Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние энергетического обмена и антиоксидантной защиты клеток крови у больных на фоне сахарного диабета и его осложнений

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние энергетического обмена и антиоксидантной защиты клеток крови у больных на фоне сахарного диабета и его осложнений"

На правах рукописи

КУЛ ЛЕВА

Ирина Олеговна

СОСТОЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК КРОВИ У БОЛЬНЫХ НА ФОНЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА И ЕГО

ОСЛОЖНЕНИЙ

03.01.04 - биохимия 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005552574

1 8 СЕН 2014

Краснодар-2014

005552574

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России). Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор,

член корреспондент РАМН Терентьев Александр Александрович доктор биологических наук, главный научный сотрудник НИЛ патологии сердечно-сосудистой системы РНИМУ Микаелян Нина Погосовна

Официальные оппоненты:

Никулина Дина Максимовна, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО АГМА Минздрава России), кафедра биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики, заведующая кафедрой. Овсянников Виктор Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России), кафедра патологической физиологии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация - государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 2 октября 2014 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д208.038.02 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России; 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России http://www.ksma.ru

Автореферат разослан «<23 » августа 2014 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д208.038.02 доктор медицинских наук, 0

доцент ' Лапина Наталья Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость сахарным диабетом (СД) вследствие высокой распространённости, ранней инвалидизации и уменьшения продолжительности жизни больных является одной из важнейших медико-социальных проблем. Основной причиной повышенной смертности населения являются сосудистые осложнения СД, в том числе диабетическая по-линейропатия (ДПН).

Молекулярные механизмы, определяющие взаимосвязь между нарушением гомеостаза глюкозы и развитием диабетических ангиопатий, окончательно не ясны. Многочисленные исследования в этой области свидетельствуют о том, что повреждающее действие гипергликемии на сосудистую стенку опосредуется свободными радикалами. При этом установлено, что в механизмах повышения окислительного стресса (ОС) при диабете участвует не только гипергликемия, но и гипоинсулинемия [М.И.Балаболкин. 2000; А.СепеНо, 2000; А.Ма]сЬггак, 2001; Ф.А.Гершкорон, 2005; К.В.Антонова, 2008 Б.СЬоисИшп, 2013].

Последствия окислительного стресса нейтрализуется системой антиокси-дантной защиты. Нарушение функционирования данной системы может играть важную роль в патогенезе СД первого (СД 1-го) и СД второго (СД 2-го) типов.

Имеющиеся литературные данные, посвященные изучению состояния пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) у больных с диабетом очень противоречивы и касаются исследований лишь некоторых показателей системы «ПОЛ-АОС» [Я.С^гаг^е, 2000; Н.К.Зенков, 2001; У.Ьапкш, 2003; И.И.Дедов, 2005].

В настоящее время особое значение придаётся состоянию мембран эритроцитов, как своеобразной модели для оценки степени тяжести патологического процесса. Ведущая роль в исследованиях отводится структурно — функциональным особенностям мембран, изучению интенсивности мембра-но-дестабилизирующих процессов и метаболизма мембранных липидов. Высокая корреляционная связь между изменениями свойств эритроцитарных и клеточных мембран внутренних органов позволяет использовать мембраны эритроцитов как естественную модель для исследования общих характеристик всех биологических мембран [М.В.Колосова, 2000].

Таким образом, изучение состояния эритроцитарных мембран, процессов перекисного окисления липидов, а также различных звеньев антиоксидантной системы имеет важное прогностичееское значение для больных сахарным диабетом. Это исследование ускорит познание патогенетических механизмов заболевания и будет способствовать развитию использования мембраностабилизирующей и антиоксидантной терапии.

Цель исследования — изучение комплекса нарушений энергетического обмена, особенностей изменения уровня пероксидации липидов и системы антиоксидантной защиты крови у больных СД первого и СД второго типов в

зависимости от продолжительности, степени компенсации и наличия осложнений заболевания.

Задачи исследования:

1. Оценить уровень липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и системы АОЗ в крови у больных СД второго типа в зависимости от продолжительности заболевания.

2. Исследовать влияние развития декомпенсации на процессы ПОЛ, состояние эритроцитарных мембран и систему АОЗ у больных с СД второго типа.

3. Изучить особенности липидной пероксидации, состояние эритроцитарных мембран и антиоксидантной системы в крови у больных с осложнениями СД.

4. Провести комплексное изучение нарушений энергетического обмена на фоне развития окислительного стресса у больных с сахарным диабетом и дислипидемией.

5. На основе выявленных особенностей состояния системы ПОЛ-АОС в крови у больных СД второго типа и потребления глюкозы эритроцитами, разработать практические рекомендации по выявлению активации перекис-ных процессов при СД и коррекции этих нарушении препаратами мембрано-стабилизирующей и антиоксидантной направленности.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование системы «ПОЛ-АОС» у больных с СД, включающее определение первичных и вторичных продуктов липидной пероксидации, изучение различных звеньев АОС, обладающих как внутриклеточной, так и внеклеточной направленностью действия.

Впервые для оценки состояния эритроцитарных мембран при СД второго типа использован метод определения утилизации глюкозы эритроцитами с помощью которого обнаружены значительные нарушения потребления глюкозы уже в дебюте данной патологии.

Впервые проведен анализ взаимосвязи нарушений энергетического обмена и утилизации глюкозы эритроцитами от степени развития окислительного стресса у больных сахарным диабетом второго типа и установлено угнетение аэробного синтеза АТФ вследствие активации гликолитических процессов и возрастания степени лактацидоза у больных с СД первого типа и впервые выявленным СД второго типа. Установлено, что увеличение концентрации метаболитов ПОЛ и лакгацидоз особенно выражены при СД второго типа.

Впервые показано, что по мере нарастания продолжительности заболевания, степени декомпенсации и тяжести течения заболевания, гиперлипоси-нтетическая направленность метаболизма липидов играет важную роль в патогенезе формирования диабетической полинейропатии.

Впервые у диабетических больных с дислипидемией и нарушением энергетического обмена изучено влияние мембраномодулирующего препарата липостабила и антиоксиданта липоевой кислоты для коррекции метаболической недостаточности. Впервые получен эффект возрастания утилизации глюкозы эритроцитами при применении этих препаратов, что свидетельствует о повышении чувствительности клеток к инсулину.

Практическая значимость результатов исследования. Изучение механизмов нарушения энергетического обмена и системы ПОЛ-АОЗ клеток крови при СД повышает возможности профилактики осложнений заболевания и позволяет предложить новый подход к коррекции нарушений энергетического обмена у больных.

Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Усиление процессов ПОЛ, изменения структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран и нарушения в системе антиоксидантной защиты происходят уже в дебюте СД первого типа и остаются таковыми на протяжении всего исследуемого периода заболевания.

2. При декомпенсации СД наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания восстановленного глутатиона, снижение активности всех исследуемых ферментов (супероксид-дисмутазы, каталазы, кроме глутатионпероксидазы) и в результате этого снижение утилизации глюкозы клетками по сравнению с группой компенсированного диабета. Развитие осложнений СД второго типа сопровождается более выраженным повышением плазменного уровня МДА и снижением активности СОД по сравнению с соответствующими показателями без осложнений.

Внедрение результатов исследования. Результаты проведённых исследований внедрены в лабораторную практику центральной научной исследовательской лаборатории Северо-Осетинской государственной медицинской академии. Материалы диссертации используются при чтении курсов: «Биохимия», «Биохимия тканей», «Молекулярные механизмы гормональной регуляции» студентам Северо-Осетинской государственной медицинской академии, а также в терапевтической практике поликлиники №1 г. Владикавказа.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работах, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Российский медицинский журнал», «Проблемы эндокринологии», «Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии», «Фундаментальные исследования», «Владикавказский медико-биологический вестник»).

Основные положения работы доложены и обсуждены на XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 710.12.2011 год), а также на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 21 марта 2013 год).

Апробация диссертации проведена на совместном заседании сотрудников кафедры биологической химии лечебного факультета, кафедры патофизиологии, клинической патофизиологии, кафедры эндокринологии и сотрудников научной исследовательской лаборатории патологии сердечно-сосудистой системы Российского научного исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова.

Личный вклад автора в исследование. Диссертантом определены основные идеи и методики исследования. Автор самостоятельно провел по-

дробный анализ современной литературы, набор больных и исследование лабораторных показателей крови пациентов. Представленные в диссертации результаты исследований, статистическая обработка и анализ полученных данных выполнены лично автором. На основе полученных данных сделаны выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, объекта и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель включает 221 источник, в том числе 126 отечественных и 95 зарубежных авторов. Работа содержит 16 таблиц и проиллюстрирована 10 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В соответствии с поставленной целью и задачами было обследовано 108 больных обоего пола в возрасте от 23 до 65 лет, страдающих сахарным диабетом. Все пациенты были разделены на 3 группы, согласно диагнозу.

1-ю группу больных составили 28 человек, с диагнозом «сахарный диабет второго типа, впервые выявленный». Средний возраст пациентов составил 52 года. Больные поступили в стационар в декомпенсированном состоянии, течение заболевания было осложнено ДПН.

2-я группа включала в себя 25 человек в возрасте 23-35 лет с сахарным диабетом первого типа. 15 больных находились в компенсированном состоянии, 20 - в фазе декомпенсации. Декомпенсированных пациентов разделили на 2 подгруппы: с кетоацидозом и без него.

3-я группа представлена сахарным диабетом второго типа с полинейро-патией. Средний возраст больных 53 года. В группу вошли 55 пациентов, которые подразделялись на подгруппы с компенсированным течением заболевания (29 человек) и декомпенсированным (26 человек), а также по продолжительности заболевания до 8 лет и более 8 лет.

Группу контроля составили 30 человек без эндокринной патологии. Причем, контрольная группа для сравнения с СД первого типа состояла из 15 человек того же возраста, для СД второго типа - 15 человек 40-65 лет, средний возраст 52 года.

Степень компенсации СД оценивали по уровню гликемии натощак до и более 7,5 ммоль/л и концентрации гликированного гемоглобина (НЬА]С). Декомпенсацию углеводного обмена у больных считали при показателе НЬА)С более 6,5 %.

Материалом для исследования послужила кровь больных СД. Забор материала для исследования проводили дважды в условиях стационара при поступлении больного в отделение в связи с ухудшением общего состояния, а также для кор-

рекции доз применяемых препаратов, и перед выпиской после соответствующей терапии спустя 12 дней: гипогликемическими препаратами групп сульфонил-мочевины в суточной дозе 30-60 мг, бигуанидов 1000 - 2000 мг, препаратами человеческого инсулина короткой продолжительности действия 12-40 Ед/сут., средней продолжительности в суточной дозе 6-42 Ед, и длительного действия 12-40 Ед/сут, а также антиоксидантом липоевой кислотой 300 мг/сут. и эссенциальными фосфолипидами - липостабилом 500 мг/сут.

У всех пациентов наряду с клиническим обследованием проводили определение концентрации глюкозы в сыворотке крови и уровень HbAic. Об активности процессов ПОЛ в плазме крови и мембране эритроцитов судили по содержанию первичных продуктов пероксидации: гидроперекисей (ГП) и диеновых конъюгатов (ДК), определяемых методом В.Б.Гаврилова [1983], и вторичного продукта — малонового диальдегида (МДА), для определения концентрации которого использовали метод K.Yagi [1976]. Состояние анти-оксидантной защиты в плазме крови и в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию общего, восстановленного и окисленного глутатиона измеряемого циклическим методом М.Е.Андерсон [1985], а также по активности глутатионпероксидазы (ГПО), супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ). Уровень общей антиоксидантной активности (ОАА) исследовали в сыворотке крови больных на анализаторе. Состояние энергетического обмена оценивали по уровню гликемии, АТФ, лактата и утилизации глюкозы эритроцитами. Исследование липидного состава крови включало в себя определение концентрации общего холестерина (ХС), триацилглицеридов (ТГ), ХС липо-протеинов высокой плотности (ЛПВП) при помощи набора реактивов фирмы Анапитикон (Германия), ХС липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и ХС липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) по формуле У.Т.Фридевапьда [1972], а коэффициента атерогенности (КА) по формуле А.М.Климова [1980]. Все исследования проводили до и после терапии.

Статистическую обработку материала осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента. При изучении характера взаимоотношений исследуемых параметров использовали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при р<0,05. Все средние значения в таблицах представлены в виде M ± т.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение уровня липидной пероксидации у больных СД показало увеличение содержания как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ по сравнению с контрольной группой (табл.1; 2; 3).

Так у больных СД 2-го типа отмечено повышение концентраций ГП, ДК и МДА относительно контрольной группы, как в фазе компенсации, так и на стадии декомпенсации (табл.1).

Таблица 1

Концентрация продуктов ПОЛ в крови у больных СД 2-го типа при поступлении в стационар, М±т

Исследуемый показатель Группы исследования

Контрольная группа п=7 Больные СД 2-го типа при поступлении в стационар

Фаза компенсации п=15 Фаза декомпенсации

Длительность СД менее 8 лет п=7 Длительность СД более 8 лет п=12

МДА плазмы, мкмоль/л 3,09±0,12 3,24±0,34 3,49±0,18* 3,9±0,21*,**

МДА эритроцитов, мкмоль/л 1,41±0,09 2,34±0,22* 2,18±0,26* 2,3±0,23*

гп, ммоль/мл 0,53±0,11 0,79±0,15 0,84±0,21 0,98±0,19*

ДК, ммоль/мл 2,46±0,7 3,81±0,6* 3,66±0,36* 4,21±0,57*

Примечание: *-р<0,05 по сравнению с контрольной группой

** - р<0,05 по сравнению с группой при длительности СД менее 8 лет

При этом более выраженное увеличение концентрации вторичного продукта свободнорадикального окисления - МДА в эритроцитах отмечается при декомпенсированной форме СД 2-го типа с полинейропатией, при длительности заболевания более 8 лет, а также у больных с впервые выявленным СД 2-го типа (табл.2), что свидетельствует о развитии более выраженного системного окислительного стресса в данных группах.

Содержание ДК в группе с декомпенсацией повышено по сравнению с группой компенсированного диабета, то есть можно отметить, что достижение компенсации (нормализация углеводного обмена) сопровождается снижением уровня ДК в эритроцитах больных СД. Подобное изменение содержания ДК, вероятно, можно объяснить более выраженным недостатком инсулина при де-компенсированном состоянии. Инсулин является ингибитором чувствительной к гормонам липазы и при снижении его концентрации липолиз активируется. В результате этого свободные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе триацилглицеридов, поступают одновременно с глицеролом в кровь и, таким образом, происходит увеличение их концентрации. А поскольку свободные жирные кислоты являются основным субстратом окисления, то при увеличении их содержания можно ожидать усиления в целом ин-

тенсивности свободнорадикальное окисление и в первую очередь - увеличения содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК. К тому же в группе больных СД второго типа с ДПН между содержанием ДК и уровнем НЬА|С имеется прямая корреляционная зависимость (г=0,67), что подтверждает влияние углеводного обмена на уровень продуктов ПОЛ.

У больных СД второго типа с полинейропатией даже в компенсированной фазе концентрация НЬА1С составляла в среднем (6,41±0,31) %, что достоверно превышает нормальные значения 4-5,9 %. В фазе декомпенсации количество гликированного гемоглобина почти в 2 раза (9,65±0,41) выше нормальных величин.

Таблица 2

Изменение метаболических показателей крови у больных СД 1-го типа и с впервые выявленным СД 2-го типа, М±т

Исследуемый показатель Группы исследований

Контрольная группа Группа больных СД 1-го типа Группа больных с впервые выявленным СД 2-го типа

ОАА, ед.акт. 1,72 ±0,13 п=7 2,38 ± 0,09* п=9 2,37 ± 0,06 п=10

МДА плазмы, мкмоль/л 1,92 ±0,08 п=7 3,09±0,23 п=9 4,83±0,24* п=24

МДА эритроцитов, мкмоль/л 0,97 ±0,06 п=7 2,31±0,27* п=9 2,45±0,19* п=24

ГП, ммоль/мл 0,53± 0,11 п=7 0,39±0,06 п=20 0,95±0,14* п=10

ДК, ммоль/л 1,52±0,37 п=7 3,91±0,05* п=15 4,37±0,14* п=19

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

В крови больных СД 1-го типа с осложнением в виде кетоацидоза и без него (табл.3) уровень эритроцитарного и плазменного МДА, а также содержание ДК достоверно повышены по сравнению с контрольными величинами. В ходе работы обнаружено повышение уровня плазменного МДА (р<0,05) у больных с кетоацидозом по сравнению с группой больных без кетоза. По содержанию эритроцитарного МДА и ДК значительных различий между группами не найдено.

После лечения препаратами сульфонилмочевины (диабетон МВ-20мг), бигуа-нидов (глкжофаж - 2000 мг), инсулина короткого действия (актропид 6-10 Ед) и ан-тиоксидантами (берлитион 300мг) и достоверного снижения гликемии натощак у больных независимо от стадии компенсации, концентрация всех, изучен-

ных нами, показателей перекисного окисления липидов в эритроцитах снижалась, в особенности концентрации ГП при компенсации и эритроцитарно-го МДА при декомпенсации СД 2-го типа и с длительностью заболевания свыше 8 лет.

Таблица 3

Концентрация продуктов ПОЛ в крови у больных СД 1-го типа с кетоацидозом и без кетоза,

_ __М±ш

Исследуемый показатель Группы исследования

Контрольная группа Группа больных СД 1-го типа без кетоза Группа больных СД 1-го типа с кетоацидозом

МДА плазмы, мкмоль/л 0,75 ±0,03 п=18 1,16±0,09* п=15 1,21±0,02*,** п=17

МДА эритроцитов, мкмоль/л 0,53 ±0,02 п=18 0,92±0,07* п=15 0,95±0,02* п=17

дк, ммоль/л 0,57±0,03 п=18 0,97±0,05* п=8 0,96±0,07* п=8

Примечание: *-р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - р<0,05 по сравнению с группой без осложнений

Накопление продуктов пероксидации может привести к появлению в мембранах своеобразных пор за счёт увеличения содержания гидрофильно-модифицированных углеводородных хвостов, а также к увеличению её жёсткости за счёт снижения содержания ненасыщенных жирных кислот и, таким образом, влиять на состояние инсулиновых рецепторов, снизить их гормон связывающую активность и привести к снижению потребления глюкозы клетками.

Подтверждением этому являются полученные нами данные по определению утилизации глюкозы эритроцитами.

У больных СД снижается и базальное и стимулируемое инсулином потребление глюкозы клетками крови in vitro, особенно значительно при де-компенсированном СД 2-го типа (рис.1) и при длительности течения заболевания более 8 лет (рис. 2).

3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

*

гч i ' :

II

ii

Контрольная группа

Группа больных СД 2-го типа при поступлении в стационар

Группа больных СД 2-го типа при выписки из стационара

□ Базагьное потребление глюкозы, концентрация глюкозы 7г.

□ Стимулируемое потребление глюкюзы, концентрация глокозы 7г.

□ Базагьное потребление глюкозы, концентрация глюкозы Юг.

□ Стимулируемое потребление глюкюзы, концентрация глюкозы Юг.

Рисунок 1. Утилизация глюкозы эритроцитами in vitro у больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** -р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар

3 2,5 2 1,5 1

0,5 О

г-Ь |—г— * * *

т_ I —f—

■ ■

Контрольная группа

Группа при поступлении в стационар

Группа при выписки из стационара

□ Базальное потребление глюкозы

□ Стимулируемое потребление глюкюзы

Рисунок 2. Утилизация глюкозы эритроцитами in vitro у больных сахарным диабетом второго типа длительностью более 8 лет

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар

У больных СД 2-го типа с продолжительностью диабета менее 8 лет также снижается базальное потребление глюкозы эритроцитами, но в меньшей степени. Так как стимулируемая инсулином утилизация глюкозы в данных группах больных угнетается в большей степени, то можно предполагать, что имеется инсулинорезистентность.

Как видно из диаграмм при добавлении разных концентраций глюкозы и инсулина к отмытым эритроцитам выраженных изменений в реакции клеток к инсулину не отмечается, что свидетельствует о снижении чувствительности эритроцитов к инсулину.

После проведенного лечения в группе с декомпенсированным течением диабета второго типа потребление глюкозы эритроцитами достоверно повышается: базальное на 26%, стимулируемое на 23%, но не достигает контрольных величин. В группе больных с длительностью сахарного диабета второго типа более 8 лет наблюдается незначительное повышение данных показателей.

Проведение экспериментов с эритроцитами, взятыми у больных СД 1-го типа показало, что на фоне значительного повышения уровня ТБК- активных продуктов при сниженной антиоксидантной защите, значительно снижается, как базальное, так и стимулируемое потребление глюкозы клетками. Результаты исследований зависимости между дозой инсулина и характером изменений одного из метаболических показателей свидетельствуют, что при физиологической инсулинемии у больных СД 1-го типа утилизация глюкозы эритроцитами ¡п уПго снижена по сравнению с контролем, при гиперинсули-немии этот процесс приближается к норме.

Следовательно, у больных СД первого типа снижается чувствительность клеток к пороговым физиологическим дозам инсулина. Большие дозы инсулина активируют ПОЛ, несмотря на компенсаторное «утолщение» мембраны, регистрируемое по увеличению содержания липидного фосфора (11,5±0,2 в контрольной фуппе и 3,82±0,19 ммоль/109 клеток при СД первого типа), о чём и свидетельствует сниженная чувствительность клеток к инсулину.

Таким образом, полученные нами результаты по снижению степени потребления глюкозы эритроцитами позволяют считать, что клеточные мембраны при СД претерпевают существенные структурные и функциональные изменения, сопровождающимся снижением энергообеспечения клеток.

Исследуя состояние энергетического обмена, нами было получено, что концентрация АТФ при СД 1-го типа снижена относительно контрольной группы (р<0,05), но превышает значения данного показателя равных по величине концентраций АТФ при СД 2-го типа и впервые выявленном СД 2-го типа в 1,2 раза (р<0,05) (рис.3).

На фоне достоверного снижения концентрации АТФ во всех группах больных, выявлена обратная корреляционная связь с уровнем молочной кислоты, значительное повышение которой наблюдалось при декомпенсирован-ном СД 2-го типа (4,9±0,6 моль/л).

0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

т т

1 ** *

* piЦ **

Щ **

i § 1 ж

Контрольная группа

СД 2-го типа

СД 2-го типа

впервые выявленный

СД 1-го типа

О Показатель в контрольной группе

□ Показатель при поступлении больного в стационар

□ Показатель при выписки больного из стационара

Рисунок 3. Концентрация АТФ у больных разных типов сахарного диабета в фазе декомпенсации.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** -р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар

Показатели энергетического обмена у больных с впервые выявленным СД 2-го типа в стадии декомпенсации не претерпевают значительных изменений на фоне инсулинотерапии и пероральных гипогликемических препаратов, несмотря на то, что уровень гликемии достоверно снижается более чем в 2 раза (табл.4).

Таблица 4

Показатели энергетического обмена при впервые

Группы исследования

Исследуемый показатель Контрольная Группа больных с впервые выявленным СД 2-го типа, фаза декомпенсации

группа При поступлении в стационар При выписки из стационара

Лактат, моль/л 1,1±0,32 п=7 2,47±0,П* п=10 2,92±0,2* п=8

АТФ, нмоль/мкл 0,М±0,01 п=7 0,11±0,01* п=7 0,08±0,002* п=5

НЬА1С, % 4,8±0,3 п=7 13,94±0,81* п=11 -

Глюкоза, ммоль/л 4,5±0,41 п=7 13,94±0,62* п=18 6,0±0,39* п=8

Утилизация глюкозы Юг. с инс., мкмоль(2* 10:9кл/ч) 2,11±0,03 п=7 1,49±0,09* п=25 1,49±0,11 * п=14

Примечание: * -р<0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар.

Отсутствие положительного эффекта после двухнедельного лечения ги-погликемическими препаратами можно отметить и в других группах больных с СД 1-го и 2.-го типов, что может являться одной из причин формирования и прогрессирования диабетических осложнений у пациентов.

Результаты проведенного исследования установили наличие количественных изменений липопротеинового спектра крови во всех группах больных.

У больных СД 1-го типа в фазе компенсации наблюдается повышение эндогенного уровня общих липидов сыворотки крови за счет увеличения концентрации ХС (в основном его этерифицированной формы) и тенденции к увеличению содержания ТГ (табл.5).

Кроме того, концентрация ХС ЛПВП в сыворотке крови у больных СД 1 -го в зависимости от степени компенсации заболевания достоверно уменьшается (р<0,01), при этом возрастает уровень ХС ЛПНП (р<0,01) и КА, особенно значительно при кетоацидотической декомпенсации до 7,1 ед. (при норме 1,97±0,08). У больных с гипертриглицеридемией отмеченный пониженный уровень ХС ЛПВП, по-видимому, можно объяснить усиленным катаболизмом ano — липопротеидов.

Таблица 5

Содержание липидов, холестерина в липопротеидах сыворотки крови у больных СД 1-го типа, М±ш

Исследуемый показатель Группы исследования

Контрольная группа п=12 Группа больных СД 1 -го типа, фаза компенсации п=15 Группа больных СД 1-го типа, фаза декомпенсации без кетоза п=12 Группа больных СД 1-го типа, фаза декомпенсации с кетоацидозом п=8

Свободный ХС, ммоль/л 1,98±0,12 2,45±0,16 2,31±0,14 2,73±0,19

Этерифицированный ХС, ммоль/л 4.15±0,17 7,21±0,34* 7.62±0,38* 6,83±0,31*

Общий ХС, ммоль/л 4,38±0,19 5,89±0,26* 6,16±0,14* 6,43±0,21*

ТГ, ммоль/л 0,87±0,12 0,91±0,03 1,03±0,21 1,50±0,26*

ХС ЛПВП, ммоль/л 1,53±0,06 !,39±0,05 0,95±0,04* 0,69±0.11 *

ХС ЛПНП, ммоль/л 2,79±0,13 4,09±0,13* 4,75±0,26* 4,75±0,49*

ХС ЛПОНП, ммоль/л 0,48±0,07 0,41±0,02 0,41±0,03 0,71±0,13

КА, усл.ед. 1,97±0,08 3,25±0,16 5,51±0,70* 7,10±1,20*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

У больных СД 2-го отмечается повышение показателей ХС, ТГ, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП, а также КА по сравнению с контрольными значениями. При этом фаза декомпенсации характеризуется более выраженными изменениями количественного состава ЛП крови и достоверным повышением КА в 2 раза по отношению к контролю (рис.4).

7 6 5

1 4

с

0

1 3 2 1 О

ХС ТГ ХСЛПВП ХСЛПНП ХС ЛПОНП

□ Показатель в контрольной группе

□ Показатель при поступлении больного в стационар

□ Показатель при выписки больного из стационара

Рисунок 4. Показатели липидного спектра крови больных сахарным диабетом второго типа, фаза декомпенсации.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар.

Достижение фазы клинико-метаболической компенсации не сопровождалось нормализацией изучаемых параметров.

Нами выявлена положительная корреляционная связь между уровнем МДА, ГП, ДК и уровнем общего ХС (г=0,57), ХС ЛПНП (г=0,45), ТГ (г=0,38), КА (г=0,47), глюкозы (г=0,47), что свидетельствует о взаимосвязи процессов ПОЛ с развитием декомпенсации СД 2-го типа.

Обнаруженное нами повышение концентрации МДА в плазме крови больных СД может свидетельствовать об усилении перекисных процессов в липопротеиновых комплексах, что может стать дополнительной причиной нарушения сродства ЛП к их рецепторам и, таким образом, способствовать образованию холестериновых бляшек на стенках сосудов и развитию и про-грессированию осложнений диабета. К тому же основной причиной нарушения структуры и функций клеточных мембран при СД 2-го типа служат изменения её липидного состава, являющиеся результатом активации ПОЛ.

Наряду с увеличением интенсивности свободнорадикального окисления липидов и нарушением структуры и свойств эритроцитарных мембраны при

* **

й *

*

и 4 т

В: 1 1 1 1 Г"Т~ 1 1 *

п * **

Я г

СД 1-го и СД 2-го типов наблюдаются разнонаправленные изменения в системе антиоксидантной защиты. Так показано, что в крови у больных с СД 2-го типа имеет место снижение содержания вБИ (рис.5; 6) и активности СОД и повышение активности КТ и ГПО (табл.6).

Таблица 6

Показатели антиоксидантной системы в сыворотке и эритроцитах крови у больных СД 2-го типа, М±т

>я Группы исследования

(U с_ 1 Контрольная Группа больных СД 2-го типа, фаза компенсации Группа больных СД 2-го типа, фаза декомпенсация

D со ^ * о о ä с группа При поступлении в стационар При выписки из стационара При поступлении в стационар При выписки из стационара

ОАА, Ед.акт. 1,72 ±0,13 п=7 2,58±0,09* п=9 2,45±0,08* п=9 2,31±0,05* п=15 2,39±0,07* п=15

сод, ЕД/мл 209,73± 11,42 п=7 89,78±13,8* п=7 102,2±16,8* п=7 110,4±22,12* п=12 125,8±16,3* ц—11

КТ, мЕД/м л 0,28 ±0,04 п=7 0,68±0,18* п=7 0,55±0,15* п=7 0,46±0,13* п=10 0,27±0,05** п=10

ГПО, ЕД/мл 0,12±0,05 ч=7 0,36±0,04* п=7 0,43±0,06* п=7 0,23±0,06 п=10 0,19±0,04 п=9

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар

Фаза декомпенсации СД 2-го типа характеризуется повышением концентрации ОАА в сыворотке крови. При этом активность СОД не претерпевает значительных изменений, а концентрация КТ и ГПО достоверно повышены в 1,8 и 2 раза соответственно.

Увеличение содержания перекиси водорода, которая является ингибитором СОД и субстратом для КТ может служить причиной снижения активности СОД и увеличения активности КТ.

Развитие поздних осложнений при диабете обусловлено в основном воздействием супероксидного радикала. Обнаруженное нами снижение активности СОД можно рассматривать как фактор, определяющий развитие ряда осложнений СД 2-го типа, что позволяет рекомендовать использование антиоксидантной терапии, первостепенной задачей которой является обезвреживание кислородного радикала Ог*.

В проведенных нами исследованиях установлено, что активация ПОЛ в эритроцитах приводит к достоверному снижению концентрации общего глу-татиона в плазме крови в 2,75 раза, в эритроцитах - в 1,77 раза, восстановленной формы трипептида - в 3,51 раза в плазме крови ив 1,9 - в эритроцитах, окисленной формы глутатиона в 1,87 раза в плазме крови и 1,5 в эритроцитах по сравнению контрольными величинами (рис.5; 6).

Контрольная Группа больных Группа больных группа при поступлении в при выписки из

стационар стационара

с ~*»<ЗЗН -^СвБв

Рисунок 5. Содержание общего, восстановленного и окисленного глутатиона в эритроцитах крови у больных СД 2-го типа.

Контрольная Группа больных Группа больных группа при поступлении в при выписки из

стационар стационара

«•«43 -а-вЗН -«к-ввЗС

Рисунок 6. Содержание общего, восстановленного и окисленного глутатиона в плазме крови у больных СД 2-го типа.

При этом в плазме крови значительно снижалась величина соотношения содержания восстановленного глутатиона к содержанию окисленного (4,38 по сравнению с 8,2 - в контрольной группе), что свидетельствует о сокращении ёмкости редокс - потенциала глутатионзависимой системы в эритроцитах у больных с диабетом 2 -го типа.

Следствием снижения внутриклеточного содержания вЗН является изменение активности глутатионзависимых ферментов. Так показано, что между уровнем 05Н и активностью ОЗБО имеется прямая корреляционная зависи-

мость, тогда как между содержанием восстановленного глутатиона и активностью ГПО найдена отрицательная зависимость.

На изменение активности ферментов глутатионового метаболизма in vivo может влиять и недостаток инсулина, имеющий место у всех больных СД 1-го и СД 2-го типов.

Развитие декомпенсированного состояния в целом усугубляет возникшие изменения исследуемых показателей. При декомпенсации наблюдается более выраженное увеличение уровня первичных продуктов ПОЛ, снижение содержания восстановленного глутатиона, повышение активности всех исследуемых ферментов по сравнению с группой компенсированного СД 2-го типа.

Активация ПОЛ и нарушение тиолдисульфидного обмена, сопровождающиеся снижением антиоксидантного потенциала системы глутатиона в эритроцитах при СД второго типа может приводить к стимуляции спонтанного липолиза и к возникновению инсулинорезистентности.

Полученные нами данные, свидетельствуют о мобилизации защитных механизмов в условиях свободно-радикальной атаки при сахарном диабете. Этот факт наиболее ярко подтверждается и у группы больных с впервые выявленным СД второго типа при поступлении в стационар, у которых установлено достоверное повышение всех изученных нами показателей АОС относительно контрольной группы (табл.7).

Таблица 7

Показатели антиоксидантной системы в сыворотке и эритроцитах крови у больных с впервые выявленным сахарным диабетом второго типа,

М±ш

Исследуемый показатель Группы исследования

Контрольная группа Группа больных СД 2-го типа, фаза декомпенсации, при поступлении в стационар Группа больных СД 2-го типа, фаза декомпенсации, при выписки из стационара

ОАА, Ед.акт. 1,72 ±0,13 п=7 2,37±0,06* п=10 2,49±0,06* п=8

КТ, мЕД/мл 0,28± 0,04 п=7 0,62±0,11* п=9 1,48±0,09* п=9

ГПО, ЕД/мл 0,12±0,05 п=7 0.29±0,03* п=8 0,45±0,07*,** п=8

сод, ЕД/мл 209,73± 11,42 п=7 323±14,47* п=9 381±30,44*,** п=7

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой ** - р<0,05 по сравнению с группой при поступлении в стационар

В группе больных с впервые выявленным СД 2-го типа в фазе декомпенсации включение в терапию наряду с гипогликемическими препаратами также и антиоксиданта липоевой кислоты отмечает повышение активности изу-

чаемых нами ферментов антиоксидантной защиты (р<0,05). Десятидневное внутривенное введение тиоктовой кислоты в дозе 300 мг привело к повышению активности СОД на 18 %, КТ - 140 %, ГПО - 55%.

У декомпенсированных больных СД 1-го типа при поступлении обнаружено повышение всех изученных ферментов АОС. При выписке отмечено снижение концентрации ОАА за счет снижения активности ГПО в 0,6 раза с 0,58±0,17 до 0,32±0,09 ед/мл.

В группе больных при применении липостабила (в суточной дозе 500 мг в течение 10 дней пребывания в стационаре) на фоне сахароснижающей терапии диабета (актропид 4-14 Ед- 3 раза, новорапид 8-10 Ед - 3 раза, хумалог 14 Ед - 3 раза, левемир 10-14 Ед -1-2 раза, протофан 8-14 Ед - 2 раза, лантус 16-48 Ед - 1 раз), наступает фаза достижения компенсации (нормализация углеводного обмена) (табл.8).

Таблица 8

Исследование метаболических показателей у больных СД 1-го типа в

фазе декомпенсации на фоне лечения инсулином _и эссенцнальными фосфолипндами (ЭФЛ), М±т_

Исследуемый показатель Группы исследования

Контрольная группа Группа больных СД 1-го типа, фаза декомпенсации

Терапия инсулином Терапия инсулином и ЭФЛ

МДА, нмоль/109кл. 3,15±0,4 8,03±0,9* 3,79±0,2*,**

ГП, отн.ед./109кл. 1,34±0,06 3,81±0,4* 1,96±0,03*,**

ОАА, % 61,3±2,1 49,9±2,2* 56,3±2,2*,**

Липидный фосфор, ммоль/109кл. 11,5±0,2 3,82±0,19* 4,3±0,37*

Утилизация глюкозы Юг. с инс., мкмоль(2* 109кл/ч) 2,75±0,15 1,78±0,03* 1,89±0,04*,**

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

** - р<0,05 по сравнению с группой при лечении инсулином

Снижается концентрация ТБК - активных продуктов в эритроцитах на фоне повышения антиокислительной активности сыворотки крови. Улучшается усвояемость глюкозы эритроцитами при снижении концентрации ее концентрации в периферической крови с 16,75±1,81 до 8,14±0,67 ммоль/л. При исследовании уровня продуктов ПОЛ при декомпенсации СД 1-го типа показано, что в обеих группах: при лечении инсулином вместе с ЭФЛ и только инсулином, имеются достоверные отличия по содержанию МДА и ГП в сравнении с контролем.

Таким образом, применение тиоктовой кислоты и ЭФЛ следуем считать важным дополнительным фактором в лечении больных диабетом, когда углеводный и липидный обмен не могут в достаточной степени контролиро-

ваться диетой, инсулином или антидиабетическими препаратами, чтобы избежать или свести до минимума диабетические осложнения.

ВЫВОДЫ

1. Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом второго типа по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом первого типа и характеризуются значительным увеличением содержания в крови холестерина липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина. Выраженность указанных изменений при сахарном диабете зависит от длительности заболевания, наличия декомпенсации углеводного обмена и сосудистых осложнений.

2. Сахарный диабет (СД) у больных сопровождается активацией процессов липидной пероксидации, которая проявляется увеличением содержания как первичных, так и вторичных продуктов перекисной модификации, а также изменением структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов и нарушением в системе антиоксидантной защиты, которые имеют разнонаправленные изменения при данной патологии. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в крови больных СД второго типа увеличивается уже в ранние сроки заболевания. При увеличении срока заболевания наблюдается повышение как эритроцитарного, так и плазменного уровня МДА, тогда как содержание ДК возрастает более поздние сроки заболевания.

3.У больных с декомпенсацией СД второго типа выявляется более выраженное повышение плазменного уровня МДА, увеличение содержания ДК, снижение активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КТ), а также снижение степени утилизации глюкозы эритроцитами и активности ферментов тиосульфидного обмена по сравнению с соответствующими показателями в группе компенсированного диабета.

4. При сахарном диабете второго типа, осложнённом диабетической нейропатией активация ПОЛ и нарушение тиосульфидного обмена более выражены по сравнении с таковыми у диабетических больных без осложнений.

5. Установлено, что при СД первого типа осложнённом полинейропа-тией на фоне дислипидемии и нарушения энергетического обмена, двухнедельное применение мембраностабилизирующего препарата липостабила и антиоксиданта тиоктовой кислоты, достоверно снизило уровень гликемии и лактата крови и повысило степень утилизации глюкозы эритроцитами по сравнению с диабетическими больными, принимающими только гипоглике-мическую терапию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения эффективности лечения сахарного диабета и его осложнений рекомендовано добавление к инсулинотерапии и гипогликеми-ческим лекарственным средствам антиоксидантных и мембраностабилизи-

рующих препаратов. Применение такой комплексной терапии уже на ранних стадиях заболевания может способствовать профилактики диабетических осложнений, в частности полинейропатии.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Кулаева, И.О. Изменения некоторых метаболических параметров при сахарном диабете 2-го типа / И.О. Кулаева, Н.П. Микаелян, A.A. Терентьев, Е.Ю. Францева // Сборник научных статей и тезисов XII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва, 2011. - С. 100.

2. * Микаелян, Н.П. Патогенетические механизмы нарушений функциональной активности мембран клеток у больных сахарным диабетом 1-го типа и при впервые выявленном сахарном диабете 2-го типа / Н.П. Микаелян, В.В. Потемкин, A.A. Терентьев, И.О. Кулаева, Е.Ю. Францева // Российский медицинский журнал. - 2012. -№ 4. - С. 20-22.

3. * Потемкин, В.В. Функциональное состояние мембранно-рецепторного аппарата клеток крови при впервые выявленном сахарном диабете 2-го типа / В.В. Потемкин, Е.Ю. Францева, И.О. Кулаева, Н.П. Микаелян // Проблемы эндокринологии. -2012.-№ 4, вып.2. - С. 40-41.

4. Кулаева, И.О. Состояние липопротеинового спектра крови у больных сахарным диабетом 2-го типа и его осложнениями / И.О. Кулаева, A.A. Терентьев, Н.П. Микаелян, Р.Ф. Сайфуллин // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». -2012. - Том. 2 - С. 71.

5. * Микаелян, Н.П. Активность процесса перекисного окисления липи-дов и состояние системы антиоксидантной защиты у больных сахарным диабетом 2-го типа / Н.П. Микаелян, А.Е. Турина, И.О. Кулаева, A.A. Терентьев, Р.Ф. Сайфуллин, К.А. Микаелян // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 4. - С. 64-68.

6. * Турина, А.Е. Взаимосвязь между активностью инсулиновых рецепторов и АТФ крови на фоне дислипидемии у детей при сахарном диабете / А.Е. Турина, И.О. Кулаева, Н.П. Микаелян, A.B. Микаелян, A.A. Терентьев // Фундаментальные исследования. - 2013. -№12, часть 1. - С. 30-34.

7. * Микаелян, Н.П. Влияние липоевой кислоты на липидный и энергетический метаболизм у больных диабетической нейропатией / Н.П. Микаелян, И.О. Кулаева, А.Е. Турина, A.A. Терентьев // Владикавказский медико-биологический вестник. - 2013. - Том XVII, выпуск 26. - С. 65-69.

8. * Турина, А.Е. Функциональное состояние мембран эритроцитов и печени при экспериментальном сахарном диабете и язве двенадцатиперстной кишки / А.Е. Турина, Н.П. Микаелян, И.О. Кулаева, A.A. Терентьев A.A. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. — 2013. — №12.-С. 37-41.

* — работа, опубликованная в журнале, включенном в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС — Антиоксидантная система

ГП - Гидроперекиси

ГПО - Глутатионпероксидаза

дк — Диеновые конъюгаты

дпн - Диабетическая полинейропатия

КА - Коэффициент атерогенности

КТ - Каталаза

ЛПВП — Липопротеины высокой плотности

лпнп — Липопротеины низкой плотности

лпонп — Липопротеины очень низкой плотности

МДА - Малоновый диальдегид

пол — Перекисное окисление липидов

сд - Сахарный диабет

сод — Супероксиддисмутаза

тг - Триацилглицериды

хс - Холестерин

ЭФЛ - Эссенциальные фосфолипиды

взн - Восстановленный глутатион

С88С - Окисленный глутатион

НЬА|С - Гликированный гемоглобин

Кулаева Ирина Олеговна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученной степени кандидата медицинских наук

Сдано в набор 10.07.14 г., подписано в печать 11.07.14 г. Гарнитура Times. Печать трафаретная. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1.0 Тираж 100 экз. Заказ К» 143.

Отпечатано в типографии «ОПЕРАТИВНАЯ ПОЛИГРАФИЯ» г. Владикавказ, ул. Шмулевича, 33. тел. 54-57-75