодри, США, 1988); I и Японско-Советском симпозиуме "Рецепторы. Структура и функция" сква, 1989; Киото,, Япония, 1991 ) и Др.

Структ^ра_и_объем_работн. Диссертация изложена на 199 стр., ержит 52 рисунка, В таблиц и состоит из введения, обзора лите-и, описания использованных в работе материалов и методов ледования, изложения собственных экспериментальных данных, уядения результатов работа л выводов. Список цитированной вратуры содержит 325 наименований.

ОБЩАЯ СТРАТЕГИЯ БВДЕЛЕШЯ И ВДНЖИШШЩ ОБОШГГЕЯЬШХ РЕЦЕИГОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ПОЗВОНОЧНЫХ.

Успешное решение вопроса об идентификации обонятельных молекул ¡воночвых во многом зависит от выбора общей стратегии ¡ледования. Было ясно, что это будет комплексный подход с юльзованием многих методов современной биологии. При атом (бенно важным являлся выбор критериев, по которым первоначально ¡тировались "кандидаты" в обонятельные рецепторные элементы. По юму мнению-, таким критерием могла быть способность рецептора Активно связывать пахучий стимул. Такой подход потребовал ¡меяения леченых пахучих соединений и соответствующего :тирования связывания при используемых методах разделения шолимэров (хрожтаграфм, вмхмая аффиннухз, элетрофареа, зэлектрическое фокусирование и др).

Общая схема идентификации обонятельных рецептораых элементов держала несколько этапов:

I. Доказательство наличия обонятельных рвцеоторных элементе дбонятвтнот_адетэлш_ддзвдно^шц1Л Эта проблема решал а) выявлением центров связывания пахучих стимулов с высс сродством к ним ж б) возможность» солюбилизации этих Ц£ ров связывания.

На этом этапе разделение биополимеров проводили в неденЕ рирущих условиях, чтобы использовать на каадой стг способность рецепторов связывать пахучий стимул.

- 3. ffi>K§3aT8J№CTBgj3e^ _"кандща!

При этом нео'бхо;

было использовать все критерии принадлежности исследус структур. Здесь наиболее эффективным оказались меч шиушшиии и. электрофизиологии, которые позволили опре лить функции выделенных белков, выявить их локализация клеточном и субклеточном уровнях и исследовать ряд да свойств.

дбонятельной__клвта:в. Здесь поиск был направлен щи всего на выявление ГРР-свазывахщи: вемсав, коте ассоциируются с обонятельным рецептором при его связнвг с -пахучими стимулами (по аналогии с другими видами peí ции).

В качестве объектов исследования были выбраны щыаъ черноморские скатн Daayatia pastinaca и Яaja clavata. Такой в: был обусловлен там, что мы пытались выявить общие закономэри в молекулярных механизмах обонятельной рецепции. Данные живо' воспринимают принципиально разные классы пахучих стимула] гидрофобные летучие вещества для крыс и гидрофильные создан* (аминокислоты) для рыб. Наконец, эти животные являются ма) сматикаш, что существенно при препаративном выделении peí торов. В частности скатн (как и акулы) обладают самыми разни1 органами обоняния среди водных животных.

В качества пахучих стимулов в настоящей работе были исп зованы 3Н-калфора и 3В-дешналъ для крысы и 3Н-алинакислот рыб.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ эпителия позвоночных.

I целью выявления в обонятельном эпителии позвоночных центров ывания пахучих стимулов с высоким сродством к ним было, юдено исследование связывания пахучих веществ с :ок обонятельного эпителия.

йю.1. Кривая связывания ■11-камфорн с "мембранной" фракцией ткани обонятельного эпителия крысы в присутствии немеченой камфора в широком диапазоне концентраций последней £173. Связывание выражено в % к связывании в отсутствии немеченой камфоры. Не специфическое связнва-гое¿определялось при 10 Ы немеченой камфоры.

1.0 -

0.5

10 20 30 Ссваз. (шй*ь)

Рис.2. Графики Скетчарда для кривой, представленной на рис.1.

, На рис. I и 2 представлены кривые связывания камфоры с м ранами клеток обонятельного эпителия крысы в широком даапа: концентраций камфора и графики Скэтчарда, полученные на основ; кривых связывания.

Как шдво на графиках, существует по крайней мере 3 ' центров связывания камфора с константами диссоциации К «5 «КГ Н2 « 3.5 * 1СГ®М и К3~ Ю-6!!; последняя константа дассоциа! характеризует, по-видимому, неспецифическое связывание кам£ор Аналогичные эксперименты были проведены с мембранами ши обонятельного эпителия ската с использованием в качестве стим; меченые Ь- и Ъ~ аминокислоты (рис.3).

0.50

'S 0.25 • а о о

о 0.50

0.25

0.025 0.05

Ссвяз. Спмоль)

Рис.3. Графики Сквт да дяя связывания I нокаслот с "мембран фракцией обонятелы эпителия ската [III

А - [^З-лейцин;

Б - Лз-аланин.

- о - - Ii-фор!

— • — - D-фор

Как видао' на рис.3, в обонятельном эпителии ската тольк случае Ь-ашшокаслот выявляются центры связывания с выс< сродством к стимулу. Это подтверждается электрофизиологичеа данными, которые указывают, что только L-нмидакиелоты явля эффективными пахучими стимулами для рыб. Одновременно приведе] результаты свидетельствутт о высокой степени стереоспецифично! центров связывания аминокислот с высоким сродством к стимулу, характерно для большинства ^ецепторных систем.

3 таблице I суммированы результаты анализа связывания пичных пахучих веществ о "мембранными" фракциями обонятельных силок крысы и ската. Как видно из таблицы, у обоих видов этшх обнаруживаются центра связывания пахучих стимулов с жим сродством к ним.

Таблица,.!..

Константы диссоциации различных пахучих веществ с мембранами клеток обонятельного эпителия крысы и ската СИ,171.

животное пахучий стимул К,, ( И )

. крыса камфора 5-Ю"10

3.5*10"®

скат аланин 1.5-10-10

глютамат 4.2-10"'0

-10

лизин 2.0-10

глютамин 8.0-Ю-10

Можно было предположить, что выявленные центры связывания учих стимулов в обонятельных выстилках с высоким сродством к мулам представляют собой обонятельные рецепторные молекулы, шенно об втсм свидетельствует отсутствие аналогичных центров взывания в других тканях животных (мозг, легкие, печень и др.

6, ИЗ. Это предположение послужило исходным пунктом для :ледупцего выделения данных центров связывания и определения их скции, что в свою очередь потребовало выяснения ряда свойств, их, как специфичность по отношению к стимулу, возможность побилизации с сохранением способности связывать и т.д. На рис.4 представлены данные по связыванию меченых аминокислот (Мбранной" фракцией обонятельного вштвлия ската в присутствии юченых аминокислот различной концентрации. Как видно на :унке, в обонятельном эштелги ската существует по крайней мере

четыре типа центров связывания аминокислот - для кислых ("гл матный"), йейтральных ("алаяин-сериновый" и "метиониновый" основных - ("лазиновый") аминокислот. Эти результаты хорошо со сувтся с электрофизиологическими данными, которые свидетельст о существовании по крайней мере трех типов обонятельных реце

1.0 0.6 0;2

13Н1-ала

13Н1-лиз

Ю 9876. 10 9876

конкурирующая аминокислота ( -ЮеЮЗ )

Рис.4. Связывание Ь-[^-аминокислот "мембранной" фрак обонятельного впителия ската в присутствии других немач ашшоки&тот., (Аминокислоты, которые не оказывали влиянш связывание I ^ ]-аминокислот, на графиках не представлены [

Концентрации меченых аминокислот - 5-Ю-10 М.

ров для кислых, нейтральных и основных аминокислот 1Сарг1о, £ 1984; Сарг3.о ег а1., 19891.

¿нелогичные эксперименты были проведены с "камфорным" цев

¡нвания из обонятельного эпителия красы 16,173. С этим центром жтивно связывались лишь вещества, которые по классификации гра имели камфорный запах. Таким образом, как у, наземных >тных, так и у рыб, центры связывания пахучих стимулов с жим сродством к ним обладают выраженной специфичностью по ¡иетпо к пахучему стимулу.

йюсобность нескольких аминокислот связываться с одним типом яггоров, но с разной степенью эффективности, может лежать в зве различения обонятельным анализатором огромного количества гчих веществ. В этом отношении очень характерен пример "ала--серкноЕого" центра связывания аминокислот (наименее специфич-з из выявленных центров). Алании и серии при любых концентра-с связывались с этим центром с одинаковой эффективностью, что жо согласуется с' элактрофизиологичвсними и. поведенческими хериментами на разных видах рыб. Треонин эффективно связывался знным центром только при больших концентрациях, что согласует-з поведенческими реакциями рыб, когда треонин дифференцируется аланина и серина только при малых концентрациях tRehnberg, reck, 19861.

Таблицз_2.

Злияние ферментов и SH-реагентов на связывание 3Н-кам£оры мембранами клеток обонятельного эпителия крысы [5,6]

реагент степень связывания

проназа . ' 0.35

трицциы 0.60

аоллаге'наза 0.95

$осфолипаза о 0.9S

РНК-за 1.00

a^oi2 Оле

р-хлормеркурий бензоат 0.28

К-этилмалэймид 0.IS

степень связывания выражена отношением связывания 3Н-камфоры "мембранной" фракцией после обработки реагентом к контролю.

Последующие эксперименты указали на возможную белковую при] выявленных центров связывания пахучих стимулов (влияние ] ферментов и некоторых реагентов на связывание пахучего сти мембранами клеток обонятельного эпителия (Табл.2), вираже! рН-зависимость связывания стимула, что характерно для белю рецепторов (рис.В) и, самое главное, выявление аналоги1 центров связывания в тритоновых экстрактах мембран обонятелы эпителия [7,81. Последнее обстоятельство указывало на возможнс выделения обонятельных рецепторных молекул в чистом виде, исш зуя весь арсенал современных методов разделения биополимеров.

срт 1

2000 1000

5 6 7 8 9

рн

Рис.5. рН-зависимость св; вания [ Н]-камфоры и р аланина с"мембранными" ф] циями обонятельных выси крысы и ската [6,81.

- - С3НЗ-камфора,кр

----- - [3Н1-аланин,ска'

Таким образом, в обонятельном эпителии позвоночных выяа центры связывания пахучих стимулов с высоким сродством к ш ряд свойств (стереоспэцифичность, рН-зависимость связыв; стимула, действие БН-реагентов и протеолитических фермен возможность солюбилизации этих центров с помощью детергенов потери способности связывать пахучий стимул) позволяет цре, дожить, что эти центр! представлены специфическими мембран белками. Однако для полного доказательства рецепторной при этих белков необходимо выделить их в чистом виде, проверить все критерии их принадлежности к рецепторным структурам и опр лить их связь с элементами системы трансдукции сигнала в об< тельной клетке.

2 • 1&Д@леЕИ9_запах~связ№

вами из обонятельного эпителия позвоночных. '

С целью выявления "кандидатов" в обонятельные рецепторныэ екулы на первом этапе было проведено аналитическое разделение ков мембран обонятельного эпителия. При этом, как уже зывалось выше, было использовано основное свойство рецепторов шсобность аффективно связывать пахучий стимул.

номер фракции номер фракции

Рис.6. Рис.7.

Рис.6. Аналитическая хроматография солюбилизированных тритоном Х-100 белков "мембранной" фракции ткани обонятельного эпителия крысы в присутствии меченых пахучих соединений на Ультрагелэ АсА-34 1207231

А - поглощение при 254 нм; Б - ["^-камфора; В - 13Ш-деканаль.

Рис.7. То же для обонятельного эпителия ската £293. А - поглощение при 254 ям; Б - С^-аланин; В - [3Ш-глютамат. Стрелки показывают выход белков-стандартов.

На рис.6 цредатавлеш данные по гель-фильтрации тритон« экстрактов обонятельного эпителия 1фысы. в присутствии 3Н-кам и 3Н-деканаля. Ках-шдно на представленных графиках, для о< пахучих соединений: молекулярная масса запах-связыващих бе. составила приблизительно 140 кДа. Отсутствие радиоактивности фракциях с большими молекулярными весами, в частности в несол> лизированных тритоном Х-100 фрагментах мембран, элюируемы: холостом объеме, свидетельствует о том, что данный детер1 эффективно экстрагирует из мембран все запах-связываицие бе; Так как данные пахучие венде стве принадлежат к разным кла< запахов и не конкурируют друг с другом за центры связыва! можно предположить, что рецепторные молекулы, специфичные данным пахучим вещствам, имеет близкие молекулярные массы. Бс того, с большой степенью вероятности можно утверждать, что дш фракция содержит другие типы запах-связыващих белков, спецщ них к различным классам запахов.

Аналогичные результаты были получены для тритоновнх экстра! обонятельного эпителия ската (рис.7). И в этом случае моле^ над масса белков, связывающих •'н-алаяин и 3Н-глютамат, состаз приблизительно 140 кДа.

Фракции 120-150 кДа, полученные при гель-фильтрации., капот вались в дальнейшем для аналитического изоэлектрического фок} рования (ИЭФ). При этом оказалось, ■• что способностью эффекта связывать пахучие стимулы обладают белки: 3Н-камфору и 3Н-де наль - р1 4.9 (крыса) и 3Н-аланин и 3Н-глЮтамат - р1 5.2 (ш (рис.8). Спвцнфганость связывания меченых лигандов имешс запах-связыаапцши белками в экспериментах по ИЭФ была подтве дана тем, что распределение радиоактивности вдоль геля не ко| лировало ни с количеством белка в полосе, ни с распределен тритона Х-100 вдоль геля. Последнее обстоятельство имело суще венное значение для ■ гидрофобных пахучих соеданений (кам$ар декаиаль), так как повышенная концентрация тритона х-100 в пoJ геля могла бы дать значительное нешецифическое связывание.

В дальнейшем для препаративного выделения "кандидатов" рецепторы были использованы два принципиально разных подхода: для рыб были синтезированы аффинные носители, модифицировав аминокислотами, и выделение белков проводили о помощью аф£ш

А Б

яоиер фракции номер фракции

Рис.8. Аналитическое ИЭФ фракций 120-150 нДа "мембранных" фракций обонятельных выстилок крысы (А) и ската (Б) в голиак-риламидном геле в градиенте pH 3-Ю [8, 23]. Концентрация ам-фолинов - 2%, акриламида - 4%, тритона Х-100- ОЛЖ, 18, 231.

—.— J распределение рН_вдоль геля;

- - распределение СЮ-камфоры (А) или [Ш-аланина (Б);

---- - распределена тритона Х-100 (концентрация тритона X-

100 определялась при. 280 нм).

матографии; 3) для крысы носители, модифицированные пахучим мулом (например, камфорой) синтезировать не удалось, поэтому1 елениэ "кандидатов" а рецепторы проводили по традиционной ме (рис.9).

В табл. 3 представлены данные по степени очистки "камфорного" ептора крнсы на разных стадиях выделения согласно схеме на .9 для крысы. Из представленных данных следует, что предложен-схема выделения "камфорного" рецептора позволяет получить парат довольно высокой чистоты (степень очистки. ~ 180 раз), -электрофорез выделенного препарата представлен на рис.Юа.

видно на рисунке, при электрофорааа_выявлялись две полосы с екулярвыми массами 88 и 55 КДа. Таким образом, выделенные ндидатн" в обонятельные рецепторы крнсы представляют комп-с, состоящий из двух полидаптидов (комплекс 88/55). Оба ком-ента комплекса 88/55 шмалялись с псмовдлз конаанаватна А

Гоиоганят обонятельного впителия

| центрифугирование

"мембранная" фракция

! обработка тритоном Х-100

солвбилизированше белки "мембранной" фракции

I хроматография на ! Ультрагеле АсА-34

фракция 120-150 кДа

I ИЭФ, рН 3-10

р1 4.7-5.1 | иэф, рн 4-е фракция рХ 4.9

|иммунизация кролика

Феа/бЕ

| проверка и очистка 1бДад</55 ■^38/55

• ] сорбция на СШг-агарозе

аффинная колонка

аффшшая хроматография ' фракции 120-150 кДа

аффинная колонка ( амжин-агароаа) гмашзжт-агароаа лизин-агароаа)

хроматографш

обонятельные рецепторные белки крысы

обонятельные рецепторные белки ската

Рис.9. Общая схема выделения рецепторных белков поавоноч!

Табжца_3.

Степень очистки "каи^орнаго" обонятельного рецептора на различных стадиях его выделения [23].

стадия выделения

содержание белка специфическое

<мг) связывание (пмоль/к

тритоновый экстракт обонятельного эпителия

7Ю

120-150 кДа р1 4.7-5.1 р! 4.9

90 3.4 0.45

16 310 1100

А Б В

л г < а

Не ДО. ДЦС—электрофорез обонятельного рецептора крысы (А) и (бонятельныг рецепторов гейта (В), выделанных по схеме на са рис.9. I - аланин-агароаа; 2 - глхжиат- агараза. В -жрашвание нонжзнпВалин А - ФНЩ обонятельных белков ската, ¡трелки указывают положение белков-стандартов [23, 293.

)бевно полкпептид .88' хДа), что свидетельствовало об их сопротеидной природе. В дальнейшем этот комплекс будет обозна->ся как £р88/55 - гликопротеид).

5 случае рыб была использована аффинная хроматография на £телях, модифицированных аминокислотами. Возможность провэде-такой хроматографии была возможна из-за относительно большо-зремени полужизни комплексов аминокислота-"рецептор", который савлял ~ 30 мин при 4°0 117, 291. Для выделения были выбраны возможных типа рецепторов: "аланин-сериновый", "глютаматвый" лизиновый", каждый из которых по данным конкуренции связывал ! набор аминокислот. Десорбцию связанных с аффинной колонкой зпторов проводили или вытеснением белков соответствующей юкислотой (специфическая десорбция), или низкими значениями (неспецифическая десорбция). Последний способ десорбции был йожен благодаря ярко Енраженной рН-завистмости связывания юкислот с компонентами мембран (см. рис.5) .и одновременно золял получать запах-связьшапцда белки, свободные от аминокис-. Как показали непосредственные измврэния выхода белка с коло-и ДДС-электрофорез выделенных белков, оба типа десорбции али.практически одинаковый результат (Табл.4), з таблицы 4 следует, что количество специфических звцах-связы-

Таблица_4_.

Выделение обонятельных рецепторных белков ската на аффинных колонках при разных способах десорбции (291.

колонка

десорбция *

Ю-4 И аминокислоте

алашм-агараба 37.5

глгтист-агарсза 23.0

маин-агараэа 2.5

* - количество обонятельных рецепторных белков (мкг), выделяем ив 30 иг белка "мембранной" фракции обонятельного эпителия ската.

вапцих белков, выделяемых из одного препарата, существе различалось (ала:глю:лиз / 40:20:2.5) и,' по-видимому, отраж различие в количестве рецепторных белков в обонятельном епите ската. В последупцих экспериментах исследовались только "алани и "глюташэт"-связнващие белки, т.к. в этом случае можно б получать относительно большое количество каждого из перечислен белков.

На рис.106 и 10в представлены данные по ДДС-электрофор "кандидатов" в обонятельные рецатпорныв молекулы ска выделенные с помощью аланин- и гхагплат-агароаах. Как и в слу крысы, для обоих пфЗвгяннт носителей выделялись электрофоретиче идентичные комплексы, состоящие из двух гликоцротеидов молекулярными массами 98 и 56 кДа (комплексы №98/56^^ 8РЭ8/5бГДЖ1; вр98/56 ).

Таким образом, как для млехопитащих (крыса), так и для (скат), возможными кандидатами в обонятельные рецепто; молекулы являлись мембранные гликопрогеидные комплексы (£рв£ для красы и вр93/5б для рыб). Ыохно было предположить, что субьвдиница одного белка, или это ассоциированные белки относительно прочной связью. В любом случае необходимо с определить, какой из компонентов комплекса способен связш пахучий стимул. С втой целью была проведена повтор хроматография на Ультрагеле АсА-34 запах-связыващих белков

А

В

*254

О.Ю 0.05

©

2000 136 68 «3

i i ii

20 40 60 80

номер фракции

©

24 30 35 40 44 номер фракции

20 40 60 ВО

л номэр фракции ©__

1 1 '„7

бе-

зо 34 38 42 46 50 ноиер фракцни

Рис.На. Д - хроматография на Ультрагеле АсА-34 выделанных на алашм-агароае комплексов gp98/56 ската. Десорбция с помощью 10 М аланина. В - ДЦС-электрофорез полученных фракций £29].

Рис.1X0. То же. Десорбция с колонок при рН 3.0.

^254*

- 13Н)-аланин.

(онятельного эпителия ската, выделенных на яффоттнх колонках с 'мощью десорбции как аминокислотами, так и низкими значениями [; в последнем случае хроматографию можно было проводить в исутствии меченых аминокислот.

На рис.- На представлены данные по хроматографии на Ультрагеле ¡А-34 выделенных на аханин-агароэе белков из обонятельного

эпителия ската при десорбции белков с коловки с помощью аланиа ДДО-Блектрофорез полученных при хроматографии фракций. Как вя на рисунке, такой способ десорбции приводит к выделению ведис циированного' комплекса с молекулярной массой около 140 кДг состоящего из двух полипептидов 98 и 56 кДа. Принципиально дру результат был получен при хроматографии белков, полученных при десорбции с аффинной колонки низкими значениями рН (рис .11 Последущая хроматография и ДЦС-электрофорез показали, что таком способе выделения комплекс 98/56 распадался на полишптида &р98 и ®>5б, причем только гликопротеид йр98 способен связывать 3Н-аланин (£р98£Ша). Аналогичные результ были получены для "глютаматного" рецептора (вр98глв). Каков подобные эксперимента были проведены с запах-связывавдими белк из обонятельного эпителия крысы, выделенных с помощью агарози, при этом надо отметить, что десорбция с аффинной кола проводилась низкими значениями рН (рН 3.0). И в этом еду наблюдалась диссоциация комплекса вр88/55 и только гликопрот ер88 был способен связывать 3Н-камфору. •

Таким образом, способностью связывать пахучие стимулы у об классов позвоночных обладали только мембранные гликопротеиды £ для крысы и £р98 для рыб и, соответственно, являлись главн "кандидатами" в обонятельные рецепторные молекулы. Вто белок комплексов не обладал способностью связывать пахучий ста и, как будет показано ниже, в присутствии пахучего стда ассоциировался с обонятельным рецептор», причем связь между в была относительно прочной и разрушалась или низкими значени рН, или некоторыми специфическими агентами.

Зшах-связывающие гликопротеиды из обонятельного впита ската (нр98), спещфичные к разным классам аминокислот, т одинаковую молекулярную массу. По-видимому, они представл семейство запах-связнвапцих белков, близких по своим физи химическим свойствам и отличающимся только структурой цеи связывания аминокислот. Это было подтверждено перекрест шмунофермэнтным анализом с использованием антител к выделав отдельно вр98|1ДВ и 8р98гдв, который показал наличие больш количества общих иммунных детерминант у обоих гликопротеидов.

18

Цля доказательства принадлежности выделенных запах-связнващих копротеидов gp83 и вр98 к обонятельным рецепторным молекулам о проведено исследование их тканевой и видовой специфичности, лучае связывающих аминокислоты белков были предприняты попытки елить комплексы, аналогичные &р98/56 из различных тканей ската )бонятельных выстилок других животных с помощью' станин- или тахт-агарози. В случае запах-связываодих гликопротеидов ^р88 обонятельного эпителия крысы для определения тканевой и овой специфичности был использован перекрестный иммуно-ментный анализ с использованием 18сереа/аа к комплексу 8/55. Результаты этих экспериментов представлены в Табл.5.

•Таблица_5.

Видовая и тканевая специфичности запах-связыващих гликопротеидов gp88 из крысы и gp98 из ската [23, 295.

тип препарата gp88* gp98*

гсштельный эпителий крысы да нет

" - " ската нет да

" - " мыш да

" - " морской свинки . да

" - " хомяка да

" - " карпа нет да

" - " лягушки кет

(нятельная. луковица крыса нет - •

ir крысы нет

¡г ската - нет

пие крысы нет -

юнь крысы .нет

к , нет

•аны вкуса ската _ - нет

- ( - ) эксперименты не проводились .

Как видно из приведенной таблицы, оба запах-связывающие иопротеида gp88 и ер98 обладают ярко выраженной видовой и ¡невой спкцифичностью: данные гликопротеида обнаруживаются гько в обонятельных эпителжях соответствующих животных. В этом юшении важен результат, полученный для органов вкуса ската,

который обладает чувствительность!) к аминокислотам, сравним^ чувствительностью органов обоняния.

йлмуногистохимическяй анализ на уровне световой микроско: с применением антител к гликопротеидам £р88 из обонятельн эпителия крысы показал присутствие ер88 нз поверхно обонятельного эштелия, наиболее вероятном месте локализа: обонятельных рецепторшх структур (рис. II). Одновремв: иммуногистохимический анализ, проведенный на уровне электрон микроскопии с использованием антител, меченых коллоидным золот выявил локализацию вр88 в мембранах кгутиков и булавы обоняте ной клетки.

А Б

Рис. 12. Локализация запах-связнващих. гликопротеидов gp88 в обонятельном эпителии крнсы. А - окрашивание гематоксилином Б - иммуногистохимическая реакция на 18Сер8а/55; коныогат -

антикроличьий 7-глобулин с пришитой пероксидазой хрена.

Если выделенные гликопротеиды gp88 из обонятельного эпите; крнсы действительно являются обонятельными" ' рецепторш молекулами, то полученные к ним антитела с большой степег вероятности должны иншбщювать электрический ответ выстилки пахучий стимул (ЭОГ). Действительно, обработка обонятельной и тилки крысы антителами вызывало необратимое уменьшение амплитз ЭОГ при сохранении формы и. длительности ответа (Табл. 6).

Иммуноглобулины не способны проникать через клеточную мемб! ну, поэтому местом их действия может быть только поверхнос

Таблица_6л

Влияние антител к комплексу £р88/55 на суммарный отвэт обонятельной шстилки крысы на кратковременное вдуЕание пахучего стимула [213.

обработка

Амплитуда ЭОГ*

II

Контрольный 3$3 67 ± 15 96 + 6

^етВа/55 00 32 4 10

* - Амрлитуда ЭОГ выражена в процентах к амплитуде ЭОГ, регистрируемой после промывки шстилки раствором Рингера в течение 5 мин. Контрольный - -у-глобулин неиммунизированного кролика.

I — ЭОГ регистрировали через 10 ш после добавления 1$}. II - ЭОГ регистрировали через 20 мин после последующей промывки выстилки раствором Рингера.

I

I 2 ( цг/мл )

10 20

Рис.13. Эффект антител к гликопротеидам £р88/55 на связывание

[•^П-камфора (А) и С3НЗ-деканаля (В) с "мембранной" фракцией и солюбилизированннми белками "мембранной" фракции обонятельного эпителия крысы 1213.

— • — "мембранная" фракция;

— о — солюбилизированные белки.

клетки. В том случав необратимое уменьшение амплитуда, ответа позволяет предположить, что образование комплекса gp88 -IgGgp8a/55 в первую очередь влияет на связывание гликопротеида gp88 с пахучими веществами. Действительно, антитела полностью блокировали связывание 3Н-камфоры и 3Н-деканаля с солюбилизиро-ванными белками обонятельного эпителия крысы и на 50% уменьшали связывание с препаратами мембран. Разница в действии антител на связывание лиганда для обоих типов препарата скорее всего объясняется разной степенью доступности 7-глобулинов к рецепторным элементам в обоих случаях. Это может быть связано с тем, что в случае препарата мембран часть плазматической мембраны вывернута наружу. Если рацепвдрнце элементы расположены на „внешней поверхности мембраны, то в препарате мембран часть их будет недоступна для антител.

Наконец, выделенные запах-связывандие белки как из обонятельного эпителия крысы, так и рыб, являлись мембранными гликопротеи-дами, что характерно для большинства изученных к настоящему времени рецепторов. В этом отношении интересно отметить блокирование ксшанаЗалинол А связывания пахучих веществ мембранами клеток обонятельного эпителия (рис.14). По-видимому, именно блокирование связывания пахучих веществ конкана&алинол А объясняет его ингибирование влектроольфактограммы IPolak et al., 1989; Shirley et al., 19871.

Кон А. (мг/шО

Рис.14. Влияние ¡тшанабали-на А на связывание [Ш-камфоры "мембранной" фракцией обонятельного эпителия крысы (— • —) и солюбили-зщзованными белками "мэмб-анной фракции (— о —). 211

Итак, выделенные из обонятельных выстилок позвоночных запах-связывающиэ гликопротеида (' gp88 из крысы и gp9B из ската )

удовлетворяли основным критериям, необходимым для идентификации выделенных гликопротеидов как обонятельных рецепторяых молекул. I) Они обладали способность» эффективно связывать пахучие стимулы. 3) Они являлись специфическими мембранными гликопротеидами и характеризовались высокой тканевой а. видовой специфичностью. 3) Они были локализованы в мембранах котиков обонятельной рецептор-ной клетки. 4) Специфические реагенты (антитела к ним) ингибиро-вали связывание пахучих веществ с ними, причем это ингибирование носило функциональный характер - одновременно блокировался электрический ответ клетки на пахучий с яму л. Наконец, они были связаны с наиболее • вероятными кандидатами в элементы системы трансдукции сигнала (см. ниже).

4 ■ 5в51ь_обдштежнга_рец8пторов_с_элемвнташ_^

Впервые возможность того, что комплексы gp88/55 из крысы или др98/5б из ската могут быть ассоциированными белками, в которых только гликопротеида зрВВ или вр98 являются обонятелышми рецеп-торными молекулами, возникла после экспериментов по диссоциации комплексов бр88/55 и ®р98/56 при низких рН (рис.Н). В последующих экспериментах к каждому из гликопротеидов комплексов были получены антитела 18(39а; 18&53> 16й5б) 1251, которые были

использованы для препаративного выделения соответствующих белков. Однако, используя антитела к белку 56 кДа из ската (10356), выделялся только белок 56 кДа, а не весь комплекс £р93/56, что можно было бы ожидать в случае субъеданичного белка. Более того, количество выделяемого бежа 56 кДа было в несколько раз больше предполагаемого количества гликопротеида кр98 (нарушен принцип субъеданиц 1:1 ). Наконец, использование антител при электронно-микроскопическом выявлении локализации белков в обонятельной клетке показало, что белки бб кДа локализованы как в мембране, так и цитоплазме обонятельной клетки в отличие от рецепторннх белков 8р98, локализованных только в мембрвнах.-Всв это привело к выводу, что комплексы ер98/5б из ската и йр88/55 из крысы представляют собой ассоциированные белки, а которых белки йр88 или йр98 являются рецепторами, а функция ассоциированных белков 55 кДа или 5в кДа возможно связана с трансдукциай сигнала в клетке.

Если гликопротеида ер88 или вр98 • являются ' обонятельными рецепторными молекулами, то можно предположить, что белки 55 кДа или 56 кДа' вовлечены в процессы- трансдукции сигнала в клетке. Известно, что для многих рецепторных систем, когда агонист связывается с молекулой рецептора, рецептор образует стабильный комплекс с а-субъеданицой С-белков. Если предположить, что белки 55 или 56 кДа являются а-субъеданицами С-белка или какого-либо его аналога, то, например, для рыб должен образовываться комплекс агонист (аяшонислот) - рецептор (вр98) - а-субъединица С-белка (56 иДа) и данная ситуация должна реализовываться при хроматографии на носителях, модифицированных аминокислотами, так как связывание рецептора с колонкой эквивалентно связыванию рецептора со стимулом.

Комплекс рецептор - а-субъединица С-белка диссоциирует в присутствии ГТФ или его негидролизуемых аналогов. В этом случае при хроматографии на пффияннх колонках в присутствии ГТФ, ГТФуБ, йррШПр должен связываться только рецептор (др98).

А Б В а г а г а г

V» • ^ ♦в1**' » » * ^

Рис.15. ДДС-электрофорез белков из обонятельного эпителия ската, выделенных на аффинных колонках. £331.

А - белки,связывающиеся с колонкой в контроле. Б - белки, связывающиеся в присутствии 10 рМ ГТФтЗ. В - белки 56 кДа, не сорбируемые колонкой в присутствии 10 иМ ГТФтЗ.

в - сиихнш-агароаа, б - гхахажт агараза.

На рис.15 представлен ДДС-электрофорез белков, полученных при аффинной хроматографии тритонового экстракта белков мембран ткани обонятельного эпителия ската в присутствии 10 рМ ГГФтБ. Как видно на рисунке, при этом только ер9вт или «р98глш связывались с колонкой.

Мокно было предположить, что белки отношении к гликопротеидам £р98, то есть 56_

56 кДз специфичны по существуют 56 или

ала

"гта б0ЛКИ' Однако шслэдупцив эксперименты не подтвердили этого предположения. Белки 56дда или 56ГЛ1) были выделены с помощью аф-хроматографии при сорбции соответствующего комплекса

А Е

II. А Б

ах аг а г а у

9856

I

Рис.16. Специфичность белков 56 кДа по отношению к щ>98. I - отдельно выделенные вр98 и 56 кДа:

А - ^"алг и вР^глх,: ' Б ~ 56ала и 56глв, изолированные из комплексов

ЯР^алг/56 и 8Р98Глю/56-II - ассоциация белков ®р98 и 56 кДа:

А - вр98 + 56_ и ЕрЭВ^^ + 56„: ала ала глв глю*

Б - йр98„„в + 56 и + 56 .

^ ала глю глю ала

а - алакин-агароза, г -глхжист-агароэа.

йр98/5б и влюции соответствующих белков 56 промывкой колонки ПФуЭ. Выделенные отдельно белки 56ыч были способны ассоциировать с врЭВрл,, и, соответственно, белки 56гдю с 8Р98ала (рис.16). Таким образом, белки 56 кДа способны ассоциировать с любым из рецепторннх гликопротеидов вр98.

Активация ГТФ-азяой активности аланином комплекса вр98ала/56. [321.

Ь-аланин ( |дМ ) ГТФ-ааная активность*

0.00 1.00

0.01 1.-10

0.03 1.75

0.10 1.90

0.30 3.30

1.00 2.60

* - ГТФ-азная активность принята за 1.0 при отсутствии Ь-аланина.

.Таблица 8.

ГГФ-азнвя активность выделанных белков gp98 и 56 кДа [321.

белок стимул ГТФ-взная активность*

КР^ала + «Р93^ - не детект.

56 кДа 1.00

56 кДа вла + глю 1.00

56 кДа + 8598^ - 0.75

56 кДа + ерЯВ^ ала 1.85

56 цЦа + «рЭв^ глю 0.80

56 кДа + 5Р98ГДЮ - 0.85

56 кДа + «р98глв ала 0.95

56 кДа + 8Р98глш глю 2.20

Количество каждого указанного бежа в образца - 2цг, концентрация аминокислот - I рМ, ГТФ-азная активность белка 56 кДа в отсутствии аминокислот принята за 1.0.

Все известные С-белки обладают ГТФ-азной активностью, которая ассоциирована с а-субъединицей. В наиих экспериментах только белки 56 кда (но не £р98) имели ГГФ-азную активность, составляидую 15 ± 4 нмоль/мин мг, что приблизительно соответствует ГТФ-азной активности известных С-белков. Эта ГТФ-азная активность сохранялась в комплексе др98/56, но существенно возрастала в присутствии аминокислот, при этом шлумаксимум активации наблюдался при концентрации 0.1 (Табл.7).

Особенно важно подчеркнуть, что активация ГТФ-азной активности комплекса дз98/56 была специфична по отношению к аминокислоте, причем эта специфичность полностью определялась рецептором ар98 (Табл.8). Квк видно из таблица, белок 56 кДа универсален и может быть стимулирован соответствующим гликопротеидом ер98.

Рис.17. Влияние ГТФ на связывание taHJ-аминокислот комплексом gp98/56 в присутствии немеченых аминокислот разной концентрации.

ала - связывание gp98/56gjla с I Ш-аланином; гжл - связывание gp98/56r,_!lB с £3НЗ-глютаматом. — А — контроль; — • — 10 |im ГТФ.

Ингибирование связывания -аминокислоты при концентрации немеченой аминокислоты 10 М принято за 1.0.

Наконец, известно, что в рецепторных системах, включающих в систему трансдукции сигнала в-белки, ГТФ или его негидролизуемые 'аналоги влияют, на сродство рецептора к стимулу. Аналогичные результаты были получены при исследовании связывания аминокислот комплексом £р98/56 (рис.17). Квк видно на рисунке, сродство комплекса £р98/56апа к аланину и 8Р98/56ГЛЛ) к глютамату в присутствии ГТФ уменьшалось почти на два порядка.

Приведенные данные были получены на рыбах, что было обусловлено относительной простотой выделения специфических рецепторных молекул и'соответствующих ГТФ-связывапцих белков 56 «Да, ассоциированных с ними. В аналогичных экспериментах и в случае крысы ассоциированный с обонятельным рецептором ар88 белок 55 кДа также обладал ГТФ-азаой активностью, составляющей II ±3.6 нмоль/мин мг, которая также активировалась в присутствии рецептора ер88 и пахучего стимула на 30-4056 [28]. Наконец, перекрестный иммуна— ' ферментный анализ показал наличие общих иммунных детерминант у ГТФ-связыващих белков 55 кДа крысы и 56 кДа ската [243. Таким образом, по-видимому, мы имеем дало с особым классом ГТФ-связывающих белков, ассоциированных с обонятельными рецепторными молекулами.

Все известные в-бвлки имеют консервативную часть аминокислотт-ной последовательности, идентичную для всех <3-белков. Более того, й-белки, принадлежащие к разным классам ( Са, , С0, Сг и т.д. также имеют аминокислотные последовательности, специфичные только дая данного типа ОчЗвлков. Это справедливо для а- и р-субъединиц С-белков и позволяет иммунологическими методами определить класс ГТФ-связывакщш белков. Однако в нашем, случае, используя специфические антитела к обеим субъединицам разных классов, попытка определить принадлежность ГГФ-связыващих белков 55 кДа из крысы или 56 из ската к какому-либо классу С-белков потерпела неудачу. Более того, в диапазоне молекулярных весов 55-60 кДа в обонятельных выстилках как крысы, так и ската не было выявлено ни одного типа (¿-белка. По-видимому, выявленные наш белки 55 и 56 кДа представляют особый класс ГТФ-связывающих белков, не являющихся классическими С-белками.

4 • Метабо.^м^эбонятшм

Для выяснения вопроса о скорости обмена рецепторных белков в обонятельной рецешгорой клетке 'были проведены эксперименты по включению меченого метионина в различные белки обонятельного эпителия крысы (рисЛв). Как видно на рисунке, скорость включения Ь-[З533-метионина в гликопротеиды £р88/55 была в 1.5 раза выше, чем в суммарные цитоплазматические и 4.5 раза выпе, чем в суммарные мембранные белки обонятельных клеток обонятельного эпителия.

срсп/цг

Рис.18. Включение Ь-1 БЗ-метионина в различные белки изолированного обонятельного эпителия крысы [233.

- о — - суммарные мембранные белки;

— • — - суммарные цито-

плазматические белки;

— л--Нр88/55.

8588/55 выделяли на ^ет88/55

— агарозе.

В дальнейшем мы попытались определить влияние пахучих стимулов на скорость синтеза рецепторных белков. С этой целью эксперименты по включению меченого метионина в рецепторные белки обонятельного эпителия крысы были проведены в присутствии пахучих соединений. При этом использовалась смесь пахучих веществ, чтобы получить максимальный эффект влияния запаха на синез рецепторов.

На рис.19, представлены данные по включению 1г-[3533-метионина в гликопротеиды £р88/55. .Как видно на рисунке, в присутствии пахучих веществ наблвдается резкое увеличение (примерно в два раза) синтеза гликопротеидов в первые 1-1.5 часа. В свою очередь это указывает на активацию генома обонятельной клетки под действием пахучего стимула.

срга/цг

2000

4000

1.0

2.0

3.0 час

Рис. 19. Включение Ь-[353]-метионина в гликопрот'еиды gp88/55 в присутствий смеси пахучих веществ 1253.

— о--контроль;

gp88/55 выделяли на IgC^gg/gg - агаразе.

В нервных, клетках, как это было показано для нейромедиаторов и гормонов, данная активация генома происходит через быстрое и кратковременное включение регуляторных генов, в частности с~/оз-г8на, который играет ключевую роль в каскадной регуляции генетической' активности эукариотических клеток [Ivaaov et al., 19911. Предварительные эксперименты, проведенные на изолированном обонятельном эпителии крысы, показали, что, при стимуляции эпите-телия пахучими веществами происходит быстрая (минуты) активация с-/оз-гена; максимум активации наблюдается через 10-15 минут после начала действия стимула, [Иванов, Новоселов, неопубликованные данные]. Это хорошо согласуется с данными по активации скорости синтеза обонятельных рецепторов, где максимум активации наблюдается через I-I.5 часа после начала стимуляции запахом. Таким образом прослеживается цепочка: связывание стимула-активация c-faa-гена - активация генома - активация синтеза рецепторов. Эти предварительные результаты впервые указывают на непосредственное во-

- в присутствии смеси ЮМ камфоры, каврона и линалоола.

■б

— •

влечение обонятельных рецепторов в процессы кх синтеза в клетке.

Одновременно еозник вопрос, активируется ли синтез всех обонятельных рецепторов, или активация синтеза специфична: опреде-деленный запах активирует синтез соответствующего рецептора. Данная проблема не могла быть решена с помощью использованных нами антител к рецепторным белкам, так как они не были способны различать рецепторные молекулы, специфичные к разным классам запахов.

Для решения этой проблемы были выбраны электрофизиологические методы, однако непосредственное использование изолированного обонятельного эпителия было затруднительным: I) Сразу после выделения эпителия в нем присутстуют все типы обонятельных рецепторов. 2) Чтобы зарегистрировать какие-либо изменения в специфичности обонятельных нейронов, необходимо инкубировать обонятельный эпителий в течение длительного времени (возможно, в течение нескольких недель), что также затрудняет использование культуры обонятельного эпителия. Для решения данной проблемы мы выбрали трансплантацию обонятельного эпителия в переднюю камеру глаза [15,16]. В этих условиях обонятельный эпителий нормально развивается в течение длительного периода (до года) и, что существенно, изолировано от центральной дарачой системы (т.е. исключено влияние обонятельной луковицы на специфичность обонятельных нейронов).

Рис.20. Ответ трансплантата обонятельного эпителия крысы в передней камере глаза на различные пахучие вещества после длительной стимуляции линалоолом (4 недели) и последущего времени, необходимого для удаления линалоола из организма [311. А - линалоол, Б - цитраль, В - ментон, Г - камфора. Стрелки, указывают на начало подачи стимула.

в

г

Длительная симуляция запахом проводилась путем внутрибрюшин-ньех инъекций пахучего вещества. При таком способе введения пахучего вещества стимуляция эпителия происходит через кровь ШагипЗ.-ак, 19801. В качестве стимула был внбран линалоол, который имеет очень сильный запах и не обладает физиологическим действием.

На рис.20 представлены ответы трансплантата обонятельного эпителия крысы на различные пахучие вещества. Как видно на рисунке, трансплантат был способен отвечать на линалоол или пахучие вещества того же класса. Таким образом,активация синтеза рецепторов пахучими стимулами специфична: определенный класс пахучих веществ стимулирует синтез соответствующих рецепторов.

ЗШЛХЯЕНИЕ

Представленные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что специфические запах-связыващиэ мембранные гликопротеида из обонятельного эпителия (£р88 для крысы и &р98 для ската) являются наиболее вероятными кандидатами в обонятельные рецепторные элементы позвоночных. Это определяется тем, что данные гликопротеида наиболее полно удовлетворяют всем основным критериям принадлежности выделенных белков к обонятельным рецепторным структурам. Это, одаако, на исключает возможности существования принципиально других классов обонятельных рецецторных молекул у позвоночных, учитывая исключительную гетерогенность обонятельного эпителия. Окончательное решение данного воцроса, по всей видимости, будет связано с выделением всех генов, кодирующих обонятельные рецепторные молекулы, и их "последующей реконструкцией в нерецеп-торной клетке с полным моделированием функции обонятельной рецепторной клетки. Предпринятые в последнее время исследования в данном направлении позволяют надеяться на успех: после инъекции мРНН из обонятельного эпителия крысы в ооциты ксенопуса последние были способны отвечать на пахучий стимул, что свидетельствует о возможности реконструкции рецепторного аппарата [331.

Другой главной проблемой обонятельной рецепции является вопрос о механизмах трансдукции сигнала в обонятельной клетке. Как было показано в настоящей работе, при связывании пахучих веществ с обонятельными рецепторами с последними ассоциировались ГТФ-связы-

взвцие белки 55 или 56 кДа и при этом происходила активация гто-азной активности этих белков. Естественно было предположить, что это является первой стадией трансдукции сигнала в обонятельной клетке'и осталось только найти мишень для белков 55 или 56 кДа. При этом предполагалось, что белки 55 ш 56 кДа являются а-субъ-единицами сотвэтствующего класса (ЙЗелка. Однако последующие эксперименты показали, что все обстой^ намного сложнее. С одной стороны,иммунологический анализ с использованием специфических антител ко всем классам G-белков не выявил общих иммунных детерминант у белков 55 и 56 кДа и известных G-белков. С другой другой стороны, при выделении обонятельных рецепторных элементов мы не обнаружили других белков, которые бы ассоциировались с рецептором при связывании с последним запаха. Более того, в эспериментах по экспрессии мРНК из обонятельного эпителия в ооцит ксенопуса электрический ответ на ззпах регистрировался только в случае одновременной экспрессии как рецептора gp88, так и ассоциированного с ним белка 55 кДа, причем электрический ответ ооцита определялся ами-лорид-зависимнм На+-каналом [331. Таким образом, приведенные данные указпваирт на непосредственное участие ГТФ-связывающих белков 55 и 56 кДа в процессах трансдукции сигнала.в обонятельной клетке К настоящему времени предложено несколько путей трансдукции сигнала в обонятельной клетке [Lancet, 1976; Anholt te al.,1989; Lowe et al., 19901. Это система циклических нуклеотидов и инози-толтрифосфатов, причем имеются 'прямые экспериментальные данные об участии каждой из них в трансдукции сигнала в обонятельной клетке. Нэ исключена также возможность непосредственной модуляции ионных каналов белками, которые ассоциируются с рецептором при связывании пахучего стимула. Соответственно можно было бы ожидать вовлечение белков 55 и 56 кДа в какую-нибудь из перечисленных систем (рис.21). Однако решение этого вопроса требует разработки норых подходов. Дэло в том, что до последнего времени при изучении ферментных систем, которые могли бы быть вовлеченными в процессы трансдукции сигнала в обонятельной клетке полностью игнорировалось существование самих обонятельных рецепторов. В этом аспекте выделение обонятельных рецепторов, специфичных к определенным запахам и ассоциированных с ними ГТФ-связывающих белков дает возможность перейти к непосредственному анализу цепочки пахучий стшщл - рецептор - вторичный лессендхер - начал.

f«aoplш-чyв:tвiпший Ыа-ши

7

/ "О^цшвдшлз*

/ » »ООКШШЗ! о

С-/о4 ш

шоп

Рис.21. Возмогшие дуги вовлечения запах-связываицих гликопро-теидов (ер98) и ГТФ-связывавдих белков 55 (56) кДа в процесса трансдукции сигнала в обонятельной рецепторной клетке позвоночных.

вывода

1. В обонятельных выстилках позвоночных идентифицированы семейства специфических мембранных запах-связнвавдих гликопротеидов (вр88 для крысы и £р98 для скатов).

2. Обнаруженные аапах-связывандие гликопротеиды позвоночных отвечали всем критериям принадлежности к обонятельным рецепторным элементам и являлись наиболее вероятными кандидатами в обонятельные рецапторные молекулы: а) они эффективно связывали пахучий стимул; б) они обладали тканевой и видовой специфичностью; в) они были локализованы на внешней поверхности мембран обонятельных рацепторшх клеток; г) антитела к гликопротеидам вр88 крысы и йр98 ската ингибировали их связывавание с пахучими стимулами, причем это ингибированиэ носило функциональный характер: одновременно блокировался физиологический ответ обонятельной клетки.

3. Звпах-связнвавдиэ гликопротеиды, специфичные к разным запахам, имели очень близкие физико-химические свойства и отличались, по-видимому, только структурами центров связывания запаха.

4. Скорость синтеза гликопротеидов $р88 крысы была выие, чем других белков обонятельного эпителия.- Этот синтез активировался пахучим стимулом, причем определенный запах активировал синтез соответствующего гликопротеида 8р88. 1

5. При связывании пахучего стимула с гликопротеидами gp88 крысы или зр98 ската с последними ассоциировались ГГФ-связывающие белки 55 или 56 кда соответственно (комплексы яр83/55 или ар98/56). Эти белки не обладали специфичность» к запах-связыващкм глико-протеидам (например, или £Р9аглю) и были способны связываться с любым из них. В присутствии ГТФ или его негидролизувмых аналогов комплексы йр88/55 или £р98/56 диссоциировались.

6. При связывании пахучего стимула с гликопротеидами бр88 крысы или £р98 ската происходила активация ГТФ-азной активности белков 55 или 56 кда соответственно. В присутствии ГТФ сродство комплексов gp98/56 к пахучему стимулу уменьшалось почти на два порядка.

7. ГГФ-связнващие белки 55 кда крыса и .56 кда ската образуют особый класс ГТФ-связнвапцих белков и, по-видимому, являются элементами системы трансдукции сигнала в обонятельной клетке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нстерисии. С3НЗ-камфора и (3Ш-двканаль синтезированы в Институте молекулярной генетйки АН СССР, непосредственно перед экспериментами меченые камфора и дэканаль очищались методом препаративной газовой хроматографии; £3Н]-аминокислоты фирмы АшегвЬаи, Англия.

Синтез Ь-сиакш-, Ъ-глхтшт- и Ъ-маш-агарозы был проведен стандартным методом с использованием АН-агарози и 1-элш,-3(3~ди-ктшалияапрогшл)иарбадилжид гидраиориЗа.

Синтез 1%$-агарозы был проведен стандартным методом о использованием ВгСЯ-агарозы.

Получение "лелбраннсй" фракции. Ткань обонятельного • вштелия

гомогенизировали в 25 Ш трис~НС1 буфере, рН 7.2, и двазды центрифугировали при 20 ООО § в течение часа. Осадок после второго центрифугирования ("мелЗранная" франция) или суспендировали в 0.1 и тршз-Ю1 буфере, рН 7.2, или солюбилизировали в 0.1 М трис-НС1 буфере, рН 7.2, содержащем О.ЗЬ тритона Х-100 ( сахаСшшзиро-ванмае белки. "лелЗрашой" фракщт).Ъсв операции проводили при 4°0.

Связывание леченых пахучих соединений.. Пробы в соответствующем буфере ( 50 Ш трис-ЖЯ., буфер, рН 7.2, + 0.1 Ы НаС1 + 0.1% трито-. на Х-100 для солюбилизированных белков или 50 Ш трис-НМ буфер, рН 7.2, + 0.1 Ы ЫаС1 для "мембранной" фракции) инкубировали с меченым лигандом и, в случав необходимости, с исследуемым реагентом нужной концентрации в течение часа ври 4°0. Свободный лиганд отделяли от связанного центрифугированием в случае "мембранной" фракции (20 ООО е х 10 мин) или гельфильтрацией на сефадексе Г-50 (колонки 1x5 см). Неспецифичэское связывание проводили в присутствии Ю~4М немеченых лигандов.

Получение антител. В работе использовались кроличьи антитела. Антиген (100-200 цг белка) с полным адоювангом Фрейнда вводили в подушечки задних лап кролика. Вторую инъекцию (100 цг белка без адаованта ) проводили подкожно в спину через месяц; через 10 дней брали кровь. Анализ антител проводили с помощью иллупоферлекгнога анализа. 1$} выделяли с помощью бедок А-агарааи.

Аффинная хролжогрзфия ка сиант-, гмгшап- и мшш-агарозаз:. Колонки с агарозами (0.5 х 2.0 см) последовательно соединяли и наносили белок в 50 ДО трис-НС1 буфере, рН 7.2, содержащем 0.1 К На01 и 0.1% тритона Х-100. После промывка буфером колонки разъединяли и белки элшровали или 10"4М соответствующей аминокислотой (специфическая десорбция) или 0.1 М ацетатным буфером.рН 3.0, (несгоцифичэская десорбция).

Траштлашхиш ишака абантелънаго эпителия в переднюю камеру глаза. В качестве доноров использовали новорожденных крыс линш Вистар; в качестве реципиентов - крыс весом 150-180 гр. Реципиентам предварительно проводили атропинизацию глаза и делали местну) анестезию 0.1% раствором дакаина. Под эфирным наркозом делал] разрез в роговице и с помощью шприца со стеклянным наконечники вводили трансплантируемую ткань (объем около I мм3) в передаю

камеру глаза. После необходимого времени развития трансплантата вскрывали роговицу и проводили электрофизиологические исследования аналогично как для обонятельного эпителия.

Остальные биохимические, гистохимические и электрофизиологические исследования проводили по стандартам методикам.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фесенко Е.5., Новоселов В.И., Первухин Г.Я., Фесенко Н.К. Хроматографичэское разделение компонентов соскоба обонятельной выстилки лягушки. Получение фракций, способных сенсибилизировать искусственные фосфолшидные мембраны к действию пахучих веществ. Молекулярная биология. 1976, т.Ю, стр.1249-1259.

2. PesenKo Е.Е., Novoselov V.I., Pervukhln G.Y., Fesenko N.K. Molecular mechanisms of odor-sensing. II.Studies of fractions from olfactory tissue scrapings capable of sensitizing artifical lipid membranes to action of odoranta. Btochtm. Blophya.Acta. 1977, т.466, pp.347-356.

3. Фесенко Е.Е., Фесенко йб.К., Жаворонок А.И., Новоселов В.И., Первухин Г.Я., Любарский А.Л. Моделирование фоторэцепции и обонятельной рецепции на искусственных липидных мембранах, модифицированных компонентами рецелторных систем, в: Биофизика сложны:г систел и радиационных нарушений. Наука. М. 1977, стр. 25-28.

4. Фесенко Е.Е., Новоселов В.И., Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Молекулярные механизмы обонятельной рецепции. Связывание камфоры с компонентами обонятельной выстилки крысы и лягушки. Препринт ИШ АН СССР, 1978, НЦБИ, Пущино.

5. Фесенко Е.Е., Новоселов В.И., Крапивинская Л.Д. Молекулярные. . механизмы обонятельной рецепции. Некоторые биохимические

характеристики калфзрного рецептора из обонятельной выстилки крысы. Препринт И№ АН СССР, 1978, НЦБИ, Пущино.

6. FesenKo Е.Е., HovoseloT 7.1., MJasoeclov Н.Р., Sidorov G.Y. Molecular mechanisms of odor-sensing. III. Binding of camphor receptor by rat and frog olfactory mucosa- component. Stvdla Btophyaica, 1978, B.73, Self 1.

7. Pesento E.E., NovoseloT V.I., Kraplvinskaja L.D. Molecular mechanisms of olfactory reception. IV.Some biochemical characteristics of camphor receptor from rat olfactory epithelium. Biochlm.BiopTya.Acta. 1979. 7.587, pp.424-433.

8. НотоэеЮТ V.I., KraplTlnakaJa L.D., ieaento E.E. Molecular . mechanisms oi odor-sena ing. V. Some biochemical characteristics of the.alanineous receptors from the olfactory epithelium oi the skate Daayatia poattnoca. СЬш.аепвеа, 1980. v.5, pp. 195-203- -

9. Новоселов В.И., Крашвинская Л.Д. Некоторые биохимические характеристики рецепторов для аминокислот из обонятельного эпителия ската Daayatla poatlnoca. в: I Всесоюзный биофизический съезд, 1982. Москва, тез. стр.97-98.

10. Новиков Ю.В., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. Кинетика взаимодействия пахучего стимула с обонятельным рецептором позвоеоч-ных и механизм регуляции его сродства к стимулу, в: I Всесоюзный биофизический съезд, 1982. иосква. тез. стр.99.

11. ieaenko Е.Е., Novoselov V.I., Krapivinakaia L.D., Mjasoedov H.P., Zolotarev J.A. Holecular mechanisms ot odor-aensing. V. Some biochemical characteristics of the receptor for amino acids from the olfactory epithelium of the atate Daayatla paatinooa впй carp Qarpla ciprtnua. 1983. Btaph.lm.Bldphya. Acta, у Л59, pp.250-256.

12. Фесенко E.E., Новоселов В.И., Новиков Ю.В. Свойства системы центров связывания камфора из обонятельного эпителия позвоночных. в: III Советско-швейцарский симпозиум "Биологические мембраны. Структура и функция". 1983. Ташкент, тез. стр.57,

13. Нэвоселов В.И., Крашшинская Л.Д., Фесенко Е.Е. Специфичность обонятельных рецепторшх структур черноморского ската, в: сб. "Сенсорная физиология рыб". Аппетиты. 1984. стр.64-65.

14. Новоселов В.И., Крапишшская Л.Д., Новиков Ю.В., Фесенко Е.Е, Способ длительной консервации обонятельных рецепторныз структур у рыб. в: сб. "Сенсорная физиология рыб". Апттатити. 1984. стр.64-65.

15. NoyoseloT V.I., Bragin A.G., КотШлг J.V., NeateroY "V.I., Геаейсо E.E. Transplant of olfactory mucosa in the anterioj chamber of the eye: morphology, electrophysiology and biochemistry. Dev.Weuroset. 1984. т.б, pp.317-324.

16. Новоселов В.И.,.Брагин А.Г., Новиков D.B., Нестеров В.И., Фесенко Е.Е. Развитие транешшнтов обонятельного эпителия ] шредней камере глаза. Онтогенва, 1985. т.16, стр.610-615.

17. Fesenko Е.Е., NovoseloT V.I., Hovlkov J.V. Molecular mecta nisma of odor-aenaing. VII. Kinetic characteristics o: camphor interaction with, binding altea of rat olfactory epl thfilium. BlocMm.Biophya.Aota. 1985, т.839, pp.268-275.

18. Новоселов В.И., Шстрова Ы.Ф., Фесенко Е.Е. Некоторые свойст ва глисопротеидов из обонятельного эпителия крысы. Возможная роль в рецепции пахучих веществ. Jen.ВИНИТИ,1986, Н°3395-В86

19. Новоселов В.И., Крашшинская Л.Д., Фесенко Е.Е. Специфически рецепторы из обонятельного эпителия черноморского ската Easy at la paatinaoa. Деп.ВИНИТИ, 1986. N°8635-B86.

30. Feaenko E.E., NoToaelor V.I., Byatrova M.P. Properties of odor-binding glycoproteins from rat olfactory epithelium. Ш Lett., 1#7, 7.219, pp.224-226.

81. Новоселов В.И., Бнстрова М.Ф., Фесенно Е.Е. Свойства рецеп-торных элементов из обонятельного эпителия крысы, сенсорные систем, 1987. т.1, стр.7-14.

22. Novoselo7 V.I., Novitov 'J.V., Popor V.I. The localization, supermolecuLar organization and methabollzm of the receptor apparatus of olfaotory neurons, in: 7 Soviet-Swiss symposium: Biological Membranes: Structure and function. Riga, 1988, abstr. p.97.

23. Pesenko E.E., NovoaeloT 7.1., Bystrova M.P. Properties of odor-bnding glycoproteins from rat olfactory epithelium. Blochtm.Blaphya.Airta. 1988. 7.937, pp.369-37B.

24. Крашвинская Л.Д., Новоселов В.И. Антитела к субъедавицам обонятельного рецептора черноморского ската Daayatla pdstina-оа. Men.ВИНИТИ, 1ЭВ8, К°1008-В88.

25. Новиков Ю.В., Николаев D.Ii., Новоселов В.И. Рецепторный ашарат обонятельной клетки: локализация и метаболизм, деп. ВИНИТИ. 1988, N°I009-B88.

26. HovoaeloT V.I..KraplTlmteJa Ь.В, Hikonov A.A. Speaificity of skate olfactory receptor: biochemistry and. electrophyslology. in: 2nd International Congress of Comparative Щ/atology and Tbyalolagy. Lousiana, Batton Hoosh, USA. 1988, abatr. p.89.

27. HoYoaelov V.I. Isolation and identification of olfactory receptor molecules In fish, in: "Ghemareceptlan in Aquatic Organisms", LUMCGH, Cocodrle, USA, 1988. abstr. p.19.

28. Новоселов В.И., Николаев Ю.В., Новиков Ю.В. Бнстрова Ы.Ф. ГТФ-связывающие белки из обонятельного эпителия гаысы, ассоциированные с обонятельными рецепторами. Деп.ВИШТИ, 1989, Н°117-В8Э.

29. Hovoaeloy V.I., Kraplrlnskada I.D., Pesenko Е.Е. Amino aclda binding glycoproteins from the olfactory epithelium of skate {Eaayatla paatlnooa). Chen, senses, 1989, 7.13, pp.317-329.

30. Phyllipova Т.Н., HoYoselov V.I., Alekseev S.I. Microwave effect on camphor binding to rat olfactoty epithelium. Bloelectramagnetlc8, 1989, y.9, pp.374-384.

31. Novoselov V.I., UorltoT J.V. Development of olfactory neurons tranplanted. Into the anterior chamber of the eye: Fine structure and selectivity, in. Olfaction and Taste. X. Oslo, Norway. 1989. p.256.

32. Hovoselov V.I., KraplTlnskaja L.B., Krapivlnsity G.B., Pesenko E.E. OTP-binding proteins froia skate olfactory epithelium assosiated with odor-blntUiig proteins. FEBS Lett. 1989, 7.219, pp. 197-201.

33. Kovoselov V.l., SotUsdt' J.V., Nitolaer J.V. mHNA. from га' olfactory epithelium Induces expression or olfactory receptora In Xenopua oocytes. 1л: I soviet-Japan Symposium "Becep-tore: structure and functionMoscow, 1989. abstr. p.37.

34. Попов В.И. .Хуцян С.С.,Аллахвердов Б.Л. .Ноеиков D.B. .Новосело; В.И., Фесенко Е.Е. Анализ надмолекулярной организации обонятельного нейровшиелия крысы методом замораживания-травления с круговым напылением платиной-углеродом. Цитология, 1390 T.3Z, стр.1090-1093.

35. HoToseloT V.l. Odor-binding proteins from olfactory epithe llum of vertebrates: localization and. methabolism. in: i: Japan-Soviet Sympaalm "Beceptora: Structure and Function" Kyoto, Japan, T991. abatr. p.15.

17.09.91 г. IWp. 150 эка. Зак. 3596P. Уч.-иад.л. 3,0 Отпечатано на ротапринте в ОШИ ПЩ АН СССР