Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СКЛЕРЫ И КОНЪЮНКТИВЫ ГЛАЗА

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СКЛЕРЫ И КОНЪЮНКТИВЫ ГЛАЗА"

На д

гравах рукописи,

БЫКОВА Елена Владимировна

СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОИ ЗАЩИТЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СКЛЕРЫ И КОНЪЮНКТИВЫ

ГЛАЗА

03.01.04 - биохимия

1 4 ФЕВ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар - 2013

005049612

005049612

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Сторожук Петр Григорьевич Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент

Сахнов Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Островский Олег Владимирович, доктор медицинских наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России), кафедра теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, заведующий кафедрой;

Шестопалов Александр Вячеславович, доктор медицинских наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России), кафедра общей и клинической биохимии № 2, заведующий кафедрой.

Ведущая организация - государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Москва).

Защита состоится « февраля 2013 года в Ю час. на заседании

диссертационного совета Д208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (350063, г.Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 2627375, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «.

2&» ян£др% 2013 г.

Учёный секретарь : п

диссертационного совета Г

Д 208.038.02 профессор {\£[ Скорикова Людмила Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. На современном этапе развития науки и практической медицины методы диагностики и лечения воспалительных заболеваний склеры и конъюнктивы глаза приобрели большую актуальность. Это обусловлено тем, что конъюнктивиты относятся к самым распространенным офтальмологическим заболеваниям и являются одной из основных причин временной нетрудоспособности больных с заболеваниями органов зрения (Ю.Ф. Майчук, 1981; Ю.Ф.Майчук, Е.ВЛни, 2006). Одним из ведущих этиологических факторов развития острого воспаления склеры и конъюнктивы является аденовирусная инфекция (ЕИ.Ковалевский 2010; С.Э.Аветисов, 2011). Острые конъюнктивиты составляют 30% всей офталь-мопатологии, на их долю приходится 66,1% общего числа больных с воспалительными заболеваниями глаз. Особая медико-социальная значимость проблемы аденовирусного поражения глаз связана с преимущественно эпидемическим характером инфекции, имеющей в 70% случаев госпитальное поражение (В.О. Анджелов и соавт., 1989; Ю.Ф.Майчук, 2010).

Роговица и конъюнктива непосредственно соприкасаются с внешней средой - атмосферным воздухом, в котором присутствуют различные патогенные факторы, наиболее агрессивным из повреждающих факторов является супероксидный кислород (Ог"). Он также генерируется самопроизвольно и ферментативно в клетках слизистой конъюнктивы и роговицы. При воспалительных заболеваниях его генерация существенно усиливается. Кроме того, в клетках патологического очага интенсивно образуются свободные радикалы, которые играют ведущую роль в повреждении клеточных структур глаза (Л.Т.Архипова и соавт., 2012).

Известно, что роговица и эпителиальные клетки слизистой оболочки век защищены от агрессивного воздействия внешней среды слезной жидкостью (СЖ), объем которой в норме составляет 6-7 мкл и представляет собой многокомпонентный секрет, находящийся в конъюнктивальной полости и постоянно увлажняющий наружную поверхность эпителия роговицы и

конъюнктивы (В.В.Бржеский и соавт., 2009). Неспецифические антибактериальные и антирадикальные защитные свойства СЖ обеспечиваются рядом ферментов: супероксиддисмутазой, каталазой, лизоцимом, церулоплазмином, а также другими факторами органической природы, являющимися естественными метаболитами организма: мочевиной, мочевой кислотой, билирубином, креатинином, индиканом, свободными аминокислотами и аммиаком (FJ.Haberich, 1982; A.Gang et al.; 2006, Е.Е.Сомов, 2011).

Одним из современных методов изучения показателей прооксидантно-антиоксидантной системы является исследование способности биологических жидкостей гасить люминолзависимую хемилюминесценцию (л-ХЛ). Известно, что л-XJI связана с образованием и наличием супероксидного, гид-роксильного радикалов и гипохлорита (Ю.А.Владимиров, М.П.Шерстнев, 1989), ее интенсивность зависит от уровня процессов развития свободнора-дикальных реакций перекисного окисления липидов (Т.Н.Федорова и соавт., 1991; Dandona P. et al., 1996). Исследование л-ХЛ в биолошческих жидкостях организма при различных заболеваниях с каждым годом находит все большее и большее распространение, поскольку оно, с одной стороны, достаточно хорошо отражает антиоксидантные свойства исследуемых объектов, а с другой — доступно для выполнения в клинических условиях (Ю.А. Владимиров, О.А.Азизова и соавт., 1991; А.П.Сторожук, 2000; И.В.Постникова и соавт., 2004; П.Г.Сторожук, 2011).

В настоящее время перспективным направлением в офтальмологической практике является изучение влияния препаратов, используемых при лечении острых конъюнктивитов аденовирусной и стафилококковой этиологии, на параметры хемилюминесценции в системе НЬ-НаСЬ-люминол.

Таким образом, изучение показателей антирадикальной защиты (АРЗ) в СЖ совместно с данными исследования антибактериальной защиты (АБЗ) позволит индивидуализировать подбор медикаментозных препаратов с учетом конкретной клинической ситуации в зависимости от состояния неспеци-

фических защитных систем СЖ, а также повысит эффективность проводимой терапии при острых кератоконъюнктивитах.

Целью исследования является оценка активности факторов неспецифической защиты в слезной жидкости и эффективности использования этих показателей в диагностическом алгоритме и при выборе оптимальной терапии у пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями склеры и конъюнктивы.

В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

1. Оценить состояние антивирусной, антибактериальной и антирадикальной защиты слезной жидкости в норме и при воспалительных заболеваниях склеры и конъюнктивы глаза.

2. Провести сравнительный анализ состояния факторов неспецифической защиты слезной жидкости, носослезной жидкости, отделяемого из носоглотки и сыворотки крови в физиологических условиях.

3. В лабораторных условиях (in vitro) оценить действие лекарственных средств, применяемых при лечении воспалительных заболеваний склеры и конъюнктивы, на состояние факторов неспецифической защиты слезной жидкости.

4. Выявить изменение активности ферментов антирадикальной и антибактериальной защиты слезной жидкости у пациентов при общепринятом лечении аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивитов.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики воспалительных заболеваний слизистой оболочки глаза и контроля за эффективностью лечения аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивитов.

Научная новизна. Впервые проведен анализ состояния неспецифических факторов защиты (лизоцима, церулоплазмина) и способности слезной жидкости гасить активные формы кислорода в норме и при воспалении, вызванном аденовирусной и стафилококковой инфекцией.

Впервые показано, что существует устойчивый параллелизм в динамике изменений активности факторов неспецифической защиты, содержащихся в

сыворотке крови, слезной и назолякримальной жидкостях, отделяемом из носоглотки.

Впервые установлено, что большинство лекарственных средств, применяемых в офтальмологии для лечения вирусного и стафилококкового кера-токонъюнктивита, способно ингибировать активность факторов неспецифической защиты слезной жидкости (лизоцим, церулоплазмин, л-ХЛ), что требует введения в комплекс терапии мероприятий по коррекции антибактериальной и антирадикальной защиты.

Показано, что при инфицированности конъюнктивы золотистым стафилококком происходят более выраженные сдвиги показателей факторов неспецифической защиты слезной жидкости, чем при аденовирусной инфекции, но эти изменения легче поддаются медикаментозной коррекции, поэтому при лечении стафилококкового кератоконъюнктивита (СтКК) происходит более быстрое восстановление потенциала неспецифической защиты слезной жидкости.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют возможности применения биохимических показателей СЖ в качестве диагностических критериев при оценке состояния больных с воспалительными заболеваниями конъюнктивы. Для клинической практики разработаны клинико-диагностические показатели оценки эффективности сочетанной терапии аденовирусного кератоконъюнктивита (АВКК) и СтКК - противовирусной, противовоспалительной и иммунотерапии.

В ходе исследования на основании биохимических показателей СЖ (лизоцим, церулоплазимн, л-ХЛ) разработан лабораторный алгоритм неинва-зивной диагностики и мониторинга проводимой терапии при АВКК и СтКК для офтальмологической практики.

Внедрение в практику результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику работы Краснодарского филиала ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза»» им. С.Н.Федорова, кафедры глазных болезней Кубанского государственного медицинского университета, офтальмологаче-

ских кабинетов и отделений лечебных учреждений Краснодара и Краснодарского края.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При аденовирусном кератоконъюнктивите обнаруживаются изменения содержания и активности факторов неспецифической защиты в слезной жидкости по сравнению со слезой здоровых людей.

2. Инфицированность золотистым стафилококком конъюнктивы вызывает более выраженные сдвиги показателей факторов неспецифической защиты слезной жидкости, чем при аденовирусной инфекции, но они легче поддаются медикаментозной коррекции.

3. Использование в офтальмологической практике биохимических тестов, отражающих состояние неспецифической резистентности слезной жидкости, позволяет более эффективно осуществлять антивирусную и антибактериальную терапию, а также прогнозировать исход заболевания.

4. В качестве объективных биохимических тестов, отражающих состояние антирадикальной и антибактериальной защиты слезной жидкости, следует использовать алгоритм диагностических тестов, включающий определения активности лизоцима, церулоплазмина и способность СЖ обезвреживать активные формы кислорода (АФК) по результатам люминол-хемилюминисцентной реакции.

Апробация результатов исследования. Материалы работы доложены и обсуждены на V Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии», 2010, г. Москва; VI Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии», 2011, г. Москва; VIII Congress of the South-Fast European Oph-tlialmologian Socety, 2011, Turkey, Istambul.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 статей в центральной медицинской печати, рекомендо-

ванной Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 рисунками, содержит 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, пяти глав, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Список литературы включает 216 источников, из них 154 - отечественных и 62 - иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования послужила СЖ, полученная у 25 здоровых взрослых людей обоих полов (50 глаз - контрольная группа 1) и 53 больных (106 глаз) в острый период аденовирусного (группа 2, п-54 глаза) и стафилококкового (группа 3, п=52 глаза) кератоконъюнктивита в возрасте от 18 до 60 лет. СЖ собирали с двух глаз пациента при помощи специальной пипетки со съемными наконечниками в полиэтиленовые эпиндорфы (на 2 мл), что составляло одну пробу (0,5-1,5 мл), которую сразу же подвергали исследованию.

В ходе работы были использованы сыворотка донорской крови, слезная и назолякримальная жидкости, отделяемое носоглотки, полученные натощак от здоровых людей. В образцах проб определяли активность лизоцима и це-рулоплазмина. Наряду с этим исследовали (in vitro) в биологических жидкостях изменение активности ферментов под воздействием десяти лекарственных средств, наиболее часто применяемых для лечения аденовирусного кератоконъюнктивита и офтальмогерпеса. Для этих целей к опытной пробе добавляли одно из лекарственных средств (в соотношении 1:10). Полученную смесь инкубировали в течении 30 минут при Т° 22"С, после чего в ней определяли активность ферментов.

Работа была выполнена в соответствии с дизайном исследования: 1. Клинический этап — отбор пациентов в соответствии с протоколом обследования при кератоконъюнктивите.

2. Лабораторный этап - исследование показателей аденовирусных антигенов (гексон-протеинов) для экспресс-диагностики АВКК и иммунологического анализа при АВКК и СтКК, микробиологический посев содержимого конъюнктивальной полости на флору и чувствительность к антибиотикам, определение показателей воспаления (С-реактивный белок, серомукоид, сиа-ловые кислоты) в крови, а также показателей АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ.

3. Оценка влияния офтальмологических препаратов в лабораторных тест-системах на показатели АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ для подбора корригирующей терапии при АВКК и СтКК.

4. Разработка схем лечения при АВКК и СтКК с учетом влияния препаратов на показатели АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ.

5. Оценка эффективности проведенной терапии при АВКК и СтКК по лабораторным показателям, в том числе по состоянию компонентов АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ, и клинико-инструментальным данным.

Критерии отбора пациентов. Всего было обследовано 53 пациента в острый период аденовирусного (п=27) и стафилококкового (п=26) керато-конъюнктивита.

Диагноз АВКК у больных выставлялся на основании разработанного индивидуального протокола обследования, включающего сбор анамнестических и результаты клинических и специализированных лабораторных данных. При первичной беседе все 27 больных жаловались на резь, боль, ощущение инородного тела, слезотечение и покраснение. При первичном осмотре выявлено: наличие отека век у 5 больных, серозного или гнойного отделяемого у 8 больных, инъецированная конъюнктива у 27 человек, кровоизлияния — у 11, отек конъюнктивы - у 12 и эпителиальная инфильтрация роговицы у 7 человек. У всех больных тест Ширмера был >15 мм, а тест Норна в пределах 16-21 с. Терапия больным АВКК назначалась с учетом результатов исследования наличия специфических иммуноглобулинов М (1§№) и О (^О) к аденовирусу в крови.

Диагноз СтКК у больных выставлялся на основании разработанного индивидуального протокола обследования, включающего сбор анамнестических и результаты клинических и специализированных лабораторных данных. При первичной беседе все 26 больных жаловались на резь, боль, ощущение инородного тела, слезотечение и гнойное отделяемое, покраснение. При первичном осмотре выявлено: наличие отека век у 13 больных, гнойного отделяемого у 24 больных, инъецированная конъюнктива была у 22 человек, кровоизлияния - у 12, отек конъюнктивы - у 14 человек и у 13 человек эпителиальная инфильтрация роговицы. У всех больных тест Ширмера был >15 мм, а тест Норна в пределах 16-21 с.

Слёзную жидкость собирали у пациентов до лечения АВКК и СтКК и через 14 дней от начала заболевания, чтобы проследить динамику течения заболевания на фоне проводимой терапии.

Биохимические методы исследования. В СЖ 25 здоровых людей обоего пола (п=50 глаз) определяли активность лизоцима и церулоплазмина, а также способность СЖ гасить активные формы кислорода (по л-XJI). Подобным образом исследовали СЖ у 27 больных (п=54 глаза) в острую фазу АВКК и 26 больных (п=54 глаза) со СтКК, находившихся на амбулаторном лечении.

Лизоцим определяли по методу П.Г. Сторожука (П.Г. Сторожук и со-авт., 2001, патент на изобретение № 2170932, опубликовано 20.07.2001). В качестве субстрата использовали патентованную лиофилизированную культуру Micrococcus Lysodeikticus - ML (США) и фермент Lyzozymc (активность 20000 ед/мг), выделенный из куриных яиц. Растворы субстрата и фермента готовили ex tempore на 0,067 М фосфатном буфере с рН 6,2 и хранили в емкости со льдом. Рабочий раствор субстрата содержит ML 0,08 мг/мл, при колориметрии на МФК-2МП он имеет оптическую плотность 0,300 (экстинкций) при X = 540 нм и толщине слоя 10 мм. Для расчета активности лизоцима, определяемой после действия препаратов, пользовались специальным калибровочным графиком и выражали в условных единицах (усл.ед.).

Церулоплазмин определяли по методу (B.C. Камышников, 2000), адаптированному нами для СЖ. Метод основан на способности церулоплазмина окислять р-феншендиамин. Реакцию ставили в течение 1 часа при 35"С, а останавливали путем добавления фтористого натрия. По оптической плотности образовавшихся окрашенных продуктов, определяемой при X = 540 нм, судили об активности церулоплазмина.

При люминол-хемилюминисцентном (л-XJI) методе определение способности СЖ гасить АФК проводили при длине волны (1) 335 нм. л-ХЛ СЖ определяли в Трис-HCl буфере, реакцию индуцировали раствором Н202. Объемы буферного раствора, содержащего люминол, и Н2О2 подобраны таким образом, чтобы при их соединении максимальная вспышка л-ХЛ равнялась 10,0±0,2 усл. ед., которая принимается за 100%. Для расчета активности показателя в единицах компонентов антирадикальной защиты СЖ, способных гасить Л-ХЛ, пользовались формулой: X = (К - О) х 100 = усл. ед./мл, где X - АРЗ СЖ по способности гасить л-ХЛ; К - контроль (по холостой пробе =10,0); О - количество усл.ед. непогашенной л-ХЛ; 100 - коэффициент пересчета усл.ед. на 1 мл СЖ.

Оценка эффективности лекарственных препаратов in vitro. В настоящее время для лечения и профилактики воспалительных заболеваний глаза и слезного аппарата применяется широкий арсенал лекарственных средств. В их число наиболее часто включают противовоспалительные (дик-лофенак, дикло-Ф), антивирусные (офтальмоферон, полудан, циклоферон, интерферон), антисептики (раствор сульфацил-натрия, витабакт), а также анестетики (лидокаин и алкаин) и аскорбиновую кислоту. В комплексную терапию при АВКК и СтКК включались медикаментозные препараты местного и общего действия (табл. 1).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с методами, принятыми в вариационной статистике (А.Н.Герасимов, 2007), с использованием программы STATISTICA версия 6.0. О достоверности отличий средних величин изучаемых показателей срав-

ниваемых групп судили по величине Меритерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р<0,05.

Таблица 1

Лекарственные средства местного и общего действия, используемые для лечения аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивита

Аденовирусный Стафилококковый

кератоконъюнктивит кератоконъюнктивит

Базисная терапия

Противовирусная:

о офтальмоферон +

о интерферон +

о циклоферон + -

о полудан + -

Антибактериальная:

о левомицетии +

о геитамицин +

о тобрамицин - +

о неомицин - +

о офлоксацин - +

о тетрациклин +

Дополнительная терапия

Антисептики:

о раствор сульфацил-натрия + +

о витабакт + +

Нестероидные противовоспалитель-

ные средства: + +

о индоколлир + +

о дикло Ф

Стероидные и комбинированные

препараты: +

о дексаметазон + +

о макситрол + +

о тобрадекс

Репаративиая терапия

о баларпан +

о солкосерил-желе +

о корнерегель +

Слезозаместительная терапия +

Антигистаминные препараты +

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе проведенных исследований было установлено, что у всех больных с АВКК и СтКК наблюдались выраженные изменения показателей АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ в период разгара заболевания. Результаты биохимических исследований СЖ у больных в острую фазу АВКК статистически обработаны и представлены в таблице 2.

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что у больных в острую фазу АВКК в слезной жидкости повышается активность церулоплазмина на 38%, лизоцима - на 21,6%, а способность СЖ гасить активные формы кислорода (АФК) возрастает более чем на 80%.

Таблица 2

Показатели активности лизоцима, церулоплазмина в слезной жидкости и её способность гаснть активные формы кислорода (по л-ХЛ

реакции) в острую фазу аденовирусного кератоконъюнктивита

Исследуемые показатели Абсолютные данные (М±ш) Относительные значения, %

Церулоплазмин, ед/мл 331,9 ±30,1 100,0

Здоровые (контроль, п=25)

Церулоплазмин, ед/мл 458,13 ±5,08 138,0*

Больные АВКК (п=27)

Лизоцим, усл.ед. 1243,4 ± 73,6 100,0

Здоровые (контроль, п=25)

Лизоцим, усл.ед. 1512,4 ± 102,8 121,6*

Больные АВКК (п=27)

л-ХЛ (негашеные АФК), усл. ед. 6,12 ± 0,48 100,0

Здоровые (контроль, п=25)

л-ХЛ (негашеные АФК), усл. ед. 1,18 ±0,12 19,3*

Больные АВКК (п=27)

Примечание: * - отмечено р < 0,05. При повторных исследованиях СЖ на фоне проводимой терапии при АВКК цифровые показатели у больных практически не отличались от первоначальных результатов (р>0,05).

При изучении биохимических показателей СЖ у больных со СтКК установлено (табл. 3), что в острую фазу стафилококкового кератоконъюнкти-вита существенно снижается в СЖ содержание церулоплазмина (на 48,3%) и способность СЖ гасить АФК (на 43,5%). В этот период болезни также наблюдается тенденция и к снижению активности лизоцима (на 11,4%).

Терапию больных СтКК проводили с учетом результатов микробиологического посева, а также выявленной чувствительности золотистого стафилококка к антибиотикам, которая определялась по отношению к левомицети-ну, гентамицину, тобрамицину, неомицину, офлоксацину, тетрациклину.

Таблица 3

Показатели активности лизоцима, церулоплазмина в слезной жидкости и её способность гасить активные формы кислорода (по л-ХЛ

реакции) в острую фазу стафилококкового кератоконъюнктивита

Исследуемые показатели Абсолютные данные (М±ш) Относительные значения, %

Церулоплазмин, ед/мл Здоровые (контроль, п=25) 331,9 ±30,1 100,0

Церулоплазмин, ед/мл Больные СтКК (п=26) 171,6 ± 13,9 51,7*

Лизоцим, усл.ед. Здоровые (контроль, п=25) 1243,4 ± 73,6 100,0

Лизоцим, усл.ед. Больные СтКК (п=26) 1012,1 ±59,3 81,4*

л-ХЛ (негашеные АФК), усл. ед. Здоровые (контроль, п=25) 6,12 ±0,48 100,0

л-ХЛ (негашеные АФК), усл. ед. Больные СтКК (п=26) 8,78 ± 0,77 143,5*

Примечание: * - отмечено р < 0,05.

Назначенный комплекс лечения больным СтКК благоприятно отразился не только на клиническом течении болезни, но и на динамике исследуемых показателей в слезной жидкости (табл. 4). Так, активность церулоплазмина достигла 252,9 ед/мл, что составило 76,2% от контрольных значений

(р<0,05), лизоцим увеличился до 1115,2 усл. ед. (89,7% от контроля, р>0,05), а л-ХЛ - 6,68 усл. ед. (109,2% от контроля, р>0,05).

Таблица 4

Показатели активности лизоцима, церулоплазмина в слезной жидкости и её способность гасить активные формы кислорода (по л-ХЛ реакции)

при ста< |>илококковом кератокоиъюнктивите до и после лечения

Показатели Котроль-ная группа (п=25). М±гп Больные СтКК! (до лечения, п=26) М± т Больные СтКК2 (после лечения, п=26) М±ш % СтКК! по отношению к контрольной группе % СтКК2 по отношению к контрольной группе

Церуло- плазмин, ед/мл 331,9+30,1 171,6+13,9 252,9±21,1 51,7 76,2

Лизоцим, усл.ед. 1243,4±73,6 1012,1±59,3 1115,2±96,6 81,4 89,7

л-ХЛ (негашеные АФК), усл.ед. 6,12 ±0,48 8,78±0,77 6,68±0,32 143,5 109,2

Сравнение отклонений результатов исследуемых показателей здоровых людей, больных АВКК и больных СтКК представляло научный и практический интерес, поскольку у этих пациентов не только различные возбудители, но и различная по степени тяжести клиническая картина течения болезни (табл. 5 и рис.1).

Таблица 5

Сравнительные данные по активности церулоплазмина, лизоцима в слезной жидкости и её способности гасить АФК у больных аденови-_русным и стафилококковым кератоконъюиктнвитом_

Показатели Контрольная группа, п=25 Больные АВКК, п=27 Больные СтКК, п=26

М±ш | % М±т | % М±т | %

Церулоплазмин (ед/мл) 331,9±30Д |100,0 458,13 ±5,08 |138,0* 171,6+13,9 151,7*

Лизоцим (усл. ед.) 1243,4±73,6 ¡100,0 1512,4+102,8 1121,6* 1012Д±59,3 [81,4*

л-ХЛ (усл.ед. негашеных АФК) б,12 ±0,48 |100,0 1,18 ±0,12 | 19,3* 8,78±0,77 1143,5*

Примечание: * - отмечено р < 0,05.

Из данных, приведенных в таблице 5, видно, что все три исследуемых показателя при АВКК статистически достоверно увеличиваются, а при СтКК - уменьшаются. Это, вероятно, связано с различным механизмом действия аденовируса и стафилококкового эндотоксина.

негашеные АФК

гашеные АФК

НО группа 1 (контроль) Е группа 2 (АВКК) Н группа 3 (СтКК)

Рис. 1. Распределение гашеных и негашеных форм активных форм кислорода в СЖ при инфекционных кератоконъюнктивитах.

* - отмечено р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы (группа 1).

Поскольку вирусы способны встраивать свою ДНК в ДНК клеток хозяина, это, вероятно, приводит к более интенсивному синтезу биомолекул, необходимых как для хозяина, так и для построения сложной структуры вируса. Отсюда, по-видимому, и происходит при АВКК увеличение активности церулоплазмина и лизоцима. Что же касается столь существенного усиления способности СЖ гасить активные формы кислорода (рис.1), то это явление можно объяснить усилением фильтрационной способности слезных желез для низко молекулярных соединений из сыворотки крови при АВКК, которые обладают свойством гасить активные формы кислорода. Это постоянные

компоненты сыворотки крови: мочевина, мочевая кислота, креатин, креати-нин, билирубин, индикан, свободные аминокислоты и аммиак.

Изменения активности изучаемых показателей при СтКК в сторону уменьшения, вероятно, связаны с действием стафилококкового эндотоксина, который обладает ингибирующими свойствами.

Поскольку развитие кератоконъюнктивитов зачастую возникает на фоне инфекционного процесса, захватывающего назолякримальный канал и носоглотку, то не только научный, но и практический интерес представляло изучение в физиологических условиях организации функционирования неспецифических защитных систем и активности их компонентов (например, лизоцима и церулоплазмина) в биологических жидкостях слизистых оболочек глаз и носоглотки, в сравнении с сывороткой крови (табл. 6).

Таблица б

Показатели активности лизоцима и церулоплазмина в биологических жидкостях в организме человека в физиологических условиях

Биологическая жидкость Лизоцим (усл.ед.), М ±т в% Церулоплазмин (ед/мл), М ± т в %

1. Сыворотка крови 41,19 ±3,86 100,0 198,5 ± 19,5 100,0

2. Слезная жидкость 1639,71± 68,52* 3980,8 139,1 ± 13,8* 70,1

3. Назолякримальная жидкость 137,40 ±6,74* 333,6 22,3 ± 1,9* 11,2

4. Отделяемое из носоглотки 94,27 ±7,15* 228,9 16,2 ± 1,6* 8,2

В таблице 6 видно, что активность лизоцима в отделяемом из носоглотки выше на 128,9% по сравнению с сывороткой крови, активность которой взята за 100%, в назолякримальной жидкости - на 233,6%, а в слезной жидкости она выше в 40 раз. Такое распределение активности лизоцима в биологических жидкостях можно объяснить следующим образом: слезные железы, вне всякого сомнения, синтезируют лизоцим самостоятельно, поэтому так высока его активность в слезной жидкости. Почти в три раза она выше в назолякримальной жидкости, это связано с тем, что в полость носа слеза скатывается по назолякримальному каналу и создает в нем довольно высокие

концентрации фермента. Затем назолякримальная жидкость поступает в носоглотку, в результате чего в отделяемом из носоглотки повышается активность лизоцима по сравнению с сывороткой. Полученные в исследовании данные позволяют говорить о существовании физиологического назолякри-мального градиента лизоцима, препятствующего в естественных условиях распространению инфекционных агентов из носоглотки в конъюнктивальный мешок, что, вероятно, является одним из основных механизмов реализации неспецифической резистентности слизистых оболочек в организме.

Полученные данные по влиянию лекарственных препаратов на показатели активности лизоцима представлены в таблицах 7 и 8, из которых видно, что в результате совместной 30-минутной инкубации лизоцима и большинства лекарственных средств, действие фермента остается неизменным, а в присутствии интерферона, циклоферона как мощного иммунокорректора и полудана статистически достоверно снижается активность лизоцима на 35-43%.

Вероятно, что выявленное под действием интерферона, циклоферона и полудана снижение активности лизоцима наступает исключительно за счет существенного сдвига рН среды в кислую сторону. Другие лекарственные средства оказались индифферентными по отношению к лизоциму.

Таблица 7

Действие лекарственных средств на активность лизоцима после 30-минутной совместной инкубации при +22°С (определяемой по количеству гидролизованных Micrococcus Lysodeikticus, соотношение 1:10)

Препарат п Экстинкции Ед. фермента % не ги-дролизо-ванных ML

Исходные Конечные

0. Контроль 18 0,314 0,182 43 57

1. Сульфацил-натрия 18 0,305 0,156 50 50

2. Дикло-Ф 18 0,304 0,160 49 51

3. Офтальмоферон 18 0.300 0,174 42 58

4. Алкаин 18 0,303 0,155 50 50

5. Лидокаин 18 0,303 0,160 48 52

Таблица 8

Действие лекарственных средств на активность лнзоцима после 30-мннутной совместной инкубации при +22°С (определяемой по коли-

честву гидролнзованных Мкгососсш 1л'аос1е1кЦси5, соотношение 1:10)

Препарат п Экстинкции Ед. фермента % не гидролнзованных Ж

Исходные Конечные

0. Контроль 14 0,314 0,137 58 42

1. Циклоферон 14 0,303 0,184 38 62

2. Аскорбиновая кислота 14 0,311 0,138 57 43

3. Интерферон 14 0,312 0,210 33 67

4. Диклофенак 14 0,305 0.148 53 47

5. Полудан 14 0,307 0,199 34 66

Активность церулоплазмина при действии дикло-ф, офтальмоферона, циклоферона, интерферона, полудана, алкаина и лидокаина повышается на 30-50%, лишь при действии сульфацил-натрия она остается на прежнем уровне. В присутствии аскорбиновой кислоты и диклофенака ферментная активность церулоплазмина ингибируется. О том, что реакция среды, создаваемая некоторыми препаратами, оказывает ингибирующее действие на активность изучаемых ферментов, свидетельствует динамика активности церулоплазмина в присутствии дикло-ф и диклофенака. В состав обоих препаратов входит одно и то же вещество, производное ацетилсалициловой кислоты — диклофенак натрия, натриевая соль 2-[(2,6-дихлорфенил)-амино]-бензолуксусной кислоты (А.Б.Данилов, 2009), а вспомогательные вещества различные. Так, диклофенак содержит натрий пиросульфат и гидроксид натрия, а в дикло-ф эти компоненты отсутствуют. Из этого следует, что смещение рН в кислую сторону (аскорбиновая кислота) или щелочную (гидроксид натрия в диклофенаке) вызывает существенное ингибирование фермента.

В соответствии с полученными результатами был разработан алгоритм диагностики и подбора терапии при АВКК и СтКК, включающий: 1) на первом этапе - клинико-инструментальное обследование, выполнение экспресс-диагностики с помощью аденодетектора, определение показателей

воспаления (С-реактивный белок, серомукоид, сиаловые кислоты) в крови, иммунологических показателей (специфических в крови, показате-

лей АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ;

2) на втором этапе - микробиологический посев с определением чувствительности микрофлоры к антибиотикам с последующим индивидуализированным подходом при выборе терапии и назначением в случае дисбаланса неспецифических защитных систем СЖ при одинаковой чувствительности микрофлоры таких препаратов, которые наименее снижают потенциал АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ. Например, при снижении активности лизоцима в СЖ нецелесообразно применение интерферона, циклоферона и полудана, а при снижении активности церулоплазмина нецелесообразно применение аскорбиновой кислоты и диклофенака, при снижении л-ХЛ рекомендуется назначение местной антиоксидантной терапии;

3) на третьем этапе - мониторинг проводимой терапии путем определения показателей АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ и коррекция лечения по результатам неинвазивного определения показателей СЖ.

Эффективность предложенного алгоритма была апробирована в клинической практике, при его применении было отмечено сокращение сроков выздоровления пациентов на 26,4%, снижение частоты осложнений на 46,1%.

Таким образом, на основании проведенных исследований показана необходимость предварительной оценки состояния АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ при выборе мероприятий, корригирующих биохимические нарушения при АВКК и СтКК, что снижает вероятность развития осложнений.

Выводы

1. Аденовирусный кератоконъюнктивит сопровождается характерными изменениями активности неспецифических факторов антибактериальной и антирадикальной защиты в слезной жидкости, заключающимися в увеличении активности церулоплазмина на 38,0%, лизоцима - на 21,6% и способности гасить активные формы кислорода ('02,0{,ОН, Н202) на 80,7 %.

2. Стафилококковый кератоконъюиктивит протекает с менее выраженными клиническими признаками и сопровождается снижением активности факторов антибактериальной и антирадикальной защиты слезной жидкости (церулоплазмина на 48,3%, лизоцима на 18,6% и антирадикальной способности слезной жидкости на 43,5%), что может быть обусловлено ингибирую-щим влиянием стафилококкового токсина на изучаемые показатели.

3. Изучение некоторых лекарственных средств, применяемых в офтальмологии для лечения вирусных и бактериальных инфекций (аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивитов), выявило способность цик-лоферона, интерферона и полудана ингибировать активность лизоцима.

4. Физиологический назолякримальный градиент лизоцима слизистых оболочек участвует в формировании неспецифических гуморальных защитных систем и свидетельствует о том, что слезные железы являются органами, секретирующими лизоцим.

5. Изменение активности церулоплазмина в присутствии ряда исследованных лекарственных средств, по-видимому, можно связать с химической структурой препаратов и функциональными изменениями молекулы фермента.

6. Изученные показатели и особенности изменений факторов неспецифической защиты в слезной жидкости позволили разработать и предложить для клиники алгоритм диагностики степени выраженности патологического процесса и мониторинга проводимой терапии у пациентов с аденовирусным и стафилококковым кератоконъюнктивитом.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ 1. Для разработки индивидуальных рекомендаций и схем лечения пациентов с помощью средств, улучшающих показатели неспецифических защитных систем в СЖ, в острую фазу АВКК и СтКК необходима предварительная оценка состояния АРЗ (л-ХЛ) и АБЗ (лизоцима, церулоплазмина) в СЖ, что позволит снизить частоту осложнений и сократить сроки нетрудоспособности при данных патологических состояниях.

2. При выборе схем лечения у больных с АВКК и СтКК целесообразно при прочих равных условиях использовать препараты, повышающие потенциал неспецифических защитных систем слезной жидкости, в том числе при подборе антибактериальных средств после проведения микробиологического посева. В случае одинаковой чувствительности микрофлоры к антибиотикам, рационально использовать препараты, неугнетающие АРЗ (л-XJI) и АБЗ (ли-зоцима, церулоплазмина) в СЖ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Быкова, Е.В. Опыт применения препарата «Гистохром» в комплексной терапии заболеваний роговицы / Е.В. Быкова, Т.О. Сотникова, Е.Е. Соголовская // Сб. науч. трудов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике». - СПб., 2006. - С.22-24.

2. Биохимические методы исследования слезной жидкости при вирусном кератоконъюнктивите / Е.В. Быкова, Е.Е. Соголовская, Т.С. Хвостова, Л.А. Сторожук // Сб. науч. работ V Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов. — М., 2010. — С.43-45.

3. *Факторы неспецифической антибактериальной и антирадикальной защиты биологических жидкостей и действие на их активность лекарственных средств, применяемых при вирусных инфекциях в офтальмологии / ПГ. Сторожук, Е.В. Быкова, Л.А. Сторожук, Т.С. Хвостова, И.М. Быков // Аллергология и иммунология. - 2010.-T.il, №4. - С.317-320.

4. *Быкова, Е.В. Факторы антибактериальной и антирадикальной защиты слезной жидкости при вирусном кератоконъюнктивите / Е.В. Быкова, Т.С. Хвостова, Л.А. Сторожук // International Journal Immunorehabilitation. — 2010. — Т. 12, №2.-С. 186.

5. Состояние факторов неспецифической защиты слезной жидкости в острый период аденовирусного кератоконъюнктивита /Е.В. Быкова, С.Н. Сахнов, Л.А. Сторожук, Т.С. Хвостова // Сб. науч. работ VI Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов. - М., 2011. -С.71-72.

6. *Быкова, Е.В. Способность слезной жидкости гасить активные формы кислорода в острую фазу аденовирусного кератоконъюнктивита /Е.В. Быкова, Л.А. Сторожук, Т.С. Хвостова // Фундаментальные исследования. - 2011. -№ 9. — С.398-399.

7. Sakhnov S.N., Bikova E.V., Storozhuk L.A., Khvostova T.S. Lysozymyne and ceruloplazmin lacrimal glands release at epidemic keratoconjnctivitis acuity. VIII Congress of the South-East European Ophthalmologics Society. — Turkey, Istam-bul. -2011. — P. 7-8.

8. *Быкова, Е.В. Действие противовоспалительных, антивирусных, антибактериальных и анестезиологических препаратов, применяемых в офтальмологии, на активность слезной жидкости / Е.В. Быкова, JI.A. Сторожук // Кубанский научный медицинский вестник. - 2011. - №1. - С. 167-170.

9. Антирадикальная активность слезной жидкости в острую фазу аденовирусного кератоконъюнктивита / Е.В. Быкова, С.Н. Сахнов, Т.О. Сотникова, Л.А. Сторожук // Сб. тезис. X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения - 2012». - М., 2012. - С.204-205.

10.Определение активности факторов неспецифической защиты слезной жидкости при лечении вирусных заболеваний глазной поверхности / Е.В. Быкова, С.Н. Сахнов, Е.Е. Соголовская, Т.П. Габриэль // Тезисы докладов. III Всероссийской научной конференции с международным участием «Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике». - СПб., 2012. — С.40-41.

11. Сравнительная характеристика факторов неспецифической защиты биологических жидкостей организма и действие на их активность лекарственных средств при вирусных инфекциях в офтальмологии / П.Г. Сторожук, Е.В. Быкова, Л.А. Сторожук, Т.С. Хвостова, И.М. Быков //Аллергология и иммунология. - 2012. - Т. 13, № 1.-С.8-11.

*- работа опубликована в журнале, входящем в перечень изданий, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки России для опубликования материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Список сокращений

АБЗ - антибактериальная защита

АВКК - аденовирусный кератоконъюнюгивит

АРЗ - антирадикальная защита

АФК - активные формы кислорода

л-ХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция

СЖ - слезная жидкость

СтКК - стафилококковый кератоконъюнктивит

IgG - иммуноглобулин G

IgM - иммуноглобулин М

ML - Micrococcus Lysodeikticus

Ог" - супероксидный кислород

Быкова Елена Владимировна

СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СКЛЕРЫ И КОНЪЮНКТИВЫ ГЛАЗА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 24.01.2013 Набор компьютерный. Гарнитура Times. Усл. п.л. 1,0

Тираж 100 экз. Отпечатано на копировально-множительной технике Типография ООО «редакция газеты «Всякая всячина». 350020, г. Краснодар, ул.Бабушкина, 252, т. 259-41-59.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Быкова, Елена Владимировна, Краснодар

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России)

СОСТОЯНИЕ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СКЛЕРЫ И КОНЪЮНКТИВЫ ГЛАЗА

На і си

04201354761

БЫКОВА Елена Владимировна

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сторожук П.Г. Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент Сахнов С.Н.

Краснодар - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений....................................................................... 4

Введение..................................................................................... 5

Глава I. Обзор литературы................................................................ 10

1.1. Слезный аппарат глаза.............................................................. 10

1.2. Современное представление о слезной жидкости и её физиологическая роль............................................................................................ 12

1.3. Слезная жидкость при офтальмологической патологии...................... 15

1.4. Аденовирусный кератоконъюнктивит............................................ 17

1.5. Стафилококковый кератоконъюнктивит......................................... 26

1.6. Факторы антибактериальной и антирадикальной неспецифической защиты в слезной жидкости и других биологических жидкостях организма человека...................................................................................... 29

1.6.1. Антибактериальные и антирадикальные свойства слезной жидкости.. 29

1.6.2. Роль лизоцима в организации антибактериальной защиты слизистых оболочек....................................................................... 30

1.6.3. Роль церулоплазмина в организации антибактериальной защиты организма.................................................................................... 33

1.6.4. Способность биологических жидкостей гасить активные формы

кислорода (по реакции люминолзависимой хемилюминесценции).............. 35

Глава II. Материал и методы исследования.......................................... 38

2.1. Контингент обследуемых лиц и исследуемый материал...................... 38

2.2. Метод определения активности лизоцима в СЖ............................... 42

2.3. Метод определения активности церулоплазмина в СЖ............................. 43

2.4. Метод определения способности СЖ гасить активные формы кислорода по л-ХЛ-реакции............................................................ 44

2.5. Оценка эффективности лекарственных средств, применяемых для лечения больных аденовирусным и стафилококковым кератоконъюнкти-витами, in vitro............................................................................. 45

2.6. Статистическая обработка полученных данных.............................. 51

Глава III. Состояние факторов неспецифической защиты в слезной

жидкости при аденовирусном кератоконъюнктивите............................. 52

3.1. Показатели антибактериальной и антирадикальной защиты слезной

жидкости у больных аденовирусным кератоконъюнктивитом.................. 55

Глава IV. Динамика показателей факторов неспецифической защиты

в слезной жидкости при стафилококковом кератоконъюнктивите............. 63

4.1. Состояние антирадикальной и антибактериальной защиты слезной жидкости при инфекционном кератоконъюнктивите, вызванным

золотистым стафилококком............................................................ 66

Глава V. Показатели неспецифической защиты слезной жидкости в физиологических условиях и при воспалительных заболеваниях глаз на фоне проводимой терапии............................................................... 72

5.1. Показатели неспецифической защиты слезной жидкости при инфекционных воспалительных заболеваниях склеры и конъюнктивы глаз............ 74

5.2. Действие противовоспалительных, антивирусных, антибактериальных и анестезиологических препаратов, применяемых в офтальмологии, на активность лизоцима в слезной жидкости........................................... 78

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................. 93

ВЫВОДЫ.................................................................................... 100

ЛИТЕРАТУРА.............................................................................. 102

ПРИЛОЖЕНИЯ

121

Список сокращений

АБЗ - антибактериальная защита АВ - аденовирус

АВКК - аденовирусный кератоконъюнктивит АРЗ - антирадикальная защита АФК - активные формы кислорода КА - каталаза

л-XJI - люминолзависимая хемилюминесценция

ПГ - пептидогликаны

ПОЛ - перекисное окисления липидов

СЖ - слезная жидкость

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

СтКК - стафилококковый кератоконъюнктивит

ЦП - церулоплазмин

СРБ - С-реактивный белок

GS-H - восстановленный глутатион

IgG - иммуноглобулин G

IgM - иммуноглобулин М

ML - Micrococcus Lysodeikticus

02" - супероксидный кислород

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На современном этапе развития науки и практической медицины методы диагностики и лечения воспалительных заболеваний склеры и конъюнктивы глаза приобрели большую актуальность. Это обусловлено тем, что конъюнктивиты относятся к самым распространенным офтальмологическим заболеваниям и являются одной из основных причин временной нетрудоспособности больных с заболеваниями органов зрения (Ю.Ф. Майчук, 1981; Ю.Ф. Майчук, Е.В. Яни, 2006). Одним из ведущих этиологических факторов развития острого воспаления склеры и конъюнктивы является аденовирусная инфекция (Е.И. Ковалевский, 2003; С.Э. Авети-сов, 2011). Острые конъюнктивиты составляют 30% всей офтальмопатоло-гии, на их долю приходится 66,7% общего числа больных с воспалительными заболеваниями глаз. Особая медико-социальная значимость проблемы аденовирусного поражения глаз связана с преимущественно эпидемическим характером инфекции, имеющей в 70% случаев госпитальное поражение (В.О. Анджелов и соавт., 1989; Ю.Ф. Майчук, 2010).

Роговица и конъюнктива непосредственно соприкасаются с внешней средой - атмосферным воздухом, в котором присутствуют различные патогенные факторы, наиболее агрессивным из повреждающих факторов является супероксидный кислород (02"). Он также генерируется самопроизвольно и ферментативно в клетках слизистой конъюнктивы и роговицы. При воспалительных заболеваниях его генерация существенно усиливается. Кроме того, в клетках патологического очага интенсивно образуются свободные радикалы, которые играют ведущую роль в повреждении клеточных структур глаза (Л.Т. Архипова и соавт., 2012).

Известно, что роговица и эпителиальные клетки слизистой оболочки век защищены от агрессивного воздействия внешней среды слезной жидкостью (СЖ), объем которой в норме составляет 6-7 мкл. СЖ представляет собой многокомпонентный секрет, находящийся в конъюнктивальной полости и постоянно увлажняющий наружную поверхность эпителия роговицы и конъюнктивы (В.В. Бржеский и соавт., 2009). Неспецифические антибактериальные и антирадикальные защитные свойства СЖ обеспечиваются рядом

ферментов: супероксиддисмутазой, каталазой, лизоцимом, церулоплазмином, а также другими факторами органической природы, являющимися естественными метаболитами организма: мочевиной, мочевой кислотой, билирубином, креатинином, индиканом, свободными аминокислотами и аммиаком (F.J. Haberich, 1982; A. Gang et al.,2006; Е.Е. Сомов, 2011).

Одним из современных методов изучения показателей прооксидантно-антиоксидантной системы является исследование способности биологических жидкостей гасить люминолзависимую хемилюминесценцию (л-XJI). Известно, что л-XJI связана с образованием и наличием супероксидного, гид-роксильного радикалов и гипохлорита (Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев, 1989), ее интенсивность зависит от уровня процессов развития свободнора-дикальных реакций перекисного окисления липидов (Т.Н. Федорова и соавт., 1991; P. Dandona et al., 1996). Исследование л-ХЛ в биологических жидкостях организма при различных заболеваниях с каждым годом находит все большее и большее распространение, поскольку оно, с одной стороны, достаточно хорошо отражает антиоксидантные свойства исследуемых объектов, а с другой - доступно для выполнения в клинических условиях (Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова и соавт., 1991; А.П. Сторожук, 2004; И.В. Постникова и соавт., 2004; П.Г. Сторожук, 2011).

В настоящее время перспективным направлением в офтальмологической практике является изучение влияния препаратов, используемых при лечении острых конъюнктивитов аденовирусной и стафилококковой этиологии, на параметры хемилюминесценции в системе НЬ-НгСЬ-люминол.

Таким образом, изучение показателей антирадикальной защиты (АРЗ) в СЖ совместно с данными исследования антибактериальной защиты (АБЗ) позволит индивидуализировать подбор медикаментозных препаратов с учетом конкретной клинической ситуации в зависимости от состояния неспецифических защитных систем СЖ, а также повысит эффективность проводимой терапии при острых кератоконъюнктивитах.

Целью исследования является оценка активности факторов неспецифической защиты в слезной жидкости и эффективности использования этих показателей в диагностическом алгоритме и при выборе оптимальной тера-

пии у пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями склеры и конъюнктивы.

В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

1. Оценить состояние антивирусной, антибактериальной и антирадикальной защиты слезной жидкости в норме и при воспалительных заболеваниях склеры и конъюнктивы глаза.

2. Провести сравнительный анализ состояния факторов неспецифической защиты слезной жидкости, носослезной жидкости, отделяемого из носоглотки и сыворотки крови в физиологических условиях.

3. В лабораторных условиях (in vitro) оценить действие лекарственных средств, применяемых при лечении воспалительных заболеваний склеры и конъюнктивы, на состояние факторов неспецифической защиты слезной жидкости.

4. Выявить изменение активности ферментов антирадикальной и антибактериальной защиты слезной жидкости у пациентов при общепринятом лечении аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивитов.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики воспалительных заболеваний слизистой оболочки глаза и контроля за эффективностью лечения аденовирусного и стафилококкового кератоконъюнктивитов.

Научная новизна

Впервые проведен анализ состояния неспецифических факторов защиты (лизоцима, церулоплазмина) и способности слезной жидкости гасить активные формы кислорода в норме и при воспалении, вызванном аденовирусной и стафилококковой инфекцией.

Впервые показано, что существует устойчивый параллелизм в динамике изменений активности факторов неспецифической защиты, содержащихся в сыворотке крови, слезной и назолякримальной жидкостях, отделяемом из носоглотки.

Впервые установлено, что большинство лекарственных средств, применяемых в офтальмологии для лечения вирусного и стафилококкового кера-токонъюнктивита, способно ингибировать активность факторов неспецифической защиты слезной жидкости (лизоцим, церулоплазмин, л-XJI), что тре-

бует введения в комплекс терапии мероприятий по коррекции антибактериальной и антирадикальной защиты.

Показано, что при инфицированности конъюнктивы золотистым стафилококком происходят более выраженные сдвиги показателей факторов неспецифической защиты слезной жидкости, чем при аденовирусной инфекции, но эти изменения легче поддаются медикаментозной коррекции, поэтому при лечении стафилококкового кератоконъюнктивита (СтКК) происходит более быстрое восстановление потенциала неспецифической защиты слезной жидкости.

Научно-практическая значимость работы

Полученные данные расширяют возможности применения биохимических показателей СЖ в качестве диагностических критериев при оценке состояния больных с воспалительными заболеваниями конъюнктивы. Для клинической практики разработаны клинико-диагностические показатели оценки эффективности сочетанной терапии аденовирусного кератоконъюнктивита (АВКК) и СтКК - противовирусной, противовоспалительной и иммунотерапии.

В ходе исследования на основании биохимических показателей СЖ (лизоцим, церулоплазмин, л-ХЛ) разработан лабораторный алгоритм неинва-зивной диагностики и мониторинга проводимой терапии при АВКК и СтКК для офтальмологической практики.

Внедрение в практику результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику работы Краснодарского филиала ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза»» им. С.Н. Федорова, кафедры глазных болезней Кубанского государственного медицинского университета, офтальмологических кабинетов и отделений лечебных учреждений Краснодара и Краснодарского края.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При аденовирусном кератоконъюнктивите обнаруживаются изменения содержания и активности факторов неспецифической защиты в слезной жидкости по сравнению со слезой здоровых людей.

2. Инфицированность золотистым стафилококком конъюнктивы вызы-

вает более выраженные сдвиги показателей факторов неспецифической защиты слезной жидкости,'чем при аденовирусной инфекции, но они легче поддаются медикаментозной коррекции.

3. Использование в офтальмологической практике биохимических тестов, отражающих состояние неспецифической резистентности слезной жидкости, позволяет более эффективно осуществлять антивирусную и антибактериальную терапию, а также прогнозировать исход заболевания.

4. В качестве объективных биохимических тестов, отражающих состояние антирадикальной и антибактериальной защиты слезной жидкости, следует использовать алгоритм диагностических тестов, включающий определения активности лизоцима, церулоплазмина и способность СЖ обезвреживать активные формы кислорода (АФК) по результатам люминол-хемилюминисцентной реакции.

Апробация результатов исследования

Материалы работы доложены и обсуждены на V Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии», 2010, г. Москва; VI Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов «Актуальные проблемы офтальмологии», 2011, г. Москва; VIII Congress of the South-Fast European Ophthalmologian Socety, 2011, Turkey, Istambul.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 статей в центральной медицинской печати, рекомендованной Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 рисунками, содержит 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, пяти глав, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Список литературы включает 216 источников, из них 154 - отечественных и 62 - иностранных авторов.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Слезный аппарат человека

Слезный аппарат относится к вспомогательным органам глаза и состоит из слезопродуцирующего и слезоотводящего отделов. Продукция слезной жидкости осуществляется главной слезной железой и мелкими добавочными железами Краузе (1842 г.) и Вольфринга (1885 г.). Добавочные слезные железы функционируют постоянно и осуществляют суточную потребность глаза в увлажнении (Э.К. Вольфринг, 1885; Е.Е. Сомов, 2011). Слезная железа принадлежит к сложным альвеолярно-трубчатым серозным железам. Она представлена орбитальной и пальпебральной частями, разделенными сухожилием мышцы, поддерживающей верхнее веко. Орбитальная часть расположена в ямке слезной железы лобной кости под верхне-наружным краем глазницы. Выводные протоки обеих частей железы открываются в верхний конъюнкти-вальный свод. Кровоснабжение слезной железы осуществляется за счет слезной артерии, отходящей от глазной артерии, отток крови происходит через слезную вену. Основная роль в секреции слезной железы принадлежит парасимпатическим волокнам, входящим в состав лицевого нерва. По морфологическим признакам слезные железы максимально близки к слюнным, что может служить одной из причин одновременного поражения всех их при некоторых синдромальных состояниях, например, болезни Микулича, синдроме Шегрена и др. (В.В. Бржеский и соавт., 2009). Дополнительные слезные железы Краузе и Вольфринга по своему строению аналогичны главной слезной железе и отличаются друг от друга лишь местом своего нахождения. Они располагаются в конъюнктиве, верхнем и нижнем сводах, а также в слезном мясце. Работами некоторых отечественных авторов (A.A. Отелин, 1948; B.JI. Харитонова, 1950) показано, что количество дополнительных слезных желез у разных людей различно. Причем колебания могут быть существенными.

Слезоотводящие пути начинаются слезным ручьем, представляющим собой капиллярную щель между задним ребром нижнего века и глазным яблоком, по которому слеза стекает в слезное озеро, расположенное у медиального угла глазной щели. В слезное озеро погружены нижняя и верхняя слезные точки, находящиеся на вершинах слезных сосочков (А. РагакаБ, 1929). От слезных точек начинаются нижний и верхний слезные канальцы, впадающие в слезный мешок, который окружен рыхлой клетчаткой и фасциаль-ным