Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование способов получения полиплоидов смородины и их хозяйственно-биологические особенности

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование способов получения полиплоидов смородины и их хозяйственно-биологические особенности"

00501862Ь

На правах рукописи

ДУБРОВСКИИ Максим Леонидович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЛОИДОВ СМОРОДИНЫ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Специальность 06.01.05. - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

2 дпр т

Мичуринск-наукоград РФ - 2012

005018626

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина Россельхо-закадемии.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

академик РАСХН Савельев Николай Иванович

Официальные оппоненты: Бутенко Анатолий Иванович

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ФГБОУ ВПО Мичуринский государственный аграрный университет / кафедра математики и моделирования экономических систем, профессор

Яндовка Людмила Федоровна

кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО Тамбовский государственный университет имени Г.Р. Державина / кафедра биологии, микробиологии и гигиены, доцент

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт садоводства им. И.В. Мичурина

Защита диссертации состоится 27 апреля 2012 г. в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 220.041.01 при Мичуринском государственном аграрном университете по адресу: 393760, Тамбовская обл., г. Мичуринск, ул. Интернациональная, 101. Тел./факс (47545) 5-32-13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МичГАУ, с авторефератом - на сайте университета http://www.mgau.ru, а также на сайте Высшей аттестационной комиссии Министерства образования и науки РФ http://www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан 25 марта 2012 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 220.041.01 кандидат сельскохозяйственных наук

Н.М. Соломатин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важнейшей задачей селекции при получении сортов с комплексом ценных хозяйственно-биологических признаков является создание генетически разнообразного исходного материала для дальнейшего отбора, гибридизации и выделения лучших генотипов.

Одним из методов селекции является экспериментальная полиплоидия, вызывающая у растений глубокие и разносторонние изменения в действии генов, проявлении признаков и свойств, способствуя расширению формообразовательного процесса и появлению новых генотипов. Применение в селекционной работе у смородины полиплоидии может внести вклад в совершенствование ее сортимента. Ряд хозяйственно-ценных признаков, на которые отбор на диплоидном уровне проводился неэффективно, при переходе генотипов на новый уровень плоидности могут проявиться в большей степени.

В связи с этим возникает необходимость оптимизации способов получения полиплоидов смородины и их изучения по комплексу хозяйственно-биологических особенностей с целью выделения источников ценных признаков, рекомендуемых для дальнейшего селекционного использования.

Цель и задачи исследований. Цель работы - совершенствование способов получения полиплоидов смородины, хозяйственно-биологическая оценка генотипов увеличенного уровня плоидности и выделение среди них источников ценных признаков для дальнейшего селекционного использования.

Задачи исследований:

• изучить особенности индукции митотической и мейотической полиплои-дизации у сортов смородины черной и красной при использовании химических соединений-амитотиков и оценить эффективность их применения;

• изучить особенности кариотипа у исследуемых авто- и аллотетраплоидов смородины;

• изучить в сравнительном аспекте по признаку уровня плоидности морфо-анатомические, физиологические и биохимические особенности авто- и ал-лотетраплоидных форм смородины;

• изучить морфофизиологическое качество пыльцы и выявить цитогенети-ческие особенности протекания процесса мейоза при микроспорогенезе у исследуемых генотипов разного уровня плоидности;

• изучить потенциал устойчивости изучаемых полиплоидных генотипов к абиотическим факторам (устойчивость к низким температурам в середине зимы, жаростойкость, засухоустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к катионам тяжелых металлов) и их продуктивность;

• дать экономическую оценку применяемых методов индукции полиплои-дизации у смородины;

• выделить авто и аллотетраплоидые формы смородины, рекомендуемые для использования в селекции в качестве источников ценных хозяйственно-биологических признаков.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Морфо-анатомические и цитогенетические особенности авто- и алло-полиплоидов смородины, созданных с применением 0,04%-ного раствора аце-нафтена в 1%-ном диметилсульфоксиде и 1%-ного водного раствора колхицина.

2. Потенциал устойчивости генотипов смородины с разным уровнем пло-идности к низким температурам, жаро- и засухоустойчивости, солевыносливо-сти, удельной фотосинтетической активности и продуктивности.

3. Генисточники высокой устойчивости к абиотическим стрессорам, продуктивности и ценного биохимического состава.

Научная новизна. Выявлено полиплоидизирующее действие растворов аценафтена в водном диметилсульфоксиде. Установлены цитогенетические особенности мужского гаметофита, а также морфо-анатомические показатели у авто- и аллотетраплоидов. Выявлен потенциал их устойчивости по зимостойкости, солевыносливости, жаро- и засухоустойчивости, и по этим показателям тетраплоидные аналоги не уступают диплоидным генотипам. Установлено негативное влияние абиотических стрессоров на функционирование фотосинтетического аппарата и снижение активности фотосистем I и II. Выделены тетраплоидные генотипы с крупными плодами и высоким содержанием антоцианов, витамина С, Сахаров.

Практическая значимость работы. Предложен метод обработки вегетативных и генеративных почек раствором аценафтена в диметилсульфоксиде для получения полиплоидных побегов и нередуцированной пыльцы. Выделен авто-тетраплоид смородины американской как источник нередуцированных гамет. Для селекции рекомендованы источники ценных хозяйственно-биологических признаков - высокой устойчивости к низким температурам, жаро- и засухоустойчивости, солевыносливости, ценного биохимического состава ягод.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 61-й научно-практической конференции студентов и аспирантов «Современная школа в инновационном процессе: проблемы и перспективы» (Мичуринск, МГПИ, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы» (Саратов, 2009); VI, VII и VIII Международных научных конференциях «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2009, 2010, 2011); международной научно-практической конференции «XXII Мичуринские чтения», посвященной 155-летию со дня рождения И.В. Мичурина (Мичуринск, 2010); международной научно-практической конференции «Новации в горном и предгорном садоводстве», посвященной 80-летию со дня рождения А.К. Каирова (Нальчик, 2011); а также на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина (2008-2011 гг.).

Публикации материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 из них в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 184 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, выводов, ре-

комендаций для селекции, содержит 19 таблиц и 76 рисунков. Список использованной литературы включает 249 источников, из них 55 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Условия, объекты и методика проведения исследований. Работа выполнена в ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии за период с 2008 по 2011 год. Опытные участки института расположены на окраине г. Мичуринска Тамбовской области. Почва на участке, где проводилась работа, представлена мощным выщелочным среднесуглинистым черноземом.

Климат района исследований умеренно континентальный. Месячные температуры с мая по сентябрь за каждый из трех лет превышали соответствующие среднемесячные нормы по итогам многолетних наблюдений. Самый жаркий летний период зафиксирован в 2010 году - температура июня превысила среднегодовую месячную норму в 1,2 раза, июля и августа — в 1,4 раза. В зимний период за три года поведения исследований критического понижения температур не отмечено.

Годовая сумма осадков за каждый из трех лет проводимых исследований была ниже многолетнего среднегодового значения: в 2009 г. - в 0,12 раза, в 2010 г. - в 0,42 раза, в 2011 г. - в 0,17 раза. Летом 2010 года отмечена сильная засуха с понижением влажности воздуха до 48%. Лето 2011 года характеризовалось резкой сменой среднемесячного количества осадков - при засушливом июне с пятикратным снижением количества осадков относительно средней многолетней нормы в этот период, в июле и августе зафиксировано увеличение уровня осадков относительно нормы в 1,6 и 2,2 раза соответственно

Объектами исследования для экспериментальной индукции полиплоидии являлись укорененные черенки и взрослые растения смородины черной сортов Лира, Орловская серенада, Перун, Черный жемчуг, Экзотика и смородины красной - Acopa, Вика, Голландская красная. Схема посадки 1 х 3 м, черенков -0,15 X 0,9 м, агротехника стандартная. При изучении влияния уровня плоидно-сти на проявление комплекса хозяйственно ценных признаков объектами исследования служили имеющиеся в коллекции института три диплоидные (2п=2х=16) и три константные автотетраплоидные (2п=4х=32) формы смородины американской (R. americanum Mill.) селекции Н.П. Чувашиной, по одной радиорезистентной мутантной форме смородины американской - диплоид 21-рм2 и тетраплоид 21-рм4; исходный диплоид смородины красной сорта Голландская красная (R rubrum L. * R. petraeum Wulf.) и его тетраплоидный аналог селекции Г.П. Шелаботина, а также два аллотетраплоида (2п=4х=32) - немецкий сорт Йошта (R. nigrum L. х R. divaricatum Douglas х R. uva-crispa L.) и форма СКГ 5-4 (сеянец от свободного опыления аллотетраплоидов селекции Э. Кип).

Цитологические исследования проводили с помощью микроскопов МБИ-15 и Karl Zeiss Jenamed, окуляр-микрометра MOB-1-15. Протекание микроспо-рогенеза изучали на давленых ацетогематоксилиновых препаратах по методике Л.А. Топильской, C.B. Лучниковой, Н.П. Чувашиной (1976). Фертильность пыльцы определяли ацетокарминовым методом (Паушева, 1974), жизнеспособ-

ность пыльцы - по методу Д.А. Транковского путем проращивания при t=+25°C на искусственной питательной среде, состоявшей из 1% агар-агара, 15% сахарозы и 0,001% борной кислоты (Паушева, 1974).

Изучение зимостойкости полиплоидных генотипов смородины проводили согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной оценке зимостойкости плодовых культур» (Тюрина, Гоголева, 1978). Оценку засухоустойчивости и жаростойкости тканей листа форм смородины разного уровня плоидности осуществляли по методике П.Н. Еремеева (1965) с модификацией В.Г. Леонченко (2001). Устойчивость к хлоридно-сульфатному засолению и солям тяжелых металлов оценивали по методике В.Г. Леонченко с сотрудниками (2007).

Изучение токсического действия амитотиков и влияния абиотических стресс-факторов на фотосинтезирующие ткани листовых пластинок диплоидов и тетраплоидов смородины проводили методами амплитудно-импульсной модуляции - РАМ (Pulse Amplitude Modulation) и лазерного анализа тканей - ЛАТ (Будаговский, 2008). Для этого использовали портативные приборы, измеряющие кинетику индукции флуоресценции хлорофилла - импульсный хлорофилл-флуориметр РАМ-Junior (Heinz Walz GmbH., Германия) и ЛАТ-2К (Россия). Измерения проводили после 10-минутной адаптации исследуемых листьев в темноте для наиболее полного открытия реакционных центров в хлоропластах.

Оценку концентрации пигментов в тканях листа и биохимического состава ягод проводили совместно с лабораторией физиологии и биохимии ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии - со старшим научным сотрудником Е.В. Жбановой и техником А.В. Хожайновым.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью методов математической статистики (Доспехов, 1985); построение диаграмм и вариационных кривых осуществляли в программной среде Microsoft Excel 2003 из пакета Microsoft Office.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Совершенствование способов получения полиплоидов смородины

1.1. Оценка цитотоксического действия полиплоидизирующих соединений

Отмечен цитотоксический эффект растворов полиплоидизирующих соединений (колхицина, пара-дихлорбензола, хлоралгидрата). Методом индукции флуоресценции хлорофилла зафиксирована картина химического стресса как ответная реакция фотосинтезирующих тканей листа на длительное действие токсичных амитотиков. Стадия мобилизации, регистрируемая в виде локального минимума, происходит в клетках через 24-48ч с начала обработки; во время стадии резистентности (через 48-72 ч) отмечено временное восстановление функционирования фотосинтетического аппарата. В заключительной стадии в вариантах с низкими концентрациями амитотиков происходит частичное восстановление фотосинтетической активности клеток, а при высоких концентрациях отмечено сильное ингибирование фотосинтеза и всего процесса жизнедеятельности тканей, вплоть до наступающей некротизации (рис. 1,а). В сравнении

с токсичными растворами амитотиков, установлено меньшее влияние паров аценафтена и его 0,02-0,04%-ных растворов в водном диметилсульфоксиде (ДМСО) на функционирование фотосинтетического аппарата и активность фотосистем I и II при уменьшении степени некротизации клеток фотосинтези-рующих тканей смородины черной и красной (рис. 1,6).

£ 0,9 8 0,8-

. а о,в-

I | 0,5 -5 2 0,4

Ч! £

* с о,з

в

I 0,2

| 0,1 -| в 0

24 48 72

Экспозиция, ч

—«— Контроль (вода) -0—Колхицин - 0,05% р-р —Колхицин - 0,1% р-р • ©--Колхицин-0,2% р-р -Ж- - - Колхицин - 0,5% р-р -о— Колхицин -1,0% р-р

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 -0,4 -0,3 0,2 0.1 -. 0

24 48 72 Экспозиция, ч

—«— Контроль (вода)

--В- - Аценафген в 1%-ном ДМСО - 0,02% р-р

—й— Аценафген в 1 %-ном ДМСО - 0,04% р-р

- -Х- - - ДМСО-1,0% р-р

Рис. 1. Влияние водных растворов колхицина (а) и аценафтена в ДМСО (б) на фотосинтетический аппарат смородины черной сорта Лира при анализе медленной фазы индукции флуоресценции хлорофилла.

Предварительное изучение динамики и характера проникновения растворов с действующим веществом на примере витального красителя фастгрюна в ткани стебля и почек смородины позволило отметить, что максимальная степень насыщения клеток красителем в зоне меристематически активного конуса нарастания происходит при замачивании черенков смородины в растворе в течение 24-36 ч, а также при двукратной инъекции в распускающиеся почки.

1.2. Оптимизация получения побегов увеличенного уровня плоидности

Основным полиплоидизирующим соединением, используемым для удвоения хромосом у многих растений, является колхицин - алкалоид растительного происхождения с повышенной токсичностью и высокой стоимостью препарата химической чистоты. В качестве альтернативы колхицину изучено дей-

ствие аценафтена в разных агрегатных состояниях (пары при возгонке кристаллического аценафтена; насыщенный раствор аценафтена в касторовом масле; 0,04%-ный раствор аценафтена в 1%-ном водном ДМСО) и водных растворов хлоралгидрата, пара-дихлорбензола и клопиралида.

Отмечена низкая эффективность действия паров аценафтена на меристемы верхушечных точек роста и высокая степень хлорозов распускающихся листьев с их последующей некротизаций на уровне 14-73%. При данном типе обработки измененных побегов смородины не выявлено.

При обработке вегетативных почек смородины черной и красной насыщенным (5%-ным) раствором аценафтена в касторовом масле, зафиксировано длительное действие смеси, сохраняющейся в области меристем точек роста в течение 8-12 суток. При данной способе обработки отмечено образование 1223% морфологически измененных побегов замедленного роста с выявленными различиями их цитоанатомического строения. Действие на распускающиеся почки смородины 3%-ного раствора аценафтена в касторовом масле аналогично, но выход измененных побегов ниже в 0,8-2,2 раза. На листьях, образовавшихся после обработки меристем масляными растворами аценафтена, отмечены хлорозные участки, деформации лопастей и края листовой пластинки, однако гибели новых побегов не выявлено.

Положительный эффект блокирования кариокинеза и удвоения хромосом в соматических клетках смородины черной и красной отмечен для 0,04%-ного раствора аценафтена в универсальном органическом растворителе диметил-сульфоксиде (ДМСО); при образовании измененных побегов на уровне 4,816,5% не выявлено хлороза тканей, некротизации листьев не отмечено. При увеличении кратности обработок меристем данным раствором гибель побегов не происходит из-за его малой токсичности.

При инъекции в вегетативные почки укорененных черенков смородины черной и красной водных растворов хлоралгидрата (2%-ного), парадихлорбен-зола (1%-ного) и клопиралида (3,0-10"6%-ного) отмечена гибель части почек на уровне 9-62%, после высадки обработанных черенков в грунт измененных побегов не выявлено.

Таким образом, в качестве альтернативы токсичным растворам колхицина высокой стоимости для обработок меристематических участков у смородины можно рекомендовать насыщенный (5%-ным) раствор аценафтена в касторовом масле и 0,04%-ный раствор аценафтена в 1%-ном водном ДМСО, допускающих повторные обработки почек без гибели растительных тканей.

1.3. Повышение выхода нередуцированной пыльцы при мейотической полиплоидизации смородины

При скрещивании для изменения уровня плоидности у гибридных растений в селекции используют такой прием, как опыление нередуцированной пыльцой (Седышева, Седов, 1994; Седов, Седышева, Серова, 2008). Данная задача значительно упрощается, если среди исходных родительских форм имеются полиплоидные растения, образующих пыльцу повышенного уровня плоидности по сравнению с гаплоидной пыльцой диплоидных растений (Бреславец,

1963). Однако предварительное получение цитологически стабильных полиплоидных форм требует большого количества времени, и при отсутствии таких растений для гибридизации можно использовать нередуцированную пыльцу диплоидных растений, что позволяет ускорить получение генотипов с увеличенным уровнем плоидности (Джигадло, Седышева, Джигадло, 2008; Седов, Седышева, Серова, 2008).

В норме пыльца диплоидных растений смородины красной сорта Голландская красная имеет диаметр 29,1±0,08 мкм, у тетраплоида - 35,4±0,12 мкм. У диплоида сорта при обработке амитотиками генеративных почек в предмейо-тический период отмечено увеличение диапазона варьирования размера образующихся пыльцевых зерен - с 8 мкм в контроле до 17 мкм в вариантах с 1,0%-ным раствором колхицина и 0,04%-ным раствором аценафтена в 1%-ном ДМСО (табл. 1).

Таблица 1. Влияние вида и концентрации амитотика на диаметр пыльцевых зерен диплоида смородины красной сорта Голландская красная

№ п/п Варианты опыта Диаметр пыльцевого зерна

М±т, мкм % к контр. Мт - шах, а2

мкм Д

1. Контроль 28,01±0,11 — 23-31 8 2,42

2. Колхицин, водный раствор, % 0,05 26,21±0,15 -6,43 20-30 10 4,45

3. ОД 27,75±0,14 -0,93 23-32 9 2,48

4. 0,2 27,25±0,13 -2,71 22-33 11 4,19

5. 0,5 28,08±0,12 +0,25 22-34 12 4,05

6. 1,0 28,99±0,18* +3,50 20-37 17 6,38

7. Аценафтен, пары, г кристаллов/дм3 воздуха 0,2 28,57±0,10 +2,00 24-32 8 2,32

8. 0,5 27,14±0,12 -3,11 23-31 8 3,33

9. 1,0 25,48±0,13 -9,03 21-30 9 3,38

10. 2,0 25,74±0,13 -8,10 20-30 10 3,74

11. Аценафтен (р-р) в 1%-ном ДМСО, % 0,02 29,26±0,14* +4,46 22-36 14 5,57

12. 0,04 30,97±0,22* +10,57 23-40 17 9,83

13. Хлоралгидрат, водный р-р, % 1,0 28,19±0,12 +0,64 23-34 11 3,72

14. 2,0 27,75±0,16 -0,93 22-33 11 4,62

15. П-дихлорбензол, водный р-р, % 0,5 27,16±0,17 -3,03 20-34 14 6,95

16. 1,0 28,83±0,14* +2,93 23-35 12 4,17

17. Клопиралид, водный р-р, % 0,3 -10"6 27,64±0,15 -1,32 22-33 11 4,93

18. 1,5-Ю"6 28,24±0,14 +0,82 22-35 13 4,99

19. 3,0-10"6 25,92±0,14 -7,46 21-32 11 5,02

* различия с контролем достоверны при Р>0,95.

Наибольшее увеличение среднего диаметра пыльцевого зерна отмечено в вариантах с обработкой 1,0%-ными водными растворами колхицина и пара-дихлорбензола - на 3,5% и 3,0% соответственно по сравнению с контролем, а также в вариантах с 0,02%-ным и 0,04%-ным растворами аценафтена в 1%-ном ДМСО - на 4,5% и 10,6% соответственно (рис. 2). В данных вариантах отмечено увеличение как диапазона крайних значений размеров пыльцы (в том числе и максимумов), так и дисперсии среднего значения признака, что может слу-

жить диагностическим признаком образования части анеуплоидных и нередуцированных пыльцевых зерен. В остальных вариантах опыта отмечено уменьшение диаметра пыльцы по сравнению с контролем на 0,9-9,0%, что происходит при образовании в мейозе микроядер и дальнейшим формировании мелких пыльцевых зерен с анеуплоидным набором хромосом.

50-, 45 -40 -35* 30 -I 25-

§ 20-х

15 -10 -5 ■ 0

18

Рис. 2. Влияние обработки спорогенной ткани пыльников водными растворами колхицина (д) и растворами аценафтена в ДМСО (б) на вариабельность диаметра пыльцевых зерен у диплоида сорта Голландская красная.

Подобные тенденции при использовании полиплоидизирующих соединений выявлены также у сортов смородины черной Лира, Перун, Черный жемчуг. Наибольший выход нередуцированной пыльцы был отмечен у них при обработке почек в предмейотический период 1%-ным водным раствором колхицина и 0,04%-ным раствором аценафтена в ДМСО (рис. 3).

а б

Рис. 3. Влияние обработки спорогенной ткани пыльников смородины черной сортов Лира (а) и Черный жемчуг (б) растворами колхицина и аценафтена.

Нередуцированные пыльцевые зерна образуются из диад и триад, формирующихся при нерасхождении хромосом к полюсам в анафазах I и II делений мейоза. Цитологический анализ тетрадогенеза у исследуемых сортов смородины красной и черной показал, что обработка растворами амитотиков почек с генеративными структурами в предмейотический период увеличивает образование диад и триад в 2,6-5,7 раза (рис. 4). Жизнеспособность полученной пыльцы в разных вариантах опыта отмечена на уровне 9^14%, в контроле 31—42%.

— Контроль

- Колхицин - 0,05% р-р Колзмцин - 0,1% р-р Колхицин - 0,2% р-р Колхицин - 0,5% р-р Кол»1цин -1,0% р-р

26 30 34

Диаметр пыльцевого зерна, мкм

-Контроль

- 0,02% р-р аценафтена в 1%-ном ДМСО -0,04% р-р аценафтена в 1%-ном ДМСО

Диаметр пыльцевого зерна, мкм

20

5 16

е- 12

э 8

а

4

С] Контроль □ 1,0% водный р-р колхицина в 0,04% р-р аценафгена в ДМСО

Голландская красная

Лира

Черный жемчуг

Рис. 4, Влияние обработки спорогенной ткани пыльников смородины полиплоидизи-рующими веществами на образование диад и триад в тетрадогенезе.

Таким образом, при мейотической полиплоидизации отмечена высокая эффективность 0,04%-ного раствора аценафтена в диметилсульфоксиде, что позволяет рекомендовать его для получения нередуцированной пыльцы у смородины.

2. Морфо-анатомические особенности диплоидов и тетраплоидов смородины

Отмечены достоверные различия между диплоидными и тетраплоидными генотипами смородины по комплексу морфо-анатомических и цитологических количественных признаков (табл. 2).

Таблица 2. Влияние уровня плоидности на морфоанатомические и цитологические признаки у совокупности генотипов смородины американской

Признак, уровень плоидности Значения признака Дисперсия, а2 Коэффициент вариации, О, %

М±т Отн. 4х/2х Мт - тах *

Абс. знач. 1 Д

Листовой индекс (отношение ширины к длине листовой пластинки)

2х 1,04 ±0,01 1,11 1,01-1,08 0,07 0,0009 5,14-9,46

4х 1.15 ±0,01 1,12-1,16 0,04 0,0004 3,97-7,25

Угол между боковыми лопастями листовой пластинки, град.

2х 91,56 ±0,84 1,24 88,55-94,15 5,60 2,29 4,73-12,38

4х 113,12 ± 1,76 111,06-114,65 3,59 5,35 7,47-19,85

Длина замыкающих клеток устьиц, мкм

2х 21,87 ±0,11 1,42 21,76-21,98 0,22 0,02 2,16-4,47

4х 30,97 ± 0,62 29,11-31.66 2,55 1,54 4,63 - 9,82

Ширина замыкающих клеток устьиц, мкм

2х 7.62 ±0,12 1,43 7,29-7,94 0,65 0,05 2,94-5,73

4х 10,88 ±0,32 10,54-11,04 0,50 0,22 5,82 - 12,65

Количество устьиц в 1 мм2 эпидермиса, шт.

2х 86,64 ± 3,20 1,46 81,44-91,84 10,40 9,08 4,16-9,21

4х 59,23 ±2,12 56,00-61,20 5,20 5,04 3,95 - 7,44

Диаметр пыльцевого зерна, мкм

2х 23,18 ±0,31 1,26 22,59-23,98 1,39 2,38 5,16-12,17

4х 29,27 ± 2,01 26,48-35,13 8,65 16,17 8,53-18,36

Количество ростовых пор на экзине пыльцевого зерна, шт.

2х 8,18 ±0,15 1,54 7,45-8,51 1,06 0,15 2,46-4,83

4х 12,57 ± 0,29 12,17-13,10 0,93 0,25 4,19-7,61

Примечание: * - приведен диапазон не генеральной совокупности значений признака у всех генотипов, а его средней величины у изучаемых диплоидных и тетраплоидных форм.

Между морфологическими признаками листовой пластинки (листовым индексом и углом между боковыми лопастями) установлены высокие положительные корреляционные зависимости - у диплоидных и тетрагагоидных генотипов смородины американской на уровне +0,84...+0,93; смородины красной -в интервале + 0,87...+0,94. Между длиной и шириной замыкающих клеток устьиц по всем генотипам отмечены высокие положительные корреляции +0,95... +0,98; между размерами устьиц и их количеством в эпидермисе - обратная зависимость на уровне т2= -0,91...-0,96, что связано с сохранением площади общей транспирационной поверхности листа при изменении уровня плоидности. Между диаметром пыльцевых зерен и количеством у них ростовых пор в оболочке также отмечены корреляции высокого уровня в диапазоне +0,86...+0,97.

Выявленные зависимости между морфо-анатомическими и цитологическими признаками диплоидов и тетраплоидов смородины позволяют выборочно использовать для диагностики отдельные показатели, исключив коррелирующие. Для диагностики полиплоидных форм смородины достаточно определить листовой индекс, длину замыкающих клеток устьиц и диаметр пыльцы.

Учет размеров и количества замыкающих клеток устьиц позволяет выявить среди измененных побегов смородины химерные с наличием клеток увеличенного уровня плоидности в эпидермальном слое. В листьях химерных побегов присутствуют устьица разных размеров, при статистической обработке полученных данных это выражается в увеличении дисперсии и коэффициента вариации значений признака в сравнении с более одномерными морфо- и цито-метрическими показателями исходных диплоидных форм.

3. Цитогенетические особенности авто- и аллотетраплоидов смородины и их исходных диплоидных форм

В результате подсчета числа хромосом на временных цитологических микропрепаратах в клетках кончиков корешков установлено наличие 32 хромосом (2п=4х) у всех изучаемых тетраплоидных генотипов смородины.

У авто- и аллотетраплоидов смородины аномалии по отдельным стадиям мейоза в среднем в 3-8 раз превышают показатели соответствующих диплоидов (табл.3).

Основные нарушения мейоза у тетраплоидов сходны во время обоих делений - это выброс хромосом в метафазе (до 54,8%), единичные мосты (до 2,5%) и преждевременное расхождение или отставание (до 57,3%) хромосом в анафазе (рис. 5). Хромосомы, выброшенные в анафазу за пределы веретена деления, превращаются на стадии телофазы в микроядра. Наибольшее количество аномалий в телофазе I и II делений составляют материнские клетки микроспор с одним-двумя микроядрами (до 61,9% всех нарушений на данной стадии), по окончании тетрадогенеза образующие пентады и гексады. У тетраплоидов на всех стадиях мейоза отмечены картины цитомиксиса, при котором происходит случайный обмен цитоплазмой с хромосомами между мейоцитами. Среди изученных видов процент цитомиксиса выше у смородины американской.

Таблица 3. Нарушения в мейозе при микроспорогенезе у дигшоидов, авто- и ал-лотетраплоидов смородины

Форма, уровень плоидности Нарушения по фазам мейоза, %

MI AI TI Mil All TU Тетрадо-генез

Смородина красная, сорт Голландская красная (R. rubrum L. х R. petraeum Wulf.)

2х 7,21 6,76 6,00 9,09 6,25 7,14 6,18

4х 28,30 52,99 37,39 32,00 36,71 37,12 39,52

Смородина американская (R. americanum Mill.)

21-2-1 (2х) 14,29 17,37 16,33 11,85 12,42 9,57 8,74

21-4-1 (4х) 52,17 37,68 40,81 54,39 61,29 62,04 57,27

21-рм2 (2х) 16,08 21,88 18,29 14,90 16,97 14,13 12,61

21-рм4 (4х) 62,84 71.18 65,69 57,49 67,83 65,51 61,21

Аллотетрагшоидные гибриды (R. nigrum L. х G. reclinata Mill.; R. nigrum L. x R. divaricatum Douglas x R. uva-crispa L.)

СКГ 5-4 (4x) 47,78 39,63 42,49 45,08 49,79 55,28 57,21

Йошта (4x) 42,80 37,66 38,23 36,65 42,75 46, 54 51,67

Примечание. Различия между соответствующими диплоидными и тетраплоидными формами достоверны при Р>0,99.

I

* *

Рис. 5. Нарушения в мейозе у тетраплоидов (2п=4х=32) смородины: а - асинхронность мейоза в пределах одного пыльцевого гнезда пыльника (анафаза I, тело-фаза II); б - выброс унивалента в метафазе I; в - преждевременное расхождение хромосом в анафазе I; г - хромосомный мост в поздней анафазе I; д - образование микроядер в телофазе I; е - образование микроядер в телофазе И; ж - цитомиксис между мейоцитами в телофазе П.

Следствием описанных нарушений мейоза является формирование аномальных спорад с числом микроспор больше или меньше четырех в норме. У тетраплоидов отмечены спорады с 2-9 микроспорами, у диплоидов - с 2-7. Распадаясь, они дают несбалансированные по числу хромосом микроспоры. У всех

изученных диплоидов смородины общее количество аномальных спорад не превышает 12%. Среди спорад с нарушениями у тетраплоидов преобладают пентады и гексады. У мутантной формы 21-рм4 (2п=4х) смородины американской выявлена высокая способность к формированию диад (2,7%) и триад (6,4%), являющихся источниками нередуцированной пыльцы повышенного уровня плоидности (4х).

Несмотря на отмеченные нарушения при микроспорогенезе, у тетраплоидов смородины образуется не менее 40% нормальных тетрад, дающих полноценно сформированные пыльцевые зерна с нормальным хромосомным составом. Фертильность пыльцы при ее окрашивании ацетокармином у тетраплоидов смородины американской составляет 62,5-72,7%; красной - 97,3%; смородино-крыжовниковых аллотетраплоидов - 74,3-81,5%. Наиболее высокая жизнеспособность пыльцы при ее проращивании на питательной среде отмечена у тетра-плоида сорта Голландская красная (29,0%) и аллотетраплоидов Йошта, СКГ 5-4 (29,2% и 25,6% соответственно), что позволяет использовать данные генотипы в качестве родительских форм при гибридизации и для получения генотипов с разным уровнем плоидности.

4. Потенциал устойчивости авто- и аллополиплоидов смородины к абиотическим факторам и их продуктивность

4.1. Устойчивость к низким температурам в середине зимы

У всех изученных авто- и аллотетраплоидов смородины отмечена высокая устойчивость к понижению температур в середине зимы до - 40 °С с обратимыми повреждениями тканей до 1,5 баллов. Наименьшие повреждения ксилемы и почек в условиях искусственного промораживания отмечены у аналога сорта Голландская красная (2п=4х).

Аллотетраплоиды Йошта, СКГ 5-4 характеризуются высоким уровнем устойчивости к понижению температуры до -35 °С при подмерзании тканей до 1,0 балла.

4.2. Жаростойкость и засухоустойчивость

Действие экстремальных высоких температур и дефицита влаги в первую очередь затрагивает физиологическое состояние фотосинтезирующих тканей -активность работы хлоропластов и водный баланс клеток.

В норме у всех изучаемых авто- и аллотетраплоидных форм отмечен высокий уровень удельной фотосинтетической активности, определяемой по изменению флуоресценции хлорофилла в быстрой (в диапазоне 0,81-0,85) и медленной (0,71-0,82) фазах кривой Каутского. Достоверных различий по уровню флуоресценции хлорофилла при нормальных условиях у диплоидных и тетрап-лоидных генотипов смородины не выявлено.

У всех исследуемых тетраплоидных форм смородины в нормальных условиях произрастания отмечено достоверно увеличение концентрации пигментов в тканях листовой пластинки (хлорофиллов а и Ь, а также суммы кароти-

ноидов) - у тетраплоидов смородины американской выше уровня исходных ди-плоидов в 1,10-1,37 раза; смородины красной - в 1,14-1,46 раза. Среди всех генотипов установлены высокие положительные корреляции между содержанием пигментов в листьях - между хлорофиллами а и Ь +0,97, хлорофиллом а и суммой каротиноидов +0,88, содержанием хлорофилла Ь и каротиноидов +0,83. Это свидетельствует о сохранении соотношения концентраций пигментов в растительных тканях смородины при изменении уровня плоидности растений.

Выявлены генотипические различия по интенсивности транспирации между формами разных видов и уровней плоидности. Так, у тетраплоидов смородины американской испарение влаги в нормальных условиях в 1,38-1,55 раза выше исходных диплоидов - соответственно 0,22-0,25 г/дм2-ч против 0,140,18 г/дм2-ч. У диплоидных и тетраплоидных растений смородины красной сорта Голландская красная достоверных различий величины интенсивности транспирации не обнаружено, расходование воды на испарение данными генотипами снижено до уровня 0,15-0,16 г/дм2-ч. В целом, у всех тетраплоидных форм смородины американской и красной отмечено существенно более экономичное расходование воды на транспирацию (в 3,7-5,3 раза) в сравнении с диплоидными сортами смородины черной, что коррелирует с их уровнем жаро- и засухо-I устойчивости.

В результате изучения водоудерживающей способности и степени восстановления оводненности в моделируемых условиях обезвоживания и перегрева (+50°С) выделены тетраплоидный аналог сорта Голландская красная, ал-лотетраплоиды Йошта, СКГ 5-4, сочетающие в своем генотипе высокие уровни засухо- и жаростойкости с восстановлением водного баланса тканей до исходного уровня и выше (рис. 6, 7).

Рис. 6. Водоудерживающая способность и степень восстановления оводненности листьев диплоидов и тетраплоидов смородины при тепловом шоке.

□ Потеря воды после теплового шока +50 С(0,5ч) и подсушивания (4ч) 0 Степень восстановления оводненнности после насьифния (1 ч)

С КГ 5-4

Смородина красная

Гол.кр.

(2х)

20

Рис. 7. Водоудерживающая способность и степень восстановления оводненности листьев диплоидов и тетраплоидов смородины при моделировании условий засухи.

Наибольшая степень устойчивости фотосинтетического аппарата к инги-бированию при действии высоких температур отмечена у тетраплоида сорта Голландская красная - после получасового теплового шока удельная фотосинтетическая активность (УФА) снизилась на 14,5% от исходного уровня. Алло-тетраплоидные гибриды Йошта и СКГ 5-4 оказались более устойчивы к действию повышенной температуры, чем диплоидные сорта смородины черной и крыжовника — после получасового теплового шока снижение показателя УФА от исходного уровня отмечено: у Йошты - на 24,1%; у СКГ 5-4 - на 29,4%; у сортов смородины черной (2п=2х) - на 33-77%; крыжовника (2п=2х) - на 4252%.

Отмечена высокая устойчивость аллотетраплоидов Йошта, СКГ 5-4 к фо-тоингибированию в процессе подвядания листа - за 4 ч снижение удельной фотосинтетической активности составило соответственно 1,4 и 4,8% от исходного состояния. У смородины американской наименьшее ингибирование фотохимических процессов при моделировании засухи отмечено у тетраплоида 21-4-1, составившее через 4 ч подвядания 4,8%; после 15-часового оводнения - 12,5%. У тетраплоида смородины красной фотоингибирование отмечено на уровне ди-плоида - 5,0% от исходного состояния за 4 ч подвядания; 9,2% спустя 15 ч восстановления оводненности.

При комплексной оценке водоудерживающей способности и состояния фотосинтетического аппарата в качестве источников высокой жаро- и засухоустойчивости выделены тетраплоидный аналог сорта Голландская красная, алло-тетраплоиды Йошта, СКГ 5-4.

4.3. Устойчивость к хлоридно-сульфатному засолению и катионам тяжелых металлов

В условиях возрастающего техногенного воздействия на окружающую среду происходит снижение качества почв за счет накопления токсичных анио-

□ Потеря воды после подсушивания (4ч)

@ Степень восстановления оводненнности после насыщения (1 ч)

нов кислот и катионов тяжелых металлов, что следует учитывать при возделывании различных культур.

Наименьшие некротические повреждения тканей листа от действия хлорид-анионов отмечены у аллотетраплоидов Йошта и СКГ 5-4 (до 2,3 баллов), тетраплоида сорта Голландская красная (2,6 балла) и автотетраплоида 21-рм4 смородины американской (2,7 балла). Наибольшая устойчивость фотосинтетического аппарата к действию хлорид-анионов отмечена у формы 21-рм4 (2п=4х) смородины американской - через 10 суток инкубирования высечек листа в 0,6%-ном растворе №С1 разница удельной фотосинтетической активности с контролем составила всего 15,1%.

Наименьшая степень некротизации тканей от действия сульфат-анионов отмечена у аллотетраплоидов СКГ 5-4 и Йошта (1,6 и 2,0 балла соответственно); тетраплоида сорта Голландская красная (2,0 балла) и тетраплоида смородины американской 21-рм4 (2,4 балла). Наибольшая устойчивость фотосинтетического аппарата к действию 1,2%-ного раствора сульфата натрия выявлена у формы 21-рм4 (2п=4х) смородины американской, у которой отмечено снижение удельной фотосинтетической активности на 26,4 % от уровня контроля.

При комплексной оценке фотоингибирования и некротизации тканей наибольшей устойчивостью к хлоридно-сульфатному засолению обладают тет-раплоид 21-рм4 смородины американской и аналог (2п=4х) сорта Голландская красная.

Отмечена разная степень токсического действия катионов никеля и свинца на листовую пластинку авто- и аллотетраплоидов смородины - никель более токсичен, а меньший эффект катионов свинца обусловлен их слабой подвижностью при попадании в растительные ткани, что согласуется с литературными данными, отмеченными для ряда других культур.

Наибольшей устойчивостью к некротическому поражению тканей катионами никеля на уровне 3,1-3,4 баллов обладают тетраплоид смородины красной и аллотетраплоид СКГ 5-4. Наименьшее влияние на фотосинтетический аппарат катионов никеля в растворе отмечено у аллотетраплоидов Йошта и СКГ 5-4, у которых не выявлено достоверных различий с контролем.

При хроническом действии катионов свинца наименьшие некротические повреждения тканей листа на уровне 1,3 баллов отмечены у формы 21-рм4 (2п=4х) смородины американской. Растворы с катионами свинца не оказывают существенного ингибирования фотосинтетического аппарата тетраплоидов: через 10 суток разница с соответствующими контрольными вариантами составила всего 1,6-11,2%.

При комплексной оценке уровня фотоингибирования и некротизации тканей наибольшей устойчивостью к действию катионов никеля и свинца обладают аллотетраплоиды Йошта и СКГ 5-4.

4.4. Продуктивность

Среди изученных полиплоидных генотипов смородины ягоды завязываются, формируются и достигают фазы зрелости у тетраплоидного аналога сорта

Голландская красная и смородино-крыжовниковых аллотетраплоидов Йошта и СКГ 5-4.

Аллотетраплоиды Йошта, СКГ 5-4 по особенностям плодоношения ближе к сортам крыжовника при средней массе ягоды 1,7-1,9 г и их количестве в редуцированной цветковой кисти 2-3 шт. Завязываемость ягод у аллотетраплоидов при свободном опылении составляет 36-41%.

У тетраплоидного аналога сорта Голландская красная отмечено увеличение на достоверном уровне таких ценных показателей плодоношения, как масса 100 ягод (+ 48%) и диаметр ягоды (+16%) при одинаковом с диплоидом их количестве в кисти (табл. 4).

Таблица 4. Особенности плодоношения диплоидной и тетраплоидной форм смородины красной сорта Голландская красная

Признак Уровень плоидности Отношение 4х/2х

диплоид тетраплоид

Длина цветковой кисти, мм 48,3 ±2,1 81,2 ±5,1 1,68

Количество цветков в кисти, шт. 9,8 ± 0,4 11,9 ±0,6 1,21

Количество ягод в кисти, шт. 5,0 ±0,7 5,3 ± 0,8 1,06

Завязываемость ягод при свободном опылении, % 51,1 ±2,5 44,6 ±3,6 0,87

Масса 100 ягод, г 43,8 ± 1,4 64,7 ±2,3 1,48

Масса 100 семян, г 0,55 ± 0,004 0,73 ±0,013 1,33

Количество семян в одной ягоде, шт. 5,9 ±0,6 2,0 ± 0,3 0,36

Доля массы семян в массе ягоды, % 7,41 2,26 0,30

Диаметр одной ягоды, мм 9,4 ±0,3 10,9 ±0,5 1,16

4.5. Биохимический состав ягод

Установлено, что ягоды тетраплоида сорта Голландская красная превосходят показатели диплоидного сорта - по содержанию дисахаридов на 60%; витамина С на 24%; сахаро-кислотному индексу на 19%. Одним из наиболее ценных отличий ягод тетраплоидного аналога является увеличение в 2,3 раза концентрации антоцианов (63,8 против 27,5 мг/100г), являющихся природными ан-тиоксидантами. Сочетание ценного биохимического состава ягод у тетраплоида сорта Голландская красная и его высокой устойчивости к негативным абиотическим факторам позволяет рекомендовать данный генотип для широкого использования в селекционной работе.

Отмечено, что по содержанию в ягодах биологически активных веществ аллотетраплоид СКГ-5-4 занимает промежуточное положение между диплоидными сортами смородины черной и крыжовника — по количеству растворимых сухих веществ на уровне 15,3% соответствует лучшим по этому показателю изученным сортам обеих культур; по содержанию витамина С (68,9 мг/100г) уступает смородине черной в среднем в 2,2 раза, но в 1,6-4,1 раза превосходит сорта крыжовника. По содержанию катехинов (470 мг/100г) аллотетраплоид

СКГ 5-4 не уступает многим изученным сортам смородины черной и превосходит большинство сортов крыжовника, а по содержанию антоцианов (138,6 мг/100г) ближе к сортам крыжовника, имеющим в зрелом состоянии темноокрашенные ягоды.

5. Экономическая эффективность

Определение экономической эффективности является важной задачей при проведении научных исследований, т.к. она позволяет в денежной форме определить перспективы применения изучаемых способов полиплоидизации растительных тканей и рекомендовать лучшие из них для научно-практического использования.

Расчет стоимости рабочих растворов амитотиков проводили исходя из цен на необходимые реактивы химической чистоты по состоянию на декабрь 2011 г.

Применение 0,04%-ного раствора аценафтена в 1%-ном диметилсульфок-сиде (ДМСО) при обработке черенков смородины дает возможность экономии средств в 183 раза по сравнению с использованием 0,05%-ного водного раствора колхицина, близкого по эффективности воздействия на растительные ткани (табл. 5). При использовании 0,04%-ного раствора аценафтена в 1%-ном ДМСО отмечено снижение затрат на 99,5%, при этом экономия средств составила 10,94 руб. на один получаемый измененный побег. Данный показатель достигается за счет меньшей стоимости составных химических компонентов раствора.

Таблица 5. Экономическая эффективность применения растворов полиплоиди-зирующих соединений при обработке черенков смородины (в расчете на один измененный побег)

Показатели 0,05%-ный водный раствор колхицина (контроль) 0,04%-ный раствор аценафтена в 1%-ном ДМСО

Стоимость 1 л раствора, руб. 575,0 4,7

Затраты на обработку 100 черенков, руб. 230,0 1,9

Затраты на получение одного измененного побега, руб. 11,0 0,06

Экономия средств при получении измененного побега, руб. - 10,94

Снижение затрат, % 0 99,5

Учитывая меньшую цитотоксичность и стоимость рабочего раствора аценафтена, количество повторных обработок черенков при необходимости допускается увеличить без значительного расхода средств и гибели исходного растительного материала.

выводы

1. Выявлено эффективное полиплоидизирующее действие 0,02-0,04%-ных растворов аценафтена в водном диметилсульфоксиде. При его воздействии отмечено удвоение хромосом в соматических и генеративных клетках смородины.

2. У изучаемых тетраплоидов смородины установлено достоверное увеличение морфологических показателей на 7-30% (листового индекса, угла между боковыми лопастями листовой пластинки); цитоанатомических признаков на 26-54% (длины и ширины замыкающих клеток устьиц, диаметра пыльцевого зерна и количества ростовых пор в его оболочке).

3. На этапе тетрадогенеза при микроспорогенезе у авто- и аллотетрап-лоидов смородины образуется до 40% нормальных тетрад. Наиболее жизнеспособная пыльца отмечена у тетраплоида сорта Голландская красная (29,0%), ал-лотетраплоидов Йошта (29,2%) и СКГ 5-4 (25,6%), что позволяет использовать их в качестве родительских форм при гибридизации и для получения генотипов с разным уровнем плоидности.

4. Тетраплоидный аналог сорта Голландская красная характеризуется высоким уровнем морозостойкости и способен переносить понижение температуры до - 40 °С с наименьшими повреждениями тканей на уровне диплоида.

5. Тетраплоид сорта Голландская красная, аллотетраплоиды Йошта и СКГ 5-4 обладают высокой жаро- и засухоустойчивостью при наименьшем повреждении фотосинтетического аппарата. Тетраплоидные формы смородины красной и американской по уровню жаро- и засухоустойчивости превосходят диплоидные сорта смородины черной и характеризуются меньшими транспи-рационными потерями (в 3,7-5,3 раза).

6. Выявлен высокий уровень устойчивости к хлоридно-сульфатному засолению у тетраплоидных форм Голландской красной и мутанта 21-рм4 смородины американской, которые превосходят по этому показателю аллотетраплои-дов Йошта и СКГ 5-4. Однако отмеченные аллотетраплоиды характеризуются высокой устойчивостью к действию тяжелых металлов (катионов никеля и свинца).

7. Тетраплоидный аналог сорта Голландская красная превосходит диплоидную форму по массе плодов на 48%; содержанию антоцианов - на 132%; дисахаридов - на 60%; витамина С - на 24%; сахаро-кислотному индексу - на 19%. Аллотетраплоид СКГ 5-4 по биохимическому составу ягод занимает промежуточное положение между диплоидными сортами смородины черной и крыжовника.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ

1. Для получения полиплоидов смородины и нередуцированной пыльцы рекомендовать обработку вегетативных и генеративных почек 0,04%-ным раствором аценафтена в водном диметилсульфоксиде.

2. Для селекции рекомендовать в качестве источников ценных хозяйственно-биологических признаков:

- высокой устойчивости к солям тяжелых металлов, жаро- и засухоустойчивости - аллотетраплоиды Йошта, СКГ 5-4;

- высокой устойчивости к хлоридно-сульфатному засолению - тетраплоидный мутант 21-рм4 смородины американской;

- генисточник комплекса признаков (устойчивости к низким температурам, жа-ро- и засухоустойчивости, солевыносливости, крупноплодное™ и высокого содержания витамина С, антоцианов, дисахаридов) - тетраплоидный аналог сорта Голландская красная.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Дубровский, М.Л. Морфологическая характеристика диплоидных и автотетраплоидных форм растений смородины американской и смородины красной / М.Л. Дубровский // Вопросы современной науки и практики: Университет им. В.И. Вернадского. - Том 2. Сер. Техн. науки. - № 1 (11). - 2008. -С. 186-190.

2. Папихин, Р.В. Цитологические особенности формирования мужского гаметофита у отдаленных гибридов Pyrus х Malus и Ribes х Grossularia / P.B. Папихин, М.Л. Дубровский, С.А. Брюхина // Вестник ТГУ. - Т. 16. -Вып. 2.-2011.-С. 633-637.

3. Дубровский, М.Л. Изучение in vitro жизнеспособности мужского гаметофита у форм смородины разного уровня плоидности / М.Л. Дубровский // Плодоводство и ягодоводство России. - 2011. - Т. XXVI. - С. 38-43.

4. Будаговский, A.B. Экспресс-диагностика действия токсичных соединений на фотосинтетическую активность садовых культур / A.B. Будаговский, Н.В. Соловых, О.Н. Будаговская, Ф. Ленц, Д.Г. Шорников, М.Ю. Пимкин, М.Л. Дубровский // Плодоводство и ягодоводство России. - 2011. - Т. XXVII. -С. 80-89.

5. Дубровский, М.Л. Изучение действия химических агентов при индукции мейотической полиплоидизации у смородины / М.Л. Дубровский // Вестник МичГАУ. - 2011. - № 2. - Ч. 1. - С. 66-69.

Статьи в других научных изданиях

6. Дубровский, М.Л. Количественные признаки первичной диагностики форм смородины измененного уровня плоидности / М.Л. Дубровский // Современная школа в инновационном процессе: проблемы и перспективы: Сборник материалов, посвящ. 70-летию МГПИ / Под общ. ред. Л.П. Петрищевой. - Мичуринск: МГПИ, 2009. - С. 87-88.

7. Дубровский, М.Л. Изменение морфоанатомических признаков у смородины красной при переходе с диплоидного на тетраплоидный уровень пло-

идности / М.Л. Дубровский // Материалы VI Междунар. науч. конф. «Агроэко-логические аспекты устойчивого развития АПК». - Брянск, 2009. - С. 195-197.

8. Дубровский, M.JI. Фертильность пыльцы отдалённых гибридов и полиплоидов плодовых и ягодных культур / M.JI. Дубровский, А.Н. Муравьёв, Р.В. Папихин, В.А. Терехова // Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы: материалы III Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2009. - С. 126127.

9. Дубровский, МЛ. Влияние метаболитов основных патогенов смородины на мужской гаметофит / M.JI. Дубровский, Р.В. Папихин, М.В. Маслова, В.А. Терехова // Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК: материалы VII Междунар. науч. конф. - Брянск, 2010. - С. 37-39.

10. Дубровский, МЛ. Изучение микроспорогенеза у растений смородины красной разного уровня плоидности / M.JI. Дубровский // Современное садоводство. - 2010. -№ 1. - С. 93-95.

11. Папихин, Р.В. Индуцирование полиплоидизации растений in vitro / P.B. Папихин, С.А. Муратова, M.JI. Дубровский // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: сб. статей по материалам III Всерос. науч.-практ. конф., Волгоград, 4-6 августа 2010. - Волгоград,

2010.-С. 95-100.

12. Дубровский, M.JI. Цитологические особенности аллотетраплоидных смородинно-крыжовниковых гибридов / M.JI. Дубровский // Развитие научного наследия И.В. Мичурина по генетике и селекции плодовых культур: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 155-летию со дня рождения И.В. Мичурина (XXII Мичуринские чтения, 26-28 октября 2010 г.). - Мичуринск-наукоград РФ, 2010. - С. 126-130.

13. Будаговский, A.B. Новый методический подход к оценке жаростойкости плодовых растений / A.B. Будаговский, M.JI. Дубровский, М.Ю. Пимкин, О.Н. Будаговская, А.И. Миляев // Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК: материалы VIII Междунар. науч. конф. - Брянск,

2011,- С. 317-319.

14. Дубровский, M.JI. Экспресс-диагностика полиплоидных форм смородины / МЛ. Дубровский // Новации в горном и предгорном садоводстве: Матер. междунар. науч.-практ. конф. 22-23 июня 2011 г., посвящ. 80-летию со дня рождения А.К. Каирова. - Нальчик: Полиграфсервис и Т, 2011. - С. 105-109.

Формат 60x84 1/16 Объем 1 усл.пл.

Тираж 120 экз. Заказ № 1

ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина

Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Дубровский, Максим Леонидович, Мичуринск-наукоград РФ

61 12-6/360

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЛОИДОВ СМОРОДИНЫ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Специальность 06.01.05. - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

На правах рукописи

Дубровский Максим Леонидович

Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

академик РАСХН, доктор с.-х. наук, профессор Савельев Н.И.

Мичуринск-наукоград РФ - 2012

Содержание

стр.

Введение....................................................................................................................................................................................................3

Глава I. Обзор литературы..................................................................................................................................6

1.1. Особенности явления полиплоидии у растений......................................6

1.2. Экспериментальная полиплоидия как метод селекции растений ................................................................................................................................................................................................................15

1.3. Методы искусственного получения полиплоидов у растений ........................................................................................................................................................................................................................24

1.3.1. Экспериментальная митотическая полиплоидизация..............24

1.3.2. Экспериментальная мейотическая полиплоидизация..............28

1.4. Биологические особенности и хозяйственная ценность авто- и аллополиплоидов......................................................................................................................................................29

1.4.1. Морфо-анатомические особенности......................................................................29

1.4.2. Цитогенетические особенности..................................................................30

1.4.3. Физиологические особенности и устойчивость полиплоидов к абиотическим и биотическим факторам..........................................................34

1.5. Экспериментальная полиплоидия в селекции смородины .. 37 Глава II. Цель, задачи, объекты, методика и условия проведения исследований....................................................................................................................................44

2.1. Цель и задачи исследований......................................................................................................44

2.2. Объекты исследований........................................................................................................................45

2.3. Методика исследований....................................................................................................................47

2.4. Условия проведения исследований................................................................................54

Глава III. Совершенствование способов получения полиплоидов смородины..............................................................................................................................................................................59

3.1. Оптимизация условий и способов обработки биологического материала при индукции полиплоидизации............................................................59

3.2. Экспериментальная митотическая полиплоидизация....................72

3.3. Экспериментальная мейотическая полиплоидизация....................81

Глава IV. Цитогенетические особенности диплоидов, авто- и

аллотетраплоидов смородины......................................................................................................................90

4.1. Особенности кариотипа диплоидов, авто- и аллотетраплоидов смородины..................................................................................................................................................................90

4.2. Особенности протекания мейоза при микроспорогенезе у диплоидов и авто- и аллотетраплоидов смородины......................................................93

4.3. Морфологические особенности и фертильность мужского гаметофита..........................................................................................................................................................................................102

4.4. Жизнеспособность мужского гаметофита..........................................................107

Глава V. Биологические особенности авто- и аллополиплоид-

ных форм смородины......................................................................................................................................................111

5.1. Морфо-анатомические особенности..............................................................................111

5.2. Физиологические особенности фотосинтеза и транспира-

ции........................................................................................................................................................................................................................117

Глава VI. Потенциал устойчивости авто- и аллополиплоидов

смородины к абиотическим факторам и их продуктивность............123

6.1. Устойчивость к низким температурам в середине зимы..........123

6.2. Жаростойкость..................................................................................................................................................125

6.3. Засухоустойчивость..................................................................................................................................132

6.4. Солеустойчивость........................................................................................................................................137

6.5. Устойчивость к катионам тяжелых металлов..............................................143

6.6. Продуктивность и биохимический состав ягод..........................................148

Глава VII. Экономическая оценка..........................................................................................................154

Выводы........................................................................................................................................................................................................156

Рекомендации для селекции..............................................................................................................................158

Список литературы............................................................................................................................................................159

Введение

Общеизвестно большое значение плодов и ягод в жизни человека. Они представляют собой ценнейший диетический продукт питания; служат незаменимым источником витаминов, органических кислот, Сахаров, азотистых, дубильных, ароматических веществ; способствуют лучшему усвоению других пищевых продуктов. Ягоды содержат витамины, поэтому имеют и лечебное значение (Ярославцев, 1988).

В настоящее время одной из важнейших задач плодоводства является обеспечение населения в достаточном количестве витаминной продукцией. Для решения этой задачи необходимо повышение урожайности существующих сортов плодовых и ягодных культур, а также создание новых высокоадаптивных генотипов с увеличенной продуктивностью..

Культура смородины, и в первую очередь смородины черной (Ribes nigrum L.), в настоящее время занимает ведущее место среди ягодников. Высокая урожайность, скороплодность, диетические свойства ягод, их пригодность к различным видам переработки и замораживанию создали предпосылки для увеличения площадей под смородину. Россия занимает ведущее место в мировой селекции смородины черной. К началу 60-х гг. XX века в нашей стране было создано около 100 сортов, а за последние 40 лет - около 300 из 800 сортов мирового сортимента смородины черной (Назарюк, 2003). Ряд других, менее распространенных видов смородины представляют большой интерес для садоводства и селекции.

Значительный вклад в совершенствование сортимента смородины может внести полиплоидия, которая как геномная мутация вызывает у растений глубокие и разносторонние изменения в действии генов, проявлении признаков и свойств, способствуя расширению формообразовательного процесса и появлению новых генотипов. Ряд хозяйственно-ценных признаков у растений, на которые отбор на диплоидном уровне проводился неэффективно, при переходе на новый уровень плоидности растении могут проявиться в большей степени (Шелаботин, 1995а).

При экспериментальной полиплоидизации кроме получения большого количества измененных побегов встает вопрос о быстром анализе их на наличие форм измененного уровня плоидности. Непосредственный подсчет числа хромосом у всех форм представляет собой весьма длительный и трудоемкий процесс. Поэтому целесообразно в какой-то степени сократить время анализа путем предварительного отбора предполагаемых полиплоидов по косвенным признакам, специфичным для полиплоидных форм изучаемой культуры.

Перспективным методом селекции с изменением уровня плоидности является гибридизация растений с применением нередуцированной пыльцы, индуцированной действием полиплоидизирующих соединений на генеративные почки в предмейотический период, что позволяет сократить время для получения пыльцы при отсутствии полиплоидных генотипов, служащих донорами нередуцированных гамет (Джигадло, Седышева, Джигадло, 2008).

Для дальнейшего изучения выделенных полиплоидных растений смородины требуется применение комплексных методов, позволяющих оценить количественное выражение морфо-анатомических, цитогенетических, физиологических, биохимических показателей и устойчивость растений к стрес-сорным факторам внешней среды. Большую роль при этом играет изучение функционирования фотосинтетического аппарата в норме и при действии различных повреждающих условий и выявление изменений удельной активности флуоресценции хлорофилла. Это способствует комплексной оценке генотипов, так как фотосинтез является одним из основных процессов, обеспечивающих жизнедеятельность любого растения и определяющим его целостность (Ничипорович, 1956, 1972; Мокроносов, 1983), у смородины как ягодной культуры служащим еще и важным хозяйственно-биологическим показателем продукционных процессов (Жидехина, 1988, 1992).

В связи с этим, тема диссертации является весьма актуальной и позволяет получить новые научно-практические знания в области селекции растений с увеличенным уровнем плоидности.

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Особенности явления полиплоидии у растений

Полиплоидия - это геномная мутация, состоящая в увеличении у организма числа хромосом, кратном гаплоидному. Термин «полиплоидия» был введен немецким ботаником Эдвардом Страсбургером в 1910 году. Клетки с разным числом гаплоидных наборов хромосом (п) называют: Зп - триплоид-ные, 4п - тетраплоидные и т.д. Организмы, развившиеся из полиплоидных клеток, будут называться соответственно триплоидами, тетраплоидами и т.д. Если организм содержит гаплоидный набор из 4 хромосом (т.е. п = 4, 2п = 8), то тетраплоид имеет 4п = 16 хромосом ^еЬЫпз, 1947; Лобашев, 1979; Жи-мулев, 2006).

Возможны следующие причины полиплоидии:

1) Неравное расхождение хромосом к полюсам в анафазе мейоза, что приводит к образованию гамет с нередуцированным числом хромосом, такие гаметы будут иметь не по одному набору хромосом как в норме, а по два. При участии в оплодотворении гамет с нередуцированным набором хромосом могут появиться полиплоидные организмы.

2) Деление ядра без деления клетки (амитоз, эндополиплоидизация).

3) Удвоение хромосом без их отделения друг от друга.

У растений полиплоидия широко представлена, что связано с наличием и широким распространением у них гермафродитизма (самоопыление), апо-миксиса (партеногенез) и вегетативного размножения. Цитологическое определение полиплоидов связано с открытием хромосом и совершенствованием методов микроскопических исследований. Впервые у растений были описаны полиплоиды томатов и паслена, изученные Г. Винклером в 1916 г. (Жи-мулев, 2006).

Полиплоидия в клетках растений может происходить как в природных условиях, так и искусственно - в обоих случаях на делящиеся клетки должны действовать полиплоидизирующие факторы, нарушающие кариокинез и пре-

дотвращающие расхождение хромосом, - физические (ультрафиолет, высокие или низкие температуры) или химические (вещества, связывающиеся с микротрубочками и разрушающие веретено деления).

Если удвоение геномов происходит в первом делении зиготы, такая полиплоидия является мейотической, при этом все клетки зародыша будут полиплоидными. Полиплоидизация может также возникать в части клеток в результате нарушения митоза — это соматическая, или митотическая, полиплоидия; в данном случае полиплоидными будут только клетки в той части организма, которая разовьется из исходной полиплоидной клетки, и организм окажется химерным, или миксоплоидным. Соотношение аллелей генов при митотической полиплоидизации сохраняется. Тетраплоид, возникший из гомозиготного организма, также будет гомозиготным. Если умножение наборов происходит у гибридного генотипа, который в гомологичных хромосомах несет разные аллели одних и тех же генов, тогда и образовавшийся тетраплоид будет гетерозиготным по этим генам (Жимулев, 2006).

Полиплоиды, возникающие на основе увеличения числа наборов хромосом одного вида, называют автополиплоидами. В результате скрещивания автотетраплоида с диплоидом получается автотриплоид. Автотриплоидные растения, как правило, крупнее и мощнее по вегетативной массе, чем формы растения с четным числом хромосомных наборов, но полностью стерильные из-за массовых нарушений мейоза при образовании гамет. Полиплоиды, возникающие на основе умножения геномов разных видов называют аллополи-плоидами, или амфиплоидами ^еЬЫпБ, 1947; Жимулев, 2006).

Растения, у которых произошло умножение целых гаплоидных наборов, называют собственно полиплоидами (константными), или эуплоидами. Если при полиплоидизации число хромосом не является кратным гаплоидному, то образуются гетероплоиды, или анеуплоиды. Среди анеуплоидов генотип с набором хромосом (2п+1) называют трисомиком, (2п-1) - моносомиком, (2п-2) - нулисомиком. В редких случаях одна и та же пара хромосом может иметь дополнительно не одну хромосому, а две (2п+2) у тетрасомика,

три (2п-3) у пеитасомика и т.д. Как правило, аиеуплоидные растения менее жизнеспособны и отличаются массовыми нарушениями в мейозе при образовании гамет (Лобашев, 1979; Жимулев, 2006). В настоящее время исследование анеуплоидии у растений приобретает важное практическое значение в связи с выяснением роли каждой хромосомы в генотипе - в будущем это может способствовать экспериментальному синтезу определенных генотипов. Анеуплоидия играет огромную роль в эволюции и имеет большое значение для изучения происхождения культурных растений (^еЬЫш, 1947; Лобашев, 1979).

Обозначая растения терминами «диплоид», «триплоид», «тетраплоид», «пентаплоид», «гексаплоид» и т.д., следует учитывать одну биологическую особенность. Если подавляющее большинство соматических клеток организма имеет один и тот же набор хромосом, то говорят о данном уровне плоид-ности конкретного генотипа. Однако у практически у всех видов высших растений в их организме имеются клетки с разным числом хромосом. Подобное явление получило название химерности - данный термин в его общеупотреб-ляемой трактовке применяют для обозначения сочетания у одного организма тканей с разным хромосомным набором (Бреславец, 1963; Ригер, Михаэлис, 1968; Лаптев, 1984). Строго говоря, химерными являются практически все высшие растения за счет явления эндополиплоидизации - увеличения количества хромосом в клетках уже дифференцированных тканей, утративших способность к нормальному делению митозом и переходом на эндомитоз -внутриклеточное многократное деление ядра без расхождения хромосом и цитокинеза. Эти ткани выполняют в растительном организме специализированные функции - секреторные, трофические, экскреторные и др. Из высокополиплоидных клеток состоят ткани тапетума пыльника, запасающие и выделительные ткани, первичная кора корня. В клетках таких тканей зафиксировано увеличение базового хромосомного набора в десятки и даже сотни раз. Так, в секреторных клетках волосков крапивы набор хромосом увеличен в 256 раз, что является способом увеличения интенсивности физиологиче-

ских процессов клеток, выполняющих особые функции в растительном организме (Лаптев, 1984). С явлением химерности тесно связано понятие «миксо-плоидия» как явление сочетания у организма тканей и групп клеток разного уровня плоидности, отличающихся в большую или меньшую сторону от основного набора хромосом данного генотипа (Ригер, Михаэлис, 1968; D'Amato, 1985). Для форм с константным (постоянным) уровнем плоидности количество химерных тканей и уровень миксоплоидии будет минимальным, не более единичных процентов или даже их долей от общего числа клеток. Если у растения отмечено сочетание большого количества клеток с разными наборами хромосом, то говорят о его миксоплоидии за счет химерности тканей.

Наиболее распространённый путь образования спонтанных полиплоидов в природе - это мейотический способ. К такому выводу пришли J.R. Harlan и J.M. Wet (1975) исследовав 85 родов и несколько сотен видов. Размах этого процесса в различных таксонах и количество образующихся полиплоидных форм в значительной степени зависит от генотипов и направления скрещиваний, а так же от условий окружающей среды. При некоторых скрещиваниях иногда наблюдается довольно высокий процент спонтанных полиплоидов. Например, из 100 исследованных гибридов, полученных в комбинации Saccharum ofßcinarum L. (2n=64) x S. spontaneum L. (211=80) Роуч (Roach, 1968) обнаружил, что все они являются триплоидами (2п=112) и возникли в результате оплодотворения нередуцированной яйцеклетки редуцированной пыльцой. В результате спонтанной мейотической полиплоидизации возникли многие виды современных плодовых и ягодных культур, таких как яблоня, облепиха, вишня, слива (Санкина и др., 1984).

Возникновение спонтанных полиплоидов растений половым путём зависит от частоты появления нередуцированных гамет и их концентр