Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами"

КУРЕК ДЕНИС ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

СОЗДАНИЕ НОВЫХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ С ХИТИНСВЯЗЫВАЮЩИМИ ДОМЕНАМИ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе и бионанотехиологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 о::

Москва 2011

4855982

Работа выполнена в лаборатории инженерии ферментов Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович кандидат химических наук Лопатин Сергей Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович доктор химических наук Марквичева Елена Арнольдовна

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

имени А. Н. Несмеянова РАН

Защита состоится «16» февраля 2011 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «14» января 2011 г.

Учёный секретарь специализированного совета, доктор физико-математических наук

Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рекомбинантные белки получают с использованием ДНК, в структуру которой введен ген другого организма, включая растения или животных, в том числе и человека. Важной особенностью получения рекомбинантных белков является высокая степень экспрессии целевого белка, иногда на несколько порядков превышающая уровень экспрессии в клетках родного организма. Последние два десятилетия одновременно с совершенствованием технологий получения рекомбинантных белков расширялись и области их применения в медицине и биотехнологии. Рекомбинантные белки уже широко используются в фармацевтике и медицине для лечения заболеваний, получения антител, иммуноферментного анализа или диагностики. Увеличивается и спектр использования рекомбинантных белков для научных целей. В первую очередь это получение новых ферментов с еще не известной структурой и свойствами в удобной системе экспрессии и дальнейшая очистка для последующих кристаллографических и физико-химических исследований.

В связи с расширяющимся спектром применения возникают и новые требования к качеству, универсальности методов и объемам получаемых рекомбинантных белков. С каждым годом увеличивается и разнообразие получаемых рекомбинантных белков, что требует разработки универсальных систем экспрессии и методов очистки. Использование таких универсальных систем позволит снизить стоимость получения и сделать более удобным сам процесс, часто являющийся лишь одной из стадий более масштабного исследования или производства. Кроме того, в случае применения в

медицине или для исследования пространственного строения новых ферментов возникают высокие требования к степени очистки получаемых рекомбинантных белков, требующие совершенствования уже существующих или разработки новых методов постэкспрессионной очистки целевых белков.

В настоящий момент наиболее эффективным и самым широко распространенным методом очистки рекомбинантных белков является метод аффинной хроматографии. Принцип аффинной хроматографии базируется на уникальном сродстве различных молекулярных единиц друг к другу, например, фермент -ингибитор, фермент - субстрат, фермент - кофактор. Однако главным недостатком до определенного времени была узкая специфичность таких систем очистки - каждая система могла использоваться только для очистки лишь единичного белка. Разработанный в конце двадцатого века метод использования аффинных лигандов для очистки позволил преодолеть этот недостаток аффинной хроматографии, сделав ее универсальной. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или 14- конца, и имеющие высокое сродство к сорбенту. Использование аффинных лигандов позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лиганда может способствовать улучшению растворимости целевого белка. Появившаяся одной из первых и до сих пор широко применяемая система, использующая гексагистидиновый лиганд в сочетании с металлохелат аффинной хроматографией хотя и обладает целым рядом преимуществ, но и не

является универсальной. Данная метка за счет своего малого размера практически не влияет на экспрессию или фолдинг целевого белка, а сам метод очистки является экономичным и удобным в рутинном использовании. Однако и такой вариант имеет ряд недостатков, таких как очистка нативных металлозависимых или богатых гистидинами балластных белков клетки продуцента помимо целевого белка. Поэтому на сегодняшний день существует целый ряд коммерческих аффинных лигандов, использующих различные варианты хроматографии и различающихся по своему размеру, свойствам и условиям очистки. Уже разработаны коммерчески доступные системы очистки, использующие субстратсвязывающие домены в качестве аффинных лигандов. Однако, например, в случае хитинсвязывающих доменов существует лишь одна дорогостоящая и не являющаяся оптимальной система очистки. Таким образом, на сегодняшний день не существует универсальной системы аффинной очистки рекомбинантных белков, и исследования в этой области продолжаются.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка новых аффинных сорбентов на основе хитина или хитозана для использования их в сочетании с хитинсвязывающим аффинным лигандом для очистки рекомбинантных белков; подбор и оптимизация хроматографических параметров метода для получения наиболее эффективных результатов; исследование условий и особенностей сорбции модельных рекомбинантных белков на полученных сорбентах.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Синтезировать новые аффинные сорбенты на основе хитина или хитозана.

2. Изучить их хроматографические и физические свойства, определить оптимальные условия и материалы для получения сорбентов с требуемыми хроматографическими параметрами.

3. Провести хроматографическое испытание сорбентов, выбрать и оптимизировать протоколы очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.

4. Ввести различные хитинсвязывающие домены в структуру модельного рекомбинантного белка для определения наиболее подходящего варианта использования в качестве аффинного лиганда.

5. Изучить возможности использования природных трехмерных хитиновых структур в качестве аффинных сорбентов.

6. Исследовать влияние химической структуры аффинного сорбента на сорбцию рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе работы были проанализированы и опробованы три стратегии получения аффинных сорбентов для очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом. В соответствии с разработанными стратегиями были получены сорбенты на основе частично аморфизированного хитина, реацетилированного хитозана различной молекулярной массы, сорбенты в которых хитозан иммобилизован на инертной матрице и сорбенты на основе трехмерных хитиновых структур из скелетов морских губок. Проведены хроматографические испытания сорбентов для очистки рекомбинантных белков, сравнение

полученных сорбентов по основным хроматографическим параметрам как между собой, так и с единственным коммерчески доступным сорбентом (New England Biolabs, США). Показано, что при оптимизации условий хроматографической очистки некоторые из полученных сорбентов не уступают по своим основным характеристикам коммерческому сорбенту при этом выигрывают в цене и простоте получения. Было исследовано влияние различных факторов (ионная сила подвижной фазы, степень сшивки сорбента, введение точечных мутаций в структуру хитинсвязывающего домена) на селективность и силу связывания аффинного лиганда с сорбентом. Впервые предложена возможность использования природных трехмерных хитиновых структур в качестве аффинных сорбентов для очистки рекомбинантных белков.

По итогам работы показано, что разработанные сорбенты имеют высокую селективность по отношению к хитинсвязывающей аффинной метке и достаточную емкость по белку для использования в сочетании с отработанными хроматографическими условиями при очистке рекомбинантных белков.

Апробация работы

Основные результаты, полученные в ходе данной работы были представлены автором на следующих международных и российских конференциях: XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008), конференция 14th international seminar and workshop «New aspects on chemistry and application of chitin and its derivatives» (Польша, 2009), Девятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008), конференция 9th International Conference of the European Chitin Society (Италия,

2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009), Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2010), Десятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад автора

Личный вклад автора заключался в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Часть работы, посвященная получению и определению физико-химических параметров хитиновых матриц из морских губок проводилась автором совместно с немецкими учеными в Техническом университете Дрездена (Институт биоаналитической химии, Дрезден, Германия) в рамках программы Erasmus Mundus Co-operational Programme between Russia and EU 2009.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, в том числе 5 статей в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 80 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической

части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 96 научных источников.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы был в соответствии с предложенными теоретическими стратегиями получен ряд аффинных сорбентов. Это сорбент на основе кристаллического хитина (Х-1), на основе реацетилированного хитозана (БЬС) и сорбент, в котором низкомолекулярнй хитозан был иммобилизован на инертной матрице из поливинилового спирта (ДЕН-1). В случае сорбентов на основе хитозана был определен порог молекулярной массы полимера, котороый может быть использован для получения частиц сорбента с наибольшей емкостью по белку. Хроматографические испытания, в первую очередь, выявили недостаточную механическую прочность сорбентов БЬС и Х-1, что не позволяло использовать их более двух хроматографических циклов. Для устранения этого недостатка была применена поперечная сшивка сорбента, при этом в качестве сшивающего агента был использован эпихлоргидрин, который может реагировать по гидроксильным группам полисахаридов. Такой выбор был обусловлен тем, что при использовании эпихлоргидрина в отличие от глутарового альдегида или глиоксаля для реакции сшивки не требуется наличия свободных аминогрупп полимера. Таким образом, обработку эпихлоргидрином можно проводить уже после реацетилирования хитозана, тем самым минимизируя вероятность нарушения селективности сорбента. Было получено три сорбента на основе хитина с различной расчетной степенью сшивки (Х-1.20Еру - 20%, Х-1.40Еру - 40% и Х-1.60Еру -60%). Хроматографическая проверка показала, что во всех трех

случаях механическая прочность повысилась в 4-5 раз (возможность использования до 10 хроматографических циклов очистки белка), однако с увеличением степени сшивки происходило снижение селективности сорбента вплоть до полной потери селективности в случае Х-1.60Еру (Таблица 1, Рис. 1). Сравнение эффективности сорбентов с различной степенью сшивки проводилось на примере очистки рекомбинантной оксидазы Э-аминокислот (БААО, Т/^опорягя vaпaЫ/is) со встроенным хитинсвязывающим доменом СЬВОп.

Таблица 1. Сравнение эффективности сорбентов с различной степенью сшивки. _ _____

Сорбент Активность целевого белка в клеточном экстракте, Ед/Мг Активность белка в элюированных фракциях, Ед/Мг Степень очистки

Х-1 78 1011 13.00

Х-1.20Еру 62 800 12.9

Х-1.40Еру 71 632 8.90

Х-1 .бОЕру 75 36 0.48

I

5 6

к»а

ч

ан

шв . ? _

^ ^ ^ щ

Укй . • 1

а

б«

«»я* «ивЙ» 29

вШш й1111 ММ 24

* ¿Г-

"т ■ «V : ■■ ¡(В»'

Рис. 1. Результаты ПААГ-электрофореза элюированнх фракций. 1 -Х-1, 2 - Х-1.20Еру, 3 - Х-1.40Еру, 4 - Х-1.60Еру, 5 - исходный клеточный лизат, 6 - белки - маркеры молекулярной массы.

Было определено, что в случае полученных сорбентов оптимальной является 20% сшивка эпихлоргидрином, увеличивающая механическую прочность сорбента в 4 раза и при этом не влияющая на селективность. Такая же степень сшивки была использована при получении сорбента на основе реацетилированного хитозана SLC.20Epy.

В качестве модельных рекомбинантных белков в работе была использована оксидаза D-аминокислот (КС 1.4.3.3) с тремя различными встроенными хитинсвязывающими доменами (45 кДа). Первый вариант со встроенным хитинсвязывающим доменом (ChBDn) хитиназы AI почвенной бактерии BaciJ/us circuJans WL-12, который уже используется в коммерческой системе (New England Biolabs) в качестве аффинного лиганда; второй - с таким же хитинсвязывающим доменом, но в структуре которого была сделана одна точечная мутация Tip387 на Phe (ChBDm). Точечная мутация была введена в структуру домена для снижения силы связывания с субстратом, поскольку ранее в литературе подчеркивалось, что в белки с ChBDn невозможно элюировать без использования денатурирующих агентов. И третий - со встроенным бактериальным хитинсвязывающим доменом из диоксигеназы Streptomyces coelicolor A3 (ChBDs), имеющим уровень гомологии последовательности с хитинсвязывающим доменом хитиназы AI Bacillus circu/ans 57 %. ChBDs был использован в ходе работы поскольку имеет меньший размер чем ChBD, что позволяет расчитывать на меньшую вероятность влияния доменной вставки на фолдинг целевого белка.

Сравнение сорбентов SLC.20Epy, Х-1.20Еру и ДЕН-1 по селективности и эффективности очистки рекомбинантных белков со

встроенным хитинсвязывающим доменом СИВОп показало, что при использовании при нанесении белковой смеси на колонку 50 мМ фосфатного буферного раствора (рН - 8.0) с 2М хлорида натрия первые два сорбента имеют высокую селективность и емкость 1 и 0.5 мг белка на 1 мл сорбента соответственно (Рис. 2, дорожки 1 и 2). В случае сорбента ДЕН-1, полностью отсутствовала сорбция не только рекомбинантного, но и балласных белков. Это может быть связано с недостаточной концентрацией иммобилизованных фрагментов полисахарида и, предположительно, с отсутствием распознавания хитинсвязывающим доменом субстрата из-за отсутствия участков связывания.

I 2 3 4 »

|| , .

00

¡В»«ч1 Н45 , ЩЩ

|РЩ (И

ММ 29

Ц24

Рис. 2. Результаты ПААГ-электрофореза элюированных фракций. 1-сорбент Х-1.20Еру, О А АО со встроенным СИВО,,; 2 - 8ЬС.20Еру, ЭААО со встроенным СМФП; 3 - 8ЬС.20Еру, ВААО со встроенным СЬВГ)т, 4 - белки - маркеры молекулярной массы.

Было показано, что при использовании полученных сорбентов и выбранных условий проведения хроматографической очистки рекомбинантный белок с СЬВОп может быть элюирован в неденатурирующих условиях. Для выбора наиболее подходящего варианта хитинсвязывающего домена на сорбенте 8ЬС.20Еру были

проведены исследования влияния ионной силы в подвижной фазе на сорбцию целевого рекомбинантного белка. Было показано, что при снижении концентрации хлорида натрия с 2М до 0.5М не происходило изменения селективности как в случае ChBDn, так и в случае CbBDrn. Однако емкостные характеристики сорбента в этих случаях отличались: для ChBDn в условиях 2М NaCl емкость составила 1мг/мл сорбента, а в случае ChBDm всего лишь 0.4 мг/мл сорбента. Полученные результаты согласуются с литературными данными и свидетельствуют о том, что использованная точечная мутация приводит к снижению силы связывания домена с полисахаридом. Однако для данной системы такое снижение силы связывания привело и к снижению емкостных характеристик сорбента. Результаты хроматографической очистки модельного рекомбинантного белка со встроенным доменом ChBDs показали, что рекомбинантный белок с таким аффинным лигандом не уступает белкам с ChBDn и ChBDm в селективности, хотя несколько уступает в емкости (0.7 мг белка/мл сорбента).

Следующим этапом было сравнение наиболее по эффективности из полученных сорбентов Х-1.20Еру и SLC-1.20Epy при очистке рекомбинантного белка с ChBDn с единственным существующим коммерчески доступным сорбентом Chitin beads фирмы New England Biolabs (США) при очистке рекомбинантного белка с ChBDm в подобранных условиях. Результаты сравнения показали, что по своей селективности в данных условиях оба полученных сорбента превосходят Chitin beads, но уступают по сорбционной емкости (Таблица 2, Рис. 3). К сожалению, различия как в селективности, так и в емкости по белку трудно объяснить, поскольку структура и особенности получения сорбента Chitin beads являются коммерческой тайной.

Таблица 2. Сравнение полученных сорбентов с коммерческим аналогом.

Сорбент Активность целевого белка в клеточном экстракте, Ед/Мг Активность белка в элюированных фракциях, Ед/Мг Степень очистки Емкость сорбента мг/мл

Х-1.20Еру 62 820 12.9 -1000

SLC-1.20Epy 71 814 11.5 -1000

Chitin beads 74 806 10.8 -2000

küa

66

- ■

И 29 Ы24

Й20

iaSi .* « йК.

Рис. 3. Результаты ПААГ-электрофореза элюированных фракций. 1-сорбент Х-1.20Еру при очистке DAAO со встроенным ChBD„; 2 -SLC.20Epy при очистке DAAO со встроенным ChBDn; 3 4- Chitin Beads при очистке DAAO со встроенным ChBDm; 5 - белки -маркеры молекулярной массы.

Еще один из предложенных в ходе работы подходов -использование трехмерных хитновых матриц в качестве аффинных

сорбентов. Такие трехмерные структуры получали из скелетов морских губок Лpfy.iiпа саиЬ/огтм методом последовательной депротеинизиции и деминерализации скелета (Рис. 4).

. А,'-';:

Рис. 4. Стадии получения хитиновой матрицы из скелета морской губки. Верхняя часть - исходный скелет, средняя часть - процесс частичной деминирализации. Нижняя часть - готовая хитиновая матрица.

Полученный материал был охарактеризован с помощью твердофазной ЯМР спектроскопии и спектроскопии Рамановского рассеяния. Полученные данные показали, что полученные матрицы полностью состоят из а-формы хитина, являющегося субстратом для бактериальных хитиназ. Кроме того с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии было подтверждено наличие упорядоченной на микро- и нано- уровнях структуры. Полученные трехмерные хитиновые матрицы за счет своего

строения имели и высокую удельную внутреннюю поверхность и проявляли повышенную механическую прочность. Таким образом за счет всех вышеперечисленных свойств такие структуры являлись хорошими кандидатами для использования в качестве аффинных сорбентов. Однако, хроматографические исследования показали, что в условиях, подобранных для сорбентов Х-1.20Еру и БЬС-1.20Еру, трехмерные хитиновые матрицы не имеют достаточной емкости по белку. Это может быть связано с высокой степенью кристалличности хитина в таких структурах. Для дальнейшего использования хитиновых матриц в качестве сорбентов необходимо либо понизить степень кристалличности полимера, либо оптимизировать условия хроматографической очистки.

ВЫВОДЫ

1. В ходе работы была разработана система аффинной очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим лигандом.

2. Разработан ряд оригинальных аффинных сорбентов на основе хитина и хитозана. Определена оптимальная степень сшивки для увеличения механической прочности сорбента.

3. Оптимизированы условия хроматографического протокола очистки рекомбинантных белков.

4. Выделены и охарактеризованы трехмерные хитиновые матрицы из скелетов морских губок. Показана принципиальная возможность использования таких матриц в качестве аффинных сорбентов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Курек Д.В., Лопатин С.А., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. Хроматографическая очистка рекомбинантных белков с использованием хитинсвязывающего домена как аффинной метки. // Девятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» -2008. -С. 68-70.

2. Курек Д.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. Перспективы использования хитинсвязывающих доменов для выделения и очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии. // Прикладная Биохимия и Микробиология. -2009. -Т. 45. №1. -С. 5-13.

3. Kurek D., Lopatin S., Tikhonov V., Eldarov M., Varlamov V. New chitin based affinitysorbents for purification of recombinant proteins. // 9th International Conference of the European Chitin Society. -2009. -P. 33.

4. Курек Д.В., Варламов В.П., Эрлих Г. Трехмерные хитиновые матрицы из морских губок и их применение в биотехнологии. И Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. -2009. -Т. 2. -Р. 124-125.

5. Курек Д.В., Лопатин С.А., Эльдаров М.А., Варламов В.П. Перспективы исследования и применения рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом. // Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». -2009. -С. 54-55.

6. Brunner, Е., Ehrlich, Н., Hedrich, R., Hunoldt, S., Kammer, M., Machill, S., Paasch, S., Ruhnow, M., Born, R., Bazhenov, V., Kurek,

D., Arnold, Т., Brockmann, S. Chitin-based scaffolds are an integral part of the skeleton of the marine demosponge /antheUa basta. II Journal of Structural Biology, -2009. -V. 168. -P. 539-547.

7. Курек Д.В., Эрлих Г., Варламов В.П. Трехмерные хитиновые матрицы из морских губок - новый перспективный материал для использования в биотехнологии. // Десятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» -2010. -С. 35-37.

8. Kurek D.V., Lopatin S.A., Tikhonov V.E., Varlamov V.P., New affinity sorbents for purification of recombinant proteins with the use of chitin-binding domain as an affinity tag. // Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives, by Polish Chitin Society, V. XV -2010. -P. 41 -46.

9. Ehrlich, H., Simon, P., Carrillo-Cabrera, W., Bazhenov, V., Botting, J., lian, M., Ereskovsky, A., Muricy, G., Worch, H., Mensch, A., Born, R., Springer, A., Kummer, К., Vyalikh, D., Molodtsov, S., Kurek, D., Kammer, M., Paasch, S., Brunner, E. Insights into chemistry of biological materials: newly-discovered silica-aragonite-chitin biocomposites in demosponges. // Chemistry of materials -2010. -V. 22(4). -P. 1462-1471.

10. Ehrlich H., Shiaparelli S., Ereskovsky A., Schupp P., Born R., Worch H., Bazhenov V.V., Kurek D., Varlamov V., Vyalikh D., Kummer К., Sivkov V.V., Molodtsov S.L., Meissner H., Richter G., Steck E., Richter W., Hunoldt S., Kammer M., Paasch S., Krasokhin V., Patzke G., Bnrnner E. Three dimensional chitin-based scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera). Part I. Isolation and Identification of Chitin. // International Journal of Biological Macromolecules -2010. -V. 47, p. 132-140.

11. Ehrlich H., Steck E., Ilan M., Maldonado M., Muricy G., Bavestrello G., Kljajic Z., Carballo J.L., Shiaparelli S., Ereskovsky A., Schupp P., Born R., Worch H., Bazhenov V.V., Kurek D., Varlamov V., Vyalikh D., Kummer K., Sivkov V.V., Molodtsov S.L., Meissner H., Richter G., Hunoldt S., Kammer M., Paasch S., Krasokhin V., Patzke G., Brunner E., Richter W. Three dimensional chitin-based scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera). Part II. Biomimetic Potential and Applications. // International Journal of Biological Macromolecules -2010. V. 47, p. 141-145.

Формат 60x90/16. Заказ 986. Тираж 150 экз. Подписано в печать 14.01.2011 г.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Курек, Денис Вячеславович

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Хитин, хитоз ан.

1.2 Свойства хитина и хитозана.

1.3 Деполимеризация хитина и хитозана.

1.4 Хитинолитические ферменты.

1.5 Аффинная очистка рекомбинантных белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание новых хроматографических систем для выделения и очистки рекомбинантных белков с хитинсвязывающими доменами"

Рекомбинантные белки получают с использованием ДНК, в структуру которой введен ген другого организма, включая растения или животных, в том числе и человека. Важной особенностью получения рекомбинантных белков является высокая степень экспрессии целевого белка, иногда на несколько порядков превышающая уровень экспресии в клетках родного организама. Последние два десятилетия одновременно с I совершенствованием технологий получения рекомбинантных белков расширялись и области их пременения в медицине и биотехнологии. Рекомбинантные белки уже широко используются в фармацевтике и медицине для лечения заболеваний, получения антител, иммуноферментного анализа или диагностики. Для биотехнологии одной из важнейших стала проблема получения рекомбинантных белков в препаративных количествах и связанные с этим проблемы масштабирования процессов культивации клеточных культур и последующей очистки больших обьемов целевых белков. Увеличивается и спектр использования рекомбинантных белков для научных целей. В первую очередь это получение новых ферментов с еще не известной структурой и свойствами в удобной системе экспрессии и дальнейшая очистка для последующих кристаллографических и физико-химических исследований.

В связи с расширяющимся спектром практического применения возникают и новые требования к качеству, универсальности методов и объемам получения рекомбинантных белков. Для ряда терапевтических применений уже требуются большие количества белка, что ведет к стадии масштабирования. С каждым годом увеличивается и разнообразие получаемых рекомбинантных белков, требующий разработки универсальных систем экспресии и методов очистки. Использование таких универсальных систем позволит снизить стоимость получения и сделать более удобным сам процесс, являющийся зачастую лишь одной из стадий более масштабного исследования или производства. Кроме того в случае применения в медицине или для исследования пространственного строения новых ферментов возникают высокие требования к степени очистки получаемых рекомбинантных белков, требующие совершенствования уже существующих или разработки новых методов постэкспрессионной очистки целевых белков.

В настоящий момент наиболее эффективным и наиболее широко распространенным методом очистки рекомбинантных белков является метод аффинной хроматографии. Аффинная хроматография основывется на уникальном сродстве различных молекулярных единиц друг к другу, нарпимер, фермент - ингибитор, фермент - субстрат, фермент - кофактор. Однако главным недостатком до определенного времени была узкая специфичность таких систем аффинной очистки - каждая система могла использоваться только для очистки лишь одного уникального белка. Разработанный в конце двадцатого века метод использования аффинных меток для очистки позволил преодалеть этот недостаток аффинной хроматографии, сделав ее универсальной. Аффинные лиганды представляют собой полипептидные вставки, встраиваемые в структуру целевого рекомбинантного белка с С- или конца, и имеющие высокое сродство к аффинному сорбенту. Использование лигандов позволяет производить одностадийную высокоэффективную очистку различных целевых белков из сложной смеси, используя при этом одну и ту же систему аффинной хроматографии. Более того в некоторых случаях использование аффинного лигада может способствовать улучшению растворимости целевого белка. Появившаяся одной из первых и до сих пор широко используемая система, использующая гексогистидиновый лиганд в сочетании с металлохелат аффинной хроматографией хотя и оладает целым рядом преимуществ, но и не является универсальной. Данная метка за счет своего малого размера практически не влияет на экспрессию или фолдинг целевого белка, а сам метод очистки является экономичным и удобным в рутинном использовании. Однако и такой вариант имеет ряд своих недостатков, таких как очистка нативных металлзависимых или богатых гистидинами балластных белков клетки продуцента помимо целевого белка. Поэтому на сегодняшний день существует целый ряд коммерческих аффинных лигандов, использующих различные варианты хроматографии и различающихся по своему размеру, свойствам и условиям очистки. Уже разработаны и коммерчески доступны системы очистки, использующие субстратсвязывающие домены в качестве аффинных лигандов. Однако, например, в случае хитинсвязывающих доменов сществует лишь одна дорогостоющая и не являющаяся оптимальной система очистки. Таким образом на сегодняшний день не существует универсальной системы аффинной очистки рекомбинантных белков, исследования в этой области продолжаются.

Целью настоящей работы является разработка новых аффинных сорбентов на основе хитина или хитозана для использовния их в сочетании с хитинсвязывающим аффинным лигандом для очистки рекомбинантных белков; подбор и оптимизация хроматографических параметров метода для получения наиболее эффективных результатов; исследование условий и механизмов сорбции модельных рекомбинантных белков на полученных сорбентах.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Синтезировать новые аффиные сорбенты на основе хитина или хитозана.

2. Изучить их хроматографические и физических свойства, определить оптимальные условия и материалы для получения сорбентов с требуемыми хроматографическими параметрами.

3. Провести хроматографическое испытание сорбентов, выбрать и оптимизировать хроматографических протоколов очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.

4. Ввести различные хитинсвязывающе домены в структуру модельного рекомбинантного белка для определения наиболее подходящего варианта использования в качестве аффинного лиганда.

5. Изучение возможности использования природных трехмерных хитиновых структур в качестве аффинных сорбентов.

6. Исследовать влияние химической структуры аффинного сорбента на сорбцию рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим аффинным лигандом.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Курек, Денис Вячеславович

Выводы

1. В ходе работы была разработана система аффинной очистки рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим лигандом.

2. Разработан ряд оригинальных аффинных сорбентов на основе хитина и хитозана. Определена оптимальная степень сшивки эпихлоргидрином для увеличения механической прочности сорбента.

3. Оптимизированы условия хроматографического протокола очистки рекомбинантных белков.

4. Выделены и охарактеризованы трехмерные хитиновые матрицы из скелетов морских губок. Впервые показана принципиальная возможность использования таких матриц в качестве аффинных сорбентов.

Список работ по теме диссертации

1.Курек Д.В., Лопатин С. А., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. Хроматографическая очистка рекомбинантных белков с использованием хитинсвязывающего домена как аффинной метки. // Девятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» Ставрополь -2008. -С. 68-70.

2. Курек Д.В., Лопатин С.А., Варламов В.П. Перспективы использования хитинсвязывающих доменов для выделения и очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии. // Прикладная Биохимия и Микробиология. -2009. -Т. 45. №1. -С. 5-13.

3. Kurek D., Lopatin S., Tikhonov Y., Eldarov M., Varlamov V. New chitin based affinitysorbents for purification of recombinant proteins. // 9th International Conference of the European Chitin Society. Венеция -2009. -P. 33.

4. Курек Д.В., Варламов В.П., Эрлих Г. Трехмерные хитиновые матрицы из морских губок и их применение в биотехнологии. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва -2009. -Т. 2. -Р. 124-125.

5. Курек Д.В., Лопатин С.А., Эльдаров М.А., Варламов В.П. Перспективы исследования и применения рекомбинантных белков со встроенным хитинсвязывающим доменом. // Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». Звенигород -2009. -С. 54-55.

6. Brunner, Е., Ehrlich, Н., Hedrich, R., Hunoldt, S., Kammer, M., Machill, S., Paasch, S., Ruhnow, M., Born, R., Bazhenov, V., Kurek, D., Arnold, Т., Brockmann, S. Chitin-based scaffolds are an integral part of the skeleton of the marine demosponge Ianthella basta. II Journal of Structural Biology, -2009. -V. 168.-P. 539-547.

7. Курек Д.В., Эрлих Г., Варламов В.П. Трехмерные хитиновые матрицы из морских губок - новый перспективный материал для использования в биотехнологии. // Десятая международная конференция «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» Нижний Новгород -2010. -С. 35-37.

8. Kurek D.V., Lopatin S.A., Tikhonov V.E., Varlamov V.P., New affinity sorbents for purification of recombinant proteins with the use of chitin-binding domain as an affinity tag. // Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives, by Polish Chitin Society, V. XV -2010. -P. 41 - 46.

9. Ehrlich, H., Simon, P., Carrillo-Cabrera, W., Bazhenov, V., Botting, J., lian, M., Ereskovsky, A., Muricy, G., Worch, H., Mensch, A., Born, R., Springer, A., Kummer, К., Vyalikh, D., Molodtsov, S., Kurek, D., Kammer, M., Paasch, S., Brunner, E. Insights into chemistry of biological materials: newly-discovered silica-aragonite-chitin biocomposites in demosponges. // Chemistry of materials -2010. -V. 22 (4). -P. 1462-1471.

10. Ehrlich H., Shiaparelli S., Ereskovsky A., Schupp P., Born R., Worch H., Bazhenov V.V., Kurek D., Varlamov V., Vyalikh D., Kummer К., Sivkov V.V., Molodtsov S.L., Meissner H., Richter G., Steele E., Richter W., Hunoldt S., Kammer M., Paasch S., Krasokhin V., Patzke G., Brunner E. Three dimensional chitin-based scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera). Part I. Isolation and Identification of Chitin. // International Journal of Biological Macromolecules -2010. -V. 47, p. 132-140.

11. Ehrlich H., Steck E., Han M., Maldonado M., Muricy G., Bavestrello G., Kljajic Z., Carballo J. L., Shiaparelli S., Ereskovsky A., Schupp P., Born R., Worch H., Bazhenov V.V., Kurek D,, Varlamov V., Vyalikh D., Kummer К., Sivkov V.V., Molodtsov S.L., Meissner H., Richter G., Hunoldt S., Kammer M., Paasch S., Krasokhin V., Patzke G., Brunner E., Richter W. Three dimensional chitin-based scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera). Part II. Biomimetic Potential and Applications. // International Journal of Biological Macromolecules -2010. V. 47, p. 141-145.

Благодарности

Автор благодарит за помощь в проведении исследований и ценные советы сотрудника института элементоорганических соединений имени А. Н. Несмеянова РАН к.х.н. Тихонова В.Е. и сотрудника Центра «Биоинженерия» РАН к.б.н. Эльдарова М.А.

Автор выражает искреннюю признательность за поддержку и внимание сотрудникам лаборатории инженерии ферметов Центра «Биоинженерия» РАН к.х.н. Ильиной A.B., к.х.н. Левову А.Н., к.т.н. Львовой A.A., Бакулину A.B., Зубаревой A.A.

Отдельную благодарность автор хотел бы выразить всем сотрудникам Института биоаналитической химии Технического университета Дрездена (Дрезден, Германия) и лично доктору Герману Эрлиху (Dr. Hermann Ehrlich) за прекрасную возможность учиться и работать с таким интереснейшим объектом, как морские губки.

Автор благодарит программу Erasmus Mundus cooperational programme between Russia and EU 2009 и лично фрау Крузе за организационную и финансовую поддержку во время пребывания и работы в Германии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Курек, Денис Вячеславович, Москва

1. Muzarelli R.A.A. Chitin. 1977. Oxford: Pergamon Press. P. 309.

2. Pastor de Abram, A. Quitina у quitosano: obtencion, caracterization у aplicaciones. 2004. Peru: CYTED, P. 291.

3. Быкова B.M., Немцев C.B. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана. Приведено в "Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение" / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова -М.: Наука, 2002. -С. 346-359.

4. I. Aranaz, М. Mengibar, R.Harris, I. Panos, В. Miralles, N. Acosta, G. Galed, A. Heras, Functional Characterization of Chitin and Chitosan // Curr. Chem. Biol. -2009. -V. 3. -P. 203-230.

5. R.G. Boot, G.H. Renkema, A. Strijland, A.J. van Zonneveld, J.M.F.G. Aerts, Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins. // J. Biol. Chem. -1995. -Y. 270. -P. 2625226256.

6. Z. Zhu, T. Zheng, R.J. Homer, Y.K. Kim, N.Y. Chen, L. Cohn, Q. Hamid, J.A. Elias, Acidic mammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation. // Science -2004. -V. 304. -P. 1678-1682.

7. Chitosan per os: from dietary supplement to drug carrier. Eds: Muzzarelli, A.A.R. 2000. Italy: Atec Edizioni, P. 334.

8. V.K. Mourya, N.N. Inamdar, Chitosan-modifications and applications: Opportunities galore. //React. Funct. Polym. -2008. -V. 68. -P. 1013-1051.

9. K.V. Harish Prashanth, R.N. Tharanathan, Chitin/chitosan modifications and their unlimited applications potential an overview. // Trends Food Sci. Tech. -2007.-V. 18 -P. 117-131.

10. T. Kean, M. Thanou, Biodégradation, biodistribution and toxicity of chitosan // Adv. Drug Deliv. Rev. -2010. -V. 62 -P. 3-11.

11. C.H. Куликов, Ю.А. Тюрин, ДА. Долбин, Р.З. Хайруллин, Роль структуры в биологической активности хитозана. // Вестник Казанского технологического университета -2007. -Т. 6. -С. 10-15.

12. R. Jayakumar, N. Nwe, S. Tokura, H. Tamura, Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials. // Int. J. Biol. Macromol. -2007. -V. 40 -P. 175-181.

13. F. Shahidi, J. Kamil, V. Arachchi, Y.-J. Jeon, Food applications of chitin and chitosans. // Trends Food Sci. Tech. -1999. -V. 10. -P. 37-51.

14. P.K. Dutta, S. Tripathi, G.K. Mehrotra, J. Dutta, Perspectives for chitosan based antimicrobial films in food applications // Food Chem. -2009. -V. 114. -P. 1173-1182.

15. S.K. Chen, M.L. Tsai, J.R. Huang, R.H. Chen, In Vitro Antioxidant Activities of Low-Molecular-Weight Polysaccharides with Various Functional Groups. // J. Agric. Food Chem. 2009. - V.57. -P. 2699-2704.

16. K.W. Kim, R.L. Thomas, Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weights. // Food Chem. 2007. - V. 101. -P. 308-313.

17. E. Guibal, Interactions of metal ions with chitosan-based sorbents: a review. // Sep. Purif. Techn. . 2004. - V. 38. -P. 43-74.

18. A.H. Велешко, И.Е. Велешко, Ç.A. Кулюхин, JI.B. Мизина, А.Н. Левов,

19. B.П. Варламов, Взаимодействие радионуклидов с некоторыми функциональными производными хитозана в растворах. // -2009. -Т.51.1. C. 428-433.

20. К. Kurita, Chitin and Chitosan: Functional Biopolymers from Marine Crustaceans. // Mar. Biotechnol. 2006. - V. 8. -P. 203-226.

21. N.M. Alves, J.F. Mano, Chitosan derivatives obtained by chemical modifications for biomedical and environmental applications. // Int. J. Biol. Macromol. 2008. - V. 43. -P. 401-414.

22. C.H. Куликов, Ю.А. Тюрин, P.C. Фассахов, В.П. Варламов, Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры. //Журнал Микробиолог. Эпидемиол. Иммунол. -2009, -Т. 5. -С. 91-97.

23. C.K.S. Pillai, W. Paul, С.Р. Sharnia, Chitin and chitosan polymers: Chemistry, solubility and fiber formation. // Progr. Polym. Sci. 2009. - V. 34. -P. 641678.

24. R.A.A. Muzzarelli, Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone // Carbohyd. Polym. 2009. - V. 76. -P. 167-182.

25. Н.Г. Балабушевич, Н.И. Ларионова, Получение и характеристика полиэлектролитных частиц с белком. // Биохимия. 2004. - Т. 69. -С. 930-936.

26. А.В. Ильина, В.П. Варламов, Ю.А. Ермаков, В.Н. Орлов, К.Г. Скрябин, Хитозан -природный полиме для формирования наночастиц. // Доклады Академии Наук-2008.-Т. 421.-С. 1-3.

27. V. Dodane, V.D. Vilivalam, Pharmaceutical applications of chitosan. // Pharm. Sci. Technol. To. 1998. -V. 1. -P. 246-253.

28. M. Amidi, W.E. Hennink, Chitosan-based formulations of drugs, imaging agents and biotherapeutics. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2010. - V. 62. -P. 1-2.

29. A. Mistry, S. Stolnik, L. Ilium, Nanoparticles for direct nose-to-brain delivery of drugs. // Int. J. Pharm. 2009. - V. 379. -P. 146-157.

30. L.F. Boesel, R.L. Reis, J. San Roman, Innovative approach for producing injectable, biodegradable materials using chitooligosaccharides and green chemistry. // Biomacromol. 2009. - V.l 0. -P. 465-470.

31. S.-B. Lin, Y.-C. Lin, H.-H. Chen, Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase: Characterisation and antibacterial activity. // Food Chem. 2009. - V. 116. -P. 47-53.

32. Y. Xie, J. Hu, Y. Wei X. Hong, Preparation of chitooligosaccharides by the enzymatic hydrolysis of chitosan. // Polym. Degr. Stab. 2009. - V. 10. -P. 1885-1899.

33. C. Qin, W. Wang, H. Peng, R. Hu, W. Li, Preparation and properties of reduced chitooligomers. // Carbohyd. Polym. 2008. - V. 72. -P. 701-706.

34. Sh.-B. Lin, Y.-C. Lin, H.-H. Chen, Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase: Characterisation and antibacterial activity. // Food Chem. 2009. - V. 94. -P. 47-53.

35. R.A. A. Muzzarelli, W. Xia, M. Tomasetti P. Ilari, Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation. // Enz. Micr. Technol. 1995. - V. 17. -P. 541-545.

36. A.B. Ильина, В.П. Варламов, Влияние степени деацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом Целловиридин Г20х. // Прикл. Боихим. Микробиол. 2003. - Т. 39. -С. 273-277.

37. W. Xia, P. Liu, J. Liu, Advance in chitosan hydrolysis by non-specific cellulases. // Bioresource Technol. 2008. - V. 99. -P. 6751-6762.

38. R. Cohen-Kupiec, I. Chet, The molecular biology of chitin igestion. // Curr. Opin. Biotechnol. -1998. -V. 9. -P. 270-277.

39. B. Henrissat, G. Davies, Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. -V. 7. -P. 637-644.

40. A. Singh, S.I. Kirubakaran, N. Sakthivel, Heterologous expression of new antifungal chitinase from wheat. // Protein Expr. Purif. 2007. - V. 56. -P. 100-109.

41. S.I. Kirubakaran, N. Sakthivel, Cloning and overexpression of antifungal barley chitinase gene in Escherichia coli. // Protein Expr. Purif. 2007. - V. 52.-P. 159-166.

42. Y.Arakane, Q. Zhu, M. Matsumiya, S. Muthukrishnan, K.J. Kramer, Properties of catalytic, linker and chitin-binding domains of insect chitinase. // Insect Biochem. Molec. -2003. V. 33. -P. 631-648.

43. V. Suarez, C. Staehelin, R. Arango, H. Holtorf, J. Hofsteengeand, F. Meins, Substrate specificity and antifungal activity of recombinant tobacco class I chitinases. // Plant Mol. Biol. 2001. - V. 45. -P. 609-618.

44. V.G.H. Eijsink, G. Vaaje-Kolstad, K.M. Varum, S.J. Horn, Towards new enzymes for biofuels: lessons from chitinase research. // Trends Biotechnol. — 2008. -V. 26. -P. 228-235.

45. C. Songsiriritthigul, S. Pantoom, A.H. Aguda, R.C. Robinson, W. Suginta, Crystal structures of Vibrio harveyi chitinase A complexed with chitooligosaccharides: Implications for the catalytic mechanism. // J. Struct. Biol. 2008. - V. 162. -P. 491-499.

46. J.J. Beintema, Structural features of plant chitinases and chitin-binding proteins. // FEBS Lett. 1994. - V. 350. -P. 159-163.

47. T. Ikegami, T. Okada, M. Hashimoto, S. Seino, T. Watanabe, M. Shirakawa, Solution Structure of the Chitin-binding Domain of Bacillus circulans WL-12 Chitinase Al. // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. -P. 13654 -13661.

48. S. Luschnig, T. Batz, K. Armbruster, M.A. Krasnow, serpentine and vermiform Encode Matrix Proteins with Chitin Binding and Deacetylation Domains that Limit Tracheal Tube Length in Drosophila. // Curr. Biol. -2006. -V. 16. -P. 186-194.

49. О. Shoseyov, Z. Shani, I. Levy, Carbohydrate binding modules: biochemical properties and novel applications. //Microbiol. Mol. Biol. R. -2006. -V. 70. -P. 283-295.

50. T. Nakamura, S. Mine, Y. Hagihara, K. Ishikawa, T. Ikegami, K. Uegaki, Tertiary structure and carbohydrate recognition by the chitin-binding domain of a hyperthermophilic chitinase from Pyrococcus furiosus. II J. Mol. Biol. -2008.-V. 381.-P. 670-680.

51. A.B. Boraston, D.N. Bolam, H.J. Gilbert, G.J. Davies, Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition. // Biochem. J. -2004. -V. 382. -P. 769-781.

52. N.V. Raikhel, H.-I. Lee, W.F. Broekaert, Structure and functions of chitin-binding proteins. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1993. -V. 44. -P. 591-615.

53. Д.В. Курек, C.A. Лопатин, В.П. Варламов, Перспективы использования хитинсвязывающих доменов для выделения и очистки рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии. // Прикл. Биохим. Микробиол. 2-009. -V. 45, -Р. 5-13.

54. L. Chamoy, М. Nicolai, J. Ravaux, В. Quennedey, F. Gaill, J. Delachambre, Anovel chitin-binding protein form the vestimentiferan Riftia pachyptila interacts specifically with P-chitin. // J. Biol. Chem. -2001. -V. 276. -P. 80518058.

55. T. Ikegami, T. Okada, M. Hashimoto, S. Seino, T. Watanabe, M. Shirakawa, Solution structure of chitin-binding domain of Bacillus circulans WL-12 Chitinase Al. //J. Biol. Chem. -2000. -V. 275. -P. 13654-13661.

56. M. Alam, T. Mizutani, M. Isono, N. Nikaidou, T. Watanabe, Three Chitinase Genes (chiA, chic and chiD) Comprise the Chitinase System of Bacillus circulans WL-12. // J. Ferment. Bioeng. -1996. -V. 82. -P. 28-36.

57. T. Toratani, Y. Kezuka, T. Nonaka, Y. Hiragi, T. Watanabe, Structure of full-length bacterial chitinase containing two fibronectin type III domains revealed by small angle X-ray scattering. // Biochem. Biophys. Res. Comm. -2006. -V. 348.-P. 814-818.

58. S. Graslund, P. Nordlund, J. Weigelt, et al., Protein production and purification. // Nature Meth. -2008. -V. 5. -P. 135-145.

59. C.-T. Lin, P. A. Moore, D. L. Auberry, E. V. Landorf, T. Peppier, K. D. Victrya, F. R. Collart, V. Kery, Automated purification of recombinant proteins: Combining high-throughput with high yield. // Protein Expr. Purif. -2006.-V. 47.-P. 16-24.

60. F. Baneyx, Recombinant protein expression in Escherichia coli. II Curr. Op. Biotechnol. -1999. -V. 10. -P. 411-421.

61. M. Vedadi, C. H. Arrowsmith, A. Allali-Hassani, G. Senisterra, G. A. Wasney, Biophysical characterization of recombinant proteins: A key to higherstructural genomics success. // J. Struct. Biol. -2010. doi:10.1016/j.jsb.2010.05.005.

62. W. Tang, Z.Y. Sun, R. Pannell, V. Gurewich, J.N. Liu An efficient system for production of recombinant urokinase-type plasminogen activator // Protein Expr. Purif. -1997.-V. 11.-P. 279-283.

63. S. Shi, J. Xue, K. Fan, G. Kou, H. Wang, Y. Guo, Preparation and characterization of recombinant protein ScFv(CD 11 c)-TRP2 for tumor therapy from inclusion bodies in Escherichia coli II Protein Expr. Purif. -2007. -V. 52. -P. 131-138.

64. H. Chen, Z. Xu, N. Xu, P. Cen, Effcient production of a soluble fusion protein containing human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system // J. Biotechnol. -2005.-V. 115.-P. 307-315.

65. J. Arnau, C. Lauritzen, G. E. Petersen, J. Pedersen, Current strategies for the use of affnity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. // Protein Expr. Purif. -2006. -V. 48. -P. 1-13.

66. K. Terpe, Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003. -V. 60. -P. 523-33.

67. A. Malhotra, Tagging for Protein Expression. // Methods Enzymol. -2009. -V. 463. -P. 239-258.

68. J.J. Lichty, J.L. Malecki, H.D. Agnew, DJ. Michelson-Horowitz, S.Tan, Comparison of affinity tags for protein purification. // Protein Expr. Purif. -2005.-V.42.-P. 98-105.

69. C.A. Лопатин, В.П. Варламов, Новые тенденции металлохелат аффинной хроматографии белков. // Прикл. Биохим. Микробиолог. -1995. -Т. 31. -С. 259-266.

70. V.M. Bolanos-Garcia, O.R. Davies, Structural analysis and classification of native proteins from E. Coli, commonly co-purified by immobilized affinity chromatography. // Biochim. Biophys. Acta -2006. -V. 1760. -P. 1304-1313.

71. И.Ю. Волков, H.A. Лунина, Г.А. Велиководская, Перспективы практического применения субстратсвязывающих модулей гликозилгидролаз. // Прикл. Биохим. Микробиол. -2004. -Т. 40. -С.499-504.

72. М.Р. Bernard, D. Cao, R.V. Myers, W.R. Moyle, Tight attachement of chitin-binding-domain-tagged proteins to surfaces coated with acetylated chitosan. // Anal. Biochem. -2003. -V. 327. -P. 278-283.

73. S.S. Sharma, S. Chong, S.W. Harcum, Intein-mediated protein purification of fusion proteins expressed under high-cell density conditions in E. coli. // J. Biotechnol. -2006. -V. 125. -P. 48-56.

74. C.-J. Chiang, J.-Y. Wang, Р.-Т. Chen, Y.-P. Chao, Enhanced levan production using chitin-binding domain fused levansucrase immobilized on chitin beads. // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2009. -V. 82 -P. 445-451.

75. J.-T. Chern, Y.-P. Chao, Chitin-binding domain based immobilization of d-hydantoinase. //J. Biotechnol. -2005. -V. 117. -P. 267-275.

76. P.-M. Kao, C.-I. Chen, S.-C. Huang, K.-M. Lin, Y.-C. Chang, Y.-Ch. Liu, Preparation of fermentation-processed chitin and its application in chitinase affinity adsorption. // Process Biochem. -2009. -V. 44 -P. 343-348.

77. B. Krajewska, Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. // Enzyme Microb. Technol. -2004. -V. 35. -P. 126-139.

78. Ильина A.B. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловеридин Г20х/ А.В. Ильина, Ю. В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. -2002. -Т. 38. -С.132-135

79. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М. Химия. -1981. - 284с.

80. М. Azarkan, J. Huet, D. Baeyens-Volant, Y. Looze, G. Vandenbussche, Affinity chromatography: A useful tool in proteomics studies. // J. Chromatogr. В -2007.-V. 849.-P. 81-90.

81. R. Hahn, R. Schlegel, A. Jungbauer, Comparison of protein A affinity sorbents. // J. Chromatogr. В -2003. -V. 790. -P. 35-51.

82. C. Madeira, M.E. Freitas, C. Vargas-Lopes, H. Wolosker, R. Panizzutti, Increased brain d-amino acid oxidase (DAAO) activity in schizophrenia. // Schizophr. Res. -2008. -V. 101. -P. 76-83.

83. M. P. Boks, T. Rietkerk, M. H. van de Beek, I. E. Sommer, T.J. de Koning, R.S. Kahn, Reviewing the role of the genes G72 and DAAO in glutamate neurotransmission in schizophrenia. // Eur. Neuropsychopharmacol. -2007. -V. 17.-P. 567-572.

84. M. S. Chiou, H. Y. Li, Adsorption behavior of reactive dye in aqueous solution on chemical cross-linked chitosan beads. // Chemosphere -2003. —V. 50, -P. 1095-1105.

85. Q. Yang, F. Dou, B. Liang, Q. Shen, Studies of cross-linking reaction on chitosan fiber with glyoxal. // Carbohydr. Polym. -2005. -V. 59. -P. 205-210.