Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сопутствующая микрофлора и оптимизация условий выращивания микроводоросли спирулина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Сопутствующая микрофлора и оптимизация условий выращивания микроводоросли спирулина"

ЖТГОТ ІШКРОВДіЛСХИ!

АХк-З&'Я НАУК АУІЕНІИ

На правах руяовяса

Граядааян САР, аспирант Хаддад Разик Иатанивс

УДК 582.232:576.8

С0ШТСІ2УШАЯ МИКРОФЛОРА И 0П21Ы1Ш5Н ЇСЛОЗІЙ ВЫРАШИВАНЕЯ атЛ£Р030Д0Р0СЛИ СПЕШЕН*

03.С€.23 - баэтехнолзгзя Сбгологияеслпа наугя)

Авторе ф е р а т

дасоергадли на согскание ученой степени кандидата биологических наук

Абовяя - 1990

Работа выполнена в Институте микробиологии Академик наук Арыенки.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор, акадеиик •

АН Армения

кандидат биологических наук

Офлцгадыше оппоненты:

Доктор сельскохозяйственных наук С.Х.Майралвтян

Кандидат биологических наук ■ А.Х.Агадханян

Ведуцая организация: Институт баохидах растений АН Грузли

Зацнта состоится я 9-&С& <№'•%■ J99Q г> Б •ß. ” час. на заседании спецяалазироганного совета Е 005.08.01 в йнституте жкроб^ологгк АН Ариенхз (378510, Ариенхя, г.Абовян, Арзнинское соссе, Институт цгкрсбаслогиг).

С диссертацией' можно озвакохиться в библиотеке Института кивробаологии АН Арнешш. •.

Автореферат разослан " Н1990 г.

Ученый секретарь СПеЦИ8£238р0ВаНН0Г0 совета» кандидат биологических наук

З.В.Марзавина

Э.К.Афрйкяв Л .С .Маркосян

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. 3 последние годы значительно возрос на-гчно-практический интерес к изучении шкроводорослей и использо-58НИЮ их для получения пицезых и кормовых продуктов, различных дологически активных зецеств и лекарственных препаратов, горю-шго, а такзе для переработки и утилизации отходов и стоков фоизводстза. Больное внимание уделяется обцебиологическин проб-(еиац - вопросам применения лхкроводорослей для экологического тдоровления внешней среды, выяснению роли в плодородии почв, фодуктивности водоемов я других природных процессах. ,

Спирулина занимает ведуцее место среди апнроводорослей по гасЕтабаа производства и практического использования. Ряд строя ¡азрабатызает проекты по организации крупнотоннажного прокавог-:тва на основе спирулины белково-ватамкнных продуктов пи^о^о:'.:

[ кормового назначения, в особенности непригодных для зе^сдз-:ия регионах. Спирулина богата полноценный белканезаагшш_-ш аганокислотами, бета-каротином и многиш! физиологически активными веществами для использования в медицине и сельской хо-1ЯЙСТБе. Виесте с теи, многие вопросы физиологии питания /злс-¡ий зыракивания спирулины и получения продуктов ее биоиа а сла-£о проработаны. Фактически не изучена сопутствующая микрофлора :пирулины, ее роль з росте этой микроводоросли в природных ус-ювиях и при ее вырацивакии в промышленной ыасстабе.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось [зучекие сопутствующей клкрофлоры спирулины в связи с оптимизаций условий ее вырадавания.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие 1адачд:

- исследовать рост, накопление и состав биомассы спирулины 1а различных питательных средах, грунтовых водах содовых солон-[аков и некоторых отходах производства и охарактеризовать со-[утствующую ш1кро$лору спирулины;

- исследовать физиолого-биохимические особенности культур !актерий микрофлоры спирулины;

- изучить состав биомассы спирулины на различных средах.

Нв/чнзя новизне. Исследованы состав г динамика сопутствующей шікрофлори а ее влияние на, рост и развитие разных видов спирудины. Выявлено, что развитие определенных групп бактерий в процессе аырваавания спирудины может оказать неблагоприятное влияние на ее реет в в особенности - на хранение биомассы этой ыикроводоросля. Впервые установлено, что в условиях вырадоа-еик спирулины на белочных грунтовых водах солончаков обнаружено избирательное и интенсивное развитие алкали£ильных бактерий, что требует определенной обработки биомассы с целью пре-дотврасения ее порчи. Выявлены возможности оптимизации условий культивирования культуральной жидкости метанового брожения отходов ВИВ0ТВ0В0ДСІБ5. 1

Практическая ценность работы определяется установление!! возможностей элективного использования отходов животноводства и грунтовых вод содовых солончаков для вырацнвааия культур спирулины. Показано, что с использовагшем рециркуляции определенных количеств отработанной жидкости и подкормки источником генерального азота возможно осуществить проточное культивирование спирулини. ог основе полученных данных изучения сопуют-гуозей какро^лоу* сазработвкы предложения по получению И Э'4-¡¿¿ктквноцу хранение биоиассы спирулины. Результаты исследова-ї2і2 по характеристике микрофлоры спирулины даст основание раз-реботать рациональные методы вырацивания этой микроводоросли в условиях {отоавто-тро^даго и {отогетеротрофяого роста.

Из сопутствующей микрофлоры спирудины выделены и рекомендуются для практического применения активные продуценты £ума-

разы я аспартазы. ........

Положения, выносимые на защиту;

:_____- ДЛЯ выращивания культур Брігиііпа гаахіпа И Зрітиііов

ріагеааів в качестве питательного раствора вполне пригодно------------

использование грунтоьых вод содовых солончаков, а также отработанной жидкости кетанового брожения отходов животноводства;

- качественный и аоличественный состав сопутствующей ми-врофлоры спирулины определяется условиями ее выращивания и использованными питательными средами;

' - характерной особенностью микрофлоры спирудины является избирательное развитие алкалифильша и галафалышх бактерий, ■

.:рзди которых могут быть вьшздэкы активные продуценты ценных

ч'ераентоз;

- в условиях закрытого и открытого грунта йогу? быть разработаны эффективные аеюдн проточного культивирования спирули-;;ы с рециркуляцией отработанной культуральной жидкости.

Апсобзция оаботы. Диссертационная работа и отдельные ев ■фрагменты доложены и обсуздены на заседаниях Ученого совета Биофака Ереванского Госунта от в декабря 196йг., 27 декабря 1959г. и Ученого совета Института микробиологии АН Армении от.

¿. фззраля 1989г. и I февраля 1990г. ■ •

Публикация работы. По материалам диссертации опублияоза-ио Н- печатных работи.

Объем работы. Диссертация излснена на ddS?~страницах на-;:мнописного текста, содержит таблиц, ¡>? рисунков.

Структура работы. Диссертаций состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка использованной литературы, в том числе 60 - советских авторов. ..

Глава I. Микроводоросли спирулина и их значение.

(Обзор литературы)

На основе критического анализа литературы в соотзетствки с намеченной целью работы дано современное состояние проблемы.. Освещены вопросы биологии и значение микроводорослей, перспективы их практического применения. Подробно охарактеризованы :.акрогодоросли спирулина как эффективные нетрадиционные источники кормовых и пищевых продуктов, а такне ценных физиологически активных веществ.

Глава 2. Объекты и метода исследований.

Объектами исследований слунилл культуры Spirulijia plateaus и spiruliaa ciaxiaa , полученные от проф.Чафери ( O.Oif*-rri ) из отдела генетики и микробиологии Университета Пз-зиа, Италии, Указанные культуры язляатся представителям спнру-

ises). йсБольаовзлн аидкие к агарЕзовадкт среды. В последней случае в указаннув сроду вносилось 1,5£ агаре.

Росі спирулины при разлвчных гємлературах изучали в коленчатых пробирках но политераоссагв ТН-3 японского производства.

Культивирование 2 замкнутых системах (закрытый грунт) осуществляли б зиеевикообразньгх стеклянных установках емкостью 35, 120 к ООО д. ЕырацнБзние культур в условиях открытого грунта проводили в лотках с переиеяиванием еыкостьа 40 и 700 л.

Ёнтексивность роста спирулины определяли по накоплению веса биоивссы, нефвлокегрированиеи оптической плотности культуральной яидкости (КЗ) при 550 ни, з также микроскопическим уче-soh числа клеток б счетной камере.

Ыикробиолошчвские анализы сопутствующей, микрофлоры сшгру-лины. ее биоыассы в других субстратов проводили на различных питательных средах с учетом возыогно полного охвата разных групп микроорганизмов. .

Анализируемые субстраты - в зависимости от их обсеиекен-ности микрофлорой - исследовались в возможно палых разведениях от ІДО до ІДОООО. Использовались МПА, РПА (спорообразуадие к неспороносные бактерии), среда Хорикоей (алкалифилы), СР-І (антиномицеты). При обнаружении грибов производили рассевы на среде Чапека, олигонитрофилы учитывались на среде Эшби.

После учета обкего и группового состава микроорганизмов представителей доминантной микрофлоры выделяли в чистую культуРУ- '

. При изучении физиолого—биохимических особенностей культур использовали дифференциальные тесты, принятые для систематического ксследования спорообразующих и неспороносных бактерий.

Потребность культур в источниках углерода определяли аук-санографичесюш методом на модифицированной агариэованной (1%) среде с добавлением различных источников углеродного и азотного питания.

Проводили качественный в количественный анализ ферментативной активности{протеазной, уреазной, аспартазной, аспартат--декарбоксилазной', фуыаразной.и др.) и аминокислотного состава биоыассы. Определение аминокислот проводили на автоматиче-ладм анализаторе ашнокислот ААА 339 фирмы "Микротехна", Чахо-

Определение белка проводили по нетоду Лоури с соазт.

( Ьожгу е-к аХч!951) и по Еьельдалэ-

Глззз 3. Выращивание минроводоросли епярулина з условиях закрытого и открытого груша.

Большой практический интерес представляет использование спирулины для зыраяизания на пустынных зеылях, з частности. для освоения содовых солончаков Армении.. В этой свази з Институте микробиология АН Ардании указанные оргаязгкн в сзчзние последил;:: лет интенсивно изучаются для разработка условий рационального их выращивания с учетом природных и скръезых ресурсоз Армении . ■

Опыты проводились на пилотной установке, которая зыпслмэ-на из винипласта размерами 5x0,5 м, высотой заполнения КЖ около С,30 м, обеспечивающей обгем. культизирозания среды в'количестве ?йО л. По ходу выращивания освещенность составляла 2-4 тыс.л,■оке. Жидкость з установке перемешивается колесо:,! с лопатка:,и, соединенными с электродвигателем; движение культуральной жидкости со скоростью 0,3 м/сек. Температура вода поддерживалась в пределах 30-32°, а с помощью углекислого газа я ззоадпи раакцая среды - pH. 9,5-10,5. Осуществлялся поточный рею* культивирований путем систематического съема КЕ .с 16-х сутог:. Опыты проводились С культурами З.р1^епз1э И 3.1г.а;ааа , причем их использование дало в целом аналогичные результаты.

Средние показатели опытов,представленные в таблице I,свидетельствуют о сравнительно высокой выходе биомассы з .услозип;: зырасизания микроводоросли на упрощенной среде Заррукз, з также з артезианской воде, обогащенной минеральными добавкам:, Представленные данные являются наиболее оптимальными вариантами из серии испытаний с различными количествами съема культуральной жидкости. Лучше результаты дал съем и добавке 10 ?ь питательной среды каждые сутки.

По нааим данный, обобщенным в таблице, предельное накопление биомассы достигает ка 15-16-ые' сутки с накопление!;. I '.2'1 в концентрации 2,3-2,5 г/л. В сравнении со средой Заррука и модификацией использованная артезианская вода щелочного характера, полученная из неглубоких слоев содовых солончаков и ссс~

Накопление биомассы s,maxima при проточном выращивании в открытом грунте (подпитка 10% свеяой сроди ожодневно с 15 суток, биомасса г/л сухого вещества

Показателя 'f ! Время культивирования, сутки

I 5' ) ’ 7 ! ! 1 ! 9 | II | 13 ¡15 j 16 I 19 | 20 j 21 j 22 ] 24

Среда Зарруна

Биомасса, г/л 0,71 0,93 1,32 1,76 2,11 2,37 2,39 2,38 2,37 2,35 2,37 2,30

Съем биоиаооы, г/л/суТКИ , - ~ - - - - 0,24 0,24 0,24 0,23 0,23 0,24

Среда Заррука с бикарбонатом натрия 6,0 г/л

Биомасса, г/л 0,57 . 0,88 1,26 1,72 2,15 2, 46 2,62 2,'(5 2,34 2,37 2,39 2,43

Съем биомассы, г/л/оутки - - - - - - ' ~ 0,26 0,24 0,23 0,24 0,24 0,24

Артезианская вода с гшюо^ - 4,0; TlatlOj - 1,8 г/л

Биомасса,г/л 0,83 1,12 1,36 1,91 2,36 2,52 2,78 2,62 2,57 2,65 2,77 2,78

Съел биомассы, г/л/сутки - - - - 0,28 0,26 0,25 0,26 0,27 0,28

Примечание: знаком (-) отмечено отсутствие съема биомассы

галенная минеральным азотом, вполне пригодна для вирацаввная спирулипы с высоким выходом биокасса. Яз фоне систематического удаления КЗ и долива 10% свегего питательного рвствсра зга закономерность остается, 'причем в варианте с артезианской ведой накопление биомассы превосходит таковое у других испытанных сред. Таким образом замена сложных а дорогостоящих питательных сред на простые, подобно артезианской воде’кадочного характера, наряду с интенсификацией процесса зырашваная и накопления биомассы спирулины, MozsT обеспечить и немалый экономический аффект ее зырааивания. ' ■

3 нагих опытах были получены положительные результаты использования артезианской воды с добавлением органических стоков и отходов. Так, весьма успешны« явилось использование 0,5-1,0^ метановой бражки - отработанной зидности после метанового брожения экскрементов животных. Подобные возможности имеют сушест-венное значение для применения сдирулины в целях выработки кормовой биомассы на отходах с одновременным экологический эффектом.

В последние годы большой практический интерес вызывает вы-распивание микроводорослей, в том числе и епкрулинн в закрытых системах б частности в трубах из стекла, полиэтилена к других полимерных материалов. .

Наши опыты проводились в установках из чешского стекла различной емкости с перистальтическим насосом, обеспечивающем циркуляции HI и приспособлениями по аэрации. Испытывались з. platensis и s.maxina с применением различных питательных сред и условий выращивания. При этом особое внимание уделяли изучению условий проточного культивирования с систематическим удалением части биомассы, НЕ и заменой ее свежим питательным раствором. . . '

Таблица 2 подытоживает выборочные данные опытов с з.máxima, отражающие результаты использования и культуры s.platenain по условиям проточного зырааивания на разных средах.

Опыты прозодили в замкнутой стеклотрубной пилотной установке, вмещающей 120 л культуральной жидкости. Условия вырасп-закия: 30-32°, освещение 3-4- тыс.люкс в круглосуточном режиме.

Таблица 2

Накопление биомассы з.тахша при проточной кулмигароаашш в закрытой система стеклотрубной установки (в г/л сухих веществ)

Показатели 1 ! ■ в ремя к ультивирования, сутки

1 5 ! 7 1 ! ' ! 9 | II ; 15 1 17 рЮ •—* 'г 20 } 21 1 23 ; | 25 ■

Среда Зэрруна

Биомасса, г/л 1,47 1,77 2,11 2,34 3,12 3,08 3,04 3,11 з,п 3,16 3,15

Съем биомассы, г/л/сутки - • _ _ - 0,40 0,37 0,40 0,40 0,40 0,41

Среда Зоррука с бикарбонатом натрия 6,0 г/л

Биомасса, г/л 0,78 2,10 2,43 2,59 2,68 2,68 2,65 2,69 2,70 2,63 2,60

Съем биомассы, г/л/сутки - : - - - - 0,27 0,26 0,26 0,27 0,26 0,27

Артезианская вода с НаНСО - 4,0; К(,ло - 1,8 г/л

Биомасса, г/л 0,87 1,14 1,48 1,82. 2,71 2,84 2,78 2,82 2,77 ¿,79 2,72

Съем биомассы, г/л/сутки. - - - - 0,28 0,28 0,28. 0,27 0,27.. . 0,27.

pH з пределах 9,5-10,5. Интенсивность роста опредд..игл по выходу биомассы в сухой исчислении.

3 процессе работ были испытаны различные среда л условия культивирования, причем путем систематического сьеыа НЕ и до-дива свензй среды достигалось выращивание иикроводоросди в непрерывных условиях. В таблице приведены данные по срзде Зарру-ка, его кодификации, а .такав обогащенной минеральными добавка-;.и? щелочной артезианской воды, взятой из района содовых солончаков з Армении.

Удаление КЗ и долиз ее разного количества использовались со времени достижения ^аксиального накопления биомассы. Обычно это отмечалось спустя Э недели.. Что касается обьеиа удаляемой и добавляемой КЗ, то ёзнболее опгаиальныи оказалось съем и возобновление 10>5 питательного раствора. Такии образоы, оптимальный рзгиы-заключался з ежедневное удалении и восполнении 10% К! после достижения «зкаааального накопления биомассы.'

Выборочные варианты, представленные в таблице^ показывают, что на испытанных средах цэ.ксицуц биокассы находится в пределах 2,6-3,1 г/л, обычно на 15-ые сутки. Как показывают данные, ежесуточный съем и долиз 10$ КЕ. практически нз охражаг■:я на концентрации баохзссы. !1охпо полагать, что при более ’:тзнси-яой технология кз богатых средах ежедневный .сьви К! можно увеличить до 20~Ю$. <

На сюаазаний наших аевлвдозанай шжяо заключить, что ар-з;53’.шкокпо води, главный образом, с неглубоких слоев и щелочного характера, с добавлением минерального азота вполне пригодны для культивирования спирулины с высоким выходом. Эти данные открывают довольно большие перспективы использования спирулины в условиях Араратской равнины.

Серия экспериментов была посвящена изучению биосинтеза Йелка и содержания хлоройила в клетках спирулины при выращивании ее в различных условиях. 3 этих работах использовались среда Заррука и другие на основе среды, разработанной Венка-тараканом.

Среда, разработанная Венкатарвманом ( УеШ^агалап , 1983), содержала (г/л): и^сс^’ - 4,5; К2НРО. -0,5; к?30 ■

1,0; ;;аС1 - 1,0; ;:Еао4 . 7Н20- 0,2; СаС^ . Н20- 0,0%;

РеЗО,- 0,01; КаЯО, - 1,5.

Исследовали возиохность культивирования спирулкны в несколько кзиэненной среде Веккатарзыана. В среду ?£ 3 выесто добавляли культуральную гидкость метанового броаеыкя экскрсыентов крупного рогатого скога (кетаиовая браыка) - 5£.

С роды й 4 и Ь: 5 - к срзде Ь 2 .'оззклкла соотьстстггшш 1% иста новую брэгку и «гЛ.'О. - 3 случае среда <’с 6 глтратник

ззот среди & 2 заиешглл кгтеиовей брг^кей - 101. Вез среды ¿иелк'рН 9,0-2,5. ’

Кудьтавииовгкаь проводила ь спекк&аьких стеклянных трубках еахостьо 1,5 л прл ьепр^рыгкон продувшая воздуха, кнтек-сквнссхь ссведан;;?. 1500 леке геипорзтург 50°. К I л питательной среды добавляли 5-0 ил посевной суспена;:х Ю-дн&вйой культуры спарудины.

Результаты исследований показал;*., что прл озесязчеки;; оптимальных условий роста выход баоыассы в среде Баррука иожет составить примерно 4-5 г/л. Однако для практических цел е£ указанная среда достаточно дорогая и слозная, что вызывает необходимость поиска новых экономически выгодных сред, обеспечлва-взк высокий выход баоиассы.

Проведенные нами исследования данашки рост спарулпны в указанных средах показывают, что интенсивность н динамика роста, а такке выход биомассы существенно зависят от состава питательной среды. Наиболее интенсивный рост и наибольсий выход биомассы (6,3 г/л; наблюдается в богатой среде Заррука. Не ме-кес эффективным является также среда Венкатараиана (й 2), являвшаяся сравнительно менее слоеной. Выход баоиассы в этой среде составляет 5,5-6 г/л. Результаты культивирования спирудикы в средах с метановой брахкой свидетельствуют о тон, что замена нитратного азота метановой брвгкой такке может обеспечить рост культуры. Прн сравнительно малых количествах ыетановой бражки (5%) Еаивысший уровень выхода биомассы наблюдается на 14-15-ые дш культивирования, а затем наблвдается постепенная гибель клеток, обусловленная, видимо, недостатком азотистых компонентов. Последнее обуславливает такие заметно низкий уровень клеток (З.г/л). Это подтвертдается в опытах при культивировании сяарулины в среде с двойным содергзнием метановой брааки (10%).

Результаты свидетельствуют, что рост культуры продолжается до 20-22 дней в выход биомассы примерно в два раза больше по сравнению с культивированием ее в среде с 5%-иш содержанием метановой бражки.

Интересно отметить, что повшение концентрации азота в средо заметно подавляет рост сплрулинн.

ПССЛГГ.С-^ЯП!"! свидетельствуют также о том, что клетки спи-

■ рулякч, культивируемые в средах с различным количеством а зс-ТСЧНШГОМ ."30ÎÜ, содержа* достаточно больпое количество сырого протеина /табл. 3/,Наибольшее содержание протеина обнаружено з клетках, культивируемых в среда, содержащей 10$ метановой ôpa-,i-::и и среде Венкатарамана. Несколько мекыпий уровень протеина обнаружен в биомассе, выроете" на среде Заррука,.

Бри недостаточном для нормального роста культуры холиче-стзе азота кзблюдается не только слабый рост, но и заметно менкзее содержание сырого протеина а биомасса. Айалогэтиад картина наблюдается также в случав псвнпэияя содержания источника азота в среде.

Таблица 3

Содер™ание_ сырого протеина а хлорофилла в биомассе

3.platenais ( культивируемой з различных средах

! Среды ! Содйрчакйа сиро- ! го поотеика в % ! от cVxoro веса ! ! Сухой ! 1 вес в % ! : ! ! Хлоре-фалл ! э % от су! хого веса

СЬрруУЛ 59,0 20,4 2,05

Бешптарамана 61,0 23,7 2,61

Среда .‘?2 с 10% ' петаяояой брагской 71,5 24,0 2,01-

Среда №2 с 1% метановой бражкой + 1% КаЯб3 55,0 20,0 ' 1,65

Среда КЗ с Ъ% метане зой бражкой 1— 56,0 19,8 1,60

Результаты наших исследований показывают, ч^о биомасса спирулинн содержит достаточно большое количество аминокислот, в частности незаменимых /табл.4/, Наблюдается /^которая разни-

да б содержании аминокислот в биомассе спирулины, выросаей ка различных средах. При этом, в большинстве случаев наблюдается • корреляция между выходом биомассы, содержанием белка и количеством аминокислот.

■ Таблица 4

Аминокислотный состав белка биокассы выращенной на различных средах (% на сухой вес)

Аминокислоты Г- ' С о е д ы -

! Зарру-! ка • !Ве нката4 К£+ие та-!рамана ¡новая ! . . . ¡боаквд ! ! 10% Ш+и$та- шзваа бражка 5% !Й2+М9тан 1бракка I |1,« ЬцДО-,

Асмйагйновая КЙОЛОМ 5,г 4,16 4,60 2,55 2,73

Треонин 2,90 2,45 3,30 1,73 1,66

Серии 1,68 1,50 1,90 1,30 2,00

Глутаминовая кислота 4,8 5,80. , б,60 4,60 6,33

Продан 0,50 0,12 ’ 0,86 0,86 0,70

Глицин г,57 2,79 2,80 2,46 2,33

Аланин 1,90 2,45 ■ 2,80 1,06 3,60

Валин 2,15 ■ 1,96 2,60 3,30 3,20

Иетионин ' 0,20 0,24 0,44 0,13 0,10

Изолейцин‘ 2,25 3,00 З’.Об 3,73 2,13

Лейцин 5,00' 1,50 . 4,2 1,66 3,99

Тирозин 0,12 . еяеда елзды следы 0,22

Фенилаланин 0,14 0,10 . ■ 0,08 0*02 0,13

Гистидин 1,00 0,35 1,90 1,80 1,70

Лизин 1,70 .1,32 2,00 2,50 1,46

Аргинин 0,80 1,18 1,30 1,2 0,60

Спирулина является богатым источником’также ряда физиологически активных соединений, р - каротина, фикоцианина, хлорофилла и фикоэритрина. Наши исследования показали, что содержание хлорофилла (а + в) достаточно высокое (от '1,60 до 2,05% ка сух.вес). Наибольшее количество его обнаруживается в опытах с высоких выходов и интенсивным ростом клеток (табл.З). В био-•.зссе, выросшей ка средах Ззррука и Венкатарамана, обнаружено

твкге эецетЕое количество каротиноидов (0,35-0,40$ от сухого веса) и финоцианина (1,40 и 1,55% от сухого веса). "

Представленные г энные позволяют заключить, что для получения высокоэффективной биомассы спирулины коркового И ШІЩЄЕОГО назначения ее культивирование без сникекия содержания и состава белка можно осуществить в сравнительно простых и дешевых средах с добавлением метановой брааки.

Глаза 4. Сопутствующая кинрофлора спирулины.

Условия выращивания спирулины обуславливают ее развитие .3 оги^анной ыикрофлоре совместно с гетеротрофными и другими микроорганизмами. Регулирование взаимодействия этой цикроводорос-ли с другими микроорганизиаии определяется как их физиодого-биохииичесниігм ВЗЗИМ00ТН0ШЄЙХ1ЯЕИ, так и влиянием внешних факторов и среды выращивания. В этой связи изучение состава и динамики сопутствующей кикрофлоры спирулины может позволить разработать условия рационального выравдазания этой шкроводоросла.'

Исследовали цикрофлору з.ріагвпвіа и б.шзхіиз, выращенных в нестерильных условиях в замкнутой системе нэ пилотных уста- •' :^вках, и в открытом грунте на лабораторных установках, причем з оі'оих случаях среда аэрировалась.

По ходу микробиологических исследований культуры микробов выделяли очищали и изучали для идентификации. Основное■зшша-зи<з уделяюсь наиболее характерным и доминирующим группаы №~ крооргани~:*ов.

, Выборочные данные характеристики микрофлоры, сопутствующей росту спирулины, представлены в.таблице 5. В этой и з"_ по-, следующей таблице 6 приведены округленные данные по средним покззстеляи повторносгей анализов. Особенно характерным явля-<зтоп сравнительное обилие алкалифильных бактерий. Эта группа органкзиов, представленная рпорообразувщиіш и нвспороносншш бактериями, преобладает и в посевном материале, дультивируенои на среде Заррука. Характерное обилие алкалифильных бактерий, выявляется и в процессе выреадввзяя спирулины ка других средах з условия?: за;:рутого и открытого грунта,

Вазно ответить, что в КЕ, особенна в биомассе постоянно сикзрупиваюеся бактерии группы'кишечной гчлочки. Как правило,

Таблица 5

Микрофлора спирулины (в тыс. на мл и на г сирой биомассы, среда Заррука, 30°)

.... Группы микробов ! Посевной материал, . . среда Заррука Кж, закрытий грун?, 3 суток 3.maxima Кк, открытий грунт, 7 суток ;кж, j открытый j Грунт, ¡20 суток Биомасса, открытый грунт ' '

! ! ! S.platensis ! S.maxima f !

Иоспороносные бактерии, 120 250 . 1400 1600 2200 3000

в том числе кишечная палочка 5 _ ' Ч 8 12 150

Спороносные бактерии 20 ' 2 100 20 . 16 50

Ллкалифильные бактерии 100 . . 200 1200 1600 1600 1600

Актиношщети 2 б 20 24 18 40

Грибы - - ' - - - - 4

Дрожжи - - - - - -

Общее число 142 258 1520 1844 2254 3094

'Примечание: знаком /-/ отмечено отсутствие микроорганизмов в

- .количестве менее 1000 клеток/ил.

грибы и дрокжи представлены в малом числе, более регулярно обнаруживаются актиномицеты. При выращивании в открытом грунте микрофлора более обильна и неоднородна, однако выраженного накопления алкалифилов по мере культивирования спирулины не отмечается. По-вшшмоцу, это связано с некоторым снижением значения реакции среды в старых культурах указанной микроводоросли. Помимо алкалифильнкх форм на синтетических минеральных средах без органических добавок обнаруживается также и развитие олиго-нитро¿ильных бактерий, представленных в основном нокардиоподоб-ными формами. .

В специальной серии опытов изучен состаз микрофлоры при различных реакциях среды и температуре. Оптимальная температура роста з.р^епз19 и з.пахАпа соответственно 30° и 31°, pH 10,1 и 10,6. Пределы роста - 10°-42°, 9,5-40°. 3 пределах интенсивного роста значительных различий в составе микрофлоры не обнаружено.

С целью исключения загрязнения и развития посторонней микрофлоры испытано применение ряда антибиотиков и их комбинаций. Наиболее хорошие-результаты получены при использовании совместного добавления в среды пенициллина и колистина. Ряд антибиотиков широкого спектра действия (ципро, лонгацеф) угнетают рост спирулины.

■ Для выращивания спирулины нами был испытан предложенный индийскими авторами ряд простых сред с добавлением отходов, в частности мочи и навоза (УеЫ^агашап ,1983). Понятно, что в этих случаях существенно ва>хно изучить состав и изменения микрофлоры среды культивирования, ее влияния на развитие микроводоросли, не говоря о ее санитарно-гигиенической оценке как-.продукта кормового назначения. ■

В наших работах исследовалась микрофлора в процессе выращивания спирулины на средах с отходами яивотноводства и другими биогенными субстратами. Большое внимание уделялось использованию переработки метановым бронением жидких и твердых экскрементов крупного рогатого скота.

В таблице 6 подытожены некоторые данные, характеризующие микрофлору, развивающуюся при выращивании б. р1агепз1з на средах с указанными субстратами. В качестве основной среды применяли раствор, содераащий (г/л): н^со^ - к2нро4

0,5; К23о. . - 1,0; каС1 -- 1,0; КеБ04 - С,2; сас:ц - 0,04; -0,1. ' 4 “

Для сравнения приведены данные по среде индийских авторов СЕНН - I ( Уепкагагатап , 1983), а ганге среде Заррука без внесения соды. '

. Таблица 6

Микрофлора, э.рХаЪепзхз на различных средах . ' (тыс. клетон на мл)

Питательные среды ■ ! 1 Нзспороносные ;Всего ¡Алкали- • •филы • ( бэктеони'Бацил- ! ,. ! лы | Ё.00111 .'Актино-!мицеты ! ; !Коринз-!бакте-! рии

Соеда (Ср) Зароука без НаНСО-з 600 400 6 60 40 300

Ср. сгтн -I 800 600 - 18 100 150

Ср. 0С+5% стер.бражки • 500 400 2 4 20 400

Ср. 0С+1% СТер.брЗЗЕЕ 400 300 ^ ( 12 6 100

Ср. ОС+10% стер.брагки 8000 6000 8 16 • 6 430

Со. 0С+5$

нестер. ' бражки . .,. лооо . .2000. .. .20 . .8 . 6 . .600

Прежде всего следует подчеркнуть, что во всех вариантах с дсбавкаш метановой бракки не било отмечено угнетения роста спирулины. Обычно выход 'биомассы варьировал в пределах 0,1% от XI с^тки. Можно заметить, что в сравнительной аспекте использование столь богатого органикой субстрата позволило снизить к даже исключить аэрацию среды, что, по-видиыоыу, связано с развитиеы гетеротрофной микрофлоры, создающей условия определенного сиибаоза газообмена с фотосинтетикок-спирулиной. Оказанное выявляет перспективность данного организма для использования з переработке органических субстратов.

Поскольку осуществлялся съец КН каждые 2-3 дня, обильного развитая спорообразующих бактерий и актиношщетсв не отмеча-хосз. Обнаруживается довольно интенсивное развитие коринебак-

гарий, Екягтчагп’нгх также и микобактерии. Надо заметить, что достаточно хороший рост олигонитрофияъшх форм, включая е ко-ринебактвряй, нами систематически отмечался во многих вариантах сред, особенно минерального состава.

Среди представителей доминантной мшсрофигоры' наиболее раСПроСтранеНЕШЗ ЯВЛЯЛИСЬ Представители родов Pseudomonas, Serratia, Arthrobacter, Achroaobacter . Группа КЕПеч-

ной палочки обнаруживается регулярно, но его обильное развитие отмечается при продолжительно?.! культивировании микроводо-раслп без обновления питательной среды.

Учитывая обильное развитие гетеротрофных микроорганизмов, з особенности ка средах с органическими отходами, необходимо рекомендовать стадию промывки биомассы слирулиЕы в гехшлэгет еэ наработки для использования в кормовых и пищевых далях. Осуществление подобной обработки биомассы особенно необходимо цра вырацгванин спирулиш в условиях открытого грунта с высокой глубиной слоя кн п комбинированием фотоав-тотрофзого и фотогетеротрофного роста микрофлоры. При этом прокззка биомасса - обеспечивает одновременно удаление сода з других ншгелатальннх веществ. •

На- осковэдд комплекса ЫОрфО-фКЗИОЛОГЕЧЭСКИХ свойств осуществлена идентификация видов различных культур из сопутствующей кзхрефлота спирулкна. Ряд игашлов наделяется в ео-сто разновидности. ' "

•• Срэ.гпг представителей йакрофзоры сиирулиЕН Енявлеш пигаккн - перспективные продуцента некоторых ферментов для органических кислот в аминокислот кетодоы мйкробЕЭлогяческо-гб катализа. Приведены описания высокоактивных продуцентов фуиаразя Bacillus alcalophilus sabsp. halodurans, Pseudomonas' nitroreducens » аспартазн — Serratia эр. s ряда штаммов бацилл и культуры актннотлицетов С ЕЫрЕЕЗНПОЙ протео-литяческой, трэазпой н ашлолитзчэской активностями.

- 20

ВЫВОДЫ

X. ДЛЯ шращавашя культур S.maxina И S. р lat ene і з могут успешно применяться щелочные грунтовые воды содовых солончаков с добавлением нетратного азота I,5-2,0 г/л и выходом биомассы спирулины в пределах 0,2-0,3 г/л/сутки.

2. Органические отходы животноводства и переработанные метановым брожением стоки (метановая бражка) является хорошим субстратом для использования при выращивании сшгрулиш, что обеспечивает одновременное получение биомасса кормового назначения, переработки и обезвреживания отходов. Наиболее эффективным является использование метанонэй бражки з количестве 0,5-1,0?.

3. Применение систематической редиркуляпяи отраоотанной культуральной жидкости с подкормкой ыинер&дьным азотом мозэт обеспечить проточное эффективное культивирование спирулины о режимом ежедневного удаления спустя 2 недели культивирования микроводоросли 10% кг и добавлением соответствующего коли-честв_а нитратного азота. •

4. Вырабатываемая на основе использования минеральных сред и сред с органическими отхода1,га биомасса спирулины бога та усвояемым белком и содержит значительное количество сбалансированных незаменимых аминокислот. Существенных различий в их. содераании при.выращивании спирулины на испытанных средах не обнаружено.

5. Сопутствующая микрофлора спирулины характеризуется избирательным накоплением алкалифильных бактерий. На минеральных средах отмечается развитие кокардиопо добшх форм и олигонитрофнльных бактерий, на органических средах и в условиях фотогетэротрофного роста - обилиэ гетеротрофных бактерий, в, том числе группы кишечной палочки. Наличие в биомассе кишечной палочки а родственных групп вызывает необходимость промывки и переработки ее до выработка продуктов кормовог-о п палевого назначения.

S. Из сопутствующей микрофлоры спирулины Енделен а оха-рагтергзован ряд высокоактивных продуцентов фумаразы, аспар-

тазы и других ферментов, перспективных для практического применения. Продуценты фумаразы идентифицированы как Bacillus alcalophilue subsp. halodurana, Pseudomonas nitroreducens. продуценты аспартазы - Serratia sp. , а также представители некоторых еидов спорообразусщшс бактерий и актинсшцетов, образующих активные уреазу, протеази и аыгхаза.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Рззик.И.Хаддад, С.Н.Батдасарян, Т.С.Давидян, Э.К.А£-

ргкян. Микроводоросль спирулина и ее микрофлора. - Биолог.я. Армении, 1990, т.43, № 3, с.235-239. '

2. Разик.И.Хаддад, Г.М.Карагезян. Выращивание микроводоросли спирулина в открытом грунте. - Биолог .s. Армении, 1990, ?.43, Л 3, с.254-256.

3. Р .Іаддвд, Л.С.Маркосян. О влиянии условий выращивания па продуктивность и состав биомассы микроводоросли спирулина.-Бзологлс-Армезии, 1990, т.43, # 5, с.442.

4. ?.И.Хаддад, Г.М.Карагезяв, Э.К.Африкян. Оптимизация

условий шраяивания мнкроводоросли спирулина. - Бколзг.г.Ар-мензг, 1990, т.43, 5 7, с.623-626. '

Соискатель