Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сомаклональная изменчивость твердой и мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сомаклональная изменчивость твердой и мягкой пшеницы"

И б

lili

.. u ' ;;Ir;0 (f С ilHCHJR УНИВЕРСИТЕТ

Д P У S Б Ы Н А Р О Д О Б

на правах рукописи

В/'ЕАЕМ CEja аГ4 ГУСЕЕН Kffi"

сокдклснаяьная кашнчивость ТРЕРДОИ и иягаж пкжица.

Специальность - 03.00.грнйгикя

¿ В Т и г ь 5 i ' F á *i диссертации íw соисканис ученой отнгг-ни кандидата биологических чяук

МОСКВА- 1Э93

Работа выполнена в Центра "Баоиасенерия" Российской Академии наук.

Научный руководзтель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник А.К.ГАПОНЕНКО

Официальное оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник ?.В.САЛЬНИКОВА

кандидат биологических наук,

доцент О.Г.СЕМЕНОВ

Ведущая организация: Институт физиологии растензй и генетики Академии наук Украшш

оо

Защита состоится уССР^-^^—У 9 ЭЗ года в -/Х-

чесов на заседании специализированного сосета К 053.22.16 в Российском университете друзйы народов по адресу: 117196, г.Иосква, ул. Киклухо-Махлая, д.0.

С диссертацией иохно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г.Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан "о<?У года.

Ученый секретарь'

специализированного совета, ') V/

кандидат биологических наук ^ 1 /7 УиуР'у И.Н.Шарова

ОбЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОТЫ.

Актуальность теиц? Одним из вакннх направлений в биотехнологии растений становится клеточная селекция, которая позволяет отбирать единичные кпотки, получать из них клеточные лшши <•• последующей регенерацией растений с новыми наследственными признаками. Пргогш культивирования растительных клеток и регенерации та ннх растений, разработанные для многих сельскохо-.шй ствешшл культур, уже сейчас лоаваляах экспериментально реалии» вать воемгжноетл клеточной селекции, т.е. применять ее для сои даная новых сортов ргсотенкй. В связи с атим осоОую актуальное!1. гтрзобретед? изучение г.тябигльности и изменчивости генома растений ЩЛ1 КУЛЫЮЩЮВШлИЯ m Vit.ro, ПОСКОЛЬКУ при СОЗДШИШ ИС*|>>-novo кахерааяа дза селекции уголательно получить как шгши <\>'!ь иую изменчивость, а для генетической трансформации растений и

рССГЛЯГСГЗТ ;*Т7:ГТ:2ЛЫ*Г.'Т ¡P^J»* ИОЙТО»»») CilXlJHncirikd JiCiiMuiW ii а»

изменного генотипа.

Принципиально новым источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при культивировании клеток in vitro и регенерации растений. Сйма-клональная изменчивость нашла практическое применение при создании сортов с улучшенными свойствами у ряда экономически важ ных культур, таких как сахарный тростник (Heinz,Мее, 1971; Liu, 19611, картофель (Shepard J.F. et al., 1980; Сидоров И Др., 19851, кукуруза (Edallo et al., 19811, рис < Oono, 1452; КуЧ'Э ренко, 19801- Наследование измененных пркадакав, имеидах пахт-: сельскохозяйственное значение, изучалось у сомаклонов мшкоя шаеницн (I.arkln et a. 1. ,1304; Соорчг et в.1.,1980; Пьр.ч.счк<. ( а1.,19вы. Для твердой пиенйцы феномен сомаклональиоЗ кгменчи востй не изучен. Это связано с трудностями получения морТил-ешни каллусных |Щ| культур твердой пшеницы и растений-рвгене/кштои.

Цель и задачи исследования, Поль настоящей работ изучение генетической стабильности и изменчивости культивируемых ь, vitro соматических клеток пшеницы и полученных из них растении-регенерантов. В соответствия с этим, были поставлены слепуицип задачи:

1. Изучение влияния и-аминоОвнзойной кислоти ЦШЖ) кт< физиологически активного соединения, которое в качестве вйтами-на участвует в оОмоппыу процессах растительных организмов и не вызывает мутагенного действия (Шангин-Березевский и др., 1U83). на частоту индукции МК и регенерации расгоний с цильи ооэдшшн

гшсокоэффективной системы регенерации растений твердой пвеницы.

2. Отбор измененных форм растений-регенерантов твердой я мягкой пвешщы с использованием в качестве маркерных признаков: глиадинов, остераз, алкогольдегвдрогеназы (АДГ), глутаматдегвд-1пг«1мзы (ГДГ), глутамат-оксаноацетат трансаминазн (ГОТ) и изучение наследования измененных признаков в последувдих по коле аи-я*.

3. Изучение особенностей патогенетических процессов в кал-луспых культурах соматических клеток твердой петлицы, которые когу1\ влиять на процессы становления кариотипа растеиий-рвгено-рпнтов. а также патогенетический анализ растений-репшврантов твердой и мягкой пшеницы.

4. Генетический анализ измененных по комюиентпому составу глиадинов растениа-рвгеперантов мягкой пшеницы изогенной линии АД го/47.

Научная новизна проведенного исследования заклвчаетси в слеушем: впервые показано увеличение частоты регенерации ]астения твердой пшеницы под действием ПАБК. Вперйые изучена сома-лягамльная изменчивость по компонентному составу глиадинов твердой пшеницы, а такие изозимов эстеразы, АДГ, ГДГ и ГОТ твердой и мягкой пшеницы. Показано наличие стабильно и нестабильно наследуемых изменений по компонентному составу глиадинов г»ордой и мягкой пшеницы. Установлено, что причиной сяияения норфогенетических потенций каллусных культур является накоиле-ияв н них цитогенетических аномалий. Впервые метафазы клеток ЫК к нолюрфогопного каллуса (НЫК) пзеншды были исследованы методом .гаМ«рвнциалыюй окраски хромосом (С-окраиивание). Показана из-шлгапось рисунка С-окрашшания в хромосомах клеток НМК. В результате генетического анализа растений-рагонерантов мягкой пае-ницн изогенной линии АД 20/47 показано, что генетическая природа стабильно наследуемых изменений различна.

Ш1®ШШЙВ£а_11§1ВШй1Ь* Разработала аффективная система для ¡»генерации растений твердой пшеницы. Впервые показано наличие сомаклональной изменчивости для твердой павнида, что является доказательством возможности использования этого феномена для создания генетического разнообразия растений* необходимого для едлоюшг 1з том числе и клеточной селекции.

»пробашя работа., Материалы диссертация опубликованы в 4. расЧэтах. Гозультаты исследований долоаены на научной коаГярен-ция молодцах ученых ИОГен АН СССР (г.Москва, 1987), ва Всесоюзной конференция по биотехнологии злаков (г.Алма-Ата, 1988), на £

расшрваиом секянарв Центра "Баоннаонорая" РАН (г.Цпшта.Пйи, на Всвсовваом спышзиуиэ "Новые методы биотехнологии рвстенва" (г.Пущивд,19Э1).

Диссертация включает введение, oduop литература, пять глав собственных исследований, вывода, . amcoii литературы. материал каяояея ва. 129 страззца! ыаиаиош«: (шго текста, оодврют 13 габлчщ к 13 рггпушсов. Опасок литовцу рй ваттм 160 «готочгжос: S3 - отзчостьвюшх it 12? - шюо-

Трчгол)т.

твдодл: п кяояа.

_ юч-рцг«»». В работа иопольэовйггс;, 2 сори,

Гв(фЦС>2 шмнода crr.iiururs I ДГйф?.ТН 2 КНЗШ1 dyi;!fc JSjJiW,}

ровонао " Ла»рбаЗдааки» n читая лагам (дашисвд) ыи-ы>а юя-

ЕШЩ (Tr .aastlvusa L. I АД 20/47, ШЯуЧвННаЯ B.H.CymHQliiiai КЗ кулкуит«» ""-г----_ Оаиотиии»»" KV, Д.Г" JZCZZZMJii-idmn я

jwfore еяяо^хгаго ггшх^«иск»ич> tattepaasa баотшга каадога сорта йшш отобршш ш Ешаюнбктшду составу глизданов. Драорнмо растения, a такм пзрзачшю растонал-рогвпарапти внрвдивакесь в оранзереа цра Оототареоде 1G/8 часов, осведанность создавалась локпана ДРЛ-700 шцзость патока 2600 Вт/и8, температура во врэ-ия цветения 20-24° 0. При анализе сомаклонов использовала номенклатуру. предлохвтауо Ларкинкм я Скоукрофтом (L»rkm p.j. . Зоои oroft v.в., lean, t,a. аорвачныа регенераяты обоеначилг как scf t я »» егкссгщданЕйз потомство г.с_, зс^ а т.д. Геив-шчишак анаягэ отоорапачх по гишюкзатвоау составу глаадивш оомаклоаж проводила, окревдвал мутаятшге ¡ястанич о родгт&кьсхоЗ фора:; §sc АД 20^47 i о*АД 20/47. Растента-рапжвршггм, а такхо redpjaiu. рйотешгя пырагщшались на палях НПО "Подмосковье", п&о.Нетвдо^кд C-gffsSQTKfl pycTQlTS ПШС,, Ha день liocje hsчала HisOTaiia-i колосья растений твердой нзвижцы сортов Дггзфара и Кш&з дупи помещала в 0,1*-2 раствор ПАЕК на 8, 16 н 24 часов. В кячеоти'» контроля использовали растения, не оОраоотанные 11АБК.

Ктгльстр* in vitro, зерновка на 10-13-й день после опыления стерилизовали в течение 8-12 кяя. 70° зтанолоы в незрелые эаро дым рвамврои 0,5-1,5 121 noMeciajEa ¡катком вверх на среду rimu ( Shlmada, Va-mada, 1 979 I , СОДврпаЦУ» 2 ШУЛ 2 ,4-Д*ХЛОрфвНОКСИуК-сусной кислоты (2,4-Д), Каллусы культивировала в темноте при 1°26+2?С и через каждые-4-5 недель пересазива/и па ту не среду. Дня регенерации растений зачатки побегов с прялегавдвиа учаот ками каллуса переносили на среду йи-64 беа 2,4-Д, содв]ващуи u,t<

мг/л индолил-3~уксусной кислоты (ИУК) и культивировали на свету. Регенврантиые проростки на стадии 5-6 листьев пересаживали в перлитовый лесок для укрепления корневой системы и выращивали л условиях влажной камеры. По мере развития окрепшие проростки поренос.шш в горшки с почвой и выращивали до полного созревания в оранжерее.

Электрофоретический анализ глиадинов, эстераз, АДГ, ГДГ и ГОТ проводили в вертикальных пластинках ПААГ. Для электрофореза глиадинов использовали 8,7% ПААГ, приготовленный в 0,0083 М алхь миний-лактатном буфере (рН 3,1) (ВизЬик, zniman, 1978). электрофорез изофермантов проводили ПО Харту (Hart, 1974). Использо-ипли 7,7% разделяющий и 3,62* концентрирувдий ПААГ~и, праготов- . лонные в 0,07 М трис-Hci буфере (рН В,9). В качестве электродного буфера использовали трис-глициновый буфер, рН 8,9.

Патогенетический анализ^ В МК изучали цитогенетическае процессы в течение 3-х месяцев культивирования, начиная с момента посадки зародыша на среду. Для анализа растений-регенерантов использовали меристемы апекса корешков. Окраску хромосом проводили по Гимза iiordansky et ai., 1976) и по стандартной методике OftpaCKH по Фельгену, ЯДрЫШКИ красили AgNO^ (Hlzun-.e et al., I960). Измерение длин хромосом проводили на микрофотографиях при поноси измерительной линейки Wild с ценой деления 0,1 мм.

Статистический анализ. Достоверность полученных данных определяли, используя стандартные критерии стывдевта и критерий хг (Плохинский, 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОбСУВДЕНИЕ.

1. Влияние ПАШ на каллусогенез а регенерацию растений твердой пшеницы.

Обнаружено достоверное различие в частоте регенерации растений между контрольными растениями обоих изученных генотипов (Р> 0.05), а также разными вариантами обработки ПАБК. Коптроль-шзо каллусиые лшпга сорта Кызыл бугда обладали большей морфого-нетлчвской и регенерационной способность«}, чем Дкафаря (табл.1). Максимальное количество полученных регенератных проростков на 1 морфогенную каллусиуо линию Дкафари и Кызыл бугда составляло 0,8 и 3,9, соответственно.

Установлено стйэдлирудае влштис ПАБК на частоту регенерации растений и определена дозы обработки для каждого сорта. Для сорта ДкаТ-арн лярааит обработки ПАБК н тбтеляо 16 часов яв -„чшч:я оптимальным, так как в I пассаже частота ивдуювн МК ли-кП, обдадаиш рзгаюрвиктиой способность», у сшпгаючлась по

«i А Я ьх

О' 9*

^ о

rv ft

! 5 i

tíl ù I a

я i л ! я!-я?

f и I

vO

I I - »

Ш

О О in о

.1

i " . « к Jí iàèsû'"»

Г'- <ù I а

» - I

о

CVÍ

О Ol о

¡I t4- ф (

Sí " I

О р

i

!

^i» ь* I cv.

:-t .-I ы I ONI

ri Tt

ki t¿!

\lí\ I 4< ft <

I U n '

KV> и «'

tí О

-и

Я О

S 3 t-

й a

UV

, .» J

« ? f«

r J í-ч Ö

I

S «! ÍA л *«

»t С

,о $

V

^ й ja a s

б

ю ео о

чр

О й Ol

¡3 S 9

.С 'Л

Vх

•ч* »-hi ♦-и С J

о CV 8 8 £

¿U —J ^ *

sr.: : î vî тГ- - - '

í V е ü

'" К (

i? S- i J";

" i-i ' ñ о

а ё i a 't

if-bJ

Kï

f1-'. '"'4 Г -

O» Ó C-'

p cr> Ifl ! ?» »» '-> » w "-v £ ïsf "7' ; V :

i g в i W J* Л«*«« t>'i |Í¡ о ä 1 M ООО ООО о о «

Srr $8 ÍÍV a g 8 8 8 f.-ï i-í H S 8 Ь >--l >'-( Pi 5 S 1

А о A s я áfglg ? 8M й ? S

3 « о»; о tóS^Í'á g йооо Ac к СЗ осз О и »H N s»/ о » й

¿IÓQ KÍé^Tá^* «uay (

О CV о

сравнению акпнтролем с 43,4* до 65,5« (Р> 0,05), а количество полученных регенерентных проростков на 1 МК линию г с 0,8 до 2,3. Дня сорта Джафари всего было получено 53 фертильных расте-ний-регенерантов, из них 34 были получены из каллусных культур варианта обработки ПАЕК в течение 16 часов. Для сорта Кызыл бугда оптимальное время обработки ПАБК составляло 8 часов. Максимальное число регенератных гроростков на одну МК лини» увеличивалось по сравнению с контролем с 3,9 до 5,2. Всего было получено 160 фертильных растений-регенерентов, из них 90 были получены из каллусных культур варианта обработки ПАБК в течение 8 часов. Таким образом, степень стимулирупцего влияния ПАБК на рогенерационные способности каллусов определяется генотипом растения.

Каллуснне линии каждого сорта, полученные после обработки оптималнымн дозами ПАБК в IV пассаже, сохраняли ре генерационную способность, тогда как контрольные каллусяые линии уже к 3-му месяцу культивирования теряли способность к регенерации растений.

,1 Такйм образом показано, что в результате предобработки до-норннх растений ПАБК частота регенерации растений твердой пве-ницы достоверно увеличивается.

2. Научение изменчивости растенив-реге не рантов твердое в мягкой пкяшда по кжкягантнону составу глиадинов.

В зс2 были проанализированы 255 растений-регенерантов (1209 зерен) твердой пвеницы 2-х сортов, Дхафара и Кызыл бугда, а также 193 регенерввтов мягкой пвеницы изогенной линии АД 20'47. Для растений-регенератов мягкой паеницы линии АД 2СУ47, а также твердой пвеницы сорта Кызыл бугда была установлена изменчивость по компонентному составу глиадинов (табл.2). Соыа-клональная вариабельность выражалась в отсутствии (качественные различия), изменении интенсивности и электрофоретической подвижности (количественные различия) как единичных, так и групп компонентов при неизменности остальной части спектров. Частота изменчивости для линии АД 2СУ47 составляла зо,о*, го.гх и вычисленная по семьям, колосьям и зернам, соответственно, а для Кызыл бугда - 3,3», 1,7* и о,5*, т.е. для АД 20/47 на порядок была вняв, чем для сорта Кызыл бугда. Все регеаеравты сорта ДгаОДн имели идентичный исходной форме алектрофоретяческий спектр глиадинов.

Дня анализа рвстений-регенерентов гс^, обнаруженных в зсг Езианашшх семей, былж отобраны 6 семей мягкой пяэшща линии АД а

20/47 и 4 семьи твердой пшеницы сорта Кызыл бугда, так как данные изменения легко идентифицировались и были множественными (рис.1). Анализ компонентного состава глиадинов данных семей показал наличие стабильно (для АД 20/47 сем. n 40 , 48; для Кы знл бугда сем.н 30) а нестабильно наследуемых изменений.

Полученные данные хорово согласупгся с результатами исслс доваяий ряда авторов, деыонстрируадзх Ез&юиения спектров глиади пов соыаклоиов по сравнена® с исходными сортам (Larkin «t »1., 19b*¡ Uaddock et al., 1985).

3. Изучение ргстздЕй-рэгатерантсв твердей а иягкоЗ шпегацы по гзофзрштатному составу эстераз, АДГ, ГДР и ГОТ.

Для изучения изменчивости по изофернентаому составу автора», АДГ, ГДР и ГОТ из зрелых семян сокакловов бала проанализированы 112 раствтгВ-рэгэтэрхжш (2СЗ нарви) г-нвц""* гwsrf! ?. ~ соргоа Дхафари и Кнзнл бугда, е тагко 1G регенврантов (92 зорен) мягкой пяеницы линии АД 20/47. Сокаклоны'сорта Дяафари оказались стабильными по компонентному составу вышеуказанных ферментов. Кроме того, все использованные в работе растешм--регенеронты твердой и мягкой пиеницы показали стабильность да изоферментному составу АДГ, ГДГ и ГОТ. Для сомаклонов сем.ы 3, 8, 13, 14, 37 мягкой пяеницы линии АД 20/47 (рис.2), а также сем.ы 23 твердой пиеницы сорта Кызыл бугда была установлена изменчивость по изофермеатнсйу составу эстераз (Eat-%). Наблздао-мая изменчивость характеризовалась как отсутствием, так к появлением, а тагасе изменением знтенсивности и штктрофоре'гачеекпй подвижности отдельных изофврйптных зон на аамогражм nj/.í аоиа-менкости остальной частя спектрюв. Частота изменчивости у линии АД 20/47 была на порядок выгзе, чем у сорта Кызыл бугда. т.е. для АД 20/47 составляла 62,5», 31,25*. 30,43«, вычисленная на семьям, колосьям а зернам, соответственно; а для Кызыл бугда -2,63*, 0,941, 0,65* (табл.З). Можно предполокить, что болеа вы сокая частота изменчивости мягкой ииеницы связана, во-первых, с разницей в уровне плоидности, во-вторнх, с повывонпой изаэпча востьв линии АД 20/47, которая является чистой лшшиа, подучен ной из культуры пыльников.

4. Цитогенетический анализ каллуспых культур пшеницы.

В щитке в день посадки на ср>еду все исследовянше ««тчфя".'.'

были оущюидные. На 3-й день в культуре о частотой ш>

являлись полиплоидные матафазы с 4п--вх=йб xjiomucom (.табл.»).

Таблица 2 i Частота ссиаетонолъпой изменчивости ло компонентному составу глиадинов у растеядй-регбнерантов твердой ж шгкой шеницы SC£.

Культура Сорт Проанализровано

Зерен контр. |Семей растений-регене~;Кодосъев растешй- кютея^й • оантав • -оегенепе^тов Зерен раствнЕй-регене-рэнто^

Все- :Изме- :Все-:Изгга-: Частота :Всв-:Изыа-; Частота го гнет. ; го :нен. : % : го :нен. : % Всего:Измв- : Частота гнея. : %

Тв.пп. :Кызыя бугда Иягкая I Щ 20/47 леи....:_____________ 100 - 122 4 3,28±0,02 233 4 1,72^0,01 1099 6 0,54*0,002 100- - 19 - - 22 - - НО - . -ZOO - 50 15 30,00.¿P,06 193 -39 20,0q¿0,03 1530 149 9,73*0,01

Таблица 3 . Частота сшакпоналъной езкозчшзостя по взофериентясцу составу эстераз у раотезЕй-рогенерантов твердей в iztrsoa пшеницы SCg.

Сорт., Кол-во пмаяалиэировотрях

Зерен контр. ¡Семей растешй-раг&- ¡Колосьев растЗзрqh pacteEsS-pere-овдвдтрЛ- ¡ нерантов j геяерантов ¡ нераотов

Все- ;Изие- :Все-;Измэ-: Частота :Всэ-:Йзмв-; Частота ;Все-!Иэме-| Чаотота го гиен. : го :нен. : % ; годней. : % : го :нен. t Ц

АЕ 20/47 Кызшг оугда Льафарг 248 - 8 5 62,50+0,18 16 5 31,25*0,12 92 28 30,43*0,05 150 3S I 2,63¿0,03 'IQ6 I ' 0,94¿0,0I 236 2 0,85+0,CI 100 - 6 - - 16 - - 32

СЗ

bal { 5 f®- Ш

•ЬЙ M4, cl1-.. -H u

te» СЩ

Pïï

, ~ «Я —

' - " г;—-* ttw «1 e»

.ч.-f !TÎ 1ТПЯ

rJ У Я

-iHi-i

V*S . .1

v-v -5» r.ta

ci ci

JSflr/"

ï-4 rj a V V(

РПП

Su В

зап.

СЯ

I к 2

3 К 4

5 К S

Pîîo.'i. Электрофореграммы глиадинов растениЯ-регенерантов мягкой пшеницы лигой АД 20/47. К - контроль! 1-6 - сома-клош сем.м 3, 13, 8, 37, 40, 48, соответственно.

'¿Щ

'I

3=.i:-:Jr J'-.J

К I

... ■ > ■ - Ч -

Г- .. )

1 -M -

К 3

В)

4 К 5

ГНС. 2. Эимограмш ИзагГягыаи'пс.т! .^.— .jr-^ fini mU

'»«Я ГЛШГЛ АД <П/ДУ. - чс:Г^'-Г!,: 1 - Г, С!«*ПКЧОШ| СИМ.

'Ч в. к;, и, ссотвэдедьшшо. Схема показывает изоф^ментшй состав эстераоы контрольных растения.

0

Таблица 4.

Изменчивость структуры кариотипа соматических клеток твердой пшеницы ¡сорта Кызыл бугда, в зависимости от времени культивирования.

Номер Время каллу- культи-

вирова-

сной линии кия, сут

Исследовано метефаз

Метафазы с =4х=28

число

I 0 37 37

2 46 46

3 3 190 187

4 70 . 67

5 88 88

6 6 33 29

7 52 ' 43

8 197 187

9 12 III 89

10 58 26

II 62 42

12 30 29 21

13 59 46

14 25 20

15 60 33 23

16 10 6

17 33 16

18 25 16

19 90 30 10

20 27 16

21 45 26

100,0 100,0

98.4 95,7

100,0 87,9

82.7 94,9 80,2.

44.8 67,7 72 4

77.9 80,0

69.7 60,0

48.5 64,0 33,3 59,3

57.8

Анеушгоидные метафазы

число % число %

5 5

1 3

2 I

7 14

3

8

3 2 20 8 3

1,6 -4,3 -

3,0 5,8 1,0 0,9 12 I 22,6 10,3 13,6

2«1 8,0

66,7

29,6

6,7

3 6 8

21 25 6 5 5 5 10

4 14

7

16

9,1 11,5 4,1 18,9 43,1 9,7 17 2 8,5 20,0

30.3 40,0

42.4 28,0

п71

35.5

Частота ме-тафаз со слипаниями хромосом,?

1,0 2,5 12,0 17,0 21,0 19 О 29,0 25,0 27,0 30,0 23,0 42,0 40,0 67,0 78,0 31,7 40,0 75,0

Другие явления

мелкие хромосомы

мелкие хромое ош

мелкие хромосомы мшпше хромосомы

%

Все полиплоиден о клетки были окталлоидны. Начиная с 6-го для культивирования,во всех линиях обнаружены анеуплоиднне метафазы с частотой от 4,1% до 43,1*. Число хромосом в анеупловдгагс клетках варьировало от 8 до 55 хромосом. Среди низ 58* составляли анеуплоиды с 27 хромосомами. Отмечено, что в одной а той го кяллусной линии не встречается одновременно высокая частота полиплоидных и анеушгаидных клеток.

В МК не были обнаружены хромосомные аберрации, далциа мосты, фрагменты, дицентршш, что свидетельствует об отсутствии мутационного процесса, вызывающего разрывы и перестройки хромосом.

При исследовании МК было обнаружено, что длтата нетвфазяых хртюсом (Ц), которая обуславливается степенью их сплраятация, зависят от срока культивирования л тала каллусной меристемы (табл. Г>). На 30-й день культуры отмечено появление метаФаз о оч«яъ

Гайки и« Ь.

¡¡омвнчиностъ сутегарпоЛ длины хромосом кариотипа (1.= 1 с статических клеток твердой пшеницы сорта Кызыл бугда в зависимости от времени культивирования и типа каллуса.

Время культивирования (суток)

контроль 0 6 12 30

«К гак

171 . 175 179 ¡80 208 "

491.5 ?В3.2 413.8 502.4 362,6 182,6 -27,5 ±11.8 ±4,6 ±4,7 ±7,1 ±10.2

укороченными, сверхсшрализоватшки до 4-5 !.*га хромосоодмв. ?я-кио метафазн характерны для меристем НМК, а в ЦК наблвдаится нз границах меристем среди интерфазинх ядер с внсокохондсЕсаровантам хроматином, т.е. п клетках, перепедстх из мерзстеми в диИи-;.*;нц1тронаннуп парепхкмнуэ ткань. В ядрах о высококояденсировап-ным хроматином отмечено снижение синтеза РНК, которое проявлялось в уменьшении размеров и числа ядрывек вплоть до полного из исчезновения.

'!э 3-й день культивирования наблпдаласъ поверхностна ' ляп кость х}хзмосом, т.е. чему хромосома)® 61.дл обпаругэны ДИК-овне

Су?.Г<ЫШЯЧ

длина* хр^-мосоч кариотипа {I- . 1.

<50 345 406 493 355

473 352 410 500 35В

490 368 416 504 359

510 372 410 506 370

535 379 419 509 ' 373

тяги и нити. Они присутствовали КСК МОЕДУ гомологкчшш, тш; и кагоиолонинкиа хрошсошма, отшчоны как едаштошв и ишест-вешше, затрагивали как штеркалярвне ' участки плач хромосом, гак и теломэрпые. Посты слштшш бит непрочными и по препятствовала ааафазкому расхождению xpo:,socou.

Был проведен анализ С-охфа^ивашм по длина штафашшх хромосом в клетках МК a KXi 30-и дневной каллусноа жшии. В КШ> Сила отмачеш! следулг^з отклонения от контроля: урешннвагкэ дллк плеч в направлена: мзтацентрдоности хромосом, слияние шш утрата готерохрсаг.тикозцх блоков как телокэрных, так с щтгарсаляр-шIX. Эти отклонена« делшк нршстичоо;^ невоздохаэа достоверную нденпфшаццв сверхсшфалкзовапнлх хромосом.

Таким образе«, цитогенетЕческЕй анализ каллуешх лный тадр-дг г гсазнвды сорта Кызыл бугда показал, что с увеличением врзм-шi культивирования частота набдвдазкшс цетогоногичесыя: йно:-,:а~ лгй увела читается. Процесс старения каллуса, по касааг даянык, цитологически проявляется в уенлеинп стеаона ковденсацпа хрош-тшш в ядрах клеток, "выходящая" из «ерьстош, и постепенном сок-рачеши объет марает ека. В участках каллусв с повынешгой конденсацией хрзм- тина паблвдается нарусашга работы веретена делания. Показано, что век полиплоидия, так к анеушгаидия представляет собой явления, сопровоздидце процесс старания каллуса.

Процесс конденсация хроматика в ядрах клеток НМХ носит градиентный характер - от цонтрь керастеш к пергферш. Процесс шадбнзацзи хроматика не эаграгквает нарастет, находящейся ка поверхности каллуса, сохраняющего потеыце: к регенерации. Поскольку оба кша шрь-сте!,;. - внутренняя п поверхностная ведут свое щгоасхаздеуцо от разлнх юштек щггка, очавадяо, что уровень доф-фаренцароэки експяанта, его гвветшо-фзаолзгичоское состояние играет pciauqya роль в судьба каллуchuz ниристех. В свяэа с зтш находит об-ьксненка процесс изменчивости дялик иотафазных хромосом iipa .росте каялуса.

Б. Цатогенатачаскай анализ растешй-регенсрьнтоБ таардсЗ с вяткой паекицы.

Наш было исследовано число хрзыосоа у первичных растениВ-тюгенерантов, полученных в 1-й и во 2-й пассах:ах твердой пкени-цы сортов Дза$ари н Кызыл бугда, а также мягкой пшеницы линии АД 20/47 в *шаат высадки из культуры в перлит. Для определения числа хромосом у растаний-регенерантов после прохождения нейоза бал проведан цатогенетичоскай анализ проростков из семян второй репродукции зрелых рэгагзраятон (sc? ). При анализе числа хроио-

сом у первичных растений-регеноран-ов Джафари я Кызыл бугда, при высадке их в перлит, среди 60 растений был обнаружен один полиплоид с 4п=8х=56 хромосом и один анеуплоид с 2п=4х-1=27 хромосом, а также среди 30 растений-регенерантов АД 20/47 был обнаружен 1 анеуплоид с 2п=6х-1=41 хромосом. Все изучегоюе нами первичные растения-регенеранты сорта Дясафвря имели эуплопдноо число хромосом (2п=-4х=28). А также при исследовании числа хромосом у проростков из семян растсняй-регенераптов sc2 всех изученных сортов был установлен эушюидный набор хромосом, без видимых изменений морфология хромосом.

Наблюдаемая распространенность аноупловдных клеток в :шл-лусах. и выживаемость аяеуплсядпях растспий-рогонорзнтов у ппе-mifUi обеспечивается наличием у твердой 2-х геномов (.1 и В), а у мягкой 3-х (А. В и Д). Нормальное число хромосом у большинства регенершггов свидетельствует о том, что тотип-тттпп» о-вгл-с.-гном. ИЯ*. ПОЧТОЮ, ViZSSPS! ГРХОГбиОШЧООлН нормальны« кмут^щ.

Таким ооразом, наблццаемая нами изменчивость как по кошо-нентному составу глиадинов, так и по изоферкантному составу вс-тераз твердой и мягкой ппеницы но связана с геномными мутациями (полиплоидия и анеуплоддия).

5.1. Цитогеквтический анализ 1В хрсиосош измененного по компонентно? составу глиадинов сомаллонов пяткой станицы линия АД 20/47.

Для изучения корреляции кецду изменчивость?» по точпояегт-но'у cncTfiy белков зерновки - глиадинов и структурой хромосом, ¡'чем боля отобраны сомаклоны se, гексаплоидной пгенящ, яашв АД Г.0/47 сем. N.48. Зерновки были поделены го» 2 части, из чото-рнх одну использовала для электрофореза, ч чругуо проршзгаалч. 053if to рентах попользовала для тлтогечетаюсу.ого anrvraa. гетш»-■■:ухк:я нпсть для получения рог' •геразггов г>!*ч, в спектре глиадинов данных сомнклонов отсутствовал! о , г',, г,, '■> , л ¡табло-

t i I 5 , S , i) . I l

далось снижение интенсивности « компонентов.В тсачсство

1 , a ï 4

контроля бил использован спектр зерновок ксходаах растений линии АД 20/47, Для установления локализации геяов, кодирующих тягзу.укззашше компоненты, бил чепользовян каталог пллолшнх вариантов блоков глиадинов мягкой дамшш яра плохтрофорезо ч йШ'-е, которнй бил составлен с помощью. гиОрлдологаческого анализа (Созинов,1985).

Для установления возможной изменчивости структуры 1В хра-м-ггуи, ¡¡wyeca данный глдиденкоцирумем i "). Пиля получен., гм-га;«з»ш«э ¡достигли из корстк.ч гоЛ к« «чрч 1 "■"■■ ич>*ясу»Я дом<м<т •

Ï3

шй спектр глиадивов и были исследованы ив то до« дифференциальной окраски хромосом ш Гимза.

При визуальном наблвдешщ изменение С-окравивания 1В хромосома сомаклона не было обнаружено, .при втом все проанализированные 'метафазные пластинки имели эуплоидный набор хромосом. Из атого следует, что наблвдаемая нами изменчивость по компонентному составу глиадинов не является следствием крупных хромосомных перестроек.

6. Генетический анализ измененных по кошонентко^у составу глЕьданов мягкой шсекяцц лвкза ДД 20/47.

Для генетического анализа растешй-рогенсраетов ипэг цаеницы линии АД 20/47, потомство измененных по гакшонантноад составу сомаклонов сем. к. 48 и сем. N-40 в sc3 скрешвали с исходной линией: se ad 20/47 х o*ad 20/47. При анализа овдоспер-ма зеро л Fj (т.е. зерновок, полученных на материнском расгешлг в резуль'-эте опыления - jsc ad 20/47 х o*ad 20/471 было установлено, что все зерна имели идентичный с контролем спектр глиадинов (табл.6). В гг частота появления мутантного фенотипа для

Таблица 6.

Характер наследования изменчивости по компонентному составу глиадивов в F и Fz у растений $sc ad 20/47 х 9*ad 20/47.

к генерации Культура Проанализирован о

Колосьев Зерен

Всего Изменен. Частота s Всего Изме-| вен. Час- тога *

Fl fC6M.N 40 X х 0*АД 20/47 6 - 95 - -

«сем.ы 48 х х о"АД 20/47 5 - - 84 - -

«CeM.N 40 х X е*АД 20/47 33 9 27,3 . 255 30 11.8

F2 « C6M.N 48 X 46 1 х АД 2 0 /47 2,2 419 1 0,2

растений $ сем. N".40 АД 20/47 х о*АД 20/47 составляла 27,зх и п,в*, вычисленная по колосьям и зернам, соответственно; а для растений $ сем. N.48 АД 20/47 х <**АД 20/47 - 2,2» и 0,2*. Анализ растений $ сем. N.40 АД 20/47 х о* АД 20/47 в Р показал, что из 33-х колосьев, 9 содеркали зерновки( спектр глиадинов^

и .

которых соответствовал спектру мутаятных сокаклонов. В даинях колосьях наблвдалось расщеплевге по принципу присутствия/отсутствия ранее упомянутых компонентов глиадшгов, в соотношении -3:1. Это говорит о том, что изменчивость по компонентному составу гяпэдяпов зерновок сомзклонов семьи N.48 такза является стабильно пзсдедуе?:ой, как а у семья Н.40.

вывода.

1. Показано стпмудпрупдее влияние ПАЕК па регенерация растений твердой пяенвдн сортов Дгсфзрл и Кызыл бугда и определены оплшяльнне дока для обработка ПАЕК дояорянх растений.

3.1. "етодом электрофореза в ПААГ-е установлена пскзтгга-вость.по Есжюнентаому составу глиадштав н- нгофзраптнсну соо-гаяу зстораз сомаялонов мягкой пзвшщя лтсшз АД 20/17 я тттрдол гсгенаця сорта Кызыл бугда, цретем частота сомаклояаль-ной изменчивости у иягкой ггаешщн на порядок <5 тла внаэ. чем *

тпдгшп»

4.й. ггаС^мызоеть яо ксетопвзтяому составу гяа-динов сокаклонов сорта Дзвфзра, а такав по нзоферментгому составу АДГ, ГДГ а ГОТ соизклоиов ляянз АД 20/47 и сорта ДзсЛятп.

3. Анализ наследования изменчивости по ганпопонтнопу составу глиадннов растснаа-регенервнтов твердой и мягкоЗ пзензцн в 5Сз выявил стабильно я нестабильно наследуемые изменения.

4.1. В контрольных линиях МК культур твердой шмпицы обна-ругенн различные цатогонетгческне аномалия, частота авторах пг>-»"»«гсь г, тяйяаченаем примени культавяроваяня. Отгтачапо. что в о/доЭ л той кя «аялуснса лхин не эстречаотся оквоврог:осет чн-.'окая частота полиплоядннх я аквуштоядши: клеток.

4,,2. Устпгкямоя», что ¿цвета гфъ'юз зрсгассч <!....!■» ч?рая сбуолазллзйвгса стенопы) т стфа.тагкта, зяитяте эт ¿улъхавяроравкя и тала калдуигоЯ г»ркяв»»и,

5. Установлено. что наоладяеная па»п ссггиааяалътая гзэтза-•птвость по г-онпонентпому составу гдналвнов а по ззсхТар^птяс;? составу встераз твердой я «ягксЗ егзшщи, кэ сзязчтп о гетгжг-■¿я. я крупными хроязсшннш перестройка«!.

6. Авале* гибр-гтасс ргстзгкй ? зс АД 20/47 2 «" £0/4? ;?озазая, что мнетачесжш пртрода стайяльзо ппслэлуе^заг -~"'зи9~

разлила. . .

1. Для увеличения нвдумря л рэгегврэдя рзегзша тйзр-до® тента рекомендуется •збр5бетя5а?ь догоряяе рвогеил». 1JA.SK

ори определенных в данном исследовании оптимальных дозах.

2. Для создания генетического разнообразия растений твердой а мягкой пшеницы, необходимого для селекции, предлагается использовать феномен соааклональноЕ изменчивости.

Спкоок работ, оптйягкоиакнх по тайн

1. Бабаева O.A..[Петрова Т.ФЛ Гапоненко A.K. Цитогенетк-ка культивируемых in vitro соматических клеток и растений- роге нерантов. //Тезисы докладов всесоюзной конференции ш био-тахналогил злаковых культур.-Алма-Ата.-1988.-С.67.

2. Бабаева С.А..|Петрова Т.Й.1 иод^икадиа цитогензгяче-сках ыетодов для объектов биотехнологии растений (протопласты, каллусы, регенераты)семейства злаков.//I Всесоюзный симпозиум "Новые мзюда биотехнологии растений".-Пущшо.-1991.-С. 88.

3. Бабаева С.А., Гапоненко А.К.. [Петрова Т.й.1 Цитогенетц-ческка анализ 1В хромосомы сомаклона мягкой пиешцы, измененпо-го по к даонентному составу глиадинов. //Доклады Академии Наук CCCP.-1991.-f .320.-СД251-1253.

4. Гапоненко А.К., Шаяхметов И.О., Бабаева С.А., Охримешсо Г.Н. Анализ изофоркантного состава есгераэ, АДГ, ГДГ и ГОТ со-иаклонов твеодой и мягкой пшеницы.//Генетика.-1993.-Т.29.-к.2.--С. 143-на.

/л//- ^Зу- И дписано к печати. Объем 1»0 п.д. Тир. "IQO, »ак. §§

_— ■-^-i—:-----—;-:-:----щ—г

ТИПОГРАФИЯ РОССИЙСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. ДРУЖБЫ НАРОДОВ