Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах

Дамрина, Ирина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах"

На правах рукописи

ДАМРИНА Ирина Евгеньевна ! Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах

> 03.00.13 -Физиология

[

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы, Московская область, 2003

Работа выполнена в отделе биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Николай Захарович Жильцов

Юрий Павлович Фомичев

Юрий Дмитриевич Клинский Николай Петрович Зыкунов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Защита диссертации состоится « /» ¿иШЗшъ года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ВИЖ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан «мая 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических нк

В.П. Губанова

( I О 2.0 3

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

На современном этапе развития искусственного осеменения, когда сперму хранят неограниченное время при температуре жидкого азота (при -196° С), ставить такой вопрос как хранение спермы при температуре тела, по крайней мере, несколько странно. Дело в том, что после оттаивания при температуре тела период живучести семени резко сокращается. Следовательно, для достижения положительного результата необходимо наладить мониторинг состояния полового цикла коров, определение сроков овуляции и оптимального срока осеменения, что практически невозможно выполнить в мясном скотоводстве. Однако, прогресс в генетическом улучшении скота в этой области крайне необходим.

Идеально, было бы добиться хранения спермы в половом тракте коровы в специальных капсулах, которые бы открывались в период овуляции и выделяли порцию семени для оплодотворения яйцеклетки. Такой метод хранения семени в половом тракте самки получил в литературе название «инкапсулирование спермы» (Nebel R.L. et al., 1985, 1993,1996).

Ученые центра тропического животноводства в Австралии приступили к практическому исполнению идеи по разработке метода хранения семени при 37°С и получили первые результаты по использованию инкапсулированного семени быка в искусственном осеменении (D'Occhio М., 1993). В нашей стране с 60-х годов этому вопросу не уделяли должного внимания, глубокое замораживание захватило умы исследователей.

Особый интерес микроинкапсулирование спермы представляет для двух областей метода искусственного осеменения -это программы суперовуляция у коров-доноров и синхронизация охоты у самок сельскохозяйственных животных. В указанных ситуациях овуляция наступает в течение более длительного периода времени, и микрокапсулы могут быть доступны в течение всего периода. Таким образом, благодаря микроинкапсулированию снижается важность определения оптимального срока осеменения.

Известный ученый США Вольфганг Иохле, который 40 лет своей жизни посвятил разработке методов синхронизации охоты у самок сельскохозяйственных животных, считает, что способность использовать микроинкапсулированную сперму с долгим сроком жизни предпочтительнее инъекций простагландина F2. При этом отпадет необходимость учитывать время охоты и овуляции, что позволит методу искусственного осеменения утвердиться в мясном скотоводстве (Jöchle W., 1993).

^библиотека i

srsgzm

установлении точного времени прихода коровы в охоту, особенно в мясном скотоводстве (Foote R. et al., 1993).

Вышеизложенное позволяет заключить, что исследования, посвященные разработке способа хранения семени быка при температуре тела в капсулах, является актуальным не только в практическом, но и в теоретическом плане.

Цель работы и задачи исследований Целью настоящей работы являлось разработка среды для хранения семени быка при температуре 35-37°С и моделирование капсулы с самовытекающим семенем. В связи с этим решали следующие задачи:

1. Разработать новую синтетическую среду для хранения семени быка при 35-37°С с содержанием уже ранее вводимых в разные среды комплексонатов, витаминов, Сахаров, электролитов и органических кислот.

2. Смоделировать in vitro условия придатка семенника за счет насыщения разбавленного средой семени углекислым газом, добавления кислотных инактиваторов (янтарная и сорбиновая кислоты), понижения температуры хранения семени.

3. Смоделировать капсулу, которая обеспечит медленное вытекание семени под влиянием изменений условий среды в шейке матки (38°C<t>39°C, 5.3<рН>7.8).

4. Исследовать свойства полученных микрокапсул и их влияние на находящихся в них живчиков быка.

5. Провести экспериментальные исследования проверки результативности осеменения коров инкапсулированным семенем быка с введением его в шейку матки.

Научная новизна исследований состоит в том, что разработана среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С. Впервые применен высокомолекулярный полимер хитозан в животноводстве для инкапсулирования живчиков. Семя быка инкапсулировано в алгинат-калыдай-хитозановые микрокапсулы. Проведена проверка результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в капсулы.

Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быка в микрокапсулах.

Основные положения, выносимые на защиту:

среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С; биологическое обоснование и применение высокомолекулярного полимера хитозана для инкапсулирования;

биологическое обоснование микроинкапсулирования семени быка в животноводстве;

экспериментальные данные по инкапсулированию семени быка в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы и проверке результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в эти капсулы.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований были доложены, обсуждены и получили положительную оценку:

на ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых ученых» (2001,2002 гг. ВИЖ);

на ежегодных международных научно-практических конференциях «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001, 2002 гг., ФГОУРАМЖ);

на второй Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (19-20 ноября 2002г., ВИЖ, Дубровицы);

на научной конференции отдела биологии воспроизведения и отдела сертификации и эколого-генетических исследований в животноводстве ВИЖа (14 мая 2003 г.);

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на •/^/Страницах машинописного текста формата А4, содержит таблицы и лз рисунка. Список литературы включает источника, в том числе русских

и ЛОУ иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для решения поставленных задач данная работа выполнялась в три этапа.

На первом этапе работы была разработана синтетическая среда для кратковременного хранения семени быка при 35-37°С .

Для опытов использовали семя быков ЦСИО, отвечающее всем требованиям стандарта с подвижностью не ниже 0,7. Подвижность спермиев определяли под микроскопом, подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно.

При выборе неэлектролита руководствовались положениями по оптимальному соотношению компонентов в среде ГЛКап для хранения семени быков при плюсовых температурах (Н.З. Жильцов, 1967).

Чтобы выяснить наиболее благоприятный для живчиков процент трилона Б (динатриевая соль ЭДТА), опыты проводили по методу составления трехкомпонентных сред (метод треугольника по В.К. Милованову, 1962).

Условия придатка семенника in vitro моделировали за счет добавления кислотных инактиваторов в виде янтарной и сорбиновой кислот, насыщения семени углекислым газом и понижения температуры хранения разбавленного средой семени.

Для определения наиболее благоприятного для живчиков процента янтарной и сорбиновой кислот опыты проводили по методу составления двухкомпонентных сред (геометрический ряд по Э.Ф. Пояркову, 1917).

Опыты по определению оптимального количества витамина Е для сохранения активности семени быка при температуре 35-37°С проводили по арифметическому ряду метода составления двухкомпонентных сред (по Э.Ф. Пояркову, 1917).

Семя быка, разбавленное синтетической средой, насыщали 5% углекислым газом при помощи аппарата Кипа.

Переживаемость спермиев быка в среде при 18-20°С и 35-37°С оценивали по абсолютному показателю живучести семени (по В.К.Милованову, 1962).

Нуклеазную активность исследовали в семенной плазме быка, в семенной плазме с добавлением желтка куриного яйца и в разных вариациях синтетической среды (по Т. Маниатис, 1984). В качестве субстрата использовали ДНК фага X. Семенную плазму быка получали путем последовательных центрифугирований свежей спермы (по И.В. Кузнецовой с соавтор., 1993). Опыты проведены при совместном участии A.B. Чичилова (научный сотрудник отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа).

На втором этапе было осуществлено in vitro инкапсулирование семени быка в микрокаисулы.

При выборе способа микроинкаспулирования руководствовались положениями выдвинутыми (Barthkowiak А., 2001; Nebel et al., 1985, 1993; Марквичева с соавт., 2001). Для формирования мембраны микрокапсулы применена трехкомпонентная система полианион/Ме^/поликатион. В качестве полианиона использовали алгинат натрия (ч.д.а., вязкость 2% раствора при 25°С 3500 сП, Sigma), в качестве поликатиона -высокомолекулярный полимер кислоторастворимый хитозан (ММ 20 Кд, степень дезацитилирования 0,84, ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП г. Щелково, Московская обл.).

Микрокапсулы с полупроницаемой мембраной со спермиями внутри получали в две стадии:

1) формирование Са-алгинатных гранул, покрытых хитозаном, с иммобилизованными в них спермиями; 2) растворение алгинатного ядра с помощью натриевой соли ЭДТА. Полученные

микрокапсулы (2-3 мм в диаметре) хранили в разработанной среде при 18-20°С и при 35-37°С.

Механические свойства микрокапсул определяли по толщине их мембраны в зависимости от pH раствора полимера и времени инкубирования Са-алгинатных гранул в этом растворе, от концентрации полимера, и от температуры инкубирования микрокапсул в среде при помощи измерительной линейки оптического микроскопа (ЮОх).

Для изучения времени, необходимого для высвобождения спермиев из микрокапсул, проводили in vitro тест. Полученные алгинат-кальций-хитозановые капсулы со спермиями внутри инкубировали в данной среде при температуре близкой к температуре в половых путях коровы, при 37°С. Процент свободных спермиев определяли в оптический микроскоп (ЮОх) через 24,48 и 72 часа.

Активность спермиев после инкапсулирования определяли под микроскопом (ЮОх), подсчитывая долю клеток, двигающихся поступательно.

На третьем этапе была проведена проверка результативности осеменения коров и телок инкапсулированным семенем быка в ОПХ «Дубровицы» Подольского района (H.A. Некрасова). В опыте были использованы следующие животные:

Схема опыта.

Возраст (отелов) животных Опыт (количество животных) Контроль (количество животных)

0 3 3

1 1 3

2 2 2

3 4 3

5 1 1

6 и более 1 1

Всего 12 13

Животных осеменяли ректоцервикальным методом с введением микрокапсул в шейку матки через 12 часов после определения момента охоты, в основном один раз в сутки.

Оплодотворяемость коров и телок учитывали по числу животных повторно пришедших в охоту через 30, 60, 90 и 150 дней после осеменения. Окончательный процент оплодотворенных животных выводили по данным ректальной проверки через 60-90 дней после первого осеменения.

Проводили учет предполагаемой эмбриональной смертности.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка синтетической среды для хранения семени быка при 35-37°С.

Первоначально в исследованиях было установлено, что использование Сахаров в синтетических средах для хранения семени быка при данных условиях неприемлемо (рис. 1).

На рис. 1 видно, что активность живчиков уменьшалась (с 80 до 1%) во всех исследуемых растворах Сахаров за довольно короткий период времени по сравнению с контролем (гликокол). Уже через 4 часа наблюдалась единичная подвижность (Еп) живчиков во всех исследуемых растворах Сахаров, тогда как в контроле Еп наблюдалась только через 24 часа. Можно предположить, что сахара способствуют ускорению обменных процессов в живчиках, которые сокращают их живучесть. Отсюда следует, что в качестве неэлектролита в средах для хранения семени быка для указанных условий оптимальной является аминоуксусная кислота -гликокол.

ж- лактоза глюкоза -фруктоза

- сахароза

- раффиноза

- гликокол

Рис. 1. Активность живчиков в изотонических растворах неэлектролита при 35-37°С.

На основании этих опытов было решено далее в экспериментах использовать гликокол в количестве 0,7 г на 1000 мл дистиллированной воды.

Установлено, что янтарная и капроновая кислоты оказывают положительное влияние на увеличение срока хранения спермиев при 35-37°С при добавлении их в качестве кислотного инактиватора к гликокол-цитрат-желточной синтетической среде по сравнению с контролем (среды без кислот) (рис.2).

кислота ■ контроль

3 капроновая

кислота И янтарная

Рис. 2. Влияние органических кислот на активность семени быка при 35-37°С (средние данные 5 опытов).

0 6 24 48 72 Время, ч

Однако в среде ГлЦЖ с янтарной кислотой живчики сохраняли активность на 24 часа дольше, чем в среде с капроновой кислотой. Возможно, эти результаты подтверждают данные о том, что капроновая кислота действует как поверхностно-активное вещество. Адсорбируясь живчиками, она проникает в них, вклинивается между молекулами плазмолагена в мембране и смягчает действие холодового удара (Жильцов Н.З., 1967). При данной же температуре (35-37°С) живчики нуждаются в первую очередь в экзогенном субстрате для поддержания установленного уровня дыхания, а капроновая кислота не является источником питания. Можно предположить, что янтарная кислота, напротив, служит и источником энергии и кислотным инактиватором.

Янтарная (НООС-СН2-СН2-СООН, бутандиовая) кислота обладает химическими свойствами, характерными для дикарбоновых кислот, вступая в реакции с водными растворами щелочей, образует соли, называемые сукцинаты. Как известно, сукцинат является одним из промежуточных продуктов цикла Кребса и при помощи сукцинатдегидрогеназы превращается в фумарат с высвобождением Ог и АТФ. Более того, при окислении янтарная кислота может вступать в реакцию с Н2О2 и в зависимости от условий может образоваться пероксиянтарная (СЬЬСОООЩг, оксоянтарная или малоновая кислоты.

Вследствие того, что янтарная кислота абсолютно безвредное вещество (присутствует во всех организмах), обладающее особыми полезными свойствами, она получила широкое применение во многих областях медицины.

Было установлено, что добавление 1,56% 0,ЗМ янтарной кислоты к гликокол-цитрат-трилон Б-желточной среде увеличивало живучесть семени быка почти в 2 раза как при 18-20°С, так и при 35-37°С по сравнению со средой без янтарной кислоты (рис.3).

при 18-20°С Ш при 35-37°С

6,25 12,5 25 50

0 0,09 0,19 0,39 0,78 1,56 3,12 6Д5 12,5 25 Процент 0,ЗМ янтарной кислоты

Рис. 3. Живучесть семени быка в зависимости от % добавления янтарной кислоты.

(при температуре 18-20°С живучесть семени (Ба) была равна 86,9, при 35-37°С

абсолютный показатель живучести (ва) составил 24,3).

При пересчете этого процента на концентрированную янтарную кислоту находим, что на 1000 мл среды нужно добавить 0,65 мл янтарной кислоты.

Известно, что в процессе жизнедеятельности живчиков образуются агрессивные формы кислорода, которые окисляют или разрушают клетки, приводя к неминуемой ее гибели. Янтарная кислота способна эффективно обезвреживать свободные радикалы, тем самым предотвращать опасное для живчиков окисление липидов мембраны. Кроме того, она также обладает мощным антиоксидантным свойством. Все это дает основание предположить, что янтарная кислота является наиболее благоприятным агентом для сохранения семени при температуре близкой к температуре тела, при 35-37°С

Сорбиновая кислота (СНэСН=СНСН=СНСООН) является типичным представителем ненасыщенных карбоновых кислот. В присутствие кислорода или пероксидов легко окисляется, образуя при полном окислении углекислый газ и воду. Таким образом, она может способствовать созданию анаэробных условий в среде, которые, как известно, замедляют метаболические процессы в живчиках.

Как видно на рис. 4, добавление 3,12% 0,ЗМ сорбиновой кислоты к гликокол-цитрат-трилон Б-желточной среде с янтарной кислотой являлось оптимальным для сохранения живучести семени быка как при 18-20°С, так и при 35-37°С.

о 0090.19030,781,563,12

■ при 18-20°С Е при 35-37°С

о" о"

»л ~ сч

гп О ~

% сорбиновой КИСЛОТЫ

Рис. 4. Абсолютный

показатель живучести

семени быка в зависимости от процента

сорбиновой кислоты

(средние данные 5 опытов).

Расчетная величина изотонического раствора сорбиновой кислоты составляет 0,7 мл на 1000 мл среды.

Более того, сорбиновая кислота обладает фунгицидными свойствами и низкой токсичностью, поэтому широко используется в пищевой и косметической промьппленностях, в качестве природного консерванта, так как впервые в 1859 году была выделена Гофманом из рябинового сока. Следовательно, при хранении семени она может быть использована для предупреждения роста бактерий.

Активные молекулы кислорода, вступая в реакции с липидами, ненасыщенными гидрокарбонатами и жирными кислотами, которые в большом количестве содержатся в мембране, вызывают липидную пероксидацию, ведущую к дестабилизации мембраны, снижению подвижности и оплодотворяющей способности живчиков.

Было показано, что при хранении семени хряка в жидком состоянии изменяется соотношение жирных кислот в фосфолипидах мембраны -уменьшается количество полиненасыщенных жирных кислот (С22:6п-3) и увеличивается количество насыщенных жирных кислот (С18:0). Введение «-токоферола полностью предотвращало окислительное разрушение полиненасыщенных жирных кислот С22:бп-3 и, тем самым, увеличивало живучесть спермиев (СсгоНш Б. et а1., 2000).

В исследованиях было установлено, что добавление а-токоферол ацетата к гликокол-цитрат-трилон Б-желточной среде в небольших концентрациях (0,09 г/мл) оптимально для сохранения активности семени быка при 35-37°С (рис.5).

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 токоферол ацетат, мл

Рис. 5. Активность семени быка в зависимости от

количества (Х-токоферол ацетата при 35-37°С. (средние данные 5 опытов)

Вероятно, (Х-токоферол ацетата также как и капроновая кислота является поверхностно-активным веществом. Только в отличие от капроновой кислоты, его молекулы не вклиниваются между молекулами плазмолагена в мембране живчиков, а взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами по межмолекулярным связям. Более того, за счет отщепления атома водорода от гидроксильной группы он способен образовывать устойчивые свободные радикалы, которые в свою очередь могут вступать во взаимодействие со свободными радикалами, участвующими в образовании пероксидов.

Водорастворимый, имеющий заряд трилон Б, может свободно проникать через мембрану живчиков и регулировать внешне направленную пероксидацию, в отличие от <х-токоферол ацетата, регулирующего внутрь направленную пероксидацию.

На рис.6 показано, что добавление трилона Б (0,2 г/100 мл) не снижало активность живчиков в среде для хранения семени быка при 18-20 °С и при 35-37°С.

70%

и цитрат №

10% желток

Рис. 6. Зоны биологических уровней для синтетической среды по треугольнику с интервалом

10%.

Можно предположить, что молекулы трилона Б взаимодействуют со свободными радикалами, которые образуются при хранении спермы быка при плюсовых температурах.

На основании данных, полученных при введении вышеуказанных компонентов было решено для дальнейших исследований на 1000 мл дистиллированной воды использовать среду следующего состава: лимоннокислый натрий 3-х замещенный пятиводный 20 г, гликокол 7 г, трилон Б 2 г, янтарная кислота 0,65 мл, сорбиновая кислота 0,7мл, витамин Е (а-токоферол ацетат 10% раствора в масле) 10 мл, желток куриного яйца 50 мл.

В среднем семя быка сохраняло активность в данной среде и ГлЦЖ при 35-37°С в течение 36 часов и 12 часов, соответственно, по сравнению с контролем (неразбавленное семя при 35-37°С); а при 18-20 °С живчики сохраняли активность в течение 6 суток и 3 суток, соответственно, по сравнению с контролем (неразбавленное семя при 18-20 °С) -около 24 часов (рис. 7А).

На рис. 7Б показано, что 5% СОг удлинял срок хранения спермиев в данной среде при 35-37°С на 12 часов по сравнению с контролем (48 часов и 36 часов, соответственно), а при 18-20°С спермин - на 24 часа (7 суток и 6 суток, соответственно).

80 -

0 24 48 72 96 120 144 168 Время, ч

0-1-г—т -,-,-,---1

0 24 48 72 96 120 144 168 192 Цран,ч

Рис. 7. Активность семени быка: в данной среде при 35-37°С и 18-20°С (А); в данной среде при насыщении 5% СОг в течении 10 минут в аппарате Киппа (Б).

В последние время появились работы (В. Багиров, 1997; Т. Щит, 1998), посвященные трансформированию сперматозоидов, в которых показано, что при глубоком замораживании может происходить трансформирование ДНК живчиков.

Замечено, что желток куриного яйца, добавленный в среду для замораживания семени быка, повышает активность нуклеаз (Н.З. Жильцов и др., 2001, 2002).

Рис. 8. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X: дорожка 1 -ДНК фага X; дорожка 2 -гидролиз ДНК фага X в семенной плазме быка; дорожки 3 и 4 -гидролиз ДНК фага X в желтке куриного яйца.

Как видно из рис. 8, в желтке куриного яйца (пробирка Зи4) уже в первую минуту инкубирования была зафиксирована высокая нуклеазную активность, тогда как в семенной плазме (пробирка 3) ДНК фага X расщеплялась через 1 час инкубации.

Рис. 9. Электрофорез продуктов гидролиза ДНК фага X: дорожки 1 и 5 -гидролиз ДНК фага X в среде без трилона Бис обычным желтком; дорожки 2 и 3 -гидролиз ДНК фага X с трилоном Бис обычным желтком; дорожки 4 и 6 -гидролиз ДНК фага X в среде полностью; дорожки 7 и 8 -гидролиз ДНК фага X в среде с семенем хряка (др. опыт) и дорожка 9 - ДНК фага X.

Анализируя рисунок 9, следует отметить, что в среде с полным составом (пробирка 4 и 6) был зафиксирован допустимый остаточный уровень нуклеаз, тогда как в средах с обычным желтком куриного яйца без трилона Б (пробирка 1 и 5) и с трилоном Б (пробирка 2 и 3) наблюдалось повышение нуклеазной активности.

Следовательно, при отсутствии реагентов снижающих нуклеазную активность (тот же трилон Б), желток может быть опасным для хромосомальной ДНК живчиков с точки зрения ее деградации. Таким образом, для хранения семени быка при температуре 35-37°С следует использовать среду в полном составе с добавлением желтка, инактивированного путем нагревания.

3.2. Микроинкапсулирование семени быка in vitro.

В последнее время хитозан находит все более широкое применение в фармакологии и биомедицине, в частности для создания препаратов пролонгированного действия на основе капсулированных лекарств и разработки новых полимерных покрытий для ускорения ранозаживления. Известно, что хитозан обладает антимикробной активностью, ускоряет пролиферацию фибробластов, может стимулировать иммунную систему (Shigemasa Y., 1995, Червинец В.М., 2001).

Кроме того, поли-Ь-лизин, который был ранее предложен в качестве поликатиона, может провоцировать нежелательный провоспалительный эффект в концентрациях выше 0,02% (Strand В. et al, 1999). Однако, использование таких низких концентраций не позволяет получить стабильные мембраны, поэтому в некоторых работах предложено использовать мультислойные мембраны (Ross C.J. et al., 1999), технология получения которых предлагает существенное удлинение процедуры инкапсулирования, что может отрицательно влиять на сохранение жизнеспособности клеток.

Установлено, что комплекс алгинат-хитозан прочнее комплекса алгинат -поли-L-лизин (Thu В. et al., 1997). Недостатком хитозана по сравнению с поли-Ь-лизином является его плохая растворимость при нейтральных pH, то есть в физиологических условиях, которые так необходимы при инкапсулировании клеток.

Учитывая все вышесказанное, хитозан представляется одним из наиболее перспективных материалов, который может найти применение для микроинкапсулирования живых клеток с целью их дальнейшей имплантации. Таким образом, выбор хитозана в качестве поликатиона для создания ПЭК мембраны микрокапсул был обусловлен именно этими обстоятельствами.

В ходе исследований было установлено, что механическая прочность алгинат-хитозановых микрокапсул определяется в значительной степени толщиной полученной

мембраны, которая в свою очередь, зависит, прежде всего, от рН раствора полимера и времени инкубирования Са-алгинатных гранул в этом растворе (рис. 10 А), концентрации полимера (рис. 10 Б) и температуры культивирования микрокапсул (рис.11).

На рис. 10 А видно, что толщина мембраны уменьшалась (с 300 до 18 цм) при увеличении рН и увеличивалась при возрастании времени инкубирования гранул в растворе хитозана.

Рис.10 Б показывает, что толщина мембраны микрокапсулы увеличивалась (с 65 до 350 цм) при повышении концентрации раствора полимера.

А Б

Рис. 10. Толщина мембраны микрокапсул при 35-37°С: (А) в зависимости от величины рН раствора хитозана и от времени инкубирования Са-алгинатных грапул в растворе хитозана (ММ 20000, концентрация 1%, рН 6,0); (Б) в зависимости от концентрации раствора хитозана.

Проанализировав вышеназванные параметры и протестировав жизнеспособность живчиков при инкубировании гранул с живчиками в растворе хитозана в течение 15 минут, установили оптимальные условия инкубирования -время 10 минут, при рН 6.0 в 1% растворе хитозана.

Влияние концентрации и молекулярной массы полианиона на свойства бинарных микрокапсул было описано в исследованиях (ВагЙсо\у1ак А., 2001). Применяя полианион (алгинат) более высокой молекулярной массы можно получить микрокапсулу с большей механической устойчивостью. При понижении концентрации алгината уменьшается плотность распределения заряда на поверхности полианиона микрокапсулы, что приводит к формированию менее плотной и более проницаемой мембраны.

Показано, что температура влияет на вязкость полимерных растворов, которая в свою очередь сказывается на свойствах получаемых микрокапсул (ВаЛкотоак А., 2001). Более того, это имеет большое значение для реологического поведения полиэлектролитов, обладающих термозависимыми свойствами образования геля, когда изменением температуры при формировании мембраны микрокапсулы вокруг точки перехода золя в гель, можно смоделировать капсулу с определенной проницаемостью и механической устойчивостью мембраны.

Было установлено, что температура инкубирования влияет на толщину мембраны микрокапсул в разных средах (рис.11).

Рис. 11. Влияние температуры инкубирования на толщину мембраны микрокапсул в разных средах.

6% глюкоза ГЦЖ ->-ЛЦЖ -*-ГЖап -о-янтарная

10 20 30 Температура, С

Анализируя рис.11, следует отметить, что тенденцию к уменьшению толщины мембраны микрокапсул при повышении температуры и времени инкубирования их при этой температуре. Так при инкубировании микрокапсул с живчиками внутри в данной среде при 0°С, 18-22°С и 35-37°С толщина мембраны была соответственно 87 цм, 67 цм и 53 ¡im. Более того, через 36 часов от начала инкубирования микрокапсул наблюдалось значительное уменьшение толщины мембраны как при 18-22°С так и 35-37°С, и даже полное ее растворение, главным образом, при температуре 35-37°С. Похожие результаты были получены при инкубировании микрокапсул с живчиками при таких же температурах и в других средах -ГлКап (100 цм, 81 цм и 60 цм, соответственно), ЛЦЖ (140 цм, 125 цм и 115 цм, соответственно), ГЦЖ (167 цм, 157 цм и 140 цм, соответственно) и 6% глюкоза (180 цм, 165 цм и 150 цм, соответственно). Однако, как видно, толщина мембраны микрокапсул, инкубированных в данной среде, была почти в 3 раза тоньше, чем в 6% глюкозе. На основании этих результатов можно предположить, что эта разница в толщине мембраны

связана с рН среды инкубирования. Так в данной среде рН~6.4, в ГлКап рН~6,4, в ЛЦЖ рН~7.0, в ГЦЖ рН~7.1 и в 6% глюкоза рН~7.1.

Установлено, что концентрация хлорида кальция, используемого для инкапсулирования, влияет на время освобождения спермиев из капсул (Torre et al., 2000).

Влияние температуры инкубирования на время освобождения спермиев из алгинат/Са2+/хитозановых микрокапсул показано на рис. 12. Как видно из графика, при 35-37°С для полного высвобождения спермиев из капсул в среднем требовалось 48 часов, тогда как при 18-20°С -около 72 часов.

Рис. 12. Освобождение спермиев из

алгинат/Са2+/хитозанов ых микрокапсул.

Было установлено, что % активных свободных спермиев при микроинкапсулировании снижается при 18-22°С и 35-37°С почти в два раза, по сравнению с контролем (неинкапсулированные живчики) (рис.13).

при 18-20 С контроль при щи 35-37 С контроль при 18-20 С 35-37 С

Рис. 13. Активность инкапсулированного и не инкапсулированного семени при 18-20°С и 35-37°С.

Можно предположить, что снижение активности спермиев после инкапсулирования связано с иммобилизацией спермиев в полупроницаемой мембране и с действием на них радикалов ПЭК мембраны.

3.3. Проверка оплодотворяющей способности семени быка инкапсулированного в

алгинат-Са2+-хитозановые микрокапсулы.

Анализируя данные таблицы 1, следует отметить, что существует тенденция по снижению % оплодотворенных животных в обеих группах. Через 2 месяца наблюдалось 22 % оплодотворенных коров в опытной группе по сравнению с 90 % оплодотворенных коров в контроле, и 33 % оплодотворенных телок по сравнению с 66% -в контроле. Результаты же ректальной проверки через 5 месяцев показали 11% оплодотворенных коров в опыте по сравнению с 60% в контроле, что говорит о возможной эмбриональной смертности или расслоении плода, которая, несомненно, была выше в опытной группе по сравнению с контролем.

Учитывая, что осеменение животных проводили в среднем через 12 часов после обнаружения начала момента охоты, а для полного растворения мембраны микрокапсул в среднем в условиях in vitro при 37°С требовалось 48 часов, можно предположить, что к моменту овуляции и оплодотворению in vivo было недостаточно освободившихся из микрокапсул живчиков.

Оплодотворяемость коров и телок. Таблица 1.

Группа опыта Осеменено 1 месяц 2 месяца 5 месяцев

Пришли в охоту % стельных Пришли в охоту % стельных Пришли в охоту % стельных

Семя инкапсулированное в 9 коров 5 коров 44 2 коровы 22 1 корова 11

алгинат-кальций-хитозановые капсулы 3 телки 2 телки 33 0 телок 33 1 телка 0

Контроль (семя замороженное в 10 коров 1 корова 90 0 коров 90 3 коровы 60

среде ЛЦЖ (ЦСИО) при -196°С 3 телки 1 телка 66 0 телок 66 0 телок 100

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны и теоретически обоснованы условия хранения семени быка при температуре тела и модель микрокапсулы, обеспечивающей медленное вытекание семени под влиянием условий среды в шейке матки коров, что позволяет однократное осеменение коров в период охоты.

2. Разработана синтетическая среда для инкапсулирования семени быка, в которой подвижность спермиев в условиях температур близких к температуре тела, при 35-37°С, сохраняется в течение 72 часов.

3. Наиболее благоприятными кислотными инактиваторами семени быка при хранении его при температуре тела являются янтарная и сорбиновая кислоты, добавление которых в среду удлиняют срок живучести спермиев до 3 суток.

4. Введение трилона Б в синтетическую среду снижает нуклеазную активность желтка куриного яйца и способствует лучшей сохранности биологической полноценности спермиев, за счет взаимодействия со свободными радикалами образующимися при хранении семени быка при плюсовых температурах.

5. Применение Сахаров для хранения семени быка при плюсовых температурах сокращает живучесть спермиев. Из неэлектролитных компонентов оптимальной является аминоуксусная кислота -гликокол.

6. Насыщение семени быка, разбавленного средой, 5% углекислым газом удлиняет срок переживаемости спермиев при температуре тела на 12 часов.

7. Среда, состоящая из гликокола, лимоннокислого натрия 3-х замещенного пятиводного, трилона Б, янтарной и сорбиновой кислот, витамина Е и желтка куриного яйца, для хранения семени быка при температуре тела обеспечивает переживаемость спермиев при комнатных температурах 18-20°С, сохраняя их подвижность до 7 суток.

8. Использование высокомолекулярного полимера хитозана (кислоторастворимый, ММ 20 кДа) в комплексе с алгинатом является совместимым структурным материалом для микроинкапсулирования семени быка.

9. Применение трехкомпонентной системы алгинат-кальций-хитозан для формирования мембраны микрокапсулы обеспечивает ее растворение и медленное вытекание из нее семени под влиянием изменений условий в половых путях коровы (38°С<1>39°С, 5.3<рН>7.8) и доступ полноценных для оплодотворения ооцита живчиков в течение более длительного времени.

10. Изменение температуры инкубирования семени, инкапсулированного в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы позволяет регулировать время, необходимое для растворения ее мембраны.

11. Проверка результативности осеменения коров семенем быка микроинкапсулированным в алгинат-кальций-хитозановые капсулы показала перспективность поиска в создании новой техники и технологии искусственного осеменения коров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предлагается синтетическая среда для инкапсулирования семени быка в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы и хранения при температуре 35-37°С.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Дамрина И.Е. Хранение семени быка при температуре тела./ Материалы научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», ФГОУ РАМЖ.-2001.-Вып. 7.-С.77-79;

2. Дамрина И.Е. Микроинкапсулирование семени быка/ Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». ФГОУ РАМЖ. -2002. -Вып. 8.-С. 74-76;

3. Жильцов Н.З., Дамрина И.Е. Сохранение спермы быков при температуре тела.// ЗоотехнияЛШ. -№ 5.-С.25-26;

4. Дамрина И.Е. Сохранение семени быка при плюсовых температурах методом инкапсулирования./ Вторая международная научная конференция ««Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». ВИЖ. Дубровицы. Тезисы научных докладов. -2002.- С.120-124;

Принято к исполнению 29/05/2003 Исполнено 30/05/2003

Заказ № 307 Тираж: 110 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

»1102û ^ооз^А

1 \oQ.a

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дамрина, Ирина Евгеньевна

1. ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Сохранение семени при плюсовых температурах.

2.2. Микрокапсулирование семени быка.

2.3. Факторы, влияющие на оплодотворяющую способность спермы после осеменения.

3. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Разработка синтетической среды. ф 3.2. Определение нуклеазной активности семени быка в предложенной синтетической среде.

3.3. Анаэробное хранение семени в предложенной синтетической среде.

3.4. Микроинкапсулирование семени быка.

3.5. Определение механических свойств микрокапсул.

3.6. Определение времени высвобождения спермиев из алгинат-кальций-хитозановых микрокапсул и активности спермиев после инкапсулирования {in vitro тест).

3.7. Изучение оплодотворяющей способности семени инкапсулированного в предложенной среде в алгинат-кальций -хитозановые микрокапсулы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Среда для сохранения семени быка при температуре 35-37°С.

4.2. Механические свойства алгинат-хитозановых микрокапсул.

4.3. Проверка оплодотворяющей способности микроинкапсулированного семени.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах"

Актуальность темы

Определение оптимального времени осеменения в искусственном осеменении крупного рогатого скота это критическая точка в указанном методе, потому что существует вариабельность времени овуляции относительно установленной охоты и трудность в установлении точного времени прихода коровы в охоту, особенно в мясном скотоводстве (Foote R. et al., 1993).

Цель работы и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось разработка среды для хранения семени быка при температуре 35-37°С и моделирование капсулы с самовытекающим семенем. В связи с этим решали следующие задачи:

4. Исследовать свойства полученных микрокапсул и их влияние на находящихся в них живчиков быка.

Научная новизна исследований состоит в том, что разработана среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35-37°С. Впервые применен высокомолекулярный полимер хитозан в животноводстве для инкапсулирования живчиков. Семя быка инкапсулировано в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы. Проведена проверка результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в капсулы.

Практическая ценность работы. Предложена среда для сохранения семени быка в микрокапсулах.

Основные положения, выносимые на защиту: среда для кратковременного хранения семени быка при температуре 35

37°С; биологическое обоснование и применение высокомолекулярного полимера хитозана для инкапсулирования; биологическое обоснование микроинкапсулирования семени быка в животноводстве; экспериментальные данные по инкапсулированию семени быка в алгинат-кальций-хитозановые микрокапсулы и проверке результативности осеменения коров живчиками, инкапсулированными в эти капсулы.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований были доложены, обсуждены и получили положительную оценку: на ежегодных конференциях аспирантов и молодых ученых «Достижения молодых ученых» (2001, 2002 гг. ВИЖ);

• на ежегодных международных научно-практических конференциях

Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (2001, 2002 гг., ФГОУ РАМЖ); на второй Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (19-20 ноября 2002г., ВИЖ, Дубровицы); на научной конференции отдела биологии воспроизведения и отдела

I сертификации и эколого-генетических исследований в животноводстве ВИЖа

14 мая 2003 г.);

Ф Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в отделе биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Дамрина, Ирина Евгеньевна

6. ВЫВОДЫ

9. Применение трехкомпонентной системы алгинат-кальций-хитозан для формирования мембраны микрокапсулы обеспечивает ее растворение и медленное вытекание из нее семени под влиянием изменений условий в половых путях коровы (38°С<£>39°С, 5.3<рН>7.8) и доступ полноценных для оплодотворения ооцита живчиков в течение более длительного времени.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана и предлагается для практики искусственного осеменения среда для мирооинкапсулирования семени быка.

Рецепт среды на 1000 мл дистиллированной воды:

Лимонно-кислый натрий 3-х замещенный пятиводный 20 г

Гликокол 7 г

Трилон Б 2 г

Янтарная кислота 0,65 мл

Сорбиновая кислота 0,7мл

Витамин Е (а-токоферол ацетат 10% раствора в масле) 10 мл

Желток куриного яйца 50 мл

Способ приготовления среды: отвешивают навески гликокола, цитрата натрия и трилона Б, растворяют их в 1000 мл заранее прокипяченной дистиллированной воды, затем добавляю положенное количество янтарной кислоты и тщательно взбалтывают, сорбиновой кислоты и тщательно взбалтывают, витамина Е и тщательно взбалтывают. После этого вводят желток.

Семя разбавляют данной средой в пределах 1:20. Расфасованное семя в пенициллиновые флаконы помещают в термостат и хранят в нем при температуре 35-37°С.

Предлагается в практике искусственного осеменения применять хранение семени быка в данной среде при 35037°С до 3 суток, при 18-20°С до 7 суток.

2. Для микроинкапсулирования семени быка в практических условиях необходимы следующие реактивы: алгинат натрия (ч.д.а., вязкость 2% раствора при 25°С 3500 сП, Sigma), кислоторастворимый хитозан (ММ 20 Кд, степень дезацитилирования 0,84, ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП г. Щелково,

Московская обл.), хлорид кальция о.с.ч. (РЕАХИМ, Россия), хлорид натрия (РЕАХИМ, Россия), натриевая соль ЭДТА, о.с.ч. (Ангарский завод хим. реактивов, Россия).

3. Технология микроинкапсулирования семени быка: 2.5 мл семени, разбавленного в отношении 1:20 данной средой, смешивают с 2.5 мл 4%-ного раствора алгината натрия, приготовленного на физиологическом растворе (0.9%-ный NaCl). Для получения сферических Са-алгинатных гранул смесь по каплям добавляют в 0.5%-ный раствор СаС12 при помощи инсулинового шприца для инъекций. Полученные гранулы промывают в физрастворе, переносят в 40 мл 1%-ного раствора хитозана и инкубируют в нем 8-10 мин. 1%-ный раствор хитозана получают при смешивании 1 г хитозана с 100 мл 0.2%-ного раствора HCl. Затем добавляют по каплям 2М NaOH и доводили pH полимерного раствора до pH 6,0. Гранулы три раза промывают физраствором, а затем помещают на 10 мин в 40 мл 50 мМ-ного раствора натриевой соли ЭДТА для удаления ионов кальция из "алгинатного ядра". Полученные гранулы промывают физраствором, затем средой для инкубирования без живчиков (предложенная среда для хранения семени быка при 35-37°С). После этого помещают эти микрокапсулы с иммобилизованными спермиями внутри в среду для инкубирования и хранят при 18-20°С и при 35-37°С.

Все эксперименты по формированию микрокапсул рекомендуется проводить при комнатной температуре.

В заключение автор выражает глубокую признательность и сердечную благодарность научному руководителю Николаю Захаровичу Жильцову за помощь, оказанную в проведении и оформлении данной работы, за плодотворные дискуссии и постоянный интерес к данной работе.

Автор выражает глубокую признательность профессору Юрию Павловичу Фомичеву за помощь, оказанную при проведении экспериментов и оформлении диссертации, и за поддержку данной работы.

Часть работы выполнялась при участии сотрудника отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа Алексея Валентиновича Чичилова, которому автор выражает благодарность за помощь в проведении исследований. Автор выражает также признательность остальным сотрудникам отдела биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных ВИЖа за постоянный интерес к данной работе.

Автор выражает признательность директору Центральной станции искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Ескину Г.В., ведущему технологу станции Федоровой Е.В. за помощь при проведении экспериментов.

Автор выражает большую благодарность директору ОПХ «Дубровицы» Федоровой Р.П. и ветеринарному врачу хозяйства Некрасовой Н. А. за предоставленную мне возможность провести научно-производственный опыт и помощь при проведении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дамрина, Ирина Евгеньевна, Дубровицы, Московской обл.

1. Балашов Н.Г., Силаева М.В. Новая среда для сохранения спермы хряков./ Труды Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. -1970. т. 37.- С.97-101;

2. Балашов Н., Смирнов В., Евсюков М., Манько Ю., Нарижный А., Зыкунов Н., Мишин В., Перехожих В. Новая среда ГХЦСН-РУ1.// Свиноводство,-1987.-№ 6.-С.39-40;

3. Гальбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение. -2001.-Химия;

4. Жильцов Н.З. Влияние окислительно-восстановительного режима на сохранение семени быка и получаемое потомство. Диссертация на соискание ученой степени кандидат биологических наук. -1967. Москва;

5. Жильцов Н.З. Методические указания по использованию синтетической среды ГЛКап для сохранения смени быка при плюсовых температурах. -1971. -К.: Курская правда.-8 е.;

6. Жильцова JI.C., Ерохин A.C., Селиверстова И.А., Ларкин С.Н. Замораживание спермы быков в средах с комплексонатами металлов./ Доклады ВАСХНИЛ. -1985.-№1.~с.33-34;

7. Жильцов Н.З. Опыты по осеменению свиней спермой хряков центра по искусственному осеменению Master Breeders (UK), проведенные в Белорусии и Украине в 1994-1995 гг(неопублекованные данные);

8. Жильцов Н.З. Новое в биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных.// Зоотехния. -1999.-№ 11. -С.31;

9. Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C., Чичилов A.B. Усовершенствование технологии глубокого замораживания семени быка./ Межведомственный тематический научный сборник «Разведение и генетика животных». -2001. -Вып.34. -С.10-17;

10. П.Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C., Чичилов A.B., Паньшин С.С. Усовершенствование технологии глубокого замораживания семени быка.// Наше племенное дело. -2002. -№ 2. -С. 10-12;

11. Зальцман A.A. Хранение семени быка при температуре выше 0° С. Племенное дело и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных./ Сборник статей. -1964. -М.: Колос. -С.185-191;

12. Кузнецова И.В., Кузнецов A.B., Сигаева В.А., Шит И.Ю. Использование сперматозоидов кролика в качестве вектора для чужеродной ДНК.// Биотехнология. -1993. -№ 11-12. -С.2-5;

13. Лянсберг Э.С. Синтетические среды для хранения семени барана. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. -1970. -Дубровицы, Московская обл.;

14. Милованов В.К., Соколовская И.И. Синтетические среды для разбавления семени хряка и методы его сохранения Л Животноводство. -1957. -№2;

15. Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных. Биолого-зоотехническая монография. -1962. -М.: Сельхозиздат.-696 е.;

16. Милованов В.К., Жильцов Н.З. Концентрация кислорода в канале эпидидимиса кролика./ Доклады ВАСХНИЛ. -1970. -№ 5. -С. 34-36;

17. Милованов В.К., Жильцова J1.C. Комплексонаты металлов в средах для семени сельскохозяйственных животных.// Вестник с.-х. науки. -1982. -№ 2;

18. Моррисон Р., Бойд Р. Органическая химия./ Под редакцией проф. И.К. Коробицыной. -1974. -М.:«Мир».-1132 е.;

19. Нарижный А.Г. и др. Значение ионов Ca44", Zn44", Си44" в воспроизводительной функции самок./ Бюлл. ВНИИРГЖ. -1983. -Вып. 65;

20. Середин В.А. Сульфатная среда для хранения спермы быка при плюсовых температурах.// Ветеринария. -1968. -№ 6. -С.81-82;

21. Середин В.А. Стрептомицин и неомицин в средах для разбавления спермы.// Ветеринария. -1973. -№7. -С.78-79;

22. Соколовская И.И., Жильцов Н.З., Субботин А.Д., Голубь B.C., Голышев Н.А., Чичилов А.В. Биология воспроизведения и искусственное осеменение животных -достижения и перспективы.// Зоотехния. -1999. -№ 8:С. 14-17;

23. Химическая энциклопедия./ Под редакцией Н.С. Зефирова. «Большая российская энциклопедия». -1995. -М. -т. 1-2,4-5;

24. Хонмоде Д. Влияние добавления в среду каталазы и кратковременной оксигенации на переживаемость семени, оплодотворение и жизнеспособность приплода./ Доклады ВАСХНИЛ. -1965. -№ 7. -С.26-30;

25. Abe Н., Sendai Y., Satoh Т., Hoshi Н. (1995). Secretory products of bovine oviductal epithelial cells support the viability and motility of bovine spermatozoa in culture in vitro. J. Exp. Zoo I., 272(1):54-61;

26. Abe H., Sendai Y., Satoh Т., Hoshi H. (1995). Bovine oviduct-spesific glycoprotein: a protein factor for maintenance of viability and motility of bovine spermatozoa in vitro. Mol. Reprod. Dev., 42(2):226-232;

27. Aitken R.N.C. (1971). The oviduct. In "Physiology and biochemistry of the domestic fowl". (Eds. D.J. Bell and B.M. Freeman.) pp. 1237-1289. (Academic press: New York);

28. Aitken R.J., Clarcson J.S. (1988). Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficiency of sperm preparation techniques. J. Androl., 9:367-376;

29. Alvarez J.G., Storey B.T. (1983). Taurine, hypotaurine, epinephrine and albumin inhibit lipid peroxidation in rabbit spermatozoa and protect against loss of motility. Biol Reprod., 29: 548-555;

30. Alvarez J.G., Storey B.T. (1985). Spontaneous lipid peroxidation in rabbit and mouse epididymal spermatozoa: dependence of rate on temperature and oxygen concentration. Biol. Reprod., 32:342-351;

31. Amann R.P., Hammerstedt R.H., Veeramachanent D.N.R. (1993). The epididymis and sperm maturation: a perspective. Reprod. Fertil. Dev., 5:361-381;

32. Anderson S.H., Killian G.J. (1994). Effect of macromolecules from oviductal conditioned medium on bovine sperm motion and capacitation. . Biol. Reprod., 51:795799;

33. Askari H.A., Check J.h., Peymer N., Bollendorf A. (1994). Effect of natural antioxidants tocopherol and ascorbic acids in maintenance of sperm activity during freeze-thaw process. Arch. Androl., 33(1): 11-15. Abstract;

34. Baker H.W., Brindle J., Irvine D.S., Aitken R.J. (1996). Protective effect of antioxidants on the important of sperm motility by activated polymorphonuclear leukocytes. Fértil. Steril., 65(2): 411-419. Abstract;

35. Bakst M.R. (1993). Oviducal sperm storage in poultry: a review. Reprod. Fértil. Dev., 5:595-599;

36. Bartkowiak A., Hunkeler D. (1999). New microcapsules based on oligoeletrolyte complexation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 875:36-45;

37. Bartkowiak A., Canaple L., Ceausoglu I., Nurdin N., Renken A., Rindisbacher L., Wandrey Ch., Desvergne B., Hunkeler D. (1999). New multicomponent capsules for immunoisolation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 875:135-145;

38. Bartkowiak A. (2001). Optimal conditions of transplantable binary polyelectrolyte microcapsules. Ann. N.Y. Acad. Sci., 944:120-134;

39. Bartkowiak A., Hunkeler D. (2001). Carrageenan -oligochitosan microcapsules: optimization of the formation process (1). Colloids Surf. B. Biointerfaces, 21(4):285-298;

40. Beconi M.T., Affranchino M.A., Schang L.M., Beorlegui N.B. (1991). Influence of antioxidants on SOD activity in bovine sperm. Biochem. Int., 23(3):545-553. Abstract;

41. Berth G., Voigt A., Dautzenberg H., Donath E., Mohwald H. (2002). Polyelectrolyte complexes and layer-by-layer capsules from chitosan/chitosan sulfate. Biomacromolecules, 3(3):579-590;

42. Binelli M., Hampton J., Buhi W.C., Thatcher W.W. (1999). Persistent dominant follicle alters pattern of oviductal secretory proteins from cows at estrus. Biol. Reprod., 61:127-134;

43. Boag A.H., Sefton M.V. (1987). Microencapsulation of human fibroblasts in a water-insoluble polyacrylate. Boitechnol. Bioeng., 29:954-996;

44. Boilard M., Bailey J., Collin S., Dufour M„ Sirard M.-A. (2002). Effect of bovine oviduct epithelial cell apical plasma membranes on sperm function assessed by a noval flow cytometric approach. Biol. Reprod., 67:1125-1132;

45. Bongso A., Ho J, Fong CY, Ng SC, Ratnam S. (1993). Human sperm function after coculture with human fallopian tubal epithelial cell monolayers: in vitro model for studying cell interaction in early human conception. Arch. Androl., 31 (3): 183-190;

46. Boquest A.C., Smith J.F., Briggs R.M., Duganzich D.M., Summers P.M. (1999). Effects of bovine oviductal proteins on bull spermatozoa function. Theriogenology, 51(3):583-595;

47. Bosch P, de Avila JM, Ellington JE, Wright RW Jr. (2001). Heparin and Ca2+-free medium can enhance release of bull sperm attached to oviductal epithelial cell monolayers. Theriogenology, 56(2):247-260;

48. Braun K., Besch W., Jahr H., Loth F., Dautzenberg H., Hahn H.J. (1985). The encapsulation of pancreatic islets. Investigation of insulin secretion and content in vitro. Biomed. Biochim. Acta, 44(1): 143-147;

49. Breitbart H., Wehbie R., Lardy H.A. (1990). Calcium transport in bovine sperm mitochondria: effect of substrates and phosphate. Biochim. Biophys. Acta, 1026:57-63;

50. Brezezinska-Slebodzinska E., Slebodzinski A.B., Pietras B., Wieczorek G. (1995). Antioxidant effect of vitamin E and glutathione on lipid peroxidation in boar semen plasma. Biol. Trace Elem. Res., 47(l-3):69-74. Abstract;

51. Bureau M., Bailey J.L, Sirard M.A. (2002). Binding regulation of porcine spermatozoa to oviductal vesicles in vitro. J. Androl, 23(2):188-193;

52. Calamera J.C., Doncel G.F., Brugo-Olmedo S., Sayago A., Acosta A.A. (2002). Male antisperm antibodies:association with a modified sperm stress test and lipid peroxidation. Andrologia, 34:63-68;

53. Cerolini S., Maldjian A., Surai P., Noble R. (2000). Viability, susceptibility to peroxidation and fatty acid composition of boar semen during liquid storage. Anim. Reprod. Sci., 58(1-2):99-l 11. Abstract;

54. Chang T.M.S. (1964). Semipermeable microcapsules. Science, 146:524-525;

55. Chang T.M.S. (1966). Semipermeable aqueous microcapsules, "artificial cells": with emphasis on experiments in an extracorporeal shunt system. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 12:13-19;

56. Chang T.M.S. (1967). Microcapsules as artificial cells. Science, 3:63-70;

57. Chang, T.M.S. (1969). Lipid-coated spherical ultrathin membranes of polymer or cross-linked protein as possible cell membrane models. Fed. Proc. 28,461.Abstr.

58. Chang T.M.S. (2000). Artificial cell biotechnology for medical application -a review. Blood Purif, 18:91-96;

59. Chian R.C., Lapointe S., Sirard M.A. (1995). Capacitation in vitro of bovine spermatozoa by oviduct epithelial cell monolayer conditioned medium. Mol. Reprod. Dev., 42(3):318-324;

60. Chian R.C., Sirard M.A. (1995). Fertilization ability of bovine spermatozoa cocultured with oviduct epithelial cells. Biol. Reprod., 52:156-162;

61. Cross N.L. (1998). Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol. Reprod., 59:7-11;

62. Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T. (1998). Effect of alpha-tocopherol and ascorbic acid on bovine in vitro fertilization. Theriogenology, 49(3):619-627. Abstract;

63. Daly M.M., Keown R., Knorr D.W. (1989). Chitosan alginate capsules. US Patent no. 4,808,707;

64. Dautzenberg H., Loth F., Fechner K., Mehlis B., Pommerening K. (1985). Preparation and performance of symplex capsules. Makromol. Chem. Suppl., 9:211-217;

65. Dautzenberg H., Holzapfel G., Lukanoff B. (1993). Methods for a comprehensive characterisation of microcapsules based on polyelectrolyte complex formation. Biomater. Artif. Cells, Artif. Cells & Immob. Biotechnoi, 21:399-405;

66. Demott R.P., Suarez S.S. (1992). Hyperactivated sperm progress in the mouse oviduct. Biol. Reprod., 46:779-785;

67. DeMott R.P., Lefebvre R., Suarez S.S. (1995). Carbohydrates mediate the adherence of hamster sperm to oviductal epithelium. Biol. Reprod., 52:1395-1403;

68. De Vos P, De Haan B., Pater J, Van Schilfgaarde R. (1996). Association between capsule diameter, adequacy of encapsulation and survival of microcapsulated rat islet allografts. Transplantation, 62(7):893-899;

69. De Vos P, De Haan B, Van Schilfgaarde R. (1997). Effect of the alginate composition on the biocompatibility of alginate-polylysine mocrocapsules. Biomaterials, 18(3):273-278;

70. De Vos P, Hoogmoed CG, Busscher HJ (2002). Chemistry and biocompatibility of alginate-PLL capsules for immunoprotection of mammalian cells. J. Biomed. Mater. Res., 60(2):252-259;

71. De Vos P, Hoogmoed CG, van Zanten J, Netter S, Strubbe JH, Busscher HJ. (2003). Long-term biocompatibility, chemistry and function of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials, 24(2):305-312;

72. Donnelly E.T., McClure N., Lewis S.E. (1999). The effect of ascorbate and alpha-tocopherol supplementation in vitro on DNA integrity and hydrogen peroxide-induced DNA damage in human spermatozoa. Mutagenesis, 14(5):505-512. Abstract;

73. Donnelly E.T., McClure N., Lewis S.E. (1999). Antioxidant supplementation in vitro does not improve human sperm motility. Fértil. Steril., 72(3):484-495. Abstract;

74. Donoghue A.M., Donoghue D.J. (1997). Effects of water- and lipid-soluble antioxidants on turkey sperm viability, membrane integrity, and motility during liquid storage. Poult. Sci., 76(10): 1440-1445. Abstract;

75. Dott H.M, Foster GC. (1975). Preservation of differential staining by formal citrate. J. Reprod. Fértil., 45:57-60;

76. Dott H.M., Moor R.M., Polge C. (1976). Artificial insemination with spermatozoa in formaldehyde. J. Reprod. Fértil., 46:277. Abstract;

77. Ehrenwald E., Parks J.E., Foote R.H. (1988a). Cholesterol efflux from bovine sperm. I. Induction of the acrosome reaction with lysophosphatidyl-choline after reducing sperm cholesterol. Gamete Res., 20:145-157;

78. Ehrenwald E., Parks J.E., Foote R.H. (1988b). Cholesterol efflux from bovine sperm. II. Effect of reducing sperm cholesterol on penetration of zona-free hamster and in vitro matured bovine ova. Gamete Res., 20:413-420;

79. Ehrenwald E., Foote R.H, Parks J.E. (1990). Bovine oviductal fluid components and their potential role in sperm cholesterol efflux. Mol. Reprod. Dev., 25:195-204;

80. Ellington JE. (1991). The bovine oviduct and its role in reproduction: a review of the literature. Cornell. Vet., 81(3):313-328;

81. Ellington JE, Ignotz GC, Varner DD., Marcucio RS, Mathison P, Ball BA. (1993) in vitro interaction between oviduct epithelial and equine sperm. Arch. Androl., 31 (2):79-86;

82. Fazeli A., Duncan A.E., Watson P.F., Holt W.V. (1999). Sperm-oviduct interaction: indication of capacitation and preferential binding of uncapacitated spermatozoa to oviductal epithelial cells in porcine species. Biol. Reprod., 60-879-886;

83. Feng M., Sefiton M.V. (2000). Hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate (HEMA-MMA) copolymers for cell microencapsulation: effect of HEMA purity. J. Biomater. Sci., 11:537-545;

84. Foote R.H., Bratton R.W. (1960). Survival of bovine spermatozoa stored at 5 and 25°C in extenders containing varying levels of egg yolk, glucose, glycine, glycerol, citrate and other salts. J. Dairy Sci., 43:1322-1329;

85. Foote R.H., Parks J.E. (1993). Factors affecting preservation and fertility of bull sperm: a brief review. Reprod. Fértil. Dev., 5:665-673;

86. Fournier V., Leclerc P., Cormier N., Bailey J.L. (2003). Implication of calmodulin-dependent phosphodiesterase Type 1 during bovine sperm capacitatiopn. J. Androl., 24(1):104-112;

87. Gaserod O, Smidsrod O, Skjak-Break G. (1998). Microcapsules of alginate-chitosan. -I. A quantitative study of the interaction between alginate and chitosan. Biomaterials, 19(20): 1815-1825;

88. Gaserod O, Skjak-Break G. (1999). Microcapsules of alginate-chitosan. II. A study of capsules stability and permeability. Biomaterials, 20(8):773-783;

89. Goldman EE, Ellington JE, Foote RH. (1998). Reaction of fresh and frozen bull spermatozoa incubated with fresh and frozen bovine oviduct epithelial cells. Reprod. Nutr. Dev., 38(3):281-288;

90. Good N.E., Winget G.D., Winter W., Connolly T.N., Izawa S„ Singh R.M.M. (1966). Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry, 5:467-477;

91. Gotze M., Torner H., Kauffold P., Konig I., Dautzenberg H„ Loth F. (1986). The release of immobilized substances from Symplex capsules. Pharmazie. 41(4):250-253, Abstract;

92. Graham J.K., Hammerstedt R.H. (1992). Differential effects of butylated hydroxytoluene analogs on bull sperm subjected to cold-induced membrane stress. Cryobiology, 29:106-117;

93. Grippo A.A., Way A.L., Killian G.J. (1995). Effect of bovine ampullary and isthmic oviductal fluid on motility, acrosome reaction and fertility of bull spermatozoa J. Reprod. Fer til., 105(l):57-64;

94. Gualtieri R., Talevi R. (2000). In vitro-cultured bovine oviductal cells bind acrosome-intact sperm and retain this ability upon sperm release. Biol. Reprod., 62:1754-1762;

95. Habibulin I.H. (1965). The preservation of ram semen by reversible inactivation of spermatozoa. Ovtsevodstvo, 11 (8): 9-11. In Russian;

96. Hammerstedt R.H, Graham J.K., Nolan J.P. (1990). Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to serve. J. Androl., 11:73-88;

97. Hammerstedt R.H, Keith A.D, Amman RP. (1991). Noningestible separation barrier with plugged pores. US Patent 5 026 342;

98. Hammerstedt R.H. (1993). Maintenance of bioenergetic balance in sperm and prevention of lipid peroxsidation: a review of the effect on design of storage preservation system. Reprod. Fertil. Dev., 5:675-690;

99. Harper M.J.K. (1973). Stimulation of sperm movement from the isthmus to the site of fertilization in the rabbit oviduct. Biol. Reprod., 8:369-377;

100. Hirschberg J. (1999). Production of high-value compounds: carotenoids and vitamin E. Current Opinion in Biotechnology, 10:186-191;

101. Holland M.K., Alvarez J.G., Storey B.T. (1982). Production of superoxide and activity of superoxide dismutase in rabbit epididymal sperm. Biol. Reprod., 27:11091118;

102. Hunter RHF., Nichol R. (1983). Transport of spermatozoa in the sheep oviduct: preovulatory sequestering of cells in the caudal isthmus. J. Exp. Zool., 228:121-128;

103. Hunter RHF., Wilmut I. (1984). Sperm transport in the cow: Peri-ovulatory redistribution of viable cells within the oviduct. Reprod. Nutr. Dev., 24:597-608;

104. Hunter RHF. (1984). Pre-ovulatory arrest and peri-ovulatory redistribution of competent spermatozoa in the isthmus of pig oviduct. J. Reprod. Fertil., 72:203-211 ;

105. Hunter R.H. (1988). Transport of gametes, selection of spermatozoa and gamete lifespans in the female tracts. In: Hunter RHF (ed.), The fallopian tubes. NY:Springer-Verlag, 53-80;

106. Hunter R.H., Flechon B., Flechon J.E. (1991). Distribution, morphology and epithelial interactions of bovine spermatozoa in the oviduct before and after ovulation: a scanning electron microscope study. Tissue Cell, 23(5):641-656;

107. Hunter R.H. (1994). Ovarian regulation of sperm progression in the fallopian tubes. Zygote, 2(4):363-366;

108. Jochle W. (1993). Forty years of control of the oestrous cycle in ruminants: progress made, unresolved problems and the potential impact of sperm encapsulation technology. Reprod. Fertil. Dev., 5:587-594;

109. Jones R.C., Foote R.H. (1972). Effect of osmolality and phosphate, 'Tris', 'Tes\ 'Mes', and 'HEPES' hydrogen ion buffers on the motility of bull spermatozoa stored at 37 or 5°C. Aust. J. Biol. Sci., 25:1047-1055;

110. Ijaz A., Lambert R.D., Sirard M.A. (1994). In vitro-cultured bovine granulosa and oviductal cells secrete sperm motility-maintaining factor(s). Mol. Reprod. Dev., 37(l):54-60;

111. Iqbal n., Hunter A.G. (1995). Effect of various capacitation systems on bovine sperm motion characterictics, acrosome integrity and induction of hyperactivation. J. Dairy Sci., 78(1):91-102;

112. Kawakami E, Kashiwagi C., Hori T., Tsutsu T. (2001). Effects of canine oviduct epithelial cells on movement and capacitation of homologous spermatozoa in vitro. Anim. Reprod. Sci., 68(1-2): 121-131;

113. Khurana N.K, Niemann H. (2000). Energy metabolism in preimplantation bovine embryos derived in vitro or in vivo. Biol. Reprod., 62:847-856;

114. Lane M.-E., Therien I., Moreau R., Manjunath P. (1999). Heparin and high-density lipoprotein mediate bovine sperm capacitation by different mechanisms. Biol. Reprod., 60:169-175;

115. Larsson B., Larsson K. (1986). Sperm localization in the oviducts of artificially inseminated dairy cattle. Acta Vet. Scand., 27:303-312;

116. Lefebvre R., Chenoweth P.J., Drost M., LeClear C.T. MacCubbin M., Dutton J.T. Suarez S.S. (1995). Characterization of the oviductal sperm reservoir in cattle. Biol. Reprod., 53:1066-1074;

117. Lefebvre R., DeMott R.P., Suarez S.S., Samper J.C. (1995). Specific inhibition of equine sperm binding to oviductal epithelium. In: Sharp D.C., Bazer F.W. (eds.), Equine Reproduction VI. Madison, WI: Society for the Study of Reproduction, 689696;

118. Lefebvre R., Suarez S.S. (1996). Effect of capacitation on bull sperm binding to homologous oviductal epithelium. Biol. Reprod., 54: 575-582;

119. Lefebvre R, Lo M.C., Suarez S.S. (1997). Bovine sperm binding to oviductal epithelium involves fucose recognition. Biol. Reprod., 56:1198-1204;

120. Lenz S., Lindenberg S., Sundberg K., Andersen A. N., Horness P., Starup J., Andersen C.Y., Jensen S.S., Hay-Schmidt A. (1991). Intrauterine fertilization capsules -a clinical trial. J. In Vitro Fert. Embryo Transf, 8(5):272-275;

121. Lenz S., Lindenberg S., Sundberg K., Hamberger L., Sjogren A. (1991). Intrauterine capsules for incubation of gametes and subsequent release of embryos. J. In Vitro Fert. Embryo Transf., 8(5):265-271;

122. Lim F., Sun A.M. (1980). Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science, 210:908-910;

123. Lim F., Moss R.D. (1981). Microencapsulated of living cells and tissue. J. Pharm. Sei., 70:351-354;

124. Lim F. (1984). Microencapsulation of living cells and tissues. 1983 review and update. Appl. Biochem. Biotechnol, 10:81-85;

125. Lindemann C.B., Kanous K. (1991). The cyclic nitroxide free radical, 4-hydroxy-2,2,6,6,-tetramethylpiperidine-l-oxyl (TEMPOL), is effective in prolonging the motility of bull sperm in vitro. Biol. Reprod., 44 (Suppl.l), 117. Abstract;

126. Loeser C.R., Tulsiani D.R.P. (1999). The role of carbohydrates in the induction of the aero some reaction in mouse spermatozoa. Biol. Reprod., 60:94-101;

127. Lopyrin A.I., Rabocev V.K. (1968). The optimum time to use preserved semen. Ovtsevodstvo, 14(7):20-22 (in Russian.);

128. Macpherson J.W., Fiser P.S., Reinhart B.S. (1977). The effect of caproic acid, handling technique and storage times on the fertility of fowl spermatozoa. Poult. Sei., 56(4): 1334-1336;

129. Mann T., Lutwak-Mann C. (1981). Male reproductive function and semen, p. 212 (Springer -Verlag: Berlin.);

130. Mansfela J., Forster M., Schellenberger A., Dautzenberg H. (1991). Immobilization of invertase by encapsulation in polyelectrolyte complexes. Enzyme Microb. Technol., 13(3):240-244;

131. Martin I.C.A., Richardson B.A. (1976). Factors affecting the fertility of diluted ram semen. In "Sheep breeding". (Eds. G.I. Tomes, D.E. Robertson, R.J. Lightfoot) pp. 467-474;

132. Maxwell W.M., Salamon S. (1993). Liquid storage of ram semen: a review. Reprod. Fértil. Dev., 5:613-638;

133. McNutt T.L., Olds-Clarke P., Way A.L., Suarez S.S., Killian G.J. (1994). Effect of follicular or oviductal fluids on movement characteristics of bovine sperm during capacitation in vitro. J. Androl, 15(4):328-336;

134. Merten O.-W., Dautzenberg H., Palfi G.E. (1991). A new method for the encapsulation of mammalian cells. Cytotechnology, 7:121-130;

135. Minami S, Okamoto y, Hamada k, Fukumoto Y, Shigemasa Y. (1999). Veterenary practice with chitin and chitosan. EXP, 87:265-277;

136. Mueller, P., Rudin, D.O. (1968). Resting and action potentials in experimental biomolecular lipid membranes. J. Theor. Biol. 18,222-258;

137. Munkittrick T.W., Nebel R.L., Saacke R.G. (1992). Accessory sperm numbers for cattle inseminated with protamine sulfate microcapsules. J. Dairy Sei., 75(3):725-731;

138. Nass-Arden L., Breitbart J. (1990). Modulation of mammalian sperm motility by quercetin. Molec. Reprod. Develop., 25: 369-379;

139. Nebel R.L., Barne J.H., Saacke R.G., Lim F. (1985). Microencapsulation of bovine spermatozoa. J. Anim. Sei., 60:1631-1639;

140. Nebel R.L., Vishwanath R., McMillan W.H., Saacke R.G. (1993). Microencapsulation of bovine spermatozoa for use in artificial insemination. Reprod. Fértil. Dev., 5:701-712;

141. Nebel R.L., Vishwanath R., McMillan W.H., Pitt C.J. (1996). Microencapsulation of bovine spermatozoa: effect of capsule membrane thickness on spermatozoal viability and fertility. Anim. Reprod. Sei, 44(2):79-89;

142. Nebel R.L., Saacke R.G. (1996). Spermatozoa microcapsulation and capsule behavior in the female tract. Reprod. Dom. Anim., 31:75-85;

143. Norman G. (1964). Further studies on the preservation of mammalian spermatozoa at variable temperatures. Proc. 5th Int. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insemin. Trento, 4:269-275;

144. O'Flaherty C., Beconi M., Beorlegui N. (1997). Effect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa. Andrologia, 29(5):269-275;

145. Okamoto Y, Tomita T., Minaxni S, Matsuhashi A, Kumazawa NH, Tanioka S, Shigemasa Y. (1995). Effects of chitosan on experimental abscess with staphylococcus aureus in dogs. J. Vet. Med. Sci., 57(4):765-767;

146. Orihuela P.A., Ortiz M.E., Croxatto H.B. (1999). Sperm migration into and through the oviduct following artificial ins-emination at different stages of the estrus cycle in the rat. Biol. Reprod., 60:908-913;

147. Orive G., Hernandez R.M., Gascon A.R., Calafiore R., Chang T.M.S., De Vos P., Hortelano G., Hunkeler D., Lacik I., Shapiro A.M.J., Pedraz J.L. (2003). Cell encapsulation: promise and progress. Nature Medicine, 9(1):104-107;

148. Overstreet J.W., Cooper G.W., Katz D.F. (1978). Sperm transport in the reproductive tract of the female rabbit: II. The sustained phase of transport. Biol. Reprod., 19:115-132;

149. Pagano, R., Thompson, T.E. (1968). Spherical lipid bilayer membranes: electrical and isotopic studies of ion permeability. J. Mol. Biol. 38,41-58;

150. Parks J.E., Hammerstedt R.H. (1985). Developmental changes occurring in the lipids of ram epididymal spermatozoa plasma membrane. Biol. Reprod., 32:653-680;

151. Parks J.E., Arion J.W., Foote R.H. (1987). Lipids from plasma membrane and outer acrosomal membrane of bovine spermatozoa. Biol. Reprod., 37:1249-1258;

152. Parks J.E., Ehrenwald E. (1990). Cholesterol efflux from mammalian sperm and its potential role in capacitation. In 'Fertilization in mammals'. (Eds. Bavister B., Cummins J., Roldan E.) pp 155-168. (Serono Symposia: Norwell, MA.);

153. Parks J.E., Hough S., Elrod C. (1990). Platelet activating factor activity in the phospholipids of bovine spermatozoa. Biol. Reprod., 43:806-811;

154. Parks J.E., Graham J.K. (1992). Effects of cryopreservation procedure on sperm membranes. Theriogenology, 38:209-222;

155. Parks J.E. Lynch D.V. (1992). Lipid composition and thermotropic phase bahavior of boar, bull, stallion and rooster sperm membranes. Cryobiology, 29:255-266;

156. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Handrow R.R., Sims M.M., First N.L. (1989). Capacitation of bovine spermatozoa by oviduct fluid. . Biol. Reprod., 40:1020-1025;

157. Peirone M, Ross CJ, Hortelano G, Brash JL, Chang PL. (1998). Encapsulation of various recombinant mammalian cell types in different alginate microcapsules. J. Biomed. Mater. Res., 42(4):587-596;

158. Pollard J.W., Plante C., King W.A., Hansen P.J., Betteridge K.J., Suarez S.S. (1991). Fertilization capacity of bovine sperm may be maintained by binding to oviductal epithelia cell. Biol. Reprod., 44:102-107;

159. Pommerening K., Ristau O., Rein H., Dautzenberg H., Loth F. (1983). Immobilization of proteins and cell fragments using a new method of microencapsulation. Biomed. Biochim. Acta, 42(7-8):813-823;

160. Prokop A., Hunkeler D., Dimari S., et al. (1998). Water soluble polymers for immunoisolation I: complex coacervation and cytotoxicity. Adv. Polimer Science, 136:1-51;

161. Quinn P.J. (1989). Principles of membrane stability and phase behavior under extreme conditions. J. Boienerg. Biomembr., 21:3-19;

162. Racey P.A. (1979). The prolonged storage and survival of spermatozoa in Chiroptera. J. Reprod. Fertil. ,56:391 -402;

163. Revah I., Gadella B.M., Flesch F.M., Colenbrander B., Suarez S.S. (2000). Physiological state of bull sperm affects fucose- and mannose-binding properties. Biol. Reprod., 62:1010-1015;

164. Rathore A.K., Mukherjee D.P. (1961). Effects of egg-yolk phosphate, milk and egg-yolk boric acid-sodium bicarbonate dilutors on the morphology of ram spermatozoa. Indian Vet. J., 38:383-390;

165. Rha C. et al (1984). Biotechnology of marine polysaccharides, R.R. Colwell, E.R.Pariser, A.J.Sinkey, eds. Washington: Hempshire Publishing Corp.283;

166. Rha C. (1985). Process for encapsulation and encapsulated active material system. European Patent Application no.O 152 898;

167. Rha C. (1988). Encapsulated active material system. US Patent 4,749,620;

168. Rokstad A.M., Kulseng B., Strand B.L., et al. (2001). Transplantation of alginate microcapsules with proliferating cells in mice. Capsular overgrowth and survival of encapsulated cells of mice and human origin. Ann. N. Y. Acad. Sci., 944:216-225;

169. Rokstad AM, Holtan S., Strand B, Steinkjer B, Ryan L, Kulseng B, Skjak-Break G. (2002). Microencapsulation of cells producing therapeutic proteins: optimizing cell growth and secretion. Cell Transplant., 11(4):313-324;

170. Ross CJ, Bastedo L, Maier SA, Sands MS, Chang PL. (2000). Treatment of a lysosomal storage disease, mucopolysaccharidosis VII, with microcapsulated recombinant cells. Hum. Gene Ther., 11(15):2117-2127;

171. Ross CJ, Chang PL. (2002). Development of small alginate microcapsules for recombinant gene product delivery to the rodent brain. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 19(8):953-962;

172. Sarlos P., Molnar A., Kokai M., Gabor G., Ratky J. (2002). Comparative evaluation of the effect of antioxidants in the conservation of ram semen. Acta Vet. Hung., 50(2):235-245. Abstract;

173. Schneider C.S., Ellington J.E., Wright R.W. Jr. (1999). Relationship between bull field fertility and in vitro embryo production using sperm preparation methods with and without somatic cell co-culture. Theriogenology, 51(6):1085-1098;

174. Sefton M.Y. (1989). Blood, guts and chemical engineering. Can. J. Chem. Eng., 67:705-712;

175. Sefton M.V., Stevenson W.T.K. (1993). Microencapsulation of live animal cells using polyacrylates. Adv. Polym. Sci., 107:145-198;

176. Senger P.L. (1993). Site of semen deposition and its effect on fertility and sperm retention: a review. Reprod. Fértil. Dev., 5:659-663;

177. Setchell B.P., Sánchez-Partida L.G., Chairussyuhur A. (1993). Epididymal constituents and related substances in the storage of spermatozoa: a review. Reprod. Fértil. Dev., 5:601-612;

178. Shalev D.P., Soffer Y., Lewin L.M. (1986). Investigations on the motility of human spermatozoa in a defined medium in the presence of metabolic inhibitors and/or carnitine. Andrologia, 18:368-375;

179. Shannon P., Curson B. (1965). Contribution of seminal plasma, sperm numbers and gas phase to dilution effects of bovine spermatozoa. J. Dairy Sci., 48:1357-1361;

180. Shannon P., Curson B. (1983). Effect of egg yolk levels on the fertility of diluted bovine sperm stored at ambient temperatures. N.Z. J. Agrie. Res., 26:187-190;

181. Shannon P., Curson B., Rhodes A.P. (1984). Relationship between total spermatozoa per insemination and fertility of bovine semen stored in Caprogen at ambient temperature. N.Z. J. Agric. Res., 27:35-41;

182. Shigemasa Y, Sashiwa H, Tanioka S, Saimito H, Tanigawa T, Tanaka Y. (1992). Behavior of the mouse macrophage cell line and mouse fibroblast on copolymer containing cellulose triacetate. Int. J. Biol. Macromol., 14(5):274-278;

183. Sittinger M., Lukanoff B., Burmester G.R., Dautzenberg H. (1996). Encapsulation of artificial tissues in polyelectrolyte complexes: preliminary studies. Biomaterials, 17(10): 1049-1051;

184. Smith T.t., Koyanagi F., Yanagimachi R. (1987). Distribution and number of spermatozoa in the oviduct of the golden hamster after natural mating and artificial insemination. Biol. Reprod., 37:225-234;

185. Smith T.T., Yanagimachi R. (1990). The viability of hamster spermatozoa stored in the isthmus of the oviduct: The importance of sperm-epithelial contact for sperm survival. Biol. Reprod., 42:450-457;

186. Smith T.T., Yanagimachi R. (1991). Attachment and release of spermatozoa from the caudal isthmus of the hamster oviduct. J. Reprod. Fertii, 91:567-573;

187. Sijderquist L. (1991). ATP content and sperm motility of extended bovine semen under different storage conditions. Acta Vet. Scand., 32:511-518;

188. Strand BL, Ryan TL, In't Veld P., Kulseng B, Rokstad AM., Skjak-Break G., Espervik t. (2001). Poly-L-lysine induces fibrosis on alginate microcapsules via the induction of cytokines. Cell Transplant10(3):263-275;

189. Strand BL, Gaserod O, Kulseng B, Espervik T„ Skjak-Break G. (2002). Alginate-polylysine-alginate microcapsules: effect of size reduction on capsule properties. J. Microencapsul., 19(5):615-630;

190. Strand BL, Morch YA, Espevik T, Skjak-Break G. (2003). Visualization of alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules by confocal laser scanning microscopy. Biotechnol. Bioeng., 82(4):386-394;

191. Strand BL, Morch YA, Syvertsen KR, Espevik T, Skjak-Break G. (2003). Microcapsules made by enzymatically tailored alginate. J. Biomed. Mater. Res., 64A(3):540-550;

192. Suarez S.S. (1987). Sperm transport and motility in the mouse oviduct: observation in situ. Biol. Reprod., 36:203-210;

193. Suarez S.S., Revah I., Lo M., Kolle S. (1998). Bull sperm binding to oviductal epithelium is mediated by a Ca2+ -dependent lectinon sperm that recognizes Lewis-a trisaccharide. Biol Reprod., 59:39-44;

194. Suzuki H., Foote R.H. (1995). Bovine oviductal epithelial cells (BOEC) and oviducts: I. For embryo culture. II. Using SEM for studying interactions with spermatozoa. Microscopy Research and Technique, 31:519-530;

195. Talevi R., Guiltieri R. (2001). Sulfated glycoconjugates are powerful modulators of bovine sperm adhesion and release from the oviductal epithelium in vitro. Biol Reprod., 64:491-498;

196. Tash J.S., Mann T. (1973). Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate in relation to motility and senescence of spermatozoa. Proc. R. Soc. Lond. Biol., 184:109-114;

197. Thanawala A.J., Sonawane S.A., Sane C.R. (1988). Feasibility of using hard gelatin capsules for the packaging and deep-freezing of bull sperm. Theriogenology, 29:921929;

198. Thu B, Bruheim P, Espevik T, Smidsrod O, Soon-Shiong P, Skjak-Break G. (1996a). Alginate polycation microcapsules. I. Interaction between alginate and polycation. Biomaterials, 17(10). 1031-1040;

199. Thu B, Bruheim P, Espevik T, Smidsrod O, Soon-Shiong P, Skjak-Break G. (1996b). Alginate polycation microcapsules. II. Some functional properties. Biomaterials, 17(11):1069-1079;

200. Torre M.L., Maggi L., Giunchedi P., Conte U., Vigo D., Maffeo G. (1998). Calcium alginate beads containing an hydrophilic polymer for the encapsulation of swine spermatozoa. S.T.P. Pharma Sci., 8:233-236;

201. Torre M.L., Maggi L., Vigo D., Galli A., Bornaghi V., Maffeo G., Conte U. (2000). Controlled release of swine semen encapsulated in calcium alginate beads. Biomaterials, 21:1493-1498;

202. Torre M., Faustini M., Norberti R., Maggi L., Maffeo G., Conte U., Vigo D. (2002). Barium alginate cell-delivery systems: correlation between technological parameters. Int. J. Pharm., 242 (l-2):389;

203. Toshimori K. (1998). Maturation of mammalian spermatozoa: modifications of the acrosome and plasma membrane leading to fertilization. Cell Tissue Res., 293:177-187;

204. Uludag H, De Vos P, Tresco PA. (2000). Technology of mammalian cell encapsulation. Adv. DrugDeliv. Rev., 42(l-2):29-64;

205. Upreti G.C., Oliver J., Munday R., Smith J.F. (1991). Development of a ram semen dilluent (RSD-1) for maintaining spermatozoal motility. Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol., 23rd Ann. Conf. p. 129. Abstract;

206. Upreti G.C., Jensen K., Oliver J.E., Duganzich D.M., Munday R., Smith J.F. (1997). Motility of ram spermatozoa during storage in a chemically-defined diluent containing antioxidants. Anim. Reprod. Sci., 48(2-4):269-278. Abstract;

207. Van Blerkom J. (1989). Encapsulation of sperm for artificial insemination. US Patent 4 840 891;

208. Wandrey Ch., Vidal D.S. (2001). Purification of polymeric biomaterials. Ann. N.Y. Acad. Sci., 944:187-198;

209. Watson P.F. (1979). The preservation of semen. Oxford Rev. Reprod. Biol, 1:289350, Abstract;

210. Watson P.F. (1993). The potential impact of sperm encapsulation technology on the importance of timing of artificial insemination: a perspective in the light of published work. Reprod. Fertil. Dev., 5:691-699;

211. Watson P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Reprod. Sci., 60-61:481-492. Abstract;

212. Way AL, Griel LC, Killian G.J. (2000). Effects of accessory sex gland fluid on viability, capacitation and the acrosome reaction of caudal epididymal bull spermatozoa. J. Androl, 21 (2):213-219;

213. White I.G. (1993). Lipid and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod. Fertil Dev., 5:639-658;

214. Witters W.L., Foley C.W. (1971). Effects of benzimidazoles as inhibitors of metabolism of washed porcine spermatozoa. J. Anim. Sci., 32:287-291;

215. Yanagimachi R. (1994). Mammalian fertilization. In: Knobil E., Neill J.D. (eds.), The physiology of reproduction, 2nd ed. NY: Raven Press, Ltd.: 189-317;

216. Yao K. et al (1995). Microcapsules and microspheres related to chitosan. J.M.S.-Rev.macromol. chem. Phys., C35(l):155-180;

217. Yousef M.I., Abdallah G.A., Kamel K.I. (2003). Effect of ascorbic acid and vitamin E supplementation on semen quality and biochemical parameters of male rabbits. Anim. Reprod. Set, 76(l-2):99-l 11. Abstract;

Информация о работе

Дамрина, Ирина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Дубровицы, Московской обл., 2003
ВАК 03.00.13

Диссертация

Сохранение семени быка при температуре тела в капсулах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы