Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние системы протеиназа - альфа-1-ингибитор протеиназ при холодовом и адреналовом стрессе у крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние системы протеиназа - альфа-1-ингибитор протеиназ при холодовом и адреналовом стрессе у крыс"

харківський державний університет

. На правах рукопису

САШХІПА &С5оз ІЬяайлІБца / (} (

СТАЛ СїгСТЕМІ ПРОГВІІША-.^-1- ІНГІБІТОР ПРОШНАЗ пйі хоадооош і АдрккАяаюуу стресі у цшв

. # ' •

03.00.04 - біохімія

• АВТОРЕФЕРАТ .

ДИСЕРТАЦІЇ НА ЗДОБУТТЯ ВЧЕНОГО СТУПЕНЯ ' КАНДИДАТА БІОЛОГІЧНИХ НАУК

Харків - 1994

Дисертація є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному університеті.

НАУКОВІ КЕРІВНИКИ; доктор біологічних наук, професор Калімші Павло Оксоигійоют, доктор біологічних наук Стародуб ІЬясша 4едоропич

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ; доктор біологічних наук, професор Веремеенко Кузьма І&аотшмч, (інститут отоларінгології Ы03 України, м.Київ) доктор біологічних наук, професор Панченко Ніна Іванівна,

(інститут удосконалення лікарів МОЗ України, м. Харків)

ПРОВІДНА ОРГАНІЗАЦІЯ - Київський державний університет ім. Т. Г. Шевченко, Міносвіти України

ЗАХИСТ ВІДБУДЕТЬСЯ " 4 " березня 1994 року о 15' годині на васідаині спеціалізованої вченої ради К053.06.07 Харківського державного університету (310077, м. Харків, пл. Свободи,4).

В дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету.

Автореферат, розісланий " 4 " лютого 1994 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради .

• . КІІУ- Некрасова А. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ . Актуальність проблеми. Протеїнази відіграють важливу роль у процесах травлення, коагуляції крові, фібринолізі, активації комплементу, іммунній відповіді, при запаленні та заплідненні (Веремеенко K. H., 1987, Нагорная В. Ф. , 1990, Murano G.,, 1985, Patston P.A. et

al., 1990, Троицкий Г. В., 1985). Найбільш-розповсюдженими серед них

є серінові протеінази, .які виявлені практично у всіх субклітинних фракціях різних типів клітин (Нагорная R Ф., 1990). Регуляторна

функція їх здійснюється за реакціями двох типів: повне розщеплення

білків до. амінокислот і лімітований протеоліз (Веремеенко K. II и др., 1988, Нагорная ЕФ., 1990, Patston P.A., et al. , 1990). ^Останній відіграє важливу роль в утворенні активних форм ферментів і гормонів в неактивних »молекул, що дозволяє, повністю використовувати всю генетичну інформацію, реалізовану в, білковій молекулі та досягти швидкої генералізованої відповіді- організму на зовнішній вплив.

В результаті часткової протеолітичної деградації утворюється ряд гормонів і нейропептидів - кортикотропін, ендорфіни, мелано-тропіни, які позначають, терміном "стресові білки", тому що їх утворення і секреція посилюються при стресових ситуаціях (Веремеенко К.Е , 1987). Особливу роль відіграє трипсин, який здібний розривати

эв'язки, утворені карбоксильними групами' основних- амінокислот (Веремеенко КЕ, 1987, Шсолов ER,.1.971, Barret A. J. , 1986). Він активує хімотрипсиногени А, В,-С, проеластазу, профосфоліпазу, прок-арбоксипептидази та інші.. ' •' . '

В органівмі існують механ.ізми, які контролюють активність про-теолітичних-ферментів. Важливе значення в регуляції протеолізу мають інгібітори протеолітичних ферментів (Birk Y., 1987, Travis J. et al., 1990). Лімітований протеоліз зімогенів та інших білкових субстратів високоспеціалівованими серіновими протеіназами і регуляція цієї фун-' кції серп і нами .,(інгібіторами серінових протеіназ) є фундаментальним, механізмом контролю захисних систем (Patston P.A. .et al., '1990, Patterson S. D. і 1991).' .

Близько 90X трипсинінгібіторної активності сироватки крові припадає на долю альфа-1-інгібітора протеіназ (.J-1-ІП). Функціональна активність xLi-m визначається амінокислотним складом РІ-8алишку, . активного’сайту інпбітора .(Patston P.A. et al. , 1990, Matheson N. et al., 1989, Perlmutter D. H. . .Pierce J. A., 1989). Гомозиготний фенотип PIZZ .характеризується різким дефіцитом ^-І-ІП, недостатньою концен- ■ трацією' інгібітора в сироватці крові, шр обумовлено амінами третинної . : ■ " ■ З . ■' . ' ' ’

структур» його молекули, порушенням глхноаування (Matheson N. • et al,, 1989, Bolгг*?г S., Klesnerman j. , 1986, 1987, Perlmutter D.H.,

■ Pierce J. A. , 1989, Berninger R. V. , 1985).

Деякі стресові Оілки, бики теплового току (GRH78), можуть зв'язувати ^-1-ІП, викликаючи його акумуляцію в ендоплазматичному ретикулумі (Perlmutter D.H., Pierce J.A., 1989). Крім того, ^ -1 - ІП

може окислюватись продуктами ГОЛ, при цьому знижується його елас-тазоінгібіторла активність (Mohsenin V.. Gee J. B.L. , 1989). врахо-

вуючи, що стрес супроводжується активацією ГІОЛ в тканинах (Сабурова A. M., 1991, Ага^оНова II А. , 1987, Гуляева H. Е , Левшина И. ÍL , 1988), є підстави для припущення, що процес окислення у-і~ ІП грає важливу роль в стимуляції компенсаційних реакцій організму при стресі. Взаємозв'язок процесів акумуляції .--'-І - ІП в гепатоцитах і його окислювальною інактивацією не відома. '

Існують дані (Веремеенко K. Е и др., 1988), що під впливом

м'якого холодового стресу відбувається активація реакцій лімітованого протеолізу. До того ж, охолодження приводить до підвищення ’ систолічного, диастолічного і середнього артеріального тиску (Fregly M. J., 1989). Широкі багатопланові дослідження системи проте і наза-

x-1-ІП в тканинах організму як при холодовому, так і при інших видах стресу, а також при виникненні гіпертонічної хвороби (ГХ) на жаль відсутні. Холодовий стрес, як і інші види фізичного впливу, пов'язаний а абільшенням секреціі норадреналіну (НА) - (Kajetal В. , Go!«і?*:0in D.S., 1988), що рихятгьа ihiepec до ьлвччпьл ьимиау адреналового стресу на систему протеїназа-./-1-ІП, враховуючи роль'підвищення рівнів вгаданих катехоламінів, адреналіну (А) і НА, в розвитку ГХ Крім цього, недостатність x-1-ІП може призвести до руйнування тканини легень . під впливом протеіназ (Веремеенко К.Н., 1989), а

підвищення його т до виникнення запалення (Berninger, 1985). Закономірності стресорної обумовленості змін системи протеіназа-<"-1-ІП . в тканині легень до цього часу лишались не вивченими.

Дослідження системи протеіназа-^-l-ІП при різних станах організму і, особливо, шляхи корекції змін, шр відбуваються під впливом зовнішніх факторів, мають велике практичне значення. Не дивлячись на це, на сьогодні є лише окремі праці, присвячені вивченню шляхів корекції наслідків стресорного"впливу в використанням інгібіторів протеаз (Тарасенко Л. М. , Дев'яткіна Т. 0., Гребеннікова'В. ¡1, 1992).

■ liera робот?*

Вивчити активність протеіназ | --1-ІПв сироватці крові. - цит-озолі тіканини легень, серця, печінки, нирок в динамищ холодового впливу та при адреналовому стресі у щурів. Охарактеризувати стан системи протеіназа-*М-111 в умовах відігріву та введення трасилолу безпосередньо після холодового впливу. '

Для досягнешга ьютн буяі сформульовані такі задачі:

1. Встановити оптимальні умови сорбції гемопротеїдів як субстрату протеолітичної реакції-для визначення активності протеїназ і х-1-•-ІП. • ’

. 2. Вивчити активність протеїназ і ^-1-1П під впливом м'якого

стресорного фактору, яким є холод, 6СС, в сироватці крові, печінці, органах-ураження при гіпертензії (в міокарді, нирковій тканині) та в легенях. 1

3. Дослідити характер змін системи протеїназа-х-І-Ш при адреналовому стресі у щурів в зазначених вище субстанціях організму.

4. Проаналізувати відновлення системи протеїназа-л-1-III під

впливом фармакологічного препарату трасилолу та відігріву після холодового стресу різної тривалості. ^

Наукова новизна. .

Підібрані оптимальні умови сорбції гемопротеїдів як субстрату протеїназ для експресного та високочутливого визначення активності протеіназ і .c-1-ІП. Показано, що ефективніш' способом ¡мобілізації гемопротеїдів на поверхні.полістеролу є висушування їх кон'югатів з BSA з 0.6 М розчину бікарбонату амонію. ■ . .

Вперше проведено вивчення активності протеіназ і c-1-ІП в сироватці крояі,. цитоволі тканин серця, легень, печінки, нирок в динамищ ьіишьу холодового стресу та при адреналовому стресі у щурів. Показано, що холодовий стрес приводить спочатку до активації протеіназ у всіх дослідних субстанціях через 2 год після початку впливу, а потім - до зниження їх рівня ва рахунок,активації і/або збільшення вивільнення ■ --1-ІП печінкою. Адреналовий стрес обумовлює підвищення рівня t-1-ІІІ лише в цитозолі ткшшни легень на фоні активації протеолізу в сироватці крові. Визначено шляхи відновлення по- • рушень- в системі протеіназа-,с'-1-ІП, щр мають місце під впливом . стресорного фактору безпосередньо пійля його-дії. .

Практичне аіачешю, ’ • .

Дібрані оптимальні умови сорбції' гемопротеїдів як субстрату протеіназ дозволяють використати їх для'визначення активності протеї-' " 6 ' '

наз і J-1-ІП в біологічних рідинах як в наукових, так і в діагностичних дослідженнях в галузі медицини і ветеринари. Ці розробки . впроваджено в практику роботи інституту терапії АМН України і 13-ї лікарні м. Харкова.

Одержані в експериментальних досдідженнях на щурах результати дають уявлення про участь системи протеіназа- ■--1-ІП в розвитку стресорноі реакції організму. За допомогою аналізу змін вказано! системи під впливом трасилолу та відігріву зроблено висновок; що можливе попередження стресорноі реакції організму беспосередньо після впливу зовнішнього фактору. Показано, що ефективним способом в цьому Відношенні може бути введення-, трасилолу. На основі загально-біологічної реагаи і організму у відповідь на стрес є можливість поширення уявлень про виникнення і розвиток різних патолопй. Особливо це стосується ГХ і адреналовоі-терапії хворих на бронхіальну астму.

Апробація роботи проведена на поєднаних засіданнях Харківських відділень .Українських товаритств біохіміків, .геронтологів та геріатрів £1991, вереснь 1993 p.), на конференції молодих вчених ХДУ (ліо-тий, 1993р.), науково-практичних конференціях інституту терапії £1989, 1990, 1992, 1993 pp.); методичні розробки по'цій темі були

представлені на Республіканській науковій конференції "Применение иммуноферментного анализа в медицине" (Харків, 1989), виставці-пре-аентації Всесвітньої лабораторії (Харків, 1993) та на виставці досягнень народного господарства (Київ, 1Й93). • -

Публікації: По результатам виконаних диилідлень инубліковано 5 робіт. я .

Структура роботи: Дисертація викладена на 130 сторінках машинопису, складається з вступу, огляду літератури, глави по матеріалам і . методам дослідження, глави результатів і обговорення власних досліджень, висновків і заключения. Дисертація ілюстрована 19 рисунками та 13 таблицями. Список використаної літератури містить 195 джерел, в тому числі 96 - іншомовного походження. ■

МАТЕРІАЛИ І КЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ Поаук оптимальних умов сорбції гемопротеїдів для визначення ачтшшості протеіназ і .¿-і-ІП. В експериментах використали пероксид-азу хріну (РХ) фірми Calbiohem (США) та Гемоглобін людини, одержаний за допомогою толуолу по методу (Стародуб ЕФ., 1987). Гемоглобін модифікували шляхом утворення метформи. З цією метою розчин гемоглобіну обробляли фериціанідом калію, від залишку якого потім збавлялись 8а допомогою гельфільтрації на сефадексі G-25 фірми Pharmacia (Швец. 6 . '

ía). Концентрацію метгемоглобіну (MtHb) визначали спектрофотометричний метолом э використанням ацетонціалгідршіу (Дервиз Г. Е, 1973).

Пероксидазу і MtHb кон'югували з •сироватковим альбуміном бика (BSA) • фірми Serva (США) перйодатшш методом (Курманова Л. В. и др. , 1984). Концентрацію білка встановлювали спектрофотометрично при 280 нм. Шлучені кон'югагн диалізували проти 0.02 Іі (сарбонат-б і карбонатного буферу pH 9. 6. •

Готові препарати MtHb та кои-югати гемопротеїдів з BSA зберігали при -20”С в присутності гліцершу (50%). -

■ ¡мобілізацію білкових молекул на полістеролових-плашках здійснювали загально прийнятим методом ( Егоров А. И. и др.,. 1991) та шляхом висушування розчинів в спеціальних умовах (Бобровник С. А. , Стародуб Н.Ф. , 1988). Ефективність »мобілізації дослідних препаратів на поверхні полістеролових плашок визначали за кольоровою реакцією, згідно (Егоров A.M. , Осипов A. IL , Дзантиев Б. Б. и др., 1991).

Визначення активності протеіназ здійснювали слідуючим образом;

В одмиті лунки плашки з ¡мобілізованим комплексом РХ-В5А вносили по .

0.1 мл розчину трипсину фірми Spofa (Чехословакія), концентрації в рамках 0-8 мкг/мл в якості' контролю та дослідні- зразки 0.1 мл/лунку і інкубірували 15 хв при 37'С. ’ Потім плашку відмивали і проводили реакцію забарвлення з використанням ортофенілендіаміну як зазначено вище. Згідно результатам' вимірювань стандартних розчинів трипсину будували калібровочну криву, по якій ьионачоли активність протеіназ в дослідних зразках.■ . ; ,

З метою дослідження активності ¿-1-ІП окремо проводили реакцію комплексування проте таза-інгібітор, ;як уже відомо (Веремеенко K. H. и др., 1987). Безпосередньо'після цього б реакційній суміші визначали активність протеіназ, як зазначено вище. Активність -í-1-ІП вира- . кали в мкг/мл по різниці Між Кількістю трипсину, додатого до зразків і залишковою його концентрацією, яку визначали за калібровочною Кри-. в о ю. . '

Вплив холодового стресу на активність протеііаа і л-1-ІП у sy- . рів. В експериментах використали шурів лінії Vistar, 2-3-мюячного : .віку. Холодовий стрес відтворювали в камері типа КХ (Броварський завод холодильників). Час експозиції, становив ЗО, 60, 120 хв, 1 доба, 1 тиждень. Контрольну групу тварин держали при кімнатній теше- -ратурі. Щурів декапітували зразу ж після виливу. Кров збирали в центрифужні пробірки. Печінку перфузірували охолодженим фізіологічним розчином Б-10 хв. В експеримент брали 100 мг тканини, яку гоїю-' ' 7 . .

генізували в 1 мл 0,2 Н Ма~4осфатного буферу pH 7.2 при 4 С. Промиті охолодженим фізіологічним розчином тканини легень, серця, нирок, 50100 мг, подрібнювали ножницями, а потім гомогенізували в 1 мл фізіологічного розчину. Зразки крові та гомогенати центрифугували на протязі 10 хв, 10000 об/хв в центрифузі типу К-24 при 4 С. Зберігали при -20 С до аналізу.

Відновлегага системи протеіказа-^-1-ІП після впливу холоду у цу-рів. Окремій групі тварин через 2 год та 1 тиждень після холодового стресу вводили траснлол фірми Bayer (Германія) (у м'язи лівої задньої лапки) в дозі 0.15 мл/100 г ваги тіла. Контрольній групі тварин вводили такий же об'см фізіологічного розчину. Одну групу тварин (після 2-год'холодового стресу) витримували в нормальних температурних умовах 1 год, а нішу (після 1-тижневоі дії холоду) - тримали 1 добу і проводили досліди по схемі, наведеній вище.

Досліди по пошуку оптимальних умов сорбції гемопротеїдів, вивчення системи трипсин-..:-1-ІП при холодовому стресі і по відновленню вказаної системи у щурів були виконані на полістеролових плашках фірми Dynatech (Швейцарія) і денситометрі цієї ж фірми на базі інституту молекулярної біологи і генетики АН України (м. Київ).

Вивчешся вішпіу адреналового стресу на активність протеіназ і лі— 1 ІП у вурів. Для відтворення алр°на™о^го стгооУ У м‘я?и "іроі задньої лагігги іііурам ььидили 0. 1л розчин адреншпна гідрохлориду (Московського ендокринного заводу) в- дозі 0.15мл/ 100 г ваги.

Контрольній групі тварин вводили фізіологічний розчин в тому к об'ємі. Щур і в декапітували через ЗО хв після ін’єкції і проводили дослід за схемою, наведеною раніше.

' Досліди по вивченню' впливу адреналового стресу на активність протеіназ і г- :ч виконані а використанням плашок Linbro (США)

та багатоканального мікроспектрофотометра фірми Flow (Великоб-ритс.нія) на базі ’ХДУ і інституту терапії (Харків).

Одержані результати були оброблені математично згідно методу Ст* юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ.

ДОСЛІДЖЕННЯ ОГОШАЛЬНИХ УКОВ ІНОБШЗАЦП ГЕМОПРОТЕЇДІВ НА ПОВЕРХНІ ПОЛІСТЕРОЛОВИХ ПЛАШОК ДЛЯ-ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОТЕІНАЗ I ,-1-IIL

Основною метою досліджень, наведених в даному розділі, було вивчення оптимальних умов ¡мобілізації пероксидази, .гемоглобіну та їх кон'югатів з BSA на поверхні полістеролових пашок. Відомо (Нго Т., Лснхофф Г., 1988), ідо в лужних середовищах відбувається найбільш ' 8 ■

інтенсивна ііюбілізациг імуноглобулінів. Але, навіть у цих умовах, як наш виявлено, рівень імобілізаціі MtHb є дуже низьким, якщо проводити його оцінку по інтенсивності.каталітичного розщеплення пер-сксида водню сорСованим на поверхні полістеролу гемопротеїдом. Ефективність цього процесу для РХ значно вище. Враховуючи, що в аналітичній бюхіміі гемопротеїди використовуються, як правило, у вигляді кон'югатів з другими сполуками (і частіше за все а білками), нами вивчалась при різних умовах ефективність імобілізаціі гемопротеїдів, ковалентно пов' яваних з BSA. ’ Рівень ¡мобілізації кон'югату РХ-BSA суттєво знижувався в'залежності від концентрації кон'югату при імобілізаціі в трис-НСІ-буфері, рН9.0, при порівнянні з імобілі-зацією в' карбонат-б і карбонатному буфері,. рГО.б та 10.8.' Найбільша ступінь імобійізаціі спостерігалась при використанні карбонат-бікарбонатного буферу рН9. б. Таким чином, .в подальших дослідженнях був використаний лише цей буфер. .

В наступній серн експериментів вивчалась залежність рівня імобілізіцн кон'югату РХ-BSA від концентрації буферного розчину. Встановлено, якщо судити по каталітичній активності кон'югату, його рівень імобілізаціі на полістеролі знижується, з ростом концентрації буферу, у всих рипядках на кривих відмічається йік, який омітусїься в бік збільшення концентрації використаного кон'югату з зростанням молярності буферу (Рис. 1). Так, при використанні 0.01, 0.02, 0.2 М буферних розчинів пік знаходиться в області'концентрацій кон'югату, маючих значення 2-2.6, 3-6 і 8-9'мкг/мл, відповідно.

Для кон'югату MtHb-BSA за-однакових умов ¡мобілізації була одержана аналогічна приведеній.вище залежність змін рівня сорбції від концентрації використаного буферу. .

¡мобілізація гемопротеїдів і їх кон'югатів з BSA висушуванням при 37 G з розчину бікарбонату амонію надала можливість успішно регі-струватн ¡мобілізовані на полістеролі не тільки кон'югатн гемопроте- . ідів з BSA, а також РХ і, навіть, MtHb. У всіх »ипадках рівень ферментативної активності а, відповідно, імобілізаціі був значно високим при використанні 0.5 М бікарбонату амонію проти 0.13 Ц (Рис. 2). Виявлено, що ефективність шобілізації-значно вище для РХ, ній для MtHb. Звертае увагу, itp при цій ке молярності бікарбонату амонію ефективність ¡мобілізації коп'югату РХ-BSA Нижче, ніж РХ Порівняний результатів по. ¡мобілізації .висушуванням РХ-BSA і MtHb-BSA показує, що природа білкз, кон'¡игованого з BSA, також має значення для процесу імобілізаціі, причому рівень його суттєво вищий для ■ . 0

Рис. 1 ¡мобілізація кон'югату РХ-ЕЄА при використанні 0.01, 0.02 і 0.2 М буферів (криві 1-3, відповідно). Ось аосцис - використана концентрація РХ-ЕЕА, а по осі ординат - ферментативна активність

бікарбонату амонію для РХ (крива 1), 0.13 і 0.5 М розчинів для

кон'югату РХ-BSA (криві 2, 3),' MtHb (криві 4, 5) і 'його кон'югату з

BSA (крива 6) у 0.5 М розчині. .

РХ-ВЗА, ніж для МШЬ-ВЗЛ. Для першого з вказаних кон'югатів область насичення досягається при високій концентрації (20 мкг/мл), а для другого і і не виявлено аж до концентрат ї 40 мкг/мл. •

активність ПРОТЕ І ПАЗ 1 -1- ІП ПРИ ХОЛОДОВО!.» СТРЕСІ У ЩУРІВ

Результати вивчення стану системи протеї наэа-.л.-1-Ш в динаміці холодового впливу в сироватці крові, цитоаолі тканин серця, легень, печінки, нирок, які мпкть'достовірну різницю при ІІОріВНеННІ а контролем, наведені в табл. 1 і 2.

У всіх досліджених субстанціях через 2 год. після початку впливу холоду відмічено підвищення активності протеіназ на фоні зниження рівня <.-1-ІП проти контролю. Чітке підвищення рівня протеіназ виявлено в сироватці крові та цитоаолі тканини легень. В цитоволі тканин серця та легень цей процес продовжується і через 1 добу. При цьому активність /-1-ІП.в печінці значно перевищує контрольний рівень. Це може свідчити про активацію синтетичних процесів 1/аСо збільшення виходу ¿-1-ІП в кров і підтверджується тим, що через 1 тиждень рівень Х-1-ІП достовірно перевищує контрольний у всіх досліджених субстанціях. '

Підвищення антипротеолітичної аіггивності через тижень після початку впливу холодового' стресу не лишається неконтрольованим з боку протеіназ. До цього періоду дослідження рівень протеіназ підвищується в печінці, нирках проти того, який спостерігається черев добу з початку впливу. Але він не досягає контрольного значення.

' Таблиця 1.

Активність протеіназ і с-1-ІП при холодовому стресі

Експозиція 1 . 1 1 Активність Протеіназі мкг/мл 1 ' 1 Активність МІСГ/МЛ •/-1-ІП,

1 1 х + ЗХ 1 1 Р 1 1 • х + Бх 1 Р 1

Сироватка крові

Контроль ' 1 0.050+0.023 І 1 7. 951+0. 012 1

2 год 1 0. 178+0. 051 І <0.001 1 7. 820+0. 048 І <0.05

1 доба 10. 0118+0. 00021 <0.001 1 7. 961+0.001 1 >0.05

1 тиждень 1 0.017+0.002 1 >0.05 1 7. 992+0.. 002 1 <0. 01

1 тиждень + відігрів! ' 1 0.016+0.006 1 1 >0.05 1 1 7. 992+0. 002 1 <0.01 1

р - ступінь вірогідності проти контролю.

Таблиця 2.

AscTHBiiitrib протеінаа і і -1II при колодоволу егрееі

Експозиція 1 Активність протеінааі Активність 1- ІП,

1 1 мкг/мл 1 1 1 мкг/мл

. 1 ’ 1 х + Sx 1 р ! 1 1 х + 5х 1 Р 1 ■

Цитозоль тшшши легень ' ■

Контроль 1 0. 037+0. 007 1 1 7. 950+0. 006 1

2 год і 0. 189+0. 034 К0. 001 1 7. 748+0. 045 1 <0. 001

2 год + фів. роччин 1 0. 014+0. 005 1 <0.05 1 7. 983+0. 005 1 <0. 01

2 год + трасилол 1 0. 015+0. 006 1 <0.05 1 7. 961+0. 020 і >0. 05

1 тиждень . ' 1 0. 024+0. 007 1 >0.05 1 7. 990+0. 002 ! <0. 001 .

1 тиждень + траоилолі 0. 083+0.' 010 1 <0.01 І 7. 955+0. 034 ¡>0.05 '

1 тиждень + відігрій! 0. 023+0. 00G І >0.05 І 7. 989+0. 002 КО. 001

• . Цитоааль Titaiuaua серця

/ - Контроль 1 0. 074+0. 018 ! І 7. 912+0. 023 1

' 2 год • 1 0. 142+0. 060 \ >0.05 І 7. 790+0. 033 1 <0. 05

2 год + трасилол 1 0. 014+0. 005 І <0.01 1 7. 909+0. 052 ¡>0.05

2 год + відігрів 1 ОГОІ ЗіО. 004 1 <0.01 І 7.962+0. 017 ! >0. 05

1 доба 1 0. 016+0. 003 І <0.01 ! 7. 591+0.114 КО. 05 ...

. 1 тиждень '■ 1 0. 030+0. 006 1 < 0. 05 1 7. 087+0. 003 КО. 01

1 тиждень + ПІДІГРІВІ 0. 024+0. 011 1 <0.05 1 7. 967+0. 015 1 >0. 05 .

Цихоаоль тканини печінки

Контроль ' ! 0.086+0.036 1 ' ! 7. 906+0. 029 1

£ год 1 0.162+0.040 1 >0.05 1 7. 790+0. 029 1 <0. 05

2 год + фів. ровчин 1 0. 014+0. 005 1 >0.05 1 7. 980+0. 007' КО. 05

1 доба . Г 0. 008+0. 003 1 >0.05 1 7.973+0. 014 1 <0. 001

1 тиждень 1 . 0. 027+0.' 005 і >0.05 ! 7. 983+0. 004 1 <0. 05

1 тиждень + трасилол! 0. 065+0. 005 1 >0.05 ! 7.971+0.003 КО. 05

Іішозахь тіииіаш іщрок

Контроль ’ 1 .0. 046+0. 007 1 ' І 7. 923+0. 014 1 . ■

2 год 1 0.168+0. 051 1 <0.05 1 7.64Q+0. 084 1 <0. 01

2 год + фів. розчин 1 0.008+0. 002 1 >0.05 1 7. 982+0. 005 КО. 01

1 тиждень 1 0. 020+0. 004 1 >0.05 1 7. 987+0.002 КО. 001

1 тиждень + відігрів! ' ' ■■ 1 0. 017+0. 005 і >0.05 1 1 1 7. 976+0. 012 1 <0. 05 . I

. р - ступінь ВІРОГІДНОСТІ проти контролю.

' . . ' Л2

В інших тканинах вказано підвищення виражено в меньшій мірі.

Здобуті дані вказують на тісний взаємозв'язок в системі протеї-наза-.-1-ІГІ і надають можливість зробити висновок, що при холодовому стресі велику роль в стимуляції компенсаційних реакцій організму у відповідь на стрес відіграють реакції лімітованого протеолізу, що відбуваються за участю трипсину і його основного інгібітора.

ВІДНОВЛЕННЯ СИСТЕМИ ПРОТЕЇНАЗА-/-і-lit ПІСЛЯ ВПЛИВУ ХОЛОДУ

Метою досліджень в цьому розділі було вивчення дії трасилолу на відновлення системи протеіназа-/-1-ІП після впливу стресу. Враховуючи, що активація протеолізу спостерігалась через 2 год та 1 тиждень після початку впливу холоду, для вивчення, ефекту трасилолу були вибрані саме ці часові експозиції. Ефективність дії трасилолу оцінювали проти того стану системи протеїназа-e-1-Ш, яке було у тварин після, повернення їх у нормальні температурні умови.

Звертає увагу, що обидва Фактори (введення трасилолу і повернення тварин у нормальні температурні умови) викликають зниження активності проте тая. Причому, це виникав на фоні росту рівня <М-ІП.

В ресіультнті ЗсиЛ'осуЬсШНЯ коректуючого впливу після 2-год стресу достовірне підвищення рівня /-1-ІП відмічено в цитозолі тканин легень, печінки, нирок. При тому виявлено, що після введення Фізіологічного розчину вказаний рівень значно збільшується ще й проти показників активності /-1-ІП, одержаних для групи тварин, яких тримали в нормальних температурних умовах. Ін'єкція трасилолу та повернення тварин у нормальні температурні умови на 1 год дають рівноважний ефект на підвищення активності ІП вказаних субстанцій, рі-

вень /-1-ІП відповідає нормі або незначно її перевищує.

В сироватці крові та цитозолі міокарду достовірне підвищення рівня /-1-ІП виявлено лише при поверненні тварин після холодового стресу у нормальні температурні ум^ви.

Таким чином, більш ефективним способом відновлення системи проте і наза-<-1- Ш після 2-год впливу холодового стресу є повернення тварин у нормальні температурні умови на 1 год.

При активації протеолізу, яка спостерігається в тканин.-:с через 1 тиждень після початку впливу холоду, активність протеіназ не перевищує контрольний рівень, а в цитозолі міокарду нижче його. Введення трасилолу в даному випадку не приводить до подальшого росту рівня <.-1-ІП, а навпаки, знижує його, наближуючи до норми. Слідує відмітити, .що в цитозолі тканини легень рівень протеіназ достовірно перевищує контрольне значення. Останнє вказує на необхідність-більшої

дози трасилолу для нормалізації протеїназного рівня тканини легень.

Повернення тварин у нормальні температурні умови на 1 добу після 1-тижневого безперервного впливу холоду не приводить до суттєвих змін рівня протеінаа. Активність протеїназ міокарду тут нижче контрольного значення, а активність інгібітора в цитозолі тканин легень, нирок, сироватки крові - вище контрольного рівня. Це свідчи- . ть, що у випадку тривалого холодового впливу Ц тиждень проти 2-год стресу) більш ефективніш засобом корекції протеїназно-антипро-теіназноі системи є введення трасилолу. • .

В тканині печінки в результаті ін'єкції трасилолу активність протеїназ залишається нижче початкового рівня на фоні високого рівня ./-І-ІП. Можливо, введення трасилолу.в даній дозі сприяє як активації протеолізу, так і синтезу та вивільненню нативного інгібітора (Дов-гаиський А. П. , 1989). . ' ,

ВПЛИВ АДРЕНАЛОВОГО СТРЕСУ НА СИСЯЕЫУ ПРОТЕІНАЗА- v'-1-ІН Результати досліджень активності' протеїназ і нри адр-

еналовому стресі наведені в табл. 3. Слідує помітити, що лише при дослідженні цитозолю тканини легень нами виявлено достовірне збільшення рівня /-1-Ш'до 7.804+0.066 (р<0. 06) проти 7. 342+0.17 (р<0. 01) у контролі. Зміни активності протеїназ і ./-І-ІП в інших досліджених субстанціях носили мало виражений характер. 'Можливо припустити, що вказане підвищення рівня /-1-ІП в тканині легень пов'язане в збільшенням синтезу даного інгібітора легеневими макрофагами.

' . Таблиця 3. •

Коефіцієнти відношень активності протеінаа і ,;1ІН при адреналовому стресі у Сі/рів.

Дослідна рідина ' Контроль . Адреналін

Сироватка крові 0.009 ■ 0.052 .

Цитозоль тканини легень 1 0.043 0. 057

Цитозоль тканини серця 0.085 ■ 0.057

Цитозоль тканини печінки 0.043 0.036 ‘

Цитозоль тканини нирок 0.095 0. 041

Аналіз відношень активності протеіназ і --1-ІП показав найбільшу активацію протеолізу в-сироватці крові, де ії -значення'зростає в б разів при порівнекні ефекту адреналіну в контролем. Стабільний рівень /-1-ІП вказаної субстанції надає основу для висновку про мож-. ' ■ • . 14- -

лив їсть збільшення активності протеїназ в сироватці крові ва рахунок вивільнення під впливом адреналового стресу тканевих протеїназ в кр-овяне русло. При тому підвищенню відношення протеіназа-інгібітор тканини легень, можливо, сприяє збільшення під впливом ін'єкції кате-холамінів кровеналовнення легень (Осадчий JL И. и др., 1986).

' В цитозолі тканин серця і нирок відношення активності протеїназ 1 А-1-1П зменьшується в 1.Б і 2 рази, відповідно, проти контролю. Даний ефект може бути частково пов'язаний', по-перше, з вниженням ■активності /-1-ІП вказаних субстанцій, незважаючи на те, пр ці зміни не мають вираженого характера. По-друге, - з збільшенням виходу проте іназ в кровяне русло під впливом адреналового стресу. 8міни в сис-: темі протеіназа-/-1-ІП в цитозолі тканин серця і нирок мають скоріше первинний характер по відношенню до інших дослідних субстанцій. ■

Відсутність змін дослідних показників в цитозолі тканини печінки виключа можливість синтезу l/або збільшення вивільнення інгібітр-ра в гепатоцитах. . . . . ' .

вшюшш.

. 1. Встановлені оптимальні умови сорбції субстрату протеолітич- .

ної реакції на полістеролі: . ■

- ефективність імобілізації таких гемопротеїдів як РХ і MtHb на полістеролі вище для пероксидази і значно збільшується при використанні їх кон'югатів з BSA.

- процес ¡мобілізації залежить від ряду фіаико-хімічних факторів: pH, типу, концентрації буферу, а якого здійснюється імобіліза-ція, причому найбільша ступінь сорбції субстратів з розчину спостерігається при використанні 0.01М карбонат-бікарбонатного буферу pH 9.6.

- ефективність імобілізації субстратів рівко посилюється, при висушуванні їх з розчинів, які містять бікарбонат амонію, до того ж вона зростає з збільшенням концентрації останнього від 0.13 до 0.5 М.

2. Холодовий стрес приводить до активації протеїназ з сироватці крові, цитозолі тканин легень, серця, печінки, нирок через 2 год. після початку впливу. Активація протеїназ відбувається спочатку на фоні зниження, а потім підвищення активності S-1-JE Збільшення ант-ипротеолітичної активності, в свою чергу, приводить до пригнічення,-а потім - активації протеолізу через тиждень після початку впливу. •

3. Ефективним способом відновлення системи проте і наза-/-1-1П після 2-год. , впливу холоду у щурів є повернення тварин у нормальні температурні умови на 1 год. Після l-тижневого безперервного впливу холоду більш ефективним способом корекці І • системи проте і наза-<М-ІП

1 15

є використання введення трасилолу в дозі 0.16 ил/100 г ваги, що дозволяє аа ЗО хв відновити дісбаланс, який мав місце в даній системі.

4. Зміни в системі.• протеіиаза-/-1-ІП при адреналовому стресі заключаются лише в значному збільшенні рівня л'-1-ІП в легенях і -активації протеоліву в сироватці крові. В інших досліджених субстанціях вони носять мало виражений характер. '

Список публікацій:

1. Самохииа JLМ. , Дубинин A.A. Использование техники иммунофе-рментного анализа для определения активности протеинаэ и их ингибиторов/Применение иммуноферментного анализа в медицине: Tea. докл.

Респ. научн. конф., 28-29 ноября 1989 г. - Харьков, 1989. - С. 62.

2. Самохина JLM., Гладков Ю. Р., Ефимов ЕВ. • Лечение при-

обретенного дефицита альфа-1-ингибитора протеинаэ на ранних- стадиях хронических обструктивних заболеваний дегких//Врачебное дело. -1092.- N10. - 0.97-100. . '

3.. Стародуб Е Ф., Самохина Л. М. , Рачков А. . Определение оптимальных условий иммобилизации гемопротеидов на поверхности под-истироловьх плашок//Укр. біох. журн. - 1993. - 65, N3. - С. 17-22.

4. Самохина. JL М. Влияние холодового стресса на активность про-теинаа и альфа-1-ингибитора протеиназ/Материаль научн. конф. молодих ученых биологического факультета и ЩИ биологии.г Харьков.- 1993.6.21. ' ■ ■ . ’ ' .

Б. Самохина JL U., Дубинин A.A. Способ определения активности. . протеинаэ или их ингибиторов в биологических жидкостях: А. с, 1655991, МКШЭ1КЗЗ/4В, 012С)1/38//0фициалышй бюллетень Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР "Открытия. Изобретения. "- 1991.- N22. - С. 102.. . .

. 6. Самохина JL U., Стародуб {і ф. Активность протеиназ и аль-

фа-1-ингибитора протеиназ при хододовом стрессе у крье//Укр. біох.

А,рн. - 1993. - Нб 1

7. Самохина JL М., Стародуб Е Ф. Восстановление системы протеина- • за-/-1-ингибитор протеинаэ после воздействия холода у крас//Укр. біох. >УРН. - 1993.- N6,- С. 109-112. - .