Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОХРАНЕНИЕ СЕМЕНИ БЫКА ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ ТЕЛА В КАПСУЛАХ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "СОХРАНЕНИЕ СЕМЕНИ БЫКА ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ ТЕЛА В КАПСУЛАХ"



На правах рукописи

ДАМРИНА Ирина Евгеньевна

Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах

03.00.13 -Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московская область, 2003

Работа выполнена в отделе биология воспроизведения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного ааучно-лсследоваштского института животноводства (8ИЖ)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Научный консуяьпюнт:

доктор биояопічесшк наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Николай Захарович Жилыдо»

Юряй Павлович Фомичев

ГОркЙ Дыитрне&йч Клиношй Николай Петрович Зыкунов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Защита диссертации состоится «/» ШМгооз года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013,0) при Всероссийском государственном йаучно-исследоватеяьском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, По-^т.^^мДон, п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан « мая 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических на;

'В.П. Губанова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

На современном этапе развития искусственного осеменения, когда сперму хранят неограниченное время при температуре жидкого азота (при -196° С), ставить такой вопрос как хранение спермы при температуре тела, по крайней мере, несколько странно. Дело в том, что после оттаивания при температуре тела период живучести семени резко сокращается. Следовательно, для достижения положительного результата необходимо наладить мониторинг состояния полового цикла коров, определение сроков овуляции и оптимального срока осеменения, что практически невозможно выполнить в мясном скотоводстве. Однако, прогресс в генетическом улучшении скота в этой области крайне необходим.

Идеально, было бы добиться хранения спермы в половом тракте коровы в специальных капсулах, которые бы открывались в период овуляции и выделяли порцию семени для оплодотворения яйцеклетки. Такой метод хранения семени в половом тракте самки получил в литературе название «инкапсулирование спермы» (Nebel R,L. et а!,, 1985, 1993.1996).

Ученые центра тропического животноводства в Австралии приступили к практическому исполнению идеи по разработке метода хранения семени нри 37СС и получили первые результаты по использованию инкапсулированного семени быка в искусственном осеменении (D'Occhio М, 1993). В нашей стране с 60-х годов этому вопросу не уделяли должного внимания, глубокое замораживание захватило умы исследователей.

Особый интерес микроинкапсулирование спермы представляет для двух областей метода искусственного осеменения -это программы суперовуляция у коров-доноров и синхронизация охоты у самок сельскохозяйственных животных. В указанных ситуациях овуляция наступает в течение более длительного периода времени, и микрокапсулы могут был, доступны в течение всего периода. Таким образом, благодаря микроинкапсулированию снижается важность определения оптимального срока осеменения.

Известный ученый США Вольфганг Иохле, который 40 лет своей жизни посвятил разработке методов синхронизации охоты у самок сельскохозяйственных животных, считает, что способность использовать микроинкапсулированную сперму с долгим сроком жизни предпочтительнее инъекций простагландина Fj. При этом отпадет необходимость учитывать время охоты и овуляции, что позволит методу искусственного осеменения утвердиться в мясном скотоводстве (Jöchle W., 1993).

Определение оптимального времени осеменения в искусственном осеменении крупного рогатого скота это критическая точка в указанном методе, потому что существует вариабельность времени ов\СЙЩиП—(ШТЕЙНТГЕЗТЕЙО у№МВЛВЯюй охоты и трудность в

цнэ мсха

I фондjewoi лигарвт^ы)

установлении точного времени прихода коровы в охоту, особенно в мясном скотоводстве (Роо1еК.е1а1.,1993).

Вышеизложенное позволяет заключать, что исследования, посвященные разработке способа хранения семени быка при температуре тела в капсулах, является актуалыгым не только в практическом, но н в теоретическом плане.

Цель работы и задачи исследований Целью настоящей работы являлось разработка среды для хранения семени быка при температуре 35-37°С и моделирование капсулы с самовытекающим семенем, В связи с этим решали следующие задачи;

5. Разработать новую синтетическую среду для хранения семени быка при 35-37°С с содержанием уже ранее вводимых в разные среды компяексонатов, витаминов, Сахаров, электролитов и органических кислот.

2. Смоделировать гп гИго условия придатка семенника за счет насыщения разбавленного средой семени углекислым газом, добавления кислотных инаетнваторов (янтарная и сорбиновая кислоты), понижения температуры хранения семени.

3. Смоделировать капсулу, которая обеспечит медленное вытекание семою под влиянием изменений условий среды в шейке матки (38ЭС<Р'391'С, 5,3<рН>7.8).

4. Исследовать свойства полученных микрокапсул я их влияние на находящихся в них живчиков быка.

Провести экспериментальные исследования проверки результативности осеменения коров инкапсулированным семенем быка с введением его в шейку матки.

Научная новизна исследований состоит в том, что разработана среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37'С, Впервые применен высокомолекулярный полимер хвтозан в животноводстве для инкапсулирования живчиков. Семя быка инкапсулировано в алгинат-кальций-хитозановые микрокаисулы, Проведена проверка результативности осемевенш коров живчиками, инкапсулированными в капсулы.

Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быка в микрокапсулах.

Основные положения, выносимые на защит)':

среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С; биологическое обоснование и применение высокомолекулярного полимера хнтозана для инкапсулирования;

биологическое обоснование микроинкапсулирсдаания семени быка в животноводстве;

экспериментальные данные по инкапсулированию семени быка в аягинат-кальций-хитозаноше микрокапсулы и проверке результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в эти капсулы.

Апробация работы. Материалы проведенных и с сл с я о ян и íi бы > доложены, обсуждены и получили положительную оценку:

на ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых ученых" (2001,2002 гг. Ш1Ж);

на ежегодных международных научно-практических конференциях «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001, 2002 гг., ФГОУРЛМЖ);

на второй Международной научной конференции «Современные достижения н проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (19-20 ноября 2002г., 131ТЖ. Дубровины);

на научной конференции отдела биологии воспроизведения и отдела сертификации и эко лого-генетических исследований в животноводстве ВИЖа(И мая 2003 г.); Публикации По теме диссертации опубликовано 4 научные работы. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследований, изложения подученных результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /^Усгращщах .машинописного текста формата А4, содержит таблицы и рисунка. Список литературы включает источника, атом числе <£3 русских

и (^¿^иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Дчя решения поставленных задач данная работа выполнялась в три этапа.

На первом этапе работы была разработана синтетическая среда для кратковременного хранения семени быка при 35-37°С.

Для опытов использовали ссмя быков ЦСИО, отвечающее всем требованиям стандарта с подвижностью не ниже 0,7. Подвижность спершев определяли под микроскопам, подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно.

При выборе неэлектролита руководствовались положениями по оптимальному соотношению компонентов в среде ГЛКап для хранения семени быков при плюсовых температурах (Н.Э. Жильцов, 1967).

Чтобы выяснить наиболее благоприятный для живчиков процент трипоиа Б (дкнатриевая соль ЭДТА), опыты проводили ко методу составления трехкомпонентных сред (метод треугольника no В.К, Милованову, 1962).

Условия придатка семенника т vitro моделировали за счет добавления кислотных иаактиваторов в виде янтарной и сорбиновой кислот, насыщения семени углекислым газом и понижения температуры хранения разбавленного средой семени.

Для определения наиболее благоприятного для живчиков процента янтарной и сорбиновой кислот опыты проводили по методу составления двухкомпонснтяьк сред (геометрический ряд по Э.Ф. Пояркову, 1917].

Опыты по определению оптимального количества витамина Е для сохранения активности семени быка при температуре 35-37°С проводили по арифметическому ряду метода составления двухшмаоментных сред (по Э.Ф. Пояркову, 1917),

Семя быка, разбавленное синтетической средой, насыщали 5% углекислым газом при помощи аппарата Кипа.

Переживаемостъ спермнев быка а среде при )8-20°С н 35-37°С оценивали по абсолютному показателю живучести семени (по В.К.Мияованову, 1962).

Нуклеазную активность исследовали в семенной плазме быка, в семенной плазме с добавлением желтка куриного яйца и в разных вариациях синтетической среды (по Т. Маниатис, 1984). В качестве субстрата использовали ДНК фага к. Семенную плазму быка получали путем последовательных центрифугирований свежей спермы (по IIB. Кузнецовой с соавтор., 1993). Опыты проведены при совместном участки A.B. Чнчилова (научный сотрудник отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа),

На втором этапе было осуществлено in viiro инкапсулирование семени быка в микро капсулы.

При выборе способа микроинкаспулирования руководствовались положениями выдвинутыми (Barthkowiak А., 200!; Nebel et al, 1985, 1993; Мархвичева с соавт., 2001). Для формирования мембраны микрокапсулы применена трехкомпонентпая система пол нан ион/Ме^/п ели катион. В качестве полнаниова использовали алгинат натрия (ч.д.а., вязкость 2% раствора при 25°С 3500 еП, Sigma), в качестве поликатиона -высокомолекулярный полимер кислаторастворкмый хитозан {ММ 20 Кд, степень дезацитилирования 0,84, ЗАО «Бионрогресс» ВНИТЙБП г. Щелкою, Московская обл.).

Микрокапсулы с полупроницаемой мембраной то слермиями внутри получали в две стадии:

1) формирование Са-аягинатяых гранул, покрытых хитозаном, с иммобилизованными в них спермиями; 2) растворение аяпшатного ядра с помощью натриевой соли ЭДТА, Полученные

микрокапсулы (2-3 мм в диаметре) хранили в разработанной среде при 18-20°С и оря 3537°С.

Механические свойства микрокапсул определяли по толщине их мембраны в зависимости от рН раствора полимера и времени инкубирования Са-алгикагкых гранул в этом растворе, от концентрации полимера, и от температуры инкубирования микрокапсул в среде при помощи измерительной линейки оптического микроскопа (ЮОх).

Для изучения времени, необходимого для высвобождения спермиев из микрокапсул, проводили in vitro тест. Полученные алгинат-кальций-хитозановые капсулы со спермиями внутри инкубировали в данной среде при температуре близкой к температуре в половых путях коровы, при 37°С. Процент свободных сперм иен определяли в оптический микроскоп (ЮОх) через 24,48 и 72часа.

Активность сперм и ев после инкапсулирования определяли под микроскопом (ЮОх), подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно.

На третьем этапе была проведена проверка результативности осеменения коров и телок инкапсулированным семенем быка в ОПХ «Дубровины» Подольского района (Н.А. Некрасова). В опыте были использованы следующие животные:

Схема опыта.

Возраст (отелов) животных Опыт (количество животных) Контроль (количество животных)

0 3 3

1 1 3

2 2 2

3 4 3

5 1 I

в и более 1 І

Всего 12 13

Животных осеменяли ректоцервикальным методом с введением микрокапсул в шейку матки через 12 часов после определения момента охоты, »основном один раз в сутки.

Оплодотворяемость коров и телок учитывали по числу животных повторно пришедших в охоту через 30, 60, 90 и 150 дней после осеменения. Окончательный процент оплодотворенных животных выводили по данным ректальной проверки через 60-90 дней после первого осеменения.

Проводили учет предполагаемой эмбриональной смертности.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка сннтегичес»)й срелы для хранения семенн быка при 35-3 7°С.

Первоначально в исследованиях было установлено, что использование Сахаров в синтетических средах да хранения семени быка ври дашых условиях неприемлемо (рис, 1).

На рис. 1 бшю, что активность живчиков уменьшалась (с 80 до }%) во всех исследуемых растворах Сахаров за довольно короткий период времени по сравнению с контролем (гликокол). Уже через 4 часа наблюдалась единичная подвижность (Еп) живчиков во всех исследуемых растворах Сахаров, тогда как в контроле Еп наблюдалась только через 24 часа. Можно предположить, что сахара способствуют ускорению обменных процессов в живчиках, которые сокращают их живучесть. Отсюда следует, что в качестве неэлектролита в средах для хранения семени быка дм указанных условий оптимальной является амнноуксз'снав кислота -гликокол.

-ж-лактоза м -о-глюкоза | -*— фруктоза < |-»—сахароза р раффиноза || ! -о- глякожщ ,

Рис, І. Активность живчиков в изотонических растворах неэлектролита вря 35-37"С,

На основаніш эпгх опытов было решено далее в экспериментах использовать гаи ко ко я в количестве 0,7 г на 1000 мл дистиллированной воды.

Установлено, что янтарная и капроновая кислоты оказывают положительное влияние на увеличение срока хранения спермиев при 35-37еС при добавлении их в качестве кислотного инактиватора к глнкокол-цитрат—желточной синтетической среде по сравнению с контролем (среды без кислот) (рис.2),

i Штошрояь !>

Г Зкагфсиювая j| ; кислота 'i

1

) Шянтарная ¡j I кисти

С Рис. 2. Влияние ij органических кислот на ¡. активность семени быка

При 35-37ЬС (средние

)

.' данные 5 опытов).

О 6 24 48 12 Время, ч

Однако в среде F.ilpK с янтарной кислотой живчика сохраняли активность на 24 часа дольше, чем в среде с капроновой кислотой. Возможно, эти результаты подтверждают данные о том, что капроновая кислота действует как по верхи ости о-активное вещество. Адсорбируясь живчиками, она проникает в них, вклинивается между молекулами плазмолагеиа в мембране и смягчает действие хояодового удара (Жильцов Н.З., 1967). При данной же температуре (35-3?°С) живчики нуждаются в первую очередь в экзогенном субстрате для поддержания установленного уровня дыхания, а капроновая кислота не являете* источником питания. Можно предположить, что янтарная кислота, напротив, служит к источником энергии и кислотным ниактиватором.

Янтарная (! ЮОС-СНг-СНг-СООН, бутандиовая) кислота обладает химическими свойствами, характерными для днкарбоновьзх кислот, вступая в реакции с водными растворами щелочей, образует соли, называемые сукцинаты, Как известно, сукнинат является одним из промежуточных продуктов цикла Крсбса » ирн помощи сукцннатдегиярогашы превращается в фумарат с высвобождением О; и АТФ. Более того, при окислении янтарная кислота может вступать в реакцию с HjOj и в зависимости от условий может образоваться перокс«янтарная (CHiCOOOH^, оксоянтарная или малоновая кислоты.

Вследствие того, что янтарная кислота абсолютно безвредное вещество (присутствует во всех организмах), обладающее особыми полезными свойствами, она получила широкое применение во многих областях медицины.

Было установлено, что добавление 1,56% О.ЗМ янтарной кислоты к гликотл-цитрат-трклок Б~ желточной среде увеличивало кивучесть семени быка почти в 2 раза как при 1820°С, так и при 35-37*С по сравнению со средой без янтарной кислоты (рис.3).

1,56

3,32

)Шпри 18-20"С ¡Шпри35-37°С

cit

«Д5 25 jo

ода од» ад? о,7я 1,56 з.п 6Д5 25 Процент 0,ЗМ янтарной кислоты

50

Ряс. 3. Живучесть семени быка в зависимости от % добавления янтарной кислоты.

(при температуре 18-20"С живучесть семена (За) была равна 86,9, при 35'37°С

абсолютный показатель живучести (Эа) составил 24,3).

При пересчете этого процента на кокцентрированную янтарную кислоту находим, что на 1000 мл среды нужно добавить 0,65 мл янтарной кислоты.

Известно, что а процессе жизнедеятельности живчиков образуются агрессивные формы кислорода, которые окисляют или разрушают клетки, приводя к неминуемой ее гибели. Янтарная кислота способна эффективно обезвреживать свободные радикалы, тш самым предотвращать опасное для живчиков окисление липидов мембраны. Кроме того, она также обладает мощным антиокскаантным свойством. Все это дает основание предположить, что «тарная кислота является наиболее благоприятным агентом дня сохранения семени при температуре близкой к температуре тела, при 35-37ЬС

Сорбиновая кислота (СНзСН-СНСН^СНСООН) является типичным представителем ненасыщенных карбоновых кислот. В присутствие кпслорода или пероксидое легко окисляется, образу« при полном окислении углекислый газ и воду. Таким образом, она может способствовать созданию анаэробных условий в среде, которые, как известно, замедляют метаболические процессы в живчиках.

Как видно на рис. 4, добавление 3,12% 0,ЭМ сорбнновой кислоты к гликокол-цитрат-трилон Б-желточной среде с янтарной кислотой являлось оптимальным для сохранения живучести семени быка как при 18-20°С, так и при35-37°С.

; л .лп і«ґі їй 1.563.12

■ при ІВ-ЇО^СІ Шпри35-37°С

Рис. 4. Абсолютный показатель живучести семени быка в

зависимости от процента сорбиновой кислоты (средние данные 5 опытов).

% сорбиновой кислоты

Расчетная величина изотонического раствора сорбиновой кислоты составляет 0,7 мл на 1000 мл среды.

Более того, сорбиновая кислота обладает фунпщидными свойствами и низкой токсичностью, поэтому широко используется в пищевой и косметической промышленности*, в качестве природного консерванта, так как впервые в 1859 году была выделена Гофманом из рябинового сока. Следовательно, при хранении семени она может бить использована для предупреждения роста бактерий.

Активные молекулы кислорода, вступая в реакции с лшшдами, ненасыщенными гидрокарбоиатами и жирными кислотами, которые в большом количестве содержатся в мембране, вызывают линидкук» пероксидашда, ведущую к дестабилизации мембраны, снижению подвижности и оплодотворяющей способности живчиков.

Было показано, что при хранении семени хряка в жидком состоянии изменяется соотношение жирных кислот в фосфолипидах мембраны -уменьшается количество полиненасыщенных жирных кислот (С22:бп-3) и увеличивается количество насыщенных жирных кислот {С18:0). Введение а-токоферола полностью предотвращало окислительное разрушение полиненасыщеяных жирных кислот С22:6л-3 и, тем самым, увеличивало живучесть спермиеэ (СегоИщ 5. е1 а!., 2000),

В исследованиях было установлено, что добавление а-токоферол аиетата к глакокол-нитрат-трилон Б-желточной среде в небольших концентрациях (0,09 г/мл) оптимально для сохранения активности семени быка при 35-37СС (рис.5).

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0,8 0.9 1 токоферол ацетат, мл

Рис. 5. Активность семени быка в зависимости от

количества «-токоферол ацетата при 35-37°С, (средние данные 5 опытов)

Вероятно, «-токоферол ацетата также как и капроновая кислота является поверхностно-активным веществом. Только в отличие от капроновой кислоты, его молекулы не вклиниваются между молекулами ллазмолагена в мембране живчиков, а взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами по межмолекулярным связям. Более того, за счет отщеплепия атома водорода от гвдроксильной группы он способен образовывать устойчивые свободные радикалы, которые в свою очередь мотут вступать во взаимодействие со свободными радикалами, участвующими в образовании пероксндов.

Водорастворимый, имеющий заряд трнлои Б, может свободно проникать через мембрану живчиков н регулировать внешне направленную пероксидацию, в отличие от «токоферол ацетата, регулирующего внутрь направленную пероксидацию.

На рис.6 показано, что добавление трилона Б (0,2 г/100 мл) не снижало активность живчиков в среде для хранения семеии быка при 18-20 ЬС и при 35-37°С.

70%

к цитрат N3

] 0% желток

Рис. 6. Зоны биологических уровней для синтетической среды по треугольнику с интервалом

10%.

Можно предположить, что молекулы трилона Б взаимодействуют со свободными радикалами, которые образуются при хранении спермы быка при плюсовых температурах.

На основании данных, полученных при введении вышеуказанных компонентов было решено для дальнейших исследований на 1000 мл дистиллированной воды использовать среду следующего состава: лимоннокислый натрий 3-х замещенный пятиводный 20 г, гликокол 7 г, трилон Б 2 г, янтарная кислота 0,63 мл, сорбиновая кислота 0,7мл, витамин Е {«-токоферол ацетат 10% раствора в масле) 10 мл, желток куриного яйца 50 мл.

В среднем семя быка сохраняло активность в данной среде и ГлЦЖ при 35-37°С в течение 36 часов и 12 часов, соответственно, по сравнению с контролем (неразбавленное семя при 35-37°С); а при 18-20 °С живчики сохраняли активность в течение 6 суток и 3 суток, соответственно, по сравнению с контролем (неразбавленное семя при 18-20 °С) -около 24 часов (рис. 7А).

На рис, 7Е показано, что 5% СО2 удлинял срок хранения спермиев в данной среде при 35-37°С на 12 часов по сравнению с контролем (48 часов н 36 часов, соответственно), а при 18-20°С спермин - на 24 часа (7 суток и б суток, соответственно).

Рис. 7, Активность семени быка; в данной среде при 35-37°С и 18-20'С (А); в данной среде при насыщении 5% СОг в течении 10 минут в аппарате Киппа (Б).

В последние время появились работы (В. Багнров, 1997; Т. Щит, 1998), посвященные трансформированию сперматозоидов, в которых доказано, что при глубоком замораживании может происходить трансформирование ДНК живчиков.

Замечено, что желток куриного яйца, добавленный в среду для замораживания семени быка, повышает активность нуклеаз (Н.Э. Жильцов и др., 2001, 2002),

I

Рис. 8. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X: дорожка I -ДНК фага X; дорожка 2 -гидролиз .ДНК фага X в семенной плазме быка; дорожки 3 н 4 -гидролиз ДНК фага X в желтке куриного яйца.

Как видно из рнс. 8, в желтке куриного яйца {пробирка Зи4) уже в первую минуту инкубирования была зафиксирована высокая нуклеазную активность, тогда как в семенной плазме (пробирка 3) ДНК фага X расщеплялась через 1 час инкубации.

Рис. 9. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага ),: дорожки I и 5 -гидролиз ДНК фага X в среде без трилона Бис обычным желтком; дорожки 2 и 3 -гидролиз ДНК фага X с трилоном Бис обычным желтком; дорожки 4 и 6 -гидролиз ДНК фага X в среде полностью; дорожки 7 и 5-гидролиз ДНК фага X в среде с семенем хряка (др. опыт) и дорожка 9 - ДНК фага л.

Анализируя рисунок 9, следует отметить, что в среде с полным составом (пробирка 4 и 6} был зафиксирован допустимый остаточный уровень нуклеаз, тогда как в средах с обычным желтком куриного Яйца без трилояа Б (пробирка 1 я 5) и с трнлоном Б (пробирка 2 и 3) наблюдалось повышение нуклеазной активности.

Следовательно, при отсутствии реагентов снижающих нуклеазную активность (тот же трилон Б), желток может быть опасным для хромосомальноЙ ДНК живчиков с точки зрения ее деградации. Таким образом, для хранения семени быка при температуре 35-37'С следует использовать среду в полном составе с добавлением желтка, и «активированного путем нагревания,

3.2. Микроинка псулкроваив t семени бык» in vitro,

В последнее время хитозан находит все более широкое применение в фармакологии и биомедицнне, в частности для создания препаратов пролонгированного действия на основе кап сули ро ванных лекарств и разработки новых полимерных покрытий для ускорения раштживления. Известно, что хитозан обладает антимикробной активностью, ускоряет пролиферацию фнбробяаетов, может стимулировать иммунную систему (Shigem&sa Y,, 1995, ЧервинецВ.М., 2001).

Кроме того, поли-Ь-диэин, который был ранее предложен в качестве поликатиона, может провоцировать нежелательный провоспалителькый эффект в концентрациях выше 0,02% (Strand В. et al, 1999), Однако, использование таких низклх концентраций не позволяет получить стабильные мембраны, поэтому в некоторых работах предложено использовать муяьтислойЕые мембраны (Ross C.J. et al., 1999), технология получения которых предлагает существенное удлинение процедуры инкапсулирования, тго может отрицательно влиять на сохранение жизнеспособности клеток.

Установлено, что комплекс алгинат-хятозан прочнее комплекса алпшат -коли-L-лотнк (Thu В, et al., 1997). Недостатком хитозана по сравнению с поля-Ь-лнзином является его плохая растворимость при нейтральных pli, то есть в физиологических условиях, которые так необходимы при инкапсулировании клеток.

Учитывая все вышесказанное, хитозан представляется одним ш наиболее дерсаективяых материалов, который может найти Применение для микроинкзлсулирования живых клеток с целью нх дальнейшей имплантации. Таким образом, выбор хитозана в качестве поликатиона для создания ПЭК мембраны мнкрокалсул бьш обусловлен именно этими обстоятельствами.

В ходе исследований было установлено, что механическая прочность алгииат-хлтозановых мнкрокалсул определяется в значительной степени толщиной подученной

мембраны, которая в свою очередь, зависит, прежде всего, от рН раствора полимера и времени инкубирования Са-алпшатяых гранул в этом растворе (рис. 10 А), концентрации полимера (рис. 10 Б) и температуры культивирования иккрокапсуд (рис. 11).

На рис. 10 А видно, что толщина мембраны уменьшалась (с 300 до 18 цм) при увеличении рН и увеличивалась при возрастании времени инкубирования гранул ъ растворе хитозана.

Рйс.10 Б показывает, что толщина мембраны микрокапсулу увеличивалась (с 65 до 350 рм) при повышении концентрации раствора полимера.

Рис. 10. Толщина мембраны микрокапсул при 35-37°С: (А) в зависимости от величины рН раствора хитдзака и от времени инкубирования Са-алганатяых гранул в растворе хитозана (ММ 20ÛÛQ, концентрация IрН 6,0); (Б) в зависимости от концентрации раствора хитозана.

Проанализировав вышеназванные параметры и протестировав жизнеспособность живчиков при инкубировании гранул с живчиками в растворе хитозэна в течение 15 минут, установили оптимальные условия инкубирования -время 10 минут, при рН 6.0 в 1% растворе хетозана.

Влияние концентрации и молекулярной массы полианиона на свойства бинарных микрокапсул было описано в исследованиях (Bartkowiak А., 200!). Применяя полианиои (алгинат) более высокой молекулярной массьг можно получить микрокапсулу с большей механической устойчивостью. При понижении концентрации алгината уменьшается плотность распределения заряда на поверхности гшлизшонз микрокапсулы, что приводят к формированию менее плотной и более проницаемой мембраны.

А

Б

7

О 2 4 6 S 10 15 Время, мм

0 0,5 1 1,5 2 Кидап^адия Хигаин^ %

Показано, что температура клияет на вязкость полимерных растворов, которая в свою очередь сказывается на свойствах получаемых ынкрокапсул (Ваг1ко\«ак А., 2001). Более того, это имеет большое значение ш реологического поведения подюлектролитоа, обладающих термозависимыми свойствами образования геля, когда изменением температуры при формировании мембраны мнкрокапсулы вокруг точки перехода золя в гель, можно смоделировать капсулу с определенной проницаемостью и механической устойчивостью мембраны.

Было установлено, что температура инкубяроващи влияет на толщину мембраны мякрокапсул в разных средах (рис.11).

200 ,

i 1

"1

6% глюкоза

ГЦЖ

ЛЦЖ

Рис 1!. Влияние температуры инкубирования на ГЛКап толщину мембраны

в

-о-янтарная [

мякрокапсул разных средах.

10 20 30 Температура, С

40

Анализируя рие.П, следует отметить, что тенденцию к уменьшению толщины мембраны мякрокапсул при повышении температуры и времени инкубирования их при этой температуре. Так при инкубировании микрокапсул с живчиками внутри в данной среде при 0°С, 18-22Т н 35-37°С толщина мембраны бы.та соответственно 87 цм, 67 (ж и 53 цм. Более того, через 36 часов от пачала инкубирования микрокапсул наблюдалось значительное уменьшение толщины мембраны как прн 18-22сС так и 35-37°С, и даже полное ее растворение, плавным образом, при температуре 35-37"С. Похожие результаты были получены при инкубировании микрокапсул с живчиками при таких же температурах и в других срезах -ГлКат? (100 цм, 8! цм и Й0 ^соответственно), ЛЦЖ (140 рм, 125 цм и 115 fiM, соответственно), ГЦЖ (167 цм, 157 цм и МО цм, соответственно) и 6% глюкоза (ISO цм, 165 цм и 150 соответственно). Однако, как видно, толашна мембраны микрокапсул, инкубированных в данной среде, была почти в 3 раза тоньше, чем в 6% глюкозе. На основании этих результатов можно предположить, что эта разница в толщине мембраны

связана с рН среды инкубирования. Так в данной среде рН-6.4, в ГлКап рН-6,4, в ЛЦЖ рН-7.0, в ГЦЖ рН-7.1 и в 6% глюкоза рН~7.|.

Установлено, что концентрация хлорида кальция, используемого для инкапсулирования, влияет на время освобождения спермиев из капсул (Torre et al., 2000).

Влияние температуры инкубирования на время освобождения спермиев из алгннат/Са27хнтозгновьіх микрокапсул показано на рис. 12. Как видно из графика, при 3537°С для полного высвобождения спермнев из капсул в среднем требовалось 48 часов, тогда как при 18-20°С -около 72 часов.

24 48 72 Время, ч

і -*-при37°С f

1----------спермиев из

алги н ат/Са:7хитозанов I ых микрокапсул.

Было установлено, что % активных свободных спермиев при микроинкапсулировании снижается при 18-22°С и 35-37аС почти в два раза, по сравнению с контролем (нетто капсул ированные живчики) (рис.13).

80-

при18-20С кашршь при лрн 35-37 С контроль при ( 18-20 С 35-37 С !

Рис, 13. Активность инкапсулированного и не инкапсулированного семени при 18-20°С и 3537°С.

Можно предположить, что снижение активности спермкев после инкапсулирования связано с иммобилизацией спермиев в полупроницаемой мембране и с действием на них радикалов ПЭК мембраны.

33. Проверка оплодотворяющей способности семени быка внкапсулкрованного в

злгинат~Са1+-хитшановые микрокапсулы.

Анализируя данные таблицы 1, следует отметить, что существует тенденция по снижению % оплодотворенных животных в обеих группах. Через 2 месяца наблюдалось 22 % оачодотворенных коров в опытной группе по сравнению с 90 % оплодотворенных коров в контроле, и 33 % оплодотворенных телок по сравнению с 66% -в контроле. Результаты же ректальной проверки через 5 месяцев показали 11% оплодотворенных коров в опыте по сравнению с 60% в контроле, что говорит о возможной эмбриональной смертности или расслоении плода, которая, несомненно, была выше в опытной группе по сравнению с контролем.

Учитывая, что осеменение животных проводили в среднем через 12 часов после обнаружения начала момента охоты, а дяя полного растворения мембраны микрокапсул в среднем в условиях in vitro при 37°С требовалось 48 часов, можно предположить, что к моменту овуляции и оплодотворению in vivo было недостаточно освободившихся из микрокапсул живчиков.

Оплодотворяем ость коров и телок. Таблица 1.

Группа опыта Осеменено I месяц 2 месяца 5 месяцев

Пришли в ОХОТ)' % стельных Пришли в охоту % стельных Пришли в окоту % стельных

Семя инкапсулированное в 9 коров 5 коров 44 2 коровы 22 1 корова и

ал гинат- кальци й-хитоза! говые капсулы 3 телки 2 телки 33 0 телок 33 I телка 0

Контроль (семя замороженное а 10 коров 1 корова 90 0 коров 90 3 коровы 60

среде ЛЦЖ(ЦСИО) при 3 телки ! телка 66 0 телок 66 0 телок 100

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны и теоретически обоснованы условия хранения семени быка при температуре тела и модель микрокапсулы, обеспечивающей медленное вытекание семени под влиянием условий среды в шейке матки коров, что позволяет однократное осеменение коров в яериод охоты,

2. Разработана синтетическая среда для инкапсулирования семени быка, в которой подвижность спермиев в условиях температур близких к температуре тела, при 3537°С, сохраняется в течение 72 часов.

3. Наиболее благоприятными кислотными инактиваторами семени быка при хранении его при температуре тела являются янтарная и сорбиковая кислоты, добавление которык вереду удлиняют срок живучести сиермнев до 3 суток.

4. Введение традояа Б в синтетическую среду снижает нуклеазную активность желтка куриного яйца и способствует лучшей сохранности биологической полноценности спермиев, за счет взаимодействия со свободными радикалами образующимися при хранении семени быка при плюсошх температурах.

5. Применение Сахаров для хранения семени быка при плюсовых температурах сокращает живучесть спермиев. Из неэлектролитных компонентов оптимальной является амииоуксусная хн слота -гликокоя.

6. Насыщение семени быка, разбавленного средой, 5% углекислым газом удлиняет срок пережиьаемости спермиев при температуре тела на 12 часов.

7. Среда, состоящая из гликокола, лимоннокислого натрия 3-х замещенного шггвводного, трилона Б, янтарной и сорбнновой кислот, витамина Е и желтка куриного яйна, для хранения семени быка при температуре тела обеспечивает переживаемость спермиев при комнатных температурах !8-20°С, сохранял их подвижность до 7 суток.

8. Использование высокомолекулярного полимера хитозаиа {кислоторастворимый, ММ 20 кДа) в комплексе с алгинатом является совместимым структурным материалом для микроинкапсулирования семени быка.

9. Применение трехкомпоневтной системы алпшаг-кальций-хитозан для формирования мембраны микрокапсулы обеспечивает ее растворение и медленное вытекание из нее семени под влиянием изменений условий в половых путях коровы (33°С<(>39°С, 5.3<рН>7,3) и доступ полноценных для оплодотворения оошгга живчиков в течение более длительного времени.

10. Изменение температуры инкубирования семени, инкапсулированного в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы позволяет регулировать время, необходимое для растворения ее мембраны.

микроинкапсулиро ванным в алганат-кальций-хитозановые капсулы показала перспективность поиска в создании новой техники и технологии искусственного осеменения коров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предлагается синтетическая среда для инкапсулирования семени быка в алгннат-калышй-хитозаиовые микрокапсулы и хранения при температуре 35-37°С,

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Дамрина НЕ. Хранение семени быка при температуре тела./ Материалы научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». ФГОУ РАМЖ,-20О1.-Вып. 7.-С.77-79;

2. Дамрина И.Е. Микроинкапсулирование семени быка,/ Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». ФГОУ РАМЖ. -2002. -Вып. 8.-С. 74-76;

3. Жилыдов Н.Э., Дамрина И.Е. Сохранение спермы быков при температуре тела,// Зоотсхния.-2002. -№ 5.-С.25-26;

4. Дамрина И.Е, Сохранение семени быка при плюсовых температурах методом инкапсулирования,/ Вторая международная научная конференция ««Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». ВИЖ. Дубровины, Тезисы научных докладов. -2002.- С.120-124;

J1, Проверка результативности осеменения коров семенем быка

Принято к исполнению 29/05/2003 Исполнено 30/05/2 £>03

Заказ №307 Тираж: 110 экз.

ООО «НАКРЛ ПРИНТ» ИНН 77271852S3 Москва, Балаклавский яр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www .autoreferatm