Система метаболической регуляции транспорта слабых органических анионов в клетках проксимальных канальцев почки

Никифоров, Анатолий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Система метаболической регуляции транспорта слабых органических анионов в клетках проксимальных канальцев почки
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Система метаболической регуляции транспорта слабых органических анионов в клетках проксимальных канальцев почки"

На правах рукописи

РГБ ОД

НИКИФОРОВ Анатолий Александрович ° ^

СИСТЕМА МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА СЛАБЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ

АНИОНОВ В КЛЕТКАХ ПРОКСИМАЛЬНЫХ КАНАЛЬЦЕВ ПОЧКИ

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (Санкт-Петербург)

Официальные оппоненты: доктор биологических

наук, профессор В.И.Воробьев

(Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург)

доктор медицинских наук, профессор В.Б.Долго-Сабуров (Институт токсикологии МЗ РФ, Санкт-Петербург)

доктор биологических наук, профессор Н.Д.Ещенко (Физиологический НИИ СПбГУ, Санкт-Петербург)

Ведущее учреждение: Институт физиологии

им.И.П.Павлова РАН, Санкт-Петерубрг

Защита состоится 16 июня 2000 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан 13 мая 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

ЛСси^*^ Л.Н. Писарева

Введение

Актуальность проблемы: На протяжении нескольких десятилетий не ослабевает интерес к механизмам транспорта органических веществ через плазматические мембраны клеток. Данные функциональных транспортных исследований, полученные при использовании экспериментальных моделей разного уровня организации (от пузырьков плазматических мембран до тканевых срезов), в последние годы находят подтверждение в молекулярно-биологических работах, посвященных клонированию и иммуноцитохимической локализации полипептидных транспортеров. Результаты как функциональных, так и молекулярно-биологических исследований свидетельствуют о том, что значение систем транспорта органических веществ для жизнедеятельности клеток обусловлено не только их ролью в обеспечении внутриклеточного накопления нутриентов (сахаров, аминокислот и т.д.), но связано также с необходимостью защиты содержимого клеток от потенциально токсичных конечных продуктов обмена веществ и чужеродных соединений, попадающих в организм из внешней среды.

Наиболее известным примером транспортных систем второго типа являются работающие за счет гидролиза АТФ переносчики семейств Gpl 70 и MRP, которые откачивают из клеток большую группу лекарственных веществ и известны в связи с явлением так называемой множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток [Silverman, 1999]. Велика роль подобных транспортных систем (например, локализованных в нейроэпителии хориоидного сплетения мозга и в эндотелии сетчатки глаза) в удалении конечных продуктов обмена из жидкостей, отделенных гисто-гемагическими барьерами, путем однонаправленного трансцеллюлярного переноса органических веществ в кровь [Бреслер, Никифоров, 1981]. И, наконец, важная роль в механизмах поддержания постоянства внутренней среды организма принадлежит транспортным системам, обеспечивающим очищение плазмы крови от ненужных и вредных веществ посредством их экскреции в почках и печени [Pritchard, Miller, 1993].

ная система (OAT система в современной классификации) транспорта веществ, собирательно именуемых слабыми органическими анионами (COA), локализованная в почках только в клетках проксимальных канальцев [Sekine et al., 1997 Race et al., 1999].

В литературе, посвященной изучению транспорта COA в проксимальных канальцах почки (ПКП), острую полемику всегда вызывал вопрос о движущей силе их противоградиентной транслокации через базолатеральную плазматическую мембрану внутрь клеток-лимитирующего этапа трансэпителиального переноса [Haberle, 1981; Бреслер, Никифоров, 1981; Moller, Sheikh, 1983]. В настоящее время наиболее обоснованной выглядит схема, согласно которой противо-градиентное накопление COA в клетках ПКП происходит по механизму антипорта с а-кетоглутаратом (КГ), цитоплазматический уровень которого поддерживается за счет его обратного симпорта cNa+ и/или его образования из других интермедиатов [Pritchard, Miller, 1993]. В последнее время получены данные, позволяющие предполагать, что антипорт с КГ осуществляют упоминавшиеся выше ОАТ транспортеры, а в симпорте КГ с Na+ участвуют SDCT2 транспортеры [Chen et al., 1999]. В рамках этой модели, транспорт COA в ПКП является третично-активным по способу сопряжения с энергетическим метаболизмом клеток - движущую силу противоградиентного переноса COA через базолатеральную мембрану создаст направленный навстречу градиент КГ, величина которого, в свою очередь, зависит от градиентаNa+, создаваемого Ыа,К-АТФазой. В то же время, активностьNa,K-ATOa3bi является основным детерминантом в энергетическом метаболизме клеток ПКП - уровень активного трансцел-люлярного транспорта Na+ не только зависит от скорости протекания процессов окислительного обмена, сопряженных с образованием АТФ, но и в значительной степени определяет энергетический статус клеток через влияние на метаболическое состояние митохондрий [Наточин, 1976; Balaban, 1990]. Следовательно, в регуляцию транспорта COA в ПКП через влияние как на внутриклеточный метаболизм КГ, так и на величину градиента Na+ на базолатеральной мембране неизбежно должны быть вовлечены метаболические процессы. Механизмы зависимости транспорта COA в клетках ПКП от клеточного энергетического метаболизма до наших работ оставались практически неизученными, что в немалой степени можно было объяснить отсутствием адекватных экспериментальных моделей для исследований такого рода.

Цель и задачи исследования: Цель работы состояла в изучении механизмов энергетического контроля транспорта COA в эпителиальных клетках ПКП. Для достижения поставленной цели необходимо было

решить следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель с минимальными структурно-функциональными повреждениями ткани, позволяющую регистрировать в разных экспериментальных условиях in vitro как активность системы транспорта COA, так и биохимические параметры, отражающие метаболическое состояние клеток ПКП.

2. Используя возможности фармакологической и функциональной модуляции скорости транспорта Na% исследовать роль активности Na,K-ATOa3bi в механизмах сопряжения транспорта СОЛ с энергетическим метаболизмом клеток ПКП.

3. С помощью метода ингибиторного анализа исследовать связь транспорта COA в клетках ПКП с процессами взаимопревращений метаболических интермедиатов и выявить метаболические пути, вовлеченные в регуляцию изучаемого транспортного процесса через изменения цитоплазматического уровня КГ.

Научная новизна работы: Впервые на уровне интактных клеток изучена роль митохондрий в обеспечении энергией транспорта органических веществ в ПКП: показано, что транспорт COA в клетках ПКП регулируется в зависимости от (1) окислительно-восстановительного (редокс) состояния митохондрий, (2) потоков внутримитохондри-альных реакций с участием пируваткарбоксилазы, аспартатаминот-рансферазы и малатдегидрогеназы и (3) активности систем транспорта метаболических интермедиатов через внутреннюю мембрану митохондрий (малат-аспартатный челночный механизм и дикарбок-силатный, трикарбоксилатный, а-кетоглутаратный и пируватный переносчики).

Выявлена роль начальных этапов глюконеогенеза (ГНГ) в метаболической регуляции транспорта COA, обусловленная их участием в экспорте восстановительных эквивалентов из митохондрий в цитоплазму.

Показано, что стимуляция транспорта COA такими метаболическими субстратами, как ацетат, пируват или лактат происходит без активации ЦТК, тогда как для развития эффектов интермедиатов ЦТК необходима активация отдельных его стадий, но не цикла как целого.

зультатов проведен на основе представления о том, что, как и при регуляции биохимических процессов [Atkinson, 1977], регуляторны-ми факторами для транспорта СОЛ в клетках ПКП являются адени-латный статус клетки, редокс-потснциал митохондрий и цитоплазмы и уровень ацетил-КоА в митохондриях.

Разработанная экспериментальная модель может быть применима для исследования механизмов влияния чужеродных веществ на почечный транспорт и метаболизм, в том числе, побочных эффектов лекарственных препаратов, на уровне интактных клеток. При использовании в качестве одного из фармакологических агентов вальпроа-та, широко применяемого при лечении эпилепсии [Chadwick, 1985], в работе показано, что этот терапевтический препарат не только замедляет транспорт других органических анионов, конкурируя с ними за транспортные переносчики, но и воздействует на энергетический обмен в клетках ПКП, влияя на метаболизм пирувата. Обнаружено, что малеат, пент-4-еноат и ионы кадмия, вызывающие, как известно [Bergeron, Gougoux, 1989], нарушение процессов реабсорбции Сахаров, аминокислот и фосфата в клетках ПКП при хроническом применении, в краткосрочных опытах in vitro стимулируют транспорт СОА на фоне повышения внутриклеточного содержания КГ. Дальнейшие исследования в этом направлении могут пролить свет на роль метаболических сдвигов в развитии нефротоксических эффектов. Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Полученные данные находятся в соответствии с теоретической моделью, согласно которой транспорт СОА в клетки ПКП сопряжен с энергетическим метаболизмом по механизму антипорта с КГ через базолатеральную плазматическую мембрану.

2. Роль КГ в энергетическом сопряжении транспорта СОА в ПКП обусловливает участие метаболических процессов в контроле этой специализированной клеточной функции, что проявляется как зависимость транспорта СОА от аденилатного статуса клетки, окислительно-восстановительного потенциала митохондрий и цитоплазмы и от доступности метаболических субстратов.

3. Относительный вклад процессов внутриклеточного образования КГ и его обратного симпорта с Na+ в поддержание градиента КГ -движущей силы транспорта СОА через базолатеральную мембрану - варьирует в зависимости от условий, в которых находятся клетки.

кие методы исследования в физиологии и биохимии" (Ленинград, 1987); VIII всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевого обмена (Харьков, 1989); всероссийском симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994); семинаре факультетов физиологии и фармакологии Медицинской школы Университета штата Нью-Йорк (Buffalo, 1994); семинаре секции сравнительной фармакологии мембран и внутриклеточной регуляции Национального института здоровья США (Research Triangle Park, 1994); симпозиуме физиологического общества Великобритании (Aberdeen, 1994); XXXIII международном конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997).

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 178 страницах и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 22 отечественную и 341 зарубежные работы. Диссертация содержит 105 рисунков и 7 таблиц.

Публикации: Основные результаты по материалам диссертации опубликованы автором в 20 печатных работах.

Материалы и методы исследования

Основные требования к экспериментальной модели для исследования механизмов метаболической регуляции транспортной функции клетки могут быть сформулированы следующим образом: 1) использование препаратов, в которых одновременно протекают транспортные и метаболические процессы; 2) интактность транспортирующих структур; 3) минимизация артефактов, связанных с различиями в метаболическом состоянии клеток в препарате и 4) возможность определения метаболических параметров как коррелятов исследуемого транспортного процесса.

Для регистрации транспорта COA использован разработанный нами совместно с В.М.Бреслером метод микрофлуориметрической регистрации люминесцентных красителей с применением контактных микрообъективов [Бреслер, Никифоров, 1981]. В качестве маркерной COA использован анионный краситель флуоресцеин, широко применяемый и другими исследователями и, как недавно подтверждено в опытах по клонированию- экспрессии [Sweet et al., 1999], являющийся типичным субстратом для ОАТ транспортера в клетках ПКГ1. Контактные объективы позволяют получать изображения структур, находящихся на глубине до 100 мкм от поверхности органа; с их помощью можно визуализировать распределение флуорох-ромав ткани и измерять интенсивность его люминесценции в отдельных гистологических структурах in situ.

Для определения биохимических параметров, характеризующих

метаболическое состояние клеток ПКП крысы, использовали суспензию фрагментов внешней коры почки, полученных без применения протеаз.

Регистрация накопления флуоресцеина в ПКП: Транспорт флуорес-цеина в ПКП исследовали на кусочках почек самцов травяной лягушки Rana temporaria массой 30-50 г и срезах внешней коры почек крыс- самцов линии Вистар массой 180-250 г. Лягушек обездвиживали разрушением спинного мозга, почки отсепаровывали и их кусочки (60-100 мг), полученные поперечным разрезом почек, ополаскивали в модифицированном растворе Рингера следующего состава (ммоль/л): NaCl 117.6; KCl 3.4; NaHCO, 2.4; СаС122.8; pH 7.6-7.8 (20°С). Крыс забивали отсечением головы, почки быстро отсепаровывали и поверхностные срезы почечной коры толщиной 0.5-0.8 мм и массой 50-80 мг, приготовленные вручную с помощью лезвия бритвы так, что естественная поверхность почки оставалась интактной, ополаскивали в физиологическом растворе (модифицированный фосфатный буфер Кребса-Рингера) следующего состава (в ммоль\л): NaCl 104.7; KCl 15.3;СаС121.5; MgS042.5;NaHC033.6;NaH2P043.3;Na2HP04 4.8; pH 7.1-7.3 (20°C). Отмытые от крови препараты инкубировали (в большинстве опытов, в течение 20 мин) в 10 мл аэрируемой среды с флуоресцеином (обычно, в концентрации 0.05 мМ) при 18-20°С (почка лягушки) или 20-22°С (почка крысы). Для инкубации обычно использовали свежеприготовленные кусочки почек лягушки или срезы коры почки крысы, преинкубированные 60 мин в аэрируемом физиологическом растворе при 20-22°С. В ряде опытов использовали среды модифицированного состава - безнатриевую, в которой NaCl эк-вимолярно заменяли на холинхлорид, или номинально бескальциевую, из которой был исключен СаС12.

Для нагрузки клеток ПКП субстратами или ингибиторами перед инкубацией с флуоресцеином использовали холодовую преинкуба-цию - препараты почек выдерживали в течение 120 мин при 2-4°С в 10 мл среды определенного состава без аэрации. В ряде опытов препараты почек преинкубировали 180 мин при 20-22°С в аэрируемом стандартном физиологическом растворе без метаболических субстратов для истощения запаса эндогенных субстратов окисления. В нескольких сериях экспериментов почки лягушки in situ перфузирова-ли через дугу аорты для того, чтобы к началу инкубации с флуоресцеином жидкость в просвете канальцев имела заданный состав. Для проверки возможности непосредственного влияния тестируемых веществ на транспорт COA использовали метаболически неактивные ПКП крысы. Свежеприготовленные срезы преинкубировали в стандартном физиологическом растворе (2 часа при 2-4°С) и затем инку-

бировали при 20°С в атмосфере аргона. В отсутствие искусственного градиента Na+ поступление флуоресцеина в клетки таких канальцев происходит по механизму простой и облегченной диффузии [Можа-ева и др., 1982].

После инкубации концентрацию флуоресцеина в канальцах оценивали с помощью лабораторного микрофлуориметра при максимумах длин волн возбуждающего света 480 нм и света флуоресценции 540 нм. Интенсивность люминесценции флуоресцеина измеряли в 40 разных извитых ПКП (S2 сегмент), расположенных на одинаковой глубине (около 40 мкм) от интактной поверхности среза внешней коры почки крысы или дорсальной поверхности кусочка почки лягушки. Измерения повторяли на срезах (или кусочках) почек от 35 животных. Данные выражали в виде нормализованного отношения К/С (каналец/ среда); величину К/С для равновесного накопления флуоресцеина при инкубации при 2-4°С в течение 90 мин для ПКП крысы или 60 мин для ПКП лягушки принимали за единицу. Определение степени восстановленное™ митохондриальных пиридин-нуклсотидов: Степень восстановленное-™ пиридиннуклеотидов в клетках ПКП лягушки и крысы оценивали по интенсивности синей аутолюминесценции ткани в области 440 - 480 им [Klahr, Hammerman, 1985], которую измеряли (максимумы: возбуждения при 366 нм, люминесценции при 462 нм) с помощью лабораторного микрофлуориметра с контактным микрообъективом с кварцевыми линзами. Интенсивность синей аутолюминесценции измеряли в 30 - 40 разных канальцах на поверхности среза или кусочка почки; измерения проводили на препаратах почек от 3-5 животных. Результаты выражали в условных единицах или в пересчете - в виде степени восстановленное™ пиридиннуклеотидов (в %), которую рассчитывали как отношение 100(It - Io)/(Ir - у, где I(, 1г и 1о - интенсивность собственной синей люминесценции после инкубации препаратов почки в растворах с тестируемым веществом, амиталом и 2,4-динитрофенолом (ДНФ), соответственно.

Получение суспензии фрагментов коры почки крысы: Суспензию фрагментов внешней коры почки крысы получали по методу, описанному В.Гудером с соавторами [Guder et al., 1969]. Полученная суспензия состояла, в основном, из фрагментов канальцев и отдельных клеток, которые практически не прокрашивались трипановым синим. Способность фрагментов канальцев в суспензии переносить инкубацию оценивали по степени выхода лактатдегидрогеназы из клеток, которую рассчитывали как процентное отношение удельной активности фермента в инкубационной среде и в гомогенате, полученном после осаждения ткани из суспензии центрифугированием. Актив-

ность лактатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически по снижению эксгинкции НАДН при 340 нм с пируватом в качестве субстрата [Bergmeyer, 1974]. Выход лактатдегидрогеназы составлял 2.6+0.3%; 3.2±0.3%; 3.4±0.4% и 4.7±0.5% (п=3) до начала инкубации и через 20, 40 и 60 мин инкубации, соответственно. Определение содержания метаболитов в ПКП крысы; Суспензию фрагментов коры почки крысы (4-8 мг белка/мл среды) инкубировали при 20-22°С в течение 30 мин в стандартном физиологическом растворе, содержавшем 0.5%-ный бычий сывороточный альбумин (фракция V, обезжиренный, Sigma) в шейкере (70 циклов\мин). Инкубацию завершали введением в пробирки 30%-ной исрхлорной кислоты. После нейтрализации содержимое пробирок центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатанты собирали для определения содержания метаболитов; осадки использовали для измерения содержания белка по методу Лоури в модификации [Markwell et al., 1978]. Метаболиты определяли с помощью методов энзимагическо-го анализа [Bergmeyer, 1974]; измерения проводили на спектрофотометре Specol {Karl Zeiss, Jena).

Регистрация потребления кислорода суспензией фрагментов коры почки крысы: Потребление кислорода в суспензии фрагментов коры почки крысы регистрировали полярографически при 20-22°С на по-лярографе ПУ-1 (Гомель, Белоруссия) с закрытым платиновым электродом Кларка. Субстраты и ингибиторы вводили в полярографическую ячейку из концентрированных водных растворов после установления стационарной скорости потребления кислорода.. Длительность одной записи не превышала 7-10 мин. Скорость потребления кислорода рассчитывали как тангенс угла наклона падающей прямой линии, отражающей изменение напряжения кислорода. Статистическая обработка: Данные об интенсивности люминесценции флуоресцеина или восстановленных пиридиннуклеотидов в клетках ПКП представлены как средние с доверительными интервалами на 95%-ном уровне значимости (если не указано иначе). Средние различаются достоверно (р<0.05), если их доверительные интервалы не перекрываются. Данные о содержании метаболитов в суспензии фрагментов коры почки крысы представлены как средние ± S.E. с указанием числа измерений в скобках. Оценку значимости различий между средними проводили в два этапа. Сначала оценивали вероятность статистически значимых различий между всеми группами данных в отдельной серии путем определения величины F-критерия (метод ANOVA). Если величина F оказывалось выше табличного значения, проводили попарное сравнение средних по методу Бонферони. При количестве групп, равном двум, эта оценка совпадала с оценкой по методу Стыодента.

Результаты и обсуждение 1. Роль Na,K-AT<J>a3bi в метаболической регуляции транспорта COA

Стимуляция накопления COA в ПКП под действием ацетата рассматривалась в литературе как характерная черта изучаемой транспортной системы [Haberle, 1981], однако ее механизм оставался необъясненным. Наше внимание привлек тот факт, что стимулятор-ное влияние ацетата на накопление COA в срезах коры почки крысы исчезало при понижении содержания Na+ в среде. При исследовании зависимости транспорта COA в клетках ПКП лягушки и крысы от внеклеточного Na+ мы обнаружили, что в первом случае только Na-зависимое накопление флуоресцеина является противоградиентным, тогда как в ПКП крысы при температуре среды инкубации 37-40°С, помимо Na-зависимой, выявляется и Na-независимая компонента активного транспорта COA, и только последняя обнаруживается при температуре ниже 25°С [Бреслер, Никифоров, 1981]. Таким образом, мы имели возможность исследовать действие ацетата на как Na-3a-висимое, так и Na-независимое накопление флуоресцеина в ПКП лягушки и крысы. Поскольку rio влиянию на Na,K-ATtpa3y снижение содержания Na+ в среде аналогично введению в нее уабаииа [Klahr, Hammerman, 1985], а ингибирование уабаином транспорта Na+ в канальцах приводит к изменению метаболического состояния митохондрий в их клетках [Balaban, Mandel, 1980], a priori мы предположили, что возможность реализация стимуляторного действия ацетата на транспорт COA в клетках ПКП зависит от уровня активности Na,K-АТФазы.

В наших опытах ацетат (1-10 мМ) стимулировал как Na- зависимое, так и Na- независимое накопление флуоресцеина в ПКП лягушки и крысы (соответственно). Этот эффект исчезал при понижении концентрации Na+ в среде инкубации или при введении в нее уабаина. Исчезновение эффекта ацетата при инкубации в среде с низким Na+ имело место и при использовании срезов (или кусочков) почек, клетки канальцев в которых были предварительно нагружены этим субстратом в процессе холодовой преинкубации. Ацетат повышал степень восстановленности пиридиннуклеотидов в митохондриях клеток ПКП лягушки при инкубации в стандартной среде (Рис.1А), особенно, в случае кусочков почек, преинкубированных в течение 3 час. Снижение содержания Na+ в среде, как в отсутствие (Рис. 1Б), так и в присутствии (Рис. 1В) ацетата также приводило к восстановлению пиридиннуклеотидов. (Аналогичные данные были получены и на срезах коры почки крысы.) Согласно теории регуляции дыхания по механизму акцепторного контроля, повышение сте-

пени восстановленное™ внутримитохондриальных пиридиннукле-отидов, вызванное снижением активности Ка,К-АТФазы, обусловлено переходом митохондрий в состояние 4 вследствие уменьшения содержания АДФ [К1аЬг, Натшегтап, 1985]. Можно было ожидать, что именно пониженный уровень АДФ ответственен за отсутствие стимуляторного влияния ацетата на накопление СОА в ПКГ1 при инкубации в среде с низким Ка+. При проверке этого предположения оказалось (Рис.2), что после нагрузки клеток канальцев АДФ ацетат стимулирует накопление флуоресцеина и при низком содержании в среде. Значит, снижение уровня АДФ в клетках ПКП в результате ингибирования ИаД-АТФазы приводит к их переходу в

I I Клмтр

I Ацвт

I I 120 N1

ГП 120 N1

Рис.1. Повышение степени вос-становленности пиридиннуклео-тидов в клетках ПКП лягушки ацетатом (ЮмМ) при стандартном и низком содержании ионов натрия в среде.

Исполъзованы свежеприготовленные (I) или преинкубированные в стандартном растворе в течение 3 час (II) кусочки почек. Б - среда без ацетата; В- среда с ацетатом.

£ 60

X 50

X О 40

1 30

л 20

6 10

такое метаболическое состояние, при котором ацетат теряет способность стимулировать накопление СОЛ в ПКП.

□□ Коитр

Ацвт

Рис.2. Стимуляция накопления флуоресцеина в ПКП лягушки в среде с низким содержанием Ма" после нагрузки клеток ацетатом вместе с АДФ.

Кусочки почек были преинкубированы в течение 2 час при 2-4°С в стандартном физиологическом растворе, содержавшем (или не содержавшем) ацетат (10 мМ), АДФ (2.5 мМ) или их комбинацию. Инкубация проводилась в среде с 10 мМ Ыа* без ацетата и АДФ.

Нет

АДФ

Мы получили возможность исследовать механизмы обеспечения энергией транспорта СОА и в условиях активации Иа.К-АТФазы. Изучая влияние солей тяжелых металлов на транспорт СОА в ПКП крысы, мы обнаружили стимуляторное действие Сё2+ на базальное (в среде без субстратов окисления) накопление флуоресцеина (Рис.3). В то время, как Си^ и И^1* дозо-зависимым образом ингибировали накопление флуоресцеина, СсР в концентрациях от 5 мкМ до 1 мМ оказывал достоверное стимулирующее действие. Стимуляция имела место лишь в начальный период инкубации (5-20 мин), сменяясь затем ингибированием. На накопление флуоресцеина в метаболически неактивных канальцах Сс12+ (0.1 мМ) не влиял. Снижение содержания Ыа' в среде (до 10 мМ), как и введение в стандартную среду уаба-

10 100 1000 юооо

Концентрация соло* металлов • еряц* (ии*оль/л)

Рис.3. Стимуляция ионами кадмия базалыюго накопления флуоресцеина в ПКП крысы.

Преинкубация 60 мин в стандартном растворе. Инкубация в стандартной среде.

ина (0.1 мМ), блокировало стимуляторный эффект Cd2+, не влияя на уровень базального накопления флуоресцеина. В случае Na-зависи-мого транспорта СОА в ПКП лягушки Cd2+ в том же диапазоне концентраций и в той же степени, как в ПКП крысы, стимулировал ба-зальное накопление флуоресцеина.

На уровне организма кадмий вызывает серьезные отравления, сопровождающиеся нарушениями функций клеток ПКП [Friberg, 1984], в том числе, ухудшением экскреции СОА [Kim et al., 1988]. На субклеточном уровне Cd2+ ингибирует Na.K-АТФазу и разобщает дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях [Webb, 1979]. В то же время, Cd2+ повышает трансэпителиальную разность потенциалов и ток короткого замыкания в изолированной коже лягушки, стимулируя активный транспорт Na+ [Hillyard, Gonick, 1976]. Сопоставление данных, полученных на субклеточном и тканевом уровнях, привело к предположению о том, что вход Cd2+ в интакт-ные клетки ограничен и его эффекты на клеточном уровне являются результатом влияния внеклеточного Cd2fHa свойства плазматической мембраны, одним из которых может быть проницаемость для Na+ и/или К+ [Taub, Saier, 1979; Jungwirth et al., 1990]. Увеличение входа в клетки как Na+, так и К+ под действием Cd2+ должно приводить к активации Кта,К-АТФазы.

При исследовании механизмов энергетического сопряжения транспорта Na+ в клетках ПКП используется полиеновый антибиотик нистатин [Mandel, 1988]. Стимуляция тканевого потребления кислорода нистатином связана с динамической активацией Na,К- АТФазы вследствие повышения проницаемости клеточной мембраны для Na+ и/или К+ [Harris et al., 1981; Ammann et al., 1990]; при этом скорость

-О- 1го N« --♦ -10 Na

160

140

Рис. 4. Стимуляция нистатином базального накопления флуоресцеина в ПКП крысы.

До начала инкубации срезы преинкубировали в аэрируемом стандартном растворе при 20°С в течение 60 мин.

Величины К/С в контроле без нистатина составляли:

2.68 ±0.07 (120 мМ Na*) 2.64 ±0.06 (10 мМ Na*).

О 50 100 150 200 250

Концентрация нистатина (мямоль/л)

уабаин-чувствительного потребления кислорода клетками ПКП рассматривается как динамический индекс трансцеллюлярного транспорта Na+. При исследовании действия нистатина на базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы мы обнаружили, что нистатин, подобно Cd2+, стимулирует накопление COA в ПКП при инкубации в среде со стандартным Na+ (Рис.4). Диапазон концентраций, при которых наблюдалась стимуляция, был очень узким, а в концентрациях выше 0.1 мМ нистатин ингибировал накопление флуоресцеина. При инкубации срезов в среде с низким содержанием Na+ проявлялся только ингибиторпый эффект нистатина. Стимулирующее влияние нистатина на накопление флуоресцеина имело место лишь в начальный период инкубации (до 30 мин), сменяясь ингибировани-ем при инкубации в течение 45-60 мин. Стимуляция базального накопления флуоресцеина нистатином (и Cd2+) блокировалась уабаи-

Рис. 5. Блокирование уабаином стимулирующего действия нистатина и ионов кадмия па накопление флуоресцеина в ПКП крысы.

Преинкубация (60 мин) и инкубация в стандартной среде. Концентрации: уабаин 0.1 мМ, нистатин 20\хМ, СсР* 0.1 мМ.

ном (Рис.5). Нистатин и Cd2+ стимулировали потребление кислорода клетками в суспензии фрагментов коры почки крысы, и эта стимуляция полностью отменялась уабаином (Рис.6).

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что транспорт СОА в ПКП находится под контролем внутриклеточных аде-нилатов, и зависимость исследуемого транспортного процесса от метаболического состояния клеток связана с активностью Ыа,К-АТФазы - ключевого звена в активной реабсорбции Иа\

Базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы в условиях настоящей работы не изменялось при удалении Ка+ из инкубационной среды или введении в нее уабаина. Поскольку эти маневры приводили к блокированию стимуляторного эффекта ацетата, встал вопрос о том, почему обеспечение энергией транспорта СОА в клетках

ПКП крысы за счет окисления эндогенных субстратов не зависит от активности Ма,К-АТФазы. Исследуя влияние сукцината на транспорт СОА в ПКП крысы, мы обнаружили, что этот субстрат (в концентрациях до 1 мМ) продолжал стимулировать накопление флуо-ресцеина и при удалении Иа+ из среды инкубации или при введении

С(1

Рис. 6. Стимуляция СсР' (А) и нистатином (Б) потребления кислорода суспензией фрагментов коры почки крысы в отсутствие экзогенных субстратов.

Конечные концентрации: СсР+ 0.5 мМ, нистатин 0.1 мМ, уаба-ин 0.1 мМ.

Содержание ткани в полярографической ячейке около 1.5 мг белка/мл.

в нееуабаина. Данные, полученные при совместном применении ацетата и сукцината, указывают на то, что эти субстраты используются как альтернативные источники энергии для транспорта СОА в клетках ПКП крысы. Стимуляторные эффекты сукцината и ацетата при инкубации в среде со стандартным содержанием Кта+ не были адди-

Нет Сук Ацет С* Л Нет Су* Лцег С*А

Рис. 7. Отсутствие аддитивности влияния сукцината и ацетата на накопление флуоресцеина в ПКП крысы.

Использованы срезы, преинкубированные в течение 3 час при 2СРС (А) или свежеприготовленные срезы (Б). Инкубацию проводили в средах с 120 или 10 мМ Ыа\ Концентрации сукцината и ацетата - 0.5 мМ.

гивны в случае как преинкубированных в течение 3 час (Рис.7А), так и свежеприготовленных (Рис.7Б) срезов. При инкубации свежеприготовленных срезов с одновременным присутствием этих субстратов в среде с низким содержанием Na* проявлялся стимуляторный эффект лишь одного из (Рис.7Б): ацетат, не будучи способен стимулировать накопление флуоресцеина в среде с низким содержанием Na+, блокировал эффект сукцината. После преинкубации срезов в течение 3 час, такое влияние ацетата в среде с низким Na+ не проявлялось (Рис.7Б).

Выше мы объяснили блокирование стимулирующего действия ацетата на транспорт СОА в клетках ПКП при снижении активности Ьта,К-АТФазы переходом митохондрий в более восстановленное состояние 4, при котором ЦТК замедляется вследствие понижения активности ПАД-зависимых дсгидрогеназ. Сукцинатдегидрогеназа - ФАД-зависимый фермент, подающий электроны при окислении сукцината в дыхательную цепь на уровне коэнзима Q. Ее активность зависит от степени восстановленности переносчиков электронов, достигая максимума в состоянии 4 [Singer et al., 1972]. Таким образом, можно предполагать, что зависимость эффектов НАД-зависи-мых субстратов окисления (например, ацетата) на транспорт СОА от активности NaJK-АТФазы определяется участком дыхательной цепи пиридиннуклеотиды - флавопротеиды, т.е. пунктом I окислительного фосфорилирования. Мы обнаружили, что базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы резко замедлялось ингибитором окисления жирных кислот с длинной цепью 2-бромопальмитатом независимо от содержания Na+ в среде инкубации. Не зависело от внешнего Na+ и стимулирующее действие пальмитата на накопление флуоресцеина. Очевидно, субстратами окисления, используемыми для обеспечения энергией базального транспорта СОА в клетках Г1КП крысы in vitro, являются эндогенные свободные жирные кислоты, которые, как и сукцинат, способны обеспечивать образование АТФ, поставляя электроны в дыхательную цепь в обход пункта I окислительного фосфорилирования.

2. Роль редокс-потенциала цитоплазмы в регуляции транспорта СОА

Метаболические субстраты в митохондриях клеток ПКП крысы используются для 1) окисления, сопряженного с образованием АТФ, и 2) субстратных взаимопревращений для обеспечения биосинтетических процессов исходным материалом. Распределение метаболических интермедиатов между окислительными и синтетическими процессами контролируется путем реципрокной регуляции двух внут-римитохондриальных реакций, вовлеченных в метаболизм пирува-

та, - пируватдегидрогеназной и пируваткарбоксилазной [Wirthensohn, Guder, 1986]. Активность пируватдегидрогеназного комплекса замедляется при повышении внугримитохондриального отношения АТФ/АДФ, НАДН/НАД+ и/или ацетил-КоА/КоА. В то же время, ацетил-КоА известен как очень мощный активатор пиру-ваткарбоксилазы [Weidemann, Krebs, 1969], занимающей особое место в метаболизме клеток ПКП, поскольку она не только катализирует первую (flux-generating) реакцию на пути образования глюкозы из пирувата или лактата, но и является анаплеротическим ферментом для ЦТК, восполняя убыль (или увеличивая уровень) митохонд-риального оксалоацетата путем карбоксилирования пирувата.

Таблица 1. Влияние лактата, пирувата и ацетата на накопление

флуоресиеина в ПКП крысы и скорости глюконеогенеза и потребления кислорода в суспензии фрагментов коры почки крысы

Субстрат Накопление Потребление Образование глюкозы (мМ) флуоресцеина кислорода (нмоль/мг белка)

(% стимуляции)

Нет 1.89 ±0.14 (17)

Ацетат (1) +24 ±2 (12) +27 + 6 (7) 1.82 ± 0.14 (6)

Лактат (5) +44 + 3 (22) +30 ± 3 (22) 7.39 ± 0.39 (13)

Пируват (5) +27 + 3 (7) +27 ± 4 (17) 7.92 ± 0.52 (13)

До начала инкубации с флуоресцеином или перед началом приготовления суспензии ткань преинкубировали в течение 60 мин при 2(УС в аэрируемом стандартном растворе без субстратов. Срезы и суспензию инкубировали в течение 20 и 30 мин, соответственно. В скобках: для накопления флуоресцеина - число серий по 120-160 измерений в каждой; для потребления кислорода и образования глюкозы - число измерений. Все данные представлены как среднее ±SE.

В рамках модели энергетического сопряжения транспорта СОА по механизму антипорта с КГ постулируется важная роль метаболических трансформаций в реализации стимуляторных эффектов субстратов окисления [Pritchard, Miller, 1993]. Основным метаболическим процессом, связанным с превращениями субстратов, поступающих в клетки ПКП, является ГНГ [Wirthensohn, Guder, 1986; Schoolwerth ct al., 1988]. Мы исследовали влияние глюкогенных субстратов, лактата и пирувата, и ингибиторов ГНГ на накопление СОА и образование глюкозы в ПКП крысы. Для сравнения был использован неглюкогенный субстрат, ацетат. Из данных Таблицы 1 следует,

что лактат оказывал па накопление СОА более сильное стимулирующее действие, чем пируват. По степени влияния на ГНГ и потребление кислорода лактат и пируват не отличались друг от друга. Стимулирующее действие ацетата на накопление флуоресцеина совпадало по величине с эффектом пирувата, а скорость потребления кислорода ацетат стимулировал в той же степени, что и лактат или пируват. Действие лактата на накопление флуоресцеина имело и качественную особенность, проявляясь при инкубации в среде с низким содержанием Иа+, в отличие от эффектов пирувата и ацетата.

Метаболическая трансформация лактата и пирувата в клетках ПКП крысы начинается в митохондриях и в обоих случаях субстратом, поступающим в митохондрии, является пируват. В митохондриях пируват может быть: (I) декарбоксилирован до ацетил-КоА, окисляемого в ЦТК и/или (2) карбоксилирован до оксалоацетата, который вступает в ЦТК или ГНГ [Мапёе!, 1985; \Virthensohn, Оис1ег, 1986]. Для проверки возможной роли активации ЦТК в реализации эффектов исследуемых субстратов на накопление СОА мы использовали ингибитор аконитазы фторацетат. Оказалось (Рис.8), что в

ПЗ Контр

БЕЗ Лак Г~~] Пир па Ацет

Нет

Р-Ацет

Ингибитор в среде >жкубации

Рис. 8. Фторацетат (1 мМ) не блокирует стимулирующее влияние лактата (5 мМ), пирувата (5 мМ) и ацетата (1 мМ) на накопление флуоресцеина в ПКП крысы.

Преинкубация (60 мин) и инкубация в стандартном растворе. В скобках над столбиками указаны величины относительных спишу ляторных эффектов субстратов.

данных условиях (преинкубация срезов в течение 60 мин) фторацетат не только не влиял на базальное накопление флуоресцеина, но и не ослаблял стимулирующее действие лактата. Более того, относительные стимуляторные эффекты ацетата и пирувата на накопление флуоресцеина были достоверно увеличены в присутствии фтораце-тата, хотя фторацетат (1 мМ) заметно снижал ГНГ из лактата, базальное потребление кислорода в суспензии фрагментов и полностью блокировал стимуляцию потребления кислорода лактатом, пи-руватом или ацетатом.

Таким образом, стимулирующее действие лактата и пирувата на транспорт СОА в ПКП крысы вряд ли было связано с активацией ЦТК. Применяя известные нам ингибиторы ГНГ, мы исследовали возможность того, что в реализацию стимуляторного влияния лактата и пирувата на накопление СОА в ПКП крысы вовлечены реакции ГНГ. При проверке влияния ингибиторов на образование глюкозы в суспензии фрагментов коры почки крысы в условиях данной работы, мы получили результаты, характерные для исследований ГНГ на препаратах из почки крысы. В частности, скорость образования глюкозы из лактата и пирувата уменьшалась а-циано-4-гид-роксициннаматом (ЦГЦ), блокатором транспорта пирувата в митохондрии, и [3-фенилпирунатом, ингибитором пируваткарбоксилазы. Хинолинат, ингибирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу (ФЕПКК), снижал скорость ГНГ из лактата более эффективно, чем из пирувата. D-Малат, ингибитор цитоплазматической малатдегид-рогеназы, уменьшал образование глюкозы из пирувата, но увеличивал - из лактата, а ингибитор трансаминаз аминооксиацетат (АОА) снижал ГНГ из лактата, но не из пирувата. При исследовании влияния ингибиторов ГНГ иа действие лактата, пирувата и ацетата на накопление флуорссцеина в ПКП крысы оказалось, что ЦГЦ и фе-нилпируват ослабляли эффекты лактата и пирувата, но усиливали эффект ацетата. Эффект лактата уменьшался в присутствии хиноли-ната, но возрастал на фоне D-малата (в тех же направлениях изменялась скорость образования глюкозы из лактата под действием этих ингибиторов). Хинолинат предотвращал эффект пирувата, не влияя на эффект ацетата, а D-малат полностью блокировал эффекты пирувата и ацетата.

Итак, только D-малат блокировал действие неглюкогенного субстрата ацетата на накопление флуоресцеина в ПКП крысы. В то же время, в ряде случаев стимуляторные эффекты лактата и пирувата модифицировались ингибиторами ГНГ по-разному. Видимо, это связано с тем, что пути ГНГ из лактата и пирувата расходятся на мито-хондриалыюм этане. Основное отличие путей образования глюкозы из лактата и пирувата состоит в способах снабжения цитоплазмы клеток восстановительными эквивалентами (в форме НАДН), необходимыми на этапе восстановительного синтеза глицеральдегид-3-фосфата - цитоплазматический НАД+ восстанавливается в реакциях с участием лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы при образовании глюкозы из лактата и пирувата, соответственно [Krebs et al., 1967]. Если в клетках ПКП крысы, как и в гепатоцитах крысы [Williamson et al., 1967], редокс-потенциал цитоплазмы регулируется парой вышеназванных реакций, находящихся вблизи отравновесия,

введение лактата в среду инкубации приводит к повышению отношения концентраций НАДН/НАД+ в цитоплазме [Cornell et al., 1974].

Предположение о зависимости транспорта СОАв ПКП отредокс-потенциала цитоплазмы может объяснить как более сильное (по сравнению с пируватом) влияние экзогенного лактата на накопление флуоресцеина, так и отличия в модифицирующем влиянии некоторых ингибиторов ГНГ на эффекты этих субстратов. Поскольку лак-тат и пируват уравновешены по сторонам базолатеральной мембраны клеток ПКП, можно искусственно регулировать цитоплазмати-ческий редокс-потенциал клеток, изменяя отношение их концентраций в среде инкубации [Sistare, Haynes, 1985; Veech, 1987]. Оказалось, что уровень накопления флуоресцеина в ПКП крысы достоверно возрастал при повышении отношения концентраций лактат/пируват в среде. В соответствии с нашим предположением феназинметосуль-фат (ФМС) - акцептор электронов, способный химически окислять НАДН, снижал уровень базального накопления флуоресцеина в ПКП крысы. Введение в среду метаболических субстратов приводило к ослаблению ингибиторного влияния ФМС, но только лактат полностью его преодолевал. Таким образом, можно предполагать, что стимулирующее влияние лактата на накопление флуоресцеина в ПКП крысы может быть опосредовано повышением степени восстановленное™ пиридиннуклеотидов в цитоплазме клеток. Зависимостью от редокс-потенциала цитоплазмы может быть объяснено и стимулирующее действие пирувата на транспорт СОА в ПКП крысы, поскольку эффект пирувата блокировался D-малагом (как уже упоминалось, в присутствии экзогенного пирувата восстановительные эквиваленты в цитоплазме образуются в реакции с участием цитоплаз-матической малагдегидрогеназы).

При исследовании влияния ингибиторов ГНГ на стимуляторные эффекты лактата и пирувата мы обнаружили, что ЦГЦ, фенилниру-ват и D-малаг ингибируют базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы. Такое влияние могло бы быть следствием их конкуренции с флуоресцеином за транспортные переносчики. Однако величина этих ингибиторных эффектов не снижалась при повышении концентрации флуоресцеина в среде инкубации, как это должно быть в случае конкуренции. Мы сопоставили влияние тестируемых ингибиторов на накопление флуоресцеина, потребление кислорода, образование глюкозы и тканевое содержание лактата, пирувата и АТФ (Таблица 2). Ни один из них не уменьшал образование глюкозы из эндогенных субстратов и содержание АТФ в суспензии фрагментов коры почки крысы. Хинолинат, ЦГЦ и АОА снижали скорость базального потребления кислорода, но действие на потребление кис-

лорода и накопление флуоресцеина не совпадало по знаку. Ингиби-рование базального накопления флуоресцеина ЦГЦ, фенилпирува-.том и Б-малатом происходило на фоне снижения отношения концентраций лактат/ гшруват в клетках ПКП, что свидетельствует о сдвиге цитоплазматических пиридиннуклеотидов в сторону большей окисленности. В согласии с предположением о зависимости базального транспорта СОА от редокс-потенциала цитоплазмы находится и тот факт, что ФМС заметно снижал уровень базального накопления флуоресцеина в ПКП крысы. Действие Б-малата на базальное накопление флуоресцеина можно трактовать как указание на то, что в отсутствие экзогенных субстратов восстановительные эквиваленты в цитоплазме клеток ПКП крысы образуются в малатдегидроге-назной реакции. На фоне ФМС не проявлялись ни ингибирующее влияние Б-малата, ни стимулирующее действие АОА на базальное накопление флуоресцеина; при этом Б-малат блокировал стимуля-торный эффект АОА (Рис.9). Кроме того, эффект АОА исчезал, а малата - заметно ослаблялся в присутствии ингибитора пируваткар-боксилазы фенилпирувата.

4----------------------Рис.9. Блокирование

ФМС действия А О А и О-малата на базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы.

Преинкубация (60 мин) и инкубация в стандарт-пом растворе.

ФМС 0.02 мМ; АОА 1 мМ; фенилпируват (ФП) 1 мМ; О-малат (О-Мал) 2 Нет ФИО ФП ММ.

Ингибиторы и с роде ичвубачии А+М - А О А +0-МаЛЦГП.

Контр

АОА

EZD D-Мал

Таким образом, базальное накопление СОА в ПКП крысы, видимо, зависит от редокс-потснциала цитоплазмы, и замедляется агентами, ингибирующими образование глюкозы из нирувата - ЦГЦ, фенилпируватом и D-малатом. Эти ингибиторы могли бы действовать на базальный транспорт СОА, влияя на аэробный гликогено-лиз, однако известно [Mandel, 1985; Wirthensohn, Guder, 1986], что запас гликогена в клетках ПКП крысы слишком мал для обеспечения энергией клеточных функций в опытах in vitro. Жирные кислоты с длинной цепью- основные эндогенные субстраты окисления в ПКП [Weidemann, Krebs, 1969] - не могут служить предшественниками глю-

Таблица 2. Сравнение влияния исследуемых ингибиторов на накопление флуоресиеина. потребление кислорода, образование глюкозы и содержание метаболитов

Ингибитор (м.М) Изменение Содержание (нмоль/мг белка) Лак/ Пир

накопления флуоресцеина потребления кислорода глюкозы АТФ лактата пирувата

Нег 1.9 ±0.1 (17) 6.4 ±0.7 (19) 7.8 ±0.6 (22) 0.31 ±0.03 (23) 25

Э-Малат (2) -34 ±2 (16) -3 ±4(18) 2.1 ±0.2(5) 4.9 ±1.0 (6) 6.6 ±0.5 (9)' 0.46 ±0.07 (8) 14

ЦГЦ (0.1) -56 ±2 (5) -20 + 4(8) 2.3 + 0.3(6) 8.4 ±0.7 (9) 7.7 ±0.6 (15) 0.64 ±0.09 (13)" 12

Фенилпируват (1) -52 ±2 (10) -4 ±3(6) 2.3 ±0.6(3) 10.9 ± 1.5(6)*" 10.1 ±0.9(15)' 1.04 ±0.10 (13)'" 10

Фенил сукцииат (1) -39 ± 3 (8) -18 ±3(7) 6.9 ±0.8 (8) 7.5 ± 1.3(9) 0.43 ± 0.06 (8) 18

Хинолинат (2) +1 ±3(6) -14 ± 4 (11) 1.9 ±0.8(3) 6.0+1.8(6) 9.1 + 1.5(10)' 0.41 ±0.09(6) 22

АОА (1) +22 ±2 (12) -18 ±4 (9) 1.6 ±0.5(3)

Ь-Циклосерин (1) +22(2) 6.1 ±1.0(6) 7.7 ±0.7 (6) 0.29 ±0.05 (6) 27

До начала приготовления суспензии фрагментов коры, как и перед инкубацией с флуоресцеином, срезы коры почки крысы были преинкубированы при 20-22"С в течение 60 мин. Продолжительность инкубации с флуоресцеином (0.05 мМ) 20 мин; продолжительность инкубации суспензии 30 мин. В скобках указаны: для накотения флуоресцеина - число отдельных серий по 120-160 измерений в каждой; в остальных случаях число отдельных определений. Данные представлены как средние ± Б.Е. Уровень значимости различий по сравнению с соответствующим контролем: *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001.

(Поскольку А О А способен образовывать комплексы с кето-кислотами, при определении содержания метаболитов был использован другой ингибитор трансаминаз, Ь-циклосерин)

жет образовываться путем трансаминирования из некоторых аминокислот (главным образом, из аланина) [Хочачка, Сомеро, 1988]. Однако, в случае вовлечения этого пути в обеспечение энергией транспорта СОА в клетках ПКП крысы ингибиторы трансаминаз АОА и L-циклосерин вряд ли стимулировали бы накопление флуоресцеина. Кроме всего прочего, эндогенный пируват не может рассматриваться в качестве предшественника глюкозы в отсутствие экзогенных субстратов, поскольку ни один из исследованных ингибиторов не влиял на базальный ГНГ в ПКП крысы.

Выход из этой ситуации, видимо, следует искать, исходя из предположения о том, что в клетках ПКП крысы, так же как и в гепато-цитах крысы [Meijer, Williamson, 1974], поддержание редокс-потен-циала цитоплазмы не сопряжено конституционально с метаболическими путями ГНГ, а происходит благодаря функционированию «ба-зальных» процессов, участвующих в переносе восстановительных эквивалентов через мембрану митохондрий. Поскольку скорость обмена малата между митохондриями и цитоплазмой в клетках ПКП

Цитозоль

иш

Пир '

ОН

Фн

Мал <-

Митохондрия

АТФ

—> Пир ■

ЩУК

он

ФП НАДИ

> 1ИД

Фн

•Мал

- Мал

ФС

Рис.10. Схема экспорта восстановительных эквивалентов в цитоплазму при функционировании футильного цикла с участием оксалоа-цетатдекарбоксилазы.

1 -малатдегидрогеназа; 2-оксалоацетатдекарбоксилаза.

ЩУК (щавелевоуксусная кислота) - оксаяоацетат; Пир - пируват; Мал - Ь-малат

ЦГЦ - цианогидроксициинамат; ХК- хииолинат; ФП - фенилпиру-ват, ФС - фенилсукцинат;

Э-М- й-малат.

крысы намного выше скорости образования глюкозы [Rognstad, 1970], вполне вероятно существование т.н. футильных циклов субстратных взаимопревращений. Наличие трех циклов, связанных с рециркуляцией малата и пирувата через мембрану митохондрий, постулировано для клеток ПКП крысы: (1) пируват- оксалоацетат-малат-оксалоацетат-фосфоенолпируват- пируват с участием пируват-киназы [Rognstad, Katz, 1972]; (2) пируват- оксалоацетат- малат- пируват с участием малик-фермента [Watford et al., 1980] и (3) пируват-оксалоацетат- малат- оксалоацетат- пируват с участием оксалоаце-татдекарбоксилазы [Janssens et al., 1980] (Рис.10). Поскольку во все три цикла вовлечены пируваткарбоксилаза и пируватный и дикар-боксилатный переносчики, они должны замедляться фенилпирува-том, ЦГЦ и фенилсукцинагом. Вероятно, в разных ситуациях могут функционировать разные циклы. Для объяснения наших данных, полученных в отсутствие экзогенных субстратов, лучше других подходит футильный цикл, изображенный на Рис.10, т.к. базальное накопление флуоресцеина ингибируется D-малатом, но не хинолина-том. Хинолинат блокирует стимулирующее влияние пирувата на накопление флуоресцеина, поэтому можно предполагать, что футильный цикл с участием ФЕГ1КК и пируваткиназы вносит основной вклад в транспорт восстановительных эквивалентов в цитоплазму при введении пирувата в инкубационную среду.

Выше мы заключили, что влияние Cd21" на транспорт СОА в ПКП крысы связано с изменением метаболического состояния митохондрий. Поскольку Cd21 и нистатин стимулировали тканевое потребление кислорода клетками ПКП крысы, можно было ожидать ак-

СИконтр C3cd □ Нист

Рис.11. Блокирование фто-рацетатом (1 мМ) ималона-том (10 мМ) стимулирующего действия нистатина (0.02 мМ) и ионов кадмия (0.1 мМ) на базальное накотьчение флуоресцеина в ПКП крысы.

•■ч ■ а:

Преинкубация (60 мин) и инкубация в стандартном растворе.

Нет F-Ацет Малом

Ингибиторы в среде инкубации

тивации окислительных процессов под действием этих агентов. Из данных Рис.11 следует, что стимуляторные эффекты Cd2+ и нистатина блокируются ингибиторами аконитазы, фторацетатом, и сук-цинатдегидрогеназы, малонатом. Следовательно, в присутствии Cd2+ и нистатина активность ЦТК становится лимитирующим звеном в энергизации транспорта СОА в ПКП крысы. Эти агенты сильнее тормозили образование глюкозы из пирувата, чем из лактата, свидетельствуя о более окисленном состоянии митохондрий. Дыхание клеток канальцев, стимулированное нистатином, лимитировано подачей восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь [Harris et al., 1981], так что экзогенный лактат используется преимущественно как субстрат окисления [Gullans et al., 1984]. Б наших опытах Cd2+ терял способность стимулировать накопление флуоресцеина в присутствии лактата, но не пирувата. Следовательно, активация ЦТК под влиянием Cd2f приводит к стимуляции ба-зального накопления СОА более сложным образом, чем просто через ускорение образования АТФ. Отсутствие аддитивности эффектов Cd2f и лактата указывает на зависимость эффекта Cd2+ от ре-докс-потенциала цитоплазмы. Об этом же свидетельствуют и данные о том, что эффект Cd2t (и нистатина) блокировался ФМС. Кроме того, влияние Cd2+ на накопление флуоресцеина в ПКП крысы отменяли ЦГЦ, фенилпируват и D-малат, тогда как хинолинат на него не влиял.

Итак, стимулирующее влияние Cd2+ (и нистатина) на базальное накопление СОА в ПКП крысы связан как с активацией ЦТК (действие фторацетата и малоната), так и с функционированием фу-тильного цикла с участием оксалоацетатдекарбоксилазы (эффекты ЦГЦ, фенилпирувата и D-малата, но не хинолината). Эти условия могут быть выполнены одновременно, если ЦТК, "разорванный" на этапе малатдегидрогеназной реакции, "вставлен" в вышеназванный футильный цикл (Рис.10). Динамическая активация Иа,К-АТФазы нистатином (или Cd2+) вызывает переход митохондрий в более окисленное состояние 3 [Harris et al., 1981; Soltoff, Mandel, 1984], при котором восстановление оксалоацетата до ма-лата в митохондриях становится затруднено (поэтому Cd2+ сильнее ингибирует ГНГ из пирувата, чем из лактата). Оксалоацетат, образованный из пирувата в пируваткарбоксилазной реакции, будет преимущественно использоваться в реакции с участием цит-ратсинтазы, и малат- "переносчик" восстановительных эквивалентов - может образовываться только при протекании реакций ЦТК в прямом направлении. В цитоплазме, малатдегидрогеназа

окисляет малат до оксалоацетата, который, в свою очередь, де-карбоксилируется при участии оксалоацетатдекарбоксилазы до иирувата, вход которого в митохондрии замыкает цикл.

3. Роль внутриклеточного КГ в регуляции транспорта СОЛ в ПКП крысы Исследуя влияние ингибиторов ГНГ, мы обнаружили стимулирующее действие ингибитора трансаминаз АОА на базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы (Таблица 2). Поскольку аналогичное действие оказывал другой ингибитор трансаминаз, L-цикло-серин, не проникающий, в отличие от АОА, в митохондрии [Meijer, Van Dam, 1974], мы предположили, что влияние АОА на транспорт COA связано с ингибированием цитоплазматической реакции с участием аспартатаминотрансферазы: Аспартат + КГ Глутамат + Оксалоацетат. Снижение уровня оксалоацетата в цитоплазме должно приводить к сдвигу малатдегидрогеназной реакции в сторону окисления малата и ускорению процесса восстановления НАД+. Следовательно, стимуляторный эффект АОА может быть объяснен зависимостью базального транспорта COA от редокс-потенциала цитоплазмы, что подкрепляется данными о блокировании D-малатом и ФМС влияния АОА на накопление флуоресцеина (Рис.9). С другой стороны, одним из субстратов цитоплазматической аспартатаминотрансферазы является КГ - "физиологический" противоанион в антипорте СОА/дикарбоксилат через базолатеральную мембрану клеток

О Нет EZ3 АОА CD AOA+Li

-м-

н"

г*

м..

10 20 30 Продолжительность инкубации (мин)

Рис.12. Ослабление стимулирующего влияния А О А (1 мМ) на базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы в присутствии ЫС1 (5 мМ) в среде инкубации.

Преишубация (60 мин) и инкубация в стандартном растворе.

ПКП. Таким образом, влияние АО А на базальное накопление флуо-ресцеина может быть опосредовано повышением уровня КГ в цитоплазме. Используя то обстоятельство, что обратное накопление КГ в клетках ПКП блокируется ионами лития [Pritchard, 1990], мы могли проверить такую возможность. Оказалось, что Li+ (1-5 мМ), не влияя на базальное накопление флуоресцеина, блокировал стимулирующее действие экзогенного КГ (0.5 мМ). Холодовая преинкуба-ция срезов с 2 мМ КГ приводила к существенному увеличению уровня накопления флуоресцеина при 20-мин инкубации, а введение LiCl (5 мМ) в среду инкубации блокировало эффект КГ, свидетельствуя о том, что его обратный симпорт с Na+ необходим для устойчивой стимуляции накопления COA. Данные Рис.12 показывают, что стимулирующее влияние АОА на базальное накопление флуоресцеина в ПКП крысы, практически одинаковое при продолжительности инкубации 10, 20 и 30 мин (стимуляция на 31%, 25% и 29%, соответственно), резко уменьшалось по величине (до 15%, 7% и 9%, соответственно) на фонеЫ+(5 мМ) в среде инкубации. Поэтому можно предполагать, что обратный транспорт КГ в клетки необходим для реализации стимуляторного влияния АОА на базальный транспорт COA в ПКП. В подтверждение этого предположения, стимуляторные эффекты АОА (или L-циклосерина) и экзогенного КГ, совпадая по величине, не суммировались.

В рамках "обменной" модели повышение цитоплазматического уровня КГ является достаточным условием для стимуляции базаль-ного транспорта COA в ПКП [Pritchard, 1995]. Для проверки этого постулата важно было найти вещества, которые не являясь субстратами окисления, могут влиять на метаболизм КГ, повышая его уровень в цитоплазме. Исследуя влияние метаболических ингибиторов на накопление флуоресцеина в ПКП крысы, мы обнаружили стиму-ляторный эффект пент-4-еноата, который представлял особый интерес, поскольку в опытах на изолированных ПКП собаки было обнаружено[Со1^оих et al., 1992], что, ингибируя образование глюкозы, пент-4-еноат повышал содержание КГ в клетках. Аналогично действию другого нефротоксичного агента, кадмия, пент-4-еноат (0.5 мМ) не стимулировал накопление флуоресцеина в среде с низким содержанием Na+ и снижал ГНГ из пирувата, но не из лактата.

Сравнение данных о влиянии используемых в работе метаболических ингибиторов на эффекты пент-4-еноата и Cd2+ на накопление флуоресцеина привело к выводу о том, что несмотря на несовпадение внутриклеточных мишеней действия этих агентов, реализация их эффектов на накопление COA опосредована общим этапом. Таким этапом может быть повышение уровня КГ в цитоплазме клеток

ПКП, тем более, что как Cd2+, так и пент-4-еноат вызывают достоверное увеличение внутриклеточного содержания КГ в ПКП крысы (Таблица 3). Данные таблицы характеризуют изменения содержания КГ в клетке в целом, тогда как только его цитоплазматический уровень является регуляторным параметром для транспорта СОЛ. Тем не менее, они показывают, что влияние пент-4-еноата и СсР специфично в отношении внутриклеточного метаболизма КГ. Эффект пент-4-еноата не суммировался с эффектами КГ или АОА, а введение 1лС1 (5 мМ) в среду инкубации приводило к резкому ослаблению стимулирующего влияния пент-4-еноата (и С(Р) на базальное накопление флуоресцеина. Исходя из этих данных, мы предполагаем, что стимуляция базального накопления флуоресцеина в ПКП крысы под действием пент-4-еноата и СсР может быть опосредована повышением уровня КГ в цитоплазме.

Таблииа 3. Влияние пент4-еноата, малеата и ионов кадмия на содержание метаболитов в ПКП крысы

Ингибитор (мМ) КГ Глутамат Малат Аммоний

Контроль 0.199 ±0.020 11.5± 1.2 1.65 ±0.31 18.3 ± 1.3

4-ПК, 1 мМ 0.265 ± 0.015* 11.4 ±0.5 1.61 ±0.32 50.1 ±3.2*

Cd2+, 0.1 мМ 0.308 ±0.021* 13.0 ±1.8 1.18 ± 0.19 47.0 ±6.6*

Малеат, 1 мМ 0.315 ±0.075* 11.7 ± 0.7 1.70+0.26 57.7 ±8.0*

Перед приготовлением суспензии срезы коры почки были преинку-бированы при 20°С в течение 60 мин. Продолжительность инкубации 30 мин. Результаты, выраженные в мкмоль/г белка, представлены в виде средних + S.E (п—5). Статистически значимые различия (метод Бонферони) (р<0.05) отмечены звездочкой.

Мы также исследовали влияние на базальный транспорт COA со стороны малеата, который, как известно [обзор: Bergeron, Gougoux., 1989], аналогично пент-4-еноату и Cd2', в опытах in vivo проявляет себя как нефротоксичный агент. Малеат (0.1-1 мМ) Na-зависимым образом стимулировал накопление флуоресцеина в ПКП крысы и увеличивал внутриклеточное содержание КГ (Таблица 3). Влияние малеата на накопление флуоресцеина заметно ослаблялось в присутствии Li+. Введение малеата интактным животным, хотя и сопровождается развитием синдрома Фанкони, не приводит к резким изменениям структуры и свойств плазматических мембран клеток ПКП [Pouliot et al., 1992]. Кажется вероятным, что развитие патологического ответа является результатом каких-то функциональных сдви-

гов. Данные нашей работы дают основание предполагать, что эффекты агентов, вызывающих синдром Фанкони, могут быть связаны с влиянием на метаболизм КГ в клетках ПКП.

Отдельный интерес представлял вопрос об участии реакций ЦТК в реализации стимулирующего действия интермедиатов ЦТК на транспорт СОА. При исследовании влияния интермедиатов ЦТК на реабсорбцию жидкости в ПКП крысы было высказано предположение о том, что обеспечение энергией осмотических процессов не требует активации цикла как единого целого [Maude, 1970]. Ряд данных, полученных в последнее время, указывают на то, что скорости отдельных реакций ЦТК в клетке могут различаться в несколько раз [Yudkoff et al., 1994; Des Rosiers et al., 1995]. Значит, цикл в значительной степени «открыт» для притока и оттока интермедиатов. Развитие эффектов разных интермедиатов на клеточные функции может вовлекать различающиеся сателлитные (для ЦТК) метаболические пути. Для их выявления мы исследовали влияние ингибиторов некоторых реакций цикла на стимулирующее действие интермедиатов ЦТК на накопление флуоресцеина. В Таблице 4 приведены величины относительных эффектов интермедиатов ЦТК на накопление флуоресцеина на фоне ингибиторов. Ингибитор аконитазы, фтора-цетат, снижал или блокировал эффекты всех интермедиатов, кроме КГ. На фоне ингибитора сукцинатдегидрогеназы, малоната, не проявлялись стимуляторные эффекты цитрата, КГ и сукцината, тогда как фумарат и малат продолжали стимулировать накопление флуоресцеина, а ингибитор а-кетоглутаратдегидрогсназы, 5-метоксиин-дол-2- карбоксилат, блокировал только эффект сукцината.

Представленные данные соответствуют представлению о том, что для обеспечения энергией транспорта СОА в ПКП крысы не требуется функционирование ЦТК как единого целого - достаточно активации его отдельных участков. Принимая во внимание возможную обратимость митохондриальной (НАД-зависимой) изоцитратдегид-рогеназы [Des Rosiers et al., 1994] и учитывая местоположение в цикле ферментов- мишеней для используемых ингибиторов, можно предположить, что одним из митохондриальных событий, опосредующих стимуляцию накопления флуоресцеина интермедиатами ЦТК, является образование изоцитрата и его транспорт в цитозоль. При этом открывается возможность повышения уровня КГ в цитоплазме за счет его образования из изоцитрата под действием цитоплазматической (НАДФ-зависимой) изоцитратдегидрогеназы. В таком случае, стимулирующее влияние интермедиатов ЦТК на накопление флуоресцеина в ПКП крысы могут быть объяснены в рамках "обменной" модели транспорта СОА.

Таблииа 4. Влияние фторацетата, малоната и 5-метоксииндол-2-карСюксилапш на действие интермедиатов цикла трикарбоновых кислот на накопление флуоресиеина и скорость образования глюкозы

Действие субстратов Влияние ингибиторов

Субстраты на накопление на скорость образования

и ингибиторы флуоресцеина глюкозы из субстратов

в контроле на фоне в концентрации

ингибиторов 0.5 мМ 2 мМ

Цитрат +35

+фторацетат + 18 -32" -23

+малонат -4* -53 -66

+МИКК +37 -22 -29

сс-Кетоглутарат +25

+фтор ацетат +41 -29 -23

+малонат -15 -64 -60

+МИКК + 107 -12* -1*

Сукцинат +26

+фторацетат -2* -44 -43

+малонат 0 -47 -60

+МИКК -4* -20 -10*

Фу Марат +23

+фторацетат -6* -18 -30

+малонат + 17 -43 -54

+МИКК +22 -12* -16*

Малат +23

+фторацетат -13 -39 -32

+малонат +34 -43 -73

+МИКК + 15 +18* -6*

До инкубации с флуоресцеином и субстратами и перед приготовлением суспензии фрагментов внешней коры почки крысы срезы преинку-бировали в аэрируемой среде без метаболических субстратов при 2(УС в течение 3 час. Концентрации: интермедиаты 0.5 мМ, фторацетат 1 мМ, малонат 10 мМ, 5-метоксииндол-2-карбоксилъная кислота (МИКК), 0.05 мМ. Все эффекты, кроме отмеченных (*), достоверно (р<0.05) отличаются от нуля.

Скорость начальных стадий ЦТК существенна для обеспечения энергией ГНГ из всех без исключения исследованных субстратов, как это следует из того факта, что фторацетат снижает скорость образования глюкозы независимо от места вхождения субстратов в цикл

(Таблица 4). Вариабельность влияния 5-метоксииндол-2-карбокси-лата на ГНГ в зависимости от субстрата позволяет предполагать, что функционирование цикла как целого при этом совершенно необязательно. Обычно, в качестве метаболического пути превращения интермедиатов ЦТК в глюкозу рассматривают цепь реакций, включающую выход малата из митохондрий и его окисление цитоплаз-матической малатдегидрогеназой до оксалоацетата [Wirthensohn, Guder, 1986; Schoolwerth et al., 1988]. Однако, возможен и другой путь, при котором углеродный скелет для образования глюкозы экспортируется из митохондрий в виде цитрата, с образованием оксалоацетата в цитоплазме при участии АТФ-зависимой цитратлиазы [Des Rosiers et al., 1995]. Этот путь ГНГ (с протеканием некоторых реакций ЦТК в обратном направлении), очевидно, должен ингибировать-ся фторацетатом. Как известно [Weidemann, Krebs, 1969], для препаратов коры почки крысы в опытах in vitro характерна высокая скорость оборота эндогенных триглицеридов. Источником ацетил-КоА, необходимого для синтеза жирных кислот с длинной цепью в цитоплазме клеток ПКП, служит экспортируемый из митохондрий цитрат, при расщеплении которого цитратлиазой, помимо ацетил-КоА, образуется оксалоацетат [Wirthensohn, Guder, 1986]. Поскольку окса-лоацетат является участником аспартатаминотрансферазной реакции, метаболический путь, связанный с выходом цитрата из митохондрий, также может рассматриваться как один из механизмов контроля за цитоплазматическим уровнем КГ в клетках ПКП крысы.

Таким образом, можно предполагать, что несколько метаболических путей могут быть задействованы в регуляции цитоплазмати-ческого уровня КГ в клетках ПКП крысы. Это предположение соответствует представлению о том, что метаболические субстраты в клетках ПКП пе просто используются в качестве "топлива" для производства АТФ и генерации восстановительных эквивалентов, но и служат регуляторными параметрами для многих метаболических процессов, в результате чего их введение в среду инкубации в опытах in vitro приводит к субстрат- специфичным перестройкам энергетического метаболизма [Mandel, 1985].

Заключение

При обсуждении результатов мы выделили метаболические параметры, такие как активность ТМа,К-АТФазы, степень восстановленное™ пиридиннуклеотидов и уровень КГ в цитоплазме, которые, по нашему мнению, выступают в роли регуляторных факторов транспорта COA в клетках ПКП. Необходимость учитывать процессы, связанные с функционированием митохондрий, затрудняет обсуждение механизмов регуляции транспорта COA, т.к. приходится про-

слеживать связь транспортной активности с потоками метаболических реакций, к тому же компартментализованных. С другой стороны, это дает основание для рассмотрения проблемы обеспечения энергией специализированной транспортной функции клеток с точки зрения теории регуляции метаболических процессов [Atkinson, 1977; Хочачка, Сомеро, 1988], исходя из предположения о существовании единой многоуровневой системы регуляции клеточного метаболизма. На наш взгляд, рассмотрение механизмов энергетического контроля за работой системы транспорта СОА в ПКП следует вести на основе предположения о наличии единой многоуровневой системы регуляции клеточного метаболизма. Можно полагать, что иерархия подсистем энергетического контроля определяется степенью значимости клеточных функций для обеспечения гомеостаза на организ-менном и клеточном уровнях. Если условно разделить специализированные клеточные функции на необходимые для нормальной жизнедеятельности самой клетки («внутренние») и вносящие вклад в обеспечение физиологических процессов («внешние»), то кажется очевидным, что система регуляции клеточного метаболизма запрограммирована на выполнение специфичных для данной клетки «внешних» функций. Функции, служащие нуждам самой клетки («внутренние»), обеспечивают базис для исполнения надстроечных, «внешних» функций и становятся лимитирующими, видимо, лишь при определенных патологических состояниях и некоторых экспериментальных условиях.

Предполагается [Atkinson, 1977], что координирующим механизмом регуляции энергетического метаболизма клеток является аде-нилатный контроль, нацеленный на поддержание неравновесного отношения концентраций АТФ/АДФ и осуществляемый посредством кинетического регулирования всех метаболических цепей (как утилизирующих АТФ, так и ведущих к его образованию) со стороны адениновых нуклеотидов. Вторым по степени значимости (после отношения концентраций АТФ/АДФ) регуляторным параметром в клетках является отношение НАДН/НАД+, характеризующее внутриклеточный редокс- потенциал. Отношение НАДН/НАД+ в митохондриях, с одной стороны, контролируется отношением АТФ/АДФ, а с другой стороны, регулирует скорость транспорта электронов по дыхательной цепи, контролируя тем самым отношение АТФ/АДФ. Редокс-потенциал цитоплазмы, поддерживаемый при участии митохондрий, контролирует многие реакции, в которых пиридиннуклео-тиды выступают как ко-факторы или субстраты. Третий уровень регуляции связан с доступностью метаболических субстратов: гоме-остатируемым параметром является отношение ацетил-КоА/КоА в

матриксе митохондрий; при этом ацетил-КоЛ выступает в роли ал-лостерического регулятора многих метаболических процессов. Эти уровни системы контроля клеточного метаболизма взаимосвязаны таким образом, что пиридиннуклеотиды и ацетил-КоА усиливают локальный аденилатный контроль вместе с некоторыми метаболическими интермедиатами, являющимися одновременно ключевыми субстратами нескольких биохимических цепей (к ним относятся, пи-руват, цитрат, оксалоацетат). Благодаря наличию такой взаимосвязи, изменение концентрации одного метаболического интермедиата может привести к кардинальной перестройке клеточного метаболизма с «включением» протяженных метаболических путей.

В рамках модели энергетического сопряжения транспорта COA в клетках ПКП по механизму антипорта COA/КГ зависимость исследуемого транспортного процесса от активности Ыа,К-АТФазы объясняют значением трансмембранного градиента Na+для поддержания градиента КГ [Pritchard, Miller, 1993]. При таком подходе участие внутриклеточных аденилатов в регуляции транспорта COA очевидно. Однако, согласно нашим данным, роль аденилатной системы контроля в метаболической регуляции транспорта COA, в первую очередь, обусловлена тем, что активность NaДС-АТФазы - основной функциональной нагрузки в клетках ПКП [Soltoff, 1986]- является фактором, определяющим энергетический статус митохондрий. Влияние активности ^'а,К-АТФазы на метаболическое состояние митохондрий осуществляется по механизму акцепторного контроля через изменение концентрации свободного АДФ в цитоплазме клеток ПКП, видимо, при участии каких-то цитоплазматических процессов, выступающих в роли усилителя сигнала [Balaban, 1990]. Участие митохондрий в регуляции транспорта COA связана с зависимостью цитоплазматического уровня КГ от экспорта метаболических интер-медиатов, таких как малат, изоцитрат и/или цитрат, из митохондри-ального матрикса. В образование и транспорт этих интермедиатов вовлечены процессы, лежащие в основе механизмов поддержания редокс-потенциала цитоплазмы клеток ПКП и, в то же время, являющиеся этапами метаболических путей синтеза глюкозы и жирных кислот. Эти процессы находятся под контролем аденилатного статуса клетки, редокс-потенциала митохондрий и внутримитохондриаль-ного отношения концентраций ацетил-КоА/КоА: от метаболического состояния митохондрий зависит не только транспорт метаболических интермедиатов через митохондриальную мембрану [Schoolwerth, LaNoue, 1985], но и сама возможность протекания внутримитохонд-риальных биохимических реакций, сопряженных с экспортом восстановительных эквивалентов [Mandel, 1985].

Малат, изоцитрат и цитрат, экспортируемые из митохондрий, прямо или опосредованно вовлекаются в систему околоравновесных реакций, регулирующую редокс-потенциал цитоплазмы. Участие КГ в качестве субстрата в околоравновссной аспартатаминотрансфераз-ной реакции позволяет предполагать, что отношение концентраций КГ/оксалоацетат в цитоплазме клеток ПКП крысы является гомеос-татируемым параметром, поскольку аспартатаминотрансфераза через продукт реакции - оксалоацетат- сопряжена с парой околоравновесных цитоплазаматических реакций, лактатдегидрогеназной и малатдегидрогеназной. Как известно [Veech, 1987], изменение потока любой из реакций, образующих околоравновесную систему, приводит к изменению потоков сопряженных реакций и изменению уровня вовлекаемых в эти реакции метаболических интермедиатов. Таким образом, можно рассматривать цитоплазматический КГ как ре-докс-чувствительный интермедиат, тем более, что этот дикарбокси-лат непосредственно вовлечен в НАД(Ф)-зависимую реакцию с участием цитоплазматической изоцитратдегидрогеназы.

Конкретные пути снабжения цитоплазмы клеток ПКП восстановительными эквивалентами варьируют in vitro в зависимости от метаболического состояния митохондрий и доступности метаболических субстратов. Функциональное или фармакологическое ингиби-рование какого-либо из этих путей приводит, видимо, к мгновенному перераспределению метаболических потоков по другим путям. В результате, в разных экспериментальных условиях в качестве лимитирующего звена могут выступать разные процессы. В частности, можно ожидать, что вклад обратного -симпорта КГ с Na+ в поддержание его цитоплазматического уровня в клетках ПКП крысы становится заметным (что проявляется как блокирующее действие ионов лития) лишь в том случае, когда экспорт из митохондрий углеродного скелета для образования КГ становится лимитирующим процессом.

Выводы

1. Активность Ыа,К-АТФазы является одним из основных факторов в механизмах метаболической регуляции как Na-зависимого, так и Na-независимого транспорта слабых органических анионов (СОА) в проксимальных канальцах почек (ПКП) лягушки и крысы (соответственно) в опытах in vitro. Ингибироваиие Na,K-AT-Фазы приводит к блокированию стимулирующего действия ацетата (и других НАД+-зависимых субстратов окисления) на накопление маркерного органического аниона, флуоресцеина, в результате падения внутриклеточного уровня АДФ. Влияние ацетата (как экзогенного, так и образующегося при окислении этанола)

не связано с активацией цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Уабаин- чувствительная стимуляция транспорта флуоресцеина в ПКП лягушки и крысы ионами кадмия или нистатином опосредована динамической стимуляцией №,К-АТФазы и требует активации ЦТК.

2. Стимулирующее влияние ФАД-зависимых субстратов окисления (сукцинат и жирные кислоты) на транспорт флуоресцеина в ПКП крысы не зависит от активности №,К-АТФазы. Сукцинат и ацетат являются альтернативно используемыми метаболическими субстратами в механизмах обеспечения энергией исследуемой транспортной системы, что может быть объяснено особенностями функционирования дыхательной цепи при окислении НАД- и ФАД-зависимых субстратов и отражает зависимость транспорта COA в клетках ПКП от редокс- состояния митохондрий.

3. Отличия в условиях реализации стимулирующего влияния лакта-та, пирувата и ацетата на транспорт COA в ПКП крысы могут быть объяснены зависимостью исследуемого транспортного процесса от окислительно- восстановительного состояния цитогшаз-матических пиридиннуклеотидов. Модулирующее влияние веществ, известных как ингибиторы глюконеогенеза, как на базаль-ное, так и на стимулированное метаболическими субстратами накопление флуоресцеина, обусловлено тем, что начальные этапы глюконеогенеза в клетках ПКП крысы совпадают с процессами, контролирующими редокс-потенциал цитоплазмы.

4. Для реализации стимулирующего влияния интермедиатов ЦТК на транспорт COA в ПКП крысы не требуется активация цикла в целом - достаточным условием является ускорение потока реакций на отдельных участках. Развитие стимуляторного эффекта а-кетоглутарата (КГ) происходит без участия митохондрий, тогда как эффекты других интермедиатов ЦТК на исследуемый транспортный процесс, видимо, опосредованы внутримитохондриаль-ным образованием малата, цитрата и/или изоцитрата.

5. Результаты работы находятся в соответствии с общепринятой моделью, согласно которой транслокация COA в клетки ПКГ1 осуществляется по механизму антипорта с цитоплазматическим КГ при участии ОАТ транспортера. Стимуляция накопления флуоресцеина в ПКП крысы под влиянием ионов кадмия, пент-4-ено-вой или малеиновой кислот сопровождается повышением уровня КГ в клетках и блокируется в присутствии ионов лития, ингиби-рующих, как известно, обратный транспорт КГ в клетки. Фармакологический анализ эффектов субстратов окисления (ацетат, лактат, пируват, интермедиаты ЦТК) на транспорт флуоресцеи-

на в ПКП крысы показывает, что они также могут быть опосредованы возрастанием уровня КГ в цитоплазме.

6. В поддержание уровня КГ в цитоплазме клеток ПКП вовлечены биохимические процессы, вследствие чего транспорт СОА находится под контролем регуляторных параметров, таких как аде-нилатный статус клетки, редокс-потенциал митохондрий и цитоплазмы и внутримитохондриальный уровень ацетил-КоА, относящихся к системе регуляции клеточного энергетического метаболизма.

Список цитируемой литературы Наточин Ю.В. Ионорегулирующая функция почки. JI.: Наука. 1976. -ХочачкаП., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. 1988. - Ammann Н., Hoel J., Boulanger Y., Vinay P. Relationship between intracellular ATP and the sodium pump activity in dog renal tubules// Can. J.Physiol.Pharmacol. 1990. V.68. P.57-67. - Atkinson D.E. Cellular Energy Metabolism and Its Regulation. New York: Academic Press. 1977. -Balaban R.S. Regulation of oxidative phosphorylation in the mammalian cell/ / Amer.J.Physiol. 1990. V.258. P.C377-C389. - Balaban R.S., Mandel L.J. Coupling of aerobic metabolism to active ion transport in the kidney// J.Physiol.,bond. 1980. V.304. P.331-348. - Bergeron M., Gougoux A. The renal Fanconi syndrome// In: The metabolic basis of inherited disease. (Scriver

C.R., Beaudet W.S., Valle D. eds.) New York: McGraw Hill. 1989. P.2569-2580. - Bergmcyer H.U. Methods of Enzymatic Analysis. New York, London: Verlag Chemie Weinham. 1974. - Chad wick D.W. Concentration-effect relationships of valproic acid// Clin.Pharmacokinet. 1985. V.10. P. 155-163 -Chen X., Tsukaguchi II., Chen X.-Z., Berger U.V., Hedigcr M.A. Molecular and functional analysis of SDCT2, a novel rat sodium-dependent dicarboxylate transporter// J.Clin.Invcst. 1999. V.103. P.1159-1168. - Cornell N.W., Lund P., Krebs ILA. The effect of lysine on gluconeogenesis from lactate in rat hepatocytes//Biochem.J. 1974. V. 142. P.327-337. - Des Hosiers C., Di Donato L., Comtc В., Laplante A., Marcoux C., David F., Fernandez C.A., Brunengraber H. Isotopomer analysis of citric acid cycle and gluconeogenesis in rat liver. Reversibility of isocitrate dehydrogenase and involvement of ATP-citrate lyase in gluconeogenesis// J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.10027-10036. - Des Rosiers C., Fernandez C.A., David F., Brunengraber H. Reversibility of the mitochondrial isocitrate dehydrogenase reaction in the perfused rat liver. Evidence from isotopomer analysis of citric acid cycle intermediates// J.Biol.Chem. 1994. V.269. P.27179-27182. - Friberg L. Cadmium and the kidney//Environ.Health Perspect. 1984. V.54. P.l-11. - Gougoux A., Zan N., Danscreau D., Vinay P. Metabolic effects of 4-pentenoate on isolated dog kidney tubules// Kidney Intern. 1992. V.42. P.586-594. - Guder W.G., Siess E., Wieland O.H. Studies on glucose synthesis in rat kidney cell suspensions/ / FEBS Lett. 1969. V.3. P.31-33. - Gullans S.R., Brazy P.C., Dennis V.W., Mandel L.J. Interactions between gluconeogenesis and sodium transport in rabbit proximal tubule// Amer.J.Physiol. 1984. V.246. P.F859-F869. - Haberle

D. A. Characteristics of p-aminohippurate transport in the mammalian kidney/ / In: Renal Transport of Organic Substances (Greger R. ed.) Berlin: Springer. 1981. P. 189-209. - Harris S.I., Balaban R.S., Barrett L., Mandel L.J. Mitochondrial respiratory capacity and Na+- and K+-dependent adenosine triphosphate-mediated ion transport in the intact renal cell// J.Biol. Chem. 1981. V.256. P. 10319-10328. - Hillyard S.D., Gonick H.C. Effects of Cd^ on short-circuit current across epithelial membranes. I.Interactions with Ca++ and vasopressin on frog skin// J.Membrane Biol. 1976. V.26. P. 109-119. -Jacquemin E., Hagenbuch В., Stieger В., Wolkoff A.W., Meier P.J. Expression cloning of a rat liver Na-independent organic anion transporter//

Proc.N. Y.Acad.Sci. 1994. V.91. P. 133-137. - Janssens P., Hems R., Ross B.D. The metabolic fate oflactate in renal cortical tubules// Biochem.J. 1980. V.190. P.27-37. - Jungwirth A., Paulmichl M., LangF. Cadmium enhanced potassium conductance in cultured renal epitheloid (MDCK) cells// Kidney Intern. 1990. V.37. P. 1477-1486. - Kim Y.K., Choi J.K., Kim J.S., Park Y.S. Changes in renal functions in cadmium- intoxicated rats// Pharmacology and Toxicology 1988. V.63. P.342-350. - Klahr S., Hammermann M. Renal metabolism// In: The Kidney: Physiology and Pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press. 1985. P.699-718. - Krebs H. A., Gasqoyne T., Notion B.M. Generation of extramitochondrial reducing power in gluconeogenesis// Biochem.J. 1967. V.102. P.275-282. - Lopez-Nieto C.E., You G., Busk K.T., Barros E.J., Beier D.R., Nigam S.K. Molecular cloning and characterization of NKT, a gene product related to the organic cation transporter family that is almost exclusively expressed in the kidneyII J.Biol.Chem, 1997. V.272. P.6471-6478. - Mandel L.J. Metabolic substrates, cellular energy production, and the regulation of proximal tubular transport// Annu. Rev.Physiol. 1985. V.47. P.85-101. - Mandel L.J. Bioenergetics of membrane transport processes// In: Membrane Physiology (Andreoli T.E., Hoffman J.F., Fanestil D.D., Schultz S.G. eds.) New York: Plenum Medical Book Company. 1988. P.295-310. -Markwell M.A.K., Haas S.M., Beiler L.L., Tolbert M.E. A modification of Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples// Analyt.Biochem. 1978. V.87. P.206-210. - Maude D.L. Effect of substrates and inhibitors of tricarboxylic acid cycle on proximal tubular fluid transport in vitro// Biochim.Biophys.Acta 1970. V.215. P.216-219. - Meijer A.J., Van Dam K. The metabolic significance of anion transport in mitochondria//' Biochim.Biophys.Acta 1974. V.346. P.213-244. - Meijer A .J., Williamson J.R. Transfer of reducing equivalents across the mitochondrial membrane. I. Hydrogen transfer mechanisms involved in the reduction of pyruvate to lactate in the isolated liver cells// Biochim.Biophys.Acta 1974. V.333. P. 1-11. - Moller J.V., Sheikh M.I. Renal organic anion transport system

- pharmacological, physiological and biochemical aspects// Pharmacol. Rev. V. 1983. V.34. P.315-358. - Pouliot J.-F., Gougoux A., Beliveau R. Brush border membrane proteins in experimental Fanconi's syndrome induced by 4-pentenoate and maleate// Can. J.Physiol. Pharmacol. 1992. V. 70. P.1247-1253.

- Pritchard J.B. Rat renal cortical slices demonstrate p-aminohippurate/ glutarate exchange and sodium/glutarate coupled p-aminohippurate transport/ / J. Pharmacol. Exp.Ther. 1990. V.255.P.969-975. - Pritchard J.B. Intracellular alpha-ketoglutarate controls the efficacy of renal organic anion transport// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1995. V.274. P.1278-1284. - Pritchard J.B., Miller D.S. Mechanisms mediating renal secretion of organic anions and cations// Physiol.Rev. 1993. V.73. P.765-796. - Race J.E., Grassl S.M., Williams W.J., Holtzman E.J. Molecular cloning and characterization of two novel human renal organic anion transporters (hOATl and hOAT3)// BBRC 1999. V.255. P.508-514. - Rognstad R Gluconeogenesis in the kidney cortex. Flow of malate between compartments// Biochem.J. 1970. V.116. P.493-502. - Rognstad R.,

Katz J. Gluconeogenesis in the kidney cortex. Quantitative estimation of carbon flowII J.Biol.Chem. 1972. V.247. P.6047-6054. - Saito H., Masuda S., Inui K.-I. Cloning and functional characterization of a novel rat organic anion transporter mediating basolateral uptake of methotrexate in the kidney// J.Biol.Chem. 1996. V.271. P.20719-20725. - Schoolwerth A.C., LaNoue K.F. Transport of metabolic substrates in renal mitochondria// Annu.Rev.Physiol.

1985. V.47. P. 143-171. - Schoolwerth A.C., Smith B.C., Culpepper R.M. Renal gluconeogenesis// Miner.Electrolyte Metab. 1988. V.14. P.347-361. -Sekine T., Watanabe N., Hosoyamada M., Endou H. Expression cloning and characterization of a novel multispecific organic anion transporter// J.Biol.Chem. 1997. V.272. P.18526-18529. - Silverman J.A. Multidrug-resistance transporters// Pharm.Biotechnol. 1999. V.12. P.353-386. - Singer T.P., Gutman M., Kearney E.B. Regulation of succinate dehydrogenase// In: Biochemistry and Biophysics of Mitochondrial Membranes (Azzone G.F., Carafoli E., Lehninger A.L., Quagliariello E. eds.) New York:: Academic Press. 1972. P.41-65. - Sistare F.D., Haynes R.C. The interaction between the cytosolic pyridine nucleotide redox potential and gluconeogenesis from lactate/ pyruvate in isolated rat hepatocytes. Implications for investigations of hormone action/! J.Biol.Chem. 1985. V.260. P. 12748-12753. -SoltoffS.P. ATP and the regulation ofrenal cell function// Annu.Rev.Physiol. 1986. V. 48.P.9-31. - Soltoff S.P., Mandcl L. J. Active ion transport in the renal proximal tubule. I. Transport and metabolic studies// J. Gen. Physiol. 1984. V.84. P.601-622. - Sweet D.H., Miller D.S., Pritchard J.B. Localization of an organic anion transporter-GFP fusion construct (rROATl-GFP) in intact proximal tubules// Amer.J.Physiol. 1999. V.276. P.F864-F873. - Taub M., Saier M.H. Regulation of 22Na transport by calcium in an established kidney epithelial cell line// J.Biol.Chem. 1979. V.254. P. 11440-11444. - Ullrich K.J. Renal transporters for organic anions and organic cations. Structural requirements for substrates// J.Membrane Biol. 1997. V.158. P.95-107. - Veech R.L. Pyridine nucleotides and control of metabolic processes// In: Pyridine Nucleotide Coenzymes. Chemical, Biochemical and Medical Aspects, pt.B. 1987. P.79-104. - Watford M., Vinay P., Lemieux G., Gougoux A. The regulation of glucose and pyruvate formation from glutamine and citric-acid-cycle intermediates in the kidney cortex of rats, dogs, rabbits and guinea pigs// Biochem.J. 1980. V.188. P.741-748. - Webb M. Interactions of cadmium with cellular components// In: The Chemistry, Biochemistry and Biology of Cadmium (Webb M. ed.) Amsterdam: Elsevier. 1979. P.285-340. - Weidemann M.J., Krebs H.A. The fuel of respiration of rat kidney cortex// Biochem.J. 1969. V.112. P.149-166. - Williamson D.H., Lund P., Krebs H.A. The redox-state of free nicotinamide- adenine nucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver// Biochem.J. 1967. V. 103. P.514-527. - Wirthensohn G., Guder W.G. Renal substrate metabolism// Physiol.Rev.

1986. V.66. P.469-497. - Yudkoff M., Nelson D., Daikhin Y., Erecinska M. Tricarboxylic acid cycle in rat brain synaptosomes. Fluxes and interactions with aspartate aminotransferase and malate/aspartate shuttle// J.Biol.Chem. 1994. V.269. P.27414-27420.

Список основных публикаций по теме диссертации

I .Бреслер В.М., Никифоров А.А. Транспорт органических кислот через плазматические мембраны. JL: Наука. 1981. 203с.

2.Можаева М.Г.. Скульский И.А., Никифоров А.А., Бреслер В.М. Влияние неорганических ионов на транспорт органической кислоты в канальцах почки крысы//Цитология. 1981. Т.23. С.660-665.

3.Можаева М.Г., Бреслер В.М., Никифоров А.А. Влияние искусственных градиентов NaCl и КС! на активный транспорт органических кислот в леэнергизованных проксимальных канальцах почки I. Градиент NaCl// Цитология. 1982. Т.24. С.673-679.

4.Можаева М.Г.. Бреслер В.М.. Никифоров А.А. Влияние искусственных градиентов NaCl и КС1 на активный транспорт органических кислот в деэнергизованных проксимальных канальцах почки. II. Градиент КС1//Цитология. 1982. Т.24. С.811-814.

5.Никифоров А. А. Влияние ацетата на Na-независимый транспорт органической кислотьг в проксимальных канальцах почки крысы// Цитология. 1982. Т.24. С.449-456.

6.Nikiforov А.А. Effect ofacetate on transport of organic acid (fluorescein) in renal proximal tubules of frog// Biochim.Biophys.Acta 1982. V. 686. P.36-46,

7.Bresler V.M.. Mozhayeva M.G.. Nikiforov A. A. The role of CI in organic acid active transport in renal proximal tubules of rat// Gen.Physiol.Biophys. 1983. V. 2. P.39-50.

8.Никифоров A.A.. Бреслер В.М. Стимулирование кадмием Na-не-зависимого транспорта органической кислоты в почечных канальцах// Цитология. 1984. Т.26. С.75-82.

9.Никифоров А.А. Стимулирующее действие кадмия на Na-зэви-симый транспорт органической кислоты в почке лягушки// Цитология. 1985. Т.27. С.834-837.

Ю.Никифоров А.А. Зависимость от кальция стимулирующего действия кадмия на транспорт органической кислоты в почке лягушки/ / Цитология. 1985. Т.27. С.887-894.

II .Бреслер В.М.. Никифоров А.А. Проблемы и перспективы применения микроспектрофлуориметрии для изучения трансмембранного транспорта// В кн.: Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии. Л.. Наука. 1987. С.22-25.

12.Nikiforov A. A., Ostretsova I.B. Effects of inhibitors of gluconeogenesis on weak organic acid uptake in rat renal tubules// Biochem.Pharmacol. 1992. V. 44. P.2213-2221.

13.Nikiforov A.A.. Ostretsova I.B. Stimulatory effect of ethanol on weak organic acid uptake in rat renal tubules// Biochem.Pharmacol. 1994a. V. 47. P.821-825.

14.Nikiforov A. A., Ostretsova I.B. Stimulation of weak organic acid uptake in rat renal tubules by cadmium and nystatin// Biochem.Pharmacol. 1994b. V. 47. P.815-820.

15-Nikiforov A.A.. Ostretsova I.B. Pent-4-enoic acid stimulates weak organic acid uptake ill rat renal tubules in vitro// J.Physiol.Lond. 1994. V. 48IP. P.35P.

16.Никифоров A.A.. Остреиова И.Б. Транспорт слабых органических кислот и глюконеогенез в проксимальных канальцах почки// Цитология 1995. Т. 37. С.390.

17. Nikiforov A. A. Stimulation by aminooxyacetate of fluorescein uptake in rat renal tubules in vitro: role of intracellular alpha-ketoglutarate// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1995. V. 274. P. 1204-1208.

18.Никифоров A.A.. Острецова И.Б. Влияние метаболических субстратов и ингибиторов на транспорт слабых органических анионов в проксимальных канальцах почки крысыII Росс, физиол. журн. им.-И.М.Сеченова. 1997. Т.83. С. 165-111.

19.Ostretsova I.B., Nikiforov A.A. Weak organic acid uptake in rat renal tubules in vitro: stimulation by pent-4-enoic acidИ Сотр. Biochem. Physiol. 1997. V. 117C. P. 1-6.

2Q./agryadskayaH.L Ostretsova I.В.. Nikiforov A.A. Inhibitory effect of valproate on weak organic acid uptake in rat renal proximal tubules// Biochem.Pharmacol. 1999. V. 58. P.1371-1377.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Никифоров, Анатолий Александрович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика ПКП

1.2. Методы исследования механизмов секреции COA в ПКП

1.3. Этапы секреции COA в ПКП

1.4. Кинетические аспекты транспорта COA в ПКП

1.5. Зависимость транспорта COA от энергетического метаболизма

1.6. Влияние физико-химических факторов на транспорт COA

1.7. Механизмы сопряжения транспорта COA с энергетическим метаболизмом клеток ПКП

Часть 2. Материалы и Методы

2.1. Регистрация накопления флуоресцеина в ПКП

2.1.1. Почка лягушки

2.1.2. Почка крысы

2.1.2.1. Метаболически активные канальцы

2.1.2.2. Метаболически неактивные канальцы

2.1.3. Определение концентрации флуоресцеина, накопленного в ПКП

2.2. Определение степени восстановленности митохондриальных пиридиннуклеотидов

2.3. Оценка состояния клеток ПКП в срезах коры почки крысы

2.4. Определение содержания метаболитов в ПКП крысы

2.4.1. Получение суспензии фрагментов коры почки крысы

2.4.2. Измерение концентрации метаболитов

2.5. Регистрация потребления кислорода суспензией фрагментов коры почки крысы

2.6. Оценка жизнеспособности фрагментов коры почки крысы

2.7. Статистическая обработка и воспроизводимость результатов

2.8. Реактивы

Часть 3. Результаты и Обсуждение

3.1. Роль №,К-АТФазы в метаболической регуляции транспорта COA

3.1.1. Влияние ацетата на Na-зависимое накопление флуоресцеина в ПКП лягушки

3.1.2. Влияние ацетата на Na-независимое накопление флуоресцеина в ПКП крысы

3.1.3. Влияние этанола на накопление флуоресцеина в ПКП крысы

3.1.4. Влияние ионов кадмия на накопление флуоресцеина в ПКП лягушки и крысы

3.1.5. Влияние сукцината на накопление флуоресцеина в ПКП крысы роль редокс-состояния митохондрий

3.2. Роль редокс-потенциала цитоплазмы в регуляции транспорта COA в ПКП крысы

3.2.1. Влияние ингибиторов ГНГ на эффекты лактата и пирувата на накопление флуоресцеина

3.2.2. Влияние ингибиторов ГНГ на базальное накопление флуоресцеина

3 .2.3. Влияние ингибиторов ГНГ на стимуляторный эффект ионов кадмия на базальное накопление флуоресцеина

3 .2.4. Влияние ингибиторов ГНГ на эффект этанола на накопление флуоресцеина

3 .3. Роль внутриклеточного КГ в регуляции транспорта COA в ПКП крысы

3.3.1. Влияние ингибиторов аспартатаминотрансферазы на базальное накопление флуоресцеина

3.3.2. Влияние пент-4-еновой кислоты на базальное накопление флуоресцеина

3.3.3. Влияние вальпроата на накопление флуоресцеина

3 .3 .4. Влияние интермедиатов ЦТК на накопление флуоресцеина

3.3.5. Влияние ингибиторов ГНГ на накопление флуоресцеина в среде с низким содержание Na+

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система метаболической регуляции транспорта слабых органических анионов в клетках проксимальных канальцев почки"

Наиболее известным примером транспортных систем второго типа являются работающие за счет гидролиза АТФ переносчики семейств Gpl70 и MRP, которые откачивают из клеток большую группу лекарственных веществ и известны в связи с явлением так называемой множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток [Silverman, 1999]. Велика роль подобных транспортных систем (например, локализованных в нейроэпителии хориоидного сплетения мозга и в эндотелии сетчатки глаза) в удалении конечных продуктов обмена из жидкостей, отделенных гисто-гематическими барьерами, путем однонаправленного трансцеллюлярного переноса органических веществ в кровь [Бреслер, Никифоров, 1981]. И, наконец, важная роль в механизмах поддержания постоянства внутренней среды организма принадлежит транспортным системам, обеспечивающим очищение плазмы крови от ненужных и вредных веществ посредством их экскреции в почках и печени [Pritchard, Miller, 1993].

Отличительными чертами процесса почечной экскреции органических соединений являются его высокая эффективность и широкий спектр веществ, воспринимаемых как транспортные субстраты [Ullrich, 1997]. Данные молекулярно-биологических работ свидетельствуют, что в процесс почечной экскреции органических веществ вовлечен целый ряд полипептидных транспортеров, обладающих сродством к химическим соединениям разных групп [Jacquemin et al., 1994; Saito et al., 1996; Lopez-Nieto et al., 1997; Masuda et al., 1997; Sekine et al., 1997; Sweet et al., 1997]. К ним относится и так называемая классическая мультиспецифичная система (ОАТ система в современной классификации) транспорта веществ, собирательно именуемых слабыми органическими анионами (COA), локализованная в почках только в клетках проксимальных канальцев [Sekine et al., 1997; 1998; Sweet et al., 1997; Race et al., 1999].

В литературе, посвященной изучению транспорта COA в проксимальных канальцах почки (ПКП), острую полемику всегда вызывал вопрос о движущей силе их противоградиентной транслокации через базолатеральную плазматическую мембрану внутрь клеток- лимитирующего этапа трансэпителиального переноса [Haberle, 1981; Бреслер, Никифоров, 1981; Moller, Sheikh, 1983]. В настоящее время наиболее обоснованной выглядит схема, согласно которой противоградиентное накопление COA в клетках ПКП происходит по механизму антипорта с а-кетоглутаратом (КГ), цитоплазматический уровень которого поддерживается за счет его обратного симпорта с Na+ и/или его образования из других интермедиатов [Pritchard, Miller, 1993]. В последнее время получены данные, позволяющие предполагать, что антипорт с КГ осуществляют упоминавшиеся выше ОАТ транспортеры, а в симпорте КГ с Na+ участвуют SDCT2 транспортеры [Chen et al., 1999]. В рамках этой модели, транспорт COA в ПКП является третично-активным по способу сопряжения с энергетическим метаболизмом клеток - движущую силу противоградиентного переноса COA через базолатеральную мембрану создает направленный навстречу градиент КГ, величина которого, в свою очередь, зависит от градиента Na+, создаваемого ИаД-АТФазой. В то же время, активность НаД-АТФазы является основным детерминантом в энергетическом метаболизме клеток ПКП - уровень активного трансцеллюлярного транспорта Na+ не только зависит от скорости протекания процессов окислительного обмена, сопряженных с образованием АТФ, но и в значительной степени определяет энергетический статус клеток через влияние на метаболическое состояние митохондрий [Наточин, 1976; Balaban, 1990]. Следовательно, в регуляцию транспорта COA в ПКП через влияние как на внутриклеточный метаболизм КГ, так и на величину градиента Na+ на базолатеральной мембране неизбежно должны быть вовлечены метаболические процессы. Механизмы зависимости транспорта COA в клетках ПКП от клеточного энергетического метаболизма до наших работ оставались практически неизученными, что в немалой степени можно было объяснить отсутствием адекватных экспериментальных моделей для исследований такого рода.

2. Используя возможности фармакологической и функциональной модуляции скорости транспорта Na+, исследовать роль активности Ма,К-АТФазы в механизмах сопряжения транспорта COA с энергетическим метаболизмом клеток ПКП.

Научная новизна работы: Впервые на уровне интактных клеток изучена роль митохондрий в обеспечении энергией транспорта органических веществ в ПКП: показано, что транспорт COA в клетках ПКП регулируется в зависимости от (1) окислительно-восстановительного (редокс) состояния митохондрий, (2) потоков внутримитохондриальных реакций с участием пируваткарбоксилазы, аспартатаминотрансферазы и малатдегидрогеназы и (3) активности систем транспорта метаболических интермедиатов через внутреннюю мембрану митохондрий (малат-аспартатный челночный механизм и дикарбоксилатный, трикарбоксилатный, а-кетоглутаратный и пируватный переносчики).

Теоретическое и практическое значение работы: В работе дано обоснование нового подхода к изучению зависимости специализированной транспортной функции клетки от энергетического метаболизма, заключающегося в том, что механизмы метаболической регуляции рассматриваются как система связей с внутриклеточными процессами, обеспечивающих "встроенность" исследуемой транспортной системы в клеточный энергетический метаболизм. Анализ результатов проведен на основе представления о том, что, как и при регуляции биохимических процессов [Atkinson, 1977], регуляторными факторами для транспорта COA в клетках ПКП являются аденилатный статус клетки, редокс-потенциал митохондрий и цитоплазмы и уровень ацетил-КоА в митохондриях.

Разработанная экспериментальная модель может быть применима для исследования механизмов влияния чужеродных веществ на почечный транспорт и метаболизм, в том числе, побочных эффектов лекарственных препаратов, на уровне интактных клеток. При использовании в качестве одного из фармакологических агентов вальпроата, широко применяемого при лечении эпилепсии [Chadwick, 1985], в работе показано, что этот терапевтический препарат не только замедляет транспорт других органических анионов, конкурируя с ними за транспортные переносчики, но и воздействует на энергетический обмен в клетках ПКП, влияя на метаболизм пирувата. Обнаружено, что малеат, пент-4-еноат и ионы кадмия, вызывающие, как известно [Bergeron, Gougoux, 1989], нарушение процессов реабсорбции Сахаров, аминокислот и фосфата в клетках ПКП при хроническом применении, в краткосрочных опытах in vitro стимулируют транспорт COA на фоне повышения внутриклеточного содержания КГ. Дальнейшие исследования в этом направлении могут пролить свет на роль метаболических сдвигов в развитии нефротоксических эффектов. Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Полученные данные находятся в соответствии с теоретической моделью, согласно которой транспорт COA в клетки ПКП сопряжен с энергетическим метаболизмом по механизму антипорта с КГ через базолатеральную плазматическую мембрану.

2. Роль КГ в энергетическом сопряжении транспорта COA в ПКП обусловливает участие метаболических процессов в контроле этой специализированной клеточной функции, что проявляется как зависимость транспорта COA от аденилатного статуса 9 клетки, окислительно-восстановительного потенциала митохондрий и цитоплазмы и от доступности метаболических субстратов. 3. Относительный вклад процессов внутриклеточного образования КГ и его обратного симпорта с Na' в поддержание градиента КГ - движущей силы транспорта СОА через базолатеральную мембрану - варьирует в зависимости от условий, в которых находятся клетки.

Апробация работы: Материалы работы были представлены на: советско-финском симпозиуме по биомембранам (Ленинград, 1981); IX всесоюзном совещании по эволюционной физиологии памяти Л.АОрбели (Ленинград, 1986); всесоюзном семинаре "Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии" (Ленинград, 1987); VIII всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевого обмена (Харьков, 1989); всероссийском симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994); семинаре факультетов физиологии и фармакологии Медицинской школы Университета штата Нью-Йорк (Buffalo, 1994); семинаре секции сравнительной фармакологии мембран и внутриклеточной регуляции Национального института здоровья США (Research Triangle Park, 1994); симпозиуме физиологического общества Великобритании (Aberdeen, 1994); XXXIII международном конгрессе по физиологическим наукам (Санкт-Петербург, 1997).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Никифоров, Анатолий Александрович

5. Результаты работы находятся в соответствии с общепринятой моделью, согласно которой транслокация COA в клетки ПКП осуществляется по механизму антипорта с цитоплазматическим КГ при участии ОАТ транспортера. Стимуляция накопления флуоресцеина в ПКП крысы под влиянием ионов кадмия, пент-4-еновой или малеиновой кислот сопровождается повышением уровня КГ в клетках и блокируется в присутствии ионов лития, ингибирующих, как известно, обратный транспорт КГ в клетки. Фармакологический анализ эффектов субстратов окисления (ацетат, лактат, пируват, интермедиаты ЦТК) на транспорт флуоресцеина в ПКП крысы показывает, что они также могут быть опосредованы возрастанием уровня КГ в цитоплазме.

6. В поддержание уровня КГ в цитоплазме клеток ПКП вовлечены биохимические процессы, вследствие чего транспорт COA находится под контролем регуляторных параметров, таких как аденилатный статус клетки, редокс-потенциал митохондрий и цитоплазмы и внутримитохондриальный уровень ацетил-КоА, относящихся к системе регуляции клеточного энергетического метаболизма.

В заключение, следует отметить, что выводы проведенного в работе анализа, направленного на выявление метаболических путей, вовлеченных в регуляцию транспорта COA в ПКП, применимы только для почки крысы. Клетки ПКП почек представителей разных видов позвоночных отличаются в отношении организации метаболических процессов, участвующих в образовании глюкозы, что обусловлено различиями в распределении между цитоплазмой и митохондриями одного из ключевых ферментов ГНГ, фосфоенолпируваткарбоксикиназы (ФЕПКК) [обзор: Wirthensohn, Guder, 1986]. Поэтому механизмы контроля редокс-потенциала и поддержания уровня КГ в цитоплазме могут быть видоспецифичными. В эксперименте, это может проявляться отличиями в действии метаболических субстратов на накопление COA в ПКП почек представителей разных видов. Тем не менее, можно полагать, что общие принципы метаболической регуляции транспорта COA в ПКП универсальны. В нашей работе показано, что зависимость исследуемого транспортного процесса от аденилатного статуса клетки и редокс-потенциала митохондрий одинаковым образом проявляется на препаратах почек лягушки и крысы. Одной из задач будущих исследований является изучение роли редокс-потенциала цитоплазмы и митохондриального ацетил-КоА в регуляции транспорта COA в почках представителей других видов позвоночных.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Никифоров, Анатолий Александрович, Санкт-Петербург

1. БерхинЕ.Б. Секреция органических веществ в почке. Л.: Наука. 1979.156с.

2. Бреслер В.М., Качман АН., Никифоров А.А. Прямое микрофлуориметрическое изучение прохождения органической кислоты через клетки проксимальных канальцев переживающей почки лягушки Rana temporaria// Журн.эвол.биохим. и физиол. 1976. Т. 12. С. 120-127.

3. Бреслер В.М., Наточин Ю.В. Угнетение секреции флуоресцеина в проксимальных канальцах почки лягушки (прижизненное исследование методом контактной микроскопии)//Бюлл.экспер.биол. и мед. 1973. Вып.6, С.67-69.

4. Бреслер В.М., Никифоров А.А. Кинетический анализ механизмов Na-зависимого транспорта органических кислот в проксимальных канальцах переживающей почки лягушки. I. Транспорт флуоресцеина и уранина в безнатриевой среде// Цитология. 1977а. Т. 19. С.82-89.

5. Бреслер В.М., Никифоров А.А. Активный транспорт органических кислот в проксимальных канальцах переживающей почки крысы в норме и при некоторых воздействиях. I. Влияние температуры, условий аэрации и ионов Na// Цитология. 1978. Т.20. С.1005-1011.

6. Бреслер В.М., Никифоров А. А. Транспорт органических кислот через плазматические мембраны. Л.: Наука. 1981. 203с.

7. Дынник В В. Регуляция цикла трикарбоновых кислот. В сб. Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. Новосибирск: Наука. 1987. С. 113-129.

8. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. М.: Мир. 1974. 957с.

9. Мелвин-Хьюз Э.А. Физическая химия. М.: Изд.иностр.лит. 1962. Т.1.

10. Можаева М.Г., Никифоров А.А., Бреслер В.М. Характеристика Na-зависимой системы активного транспорта слабых органических кислот в проксимальных канальцах переживающей почки степной черепахи//Цитология. 1980. Т.22. С.938-943.

11. Можаева М.Г., Бреслер В.M., Никифоров А.А. Влияние искусственных градиентов NaCl и КС1 на активный транспорт органических кислот в деэнергизованных проксимальных канальцах почки I. Градиент NaCl// Цитология. 1982. Т.24. С.673-679.

12. НаточинЮ.В. Ионорегулирующая функция почки. Л.: Наука. 1976.

13. Никифоров А. А. Сравнительное изучение систем активного транспорта органических кислот через клеточные слои у амфибий и млекопитающих// Автореф. дисс. канд. биол. наук. Ленинград. 1978.

14. Никифоров А. А. Влияние ацетата на Na-независимый транспорт органической кислоты в проксимальных канальцах почки крысы// Цитология. 1982. Т.24. С.449-456.

15. Никифоров А. А. Стимулирующее действие кадмия на Na-зависимый транспорт органической кислоты в почке лягушки// Цитология. 1985. Т.27. С.834-837.

16. Никифоров А. А., Бреслер В.М. Стимулирование кадмием Na-независимого транспорта органической кислоты в почечных канальцах// Цитология. 1984. Т.26. С.75-82.

17. Никифоров А.А., Острецова И.Б. Влияние метаболических субстратов и ингибиторов на транспорт слабых органических анионов в проксимальных канальцах почки крысы//Росс, физиол. журн. им.И.М.Сеченова. 1997. Т.83. С. 165-177.

18. Ньюсхолм Э,, Старт К. Регуляция метаболизма. М.: Мир. 1977. 397с.

19. Резниченко Г.И., Рудзит Э.А. Влияние условий инкубации на накопление пенициллина срезами коркового слоя почек кролика// Антибиотики. 1971. Т. 16. С.940-944.

20. Рудзит Э.А., Резниченко Г.И. Накопление пенициллина в срезах коркового слоя почек//Антибиотики. 1967. Т. 12. С.506-509.

21. ХочачкаП., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир. 1988. 568с.

22. Adkison K.D., Shen D.D. Uptake of valproic acid into rat brain is mediated by a medium-chain fatty acid transporter// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1996. V. 276. P. 1189-1200.

23. Alston T.A. Suicide substrates for mitochondrial enzymes// Pharmacol.cmd Ther. 1981. V. 12. P.1-41.

24. Ammann HNoel J., Boulanger Y., Vinay P. Relationship between intracellular ATP and the sodium pump activity in dog renal tubules// CanJ.Physiol.Pharmacol. 1990. V. 68. P. 5767.

25. Ammann H., Noel J., Tejedor A., Boulanger Y., Vinay P., Vinay P. Could cytoplasmic concentration gradients for sodium and ATP exist in intact cells?// Can.J.Physiol. Pharmacol. 1995. V.73. P.421-435.

26. Ammer U., Natochin Y., Ullrich K.J. Tissue concentration and urinary excretion pattern of sulfofluorescein by the rat kidney// J.Am.Soc.Nephrol. 1993. V. 3. P. 1474-1487.

27. Anagnostopoulos T. Electrophysiological study of the antiluminal membrane in the proximal tubule ofNecturus: effect of inorganic anions and SCN// J.Physiol.,Lond. 1977. V. 267. P.89-111.

28. Aronson P S. The renal proximal tubule: a model for diversity of anion exchangers and stilbene- sensitive anion transporters// Annu.Rev.Physiol. 1989. V. 51. P.419-441.

29. Atkinson D.E. Cellular energy metabolism and its regulation. New York:: Academic Press. 1977.

30. Bagnasco S., Good D., Balaban R.S., Burg M.B. Lactate production in isolated segments of the rat nephron// Amer.J.Physiol. 1985. V. 248. P.F522-F526.

31. Baker J.T. Dependence of p-aminohippurate transport on calcium in canine renal cortical slices// J.Physiol.,Lond. 1979. V. 288. P.425-435.

32. Balaban R.S. Regulation of oxidative phosphorylation in the mammalian cellJ! Amer. J.Physiol. 1990. V. 258. P.C377-C389.

33. Balaban R.S., Mandel L.J. Coupling aerobic metabolism to active ion transport in the kidney// J.Physiol.,Lond. 1980. V. 304. P.331-348.

34. Balaban R.S., Soltoff S.P., Storey J.M., Mandel L.J. Improved renal cortical tubule suspension. Spectrophotometric study of 02 delivery// Amer.J.Physiol. 1980. V. 238. P.F50-F59.

35. Balagura-Baruch S., Stone W.J. Renal tubular secretion of p-aminohippurate in the dog: effects of alpha-ketoglutarate// Nephron 1969. V. 6. P.633-642.

36. Barac-Nieto M. Renal uptake of p-aminohippuric acid in vitro. Effects of palmitate and L-carnitine// Biochim.Biophys.Acta 1971. V. 233. P.446-452.

37. Bergeron M., Gougoux A. The renal Fanconi syndrome// In: The metabolic basis of inherited disease. (Scriver CR, Beaudet W S., Valle D. eds.) New York: McGraw Hill. 1989. P.2569-2580.

38. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis. Veinham, New York, London: Verlag Chemie. 1974.

39. Beyer K.H., Painter R.H., Wiebelhouse V.D. Enzymatic factors in the renal tubular secretion of phenol redH Amer. J.Physiol. 1950. V. 161. P.259-267.

40. Blond D.M., Whittam R. Effects of sodium and potassium ions on oxidative phosphorylation in relation to respiratory control by a cell membrane adenosine triphosphatase// Biochem.J. 1965. V. 97. P.523-531.

41. Bosackova J. The transport of inorganic ions and p-aminohippurate in isolated cells of the renal cortex of the rabbit// Biochim.Biophys.Acta 1963. V. 71. P.345-354.

42. Boumendil-Podevin E.F., Podevin R.A. Stimulatory and inhibitory effects of sulfhydryl reagents on p-aminohippuric acid transport by isolated renal tubules// Biochim.Biophys.Acta 1977. V. 467. P.364-375.

43. Bowman H.M., Hirsch GH., Hook J.B Effect of medium pH on p-aminohippurate accumulation by slices of rat renal cortex// Experientia 1973. V. 29. P.955-956.

44. Bresler V.M., Bresler S.E., Nikiforov A.A. Structure and active transport in the plasma membrane of the tubules of frog kidney// Biochim. Biophys. A eta 1975. V. 406. P.526-537.

45. Bresler V.M., Mozhayeva M.G., Nikiforov A.A. The role of CI in organic acid active transport in renal proximal tubules of rat// Gen.Physiol.Biophys. 1983. V. 2. P. 39-50.

46. Bressler R, Corredo C., Brendel K. Hypoglycin and hypoglycin- like compounds// Pharmacol. Rev. 1969. V. 21. P. 105-130.

47. Brien J.F., Loomis C.W. Pharmacology of acetaldehyde// CanJ.Physiol.Pharmacol. 1983. V. 61. P. 1-22.

48. Brokl O H., Braun E.J., Dantzler W.H. Transport of PAH, urate, TEA, and fluid by isolated perfused and nonperfiised avian renal proximal tubules// Amer. J.Physiol. 1994. V. 266. P.R1085-R1094.

49. Burckhardt G. Sodium-dependent dicarboxylate transport in rat renal basolateral membrane vesicles// Pfluegers Arch. 1984. V. 401. P.205-261.

50. Burckhardt G, Ullrich K.J. Organic anion transport across the contraluminal membrane -Dependence on sodiumI I Kidney Intern. 1989. V. 36. P.370-377.

51. Burg MB., Grantham J.J., Abramow M., Orloff J. Preparation and study of fragments of single rabbit nephron// Amer. J.Physiol. 1966. V. 210. P. 1293-1298.

52. Burg M B., Orloff J. Effect of strophanthidin on electrolyte content and PAH accumulation of rabbit kidney slices// Amer.J.Physiol. 1962. V. 202. P.565-571.

53. Cederbaum A.I., Dicker E. Effect of cyanamide on the metabolism of ethanol and acetaldehyde and on gluconeogenesis by isolated rat hepatocytes// Biochem.Pharmacol. 1981. V. 30. P.3079-3088.

54. Chadwick D.W. Concentration-effect relationships of valproic acid// Clin.Pharmacokinet. 1985. V. 10. P. 155-163

55. Chambers R., Kempton R.T. Indication of function of the chick mesonephros in tissue culture with phenol red// J.Cell.Comp.Physiol. 1933. V. 3.P.131-160.

56. Chance B, Williams C M. The respiratory chain and oxidative phosphorylation// Adv.Enzymol. 1956. V. 17. P.65-134.

57. Chatsudthipong V., Dantzler W.H. PAH-aKG countertransport stimulates PAH uptake and net secretion in isolated snake renal tubules// Amer. J.Physiol. 1991. V. 261. P.F858-F867.

58. Chen X., Tsukaguchi H., Chen X -Z, Berger U.V., Hediger M.A. Molecular and functional analysis of SDCT2, a novel rat sodium-dependent dicarboxylate transporter// J.Clin.Invest. 1999. V.103. P.1159-1168.

59. Cherian M.G., Goyer R.A. Metallothioneins and their role in the metabolism and toxicity of metals// Life Sci. 1978. V. 23. P.l-10.

60. Chung S T., Park Y.S., Hong S.K. Effect of cations on transport of weak organic acids in rabbit kidney slices// Amer. J.Physiol. 1970. V. 219. P.30-36.

61. Cohen J.J., Barac-Nieto M. Renal metabolism of substrates in relation to renal function// In: Handbook of Physiology, sect.8: Renal Physiology (Orloff J., Berliner R.W. eds.) Washington: American Physiological Society. 1973. P.909-1001.

62. Copenhaver J.H., Davis J R. Effects of hydrogen ion concentration on transport characteristics of p-aminohippurate by rabbit kidney slices// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1965. V. 119. P.611-614.

63. Cornell N.W., Lund P., Krebs H.A. The effect of lysine on gluconeogenesis from lactate in rat hepatocytesII Biochem.J. 1974. V. 142. P.327-337.

64. Crane R.K The gradient hypothesis and other models of carrier- mediated active transport// Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol. 1977. V. 78. P.99-159.

65. Cross R.J., Taggart J.V. Renal tubular transport: accumulation of p-aminohippurate by rabbit kidney slices// Amer. J.Physiol. 1950. V. 161. P. 181-190.

66. Cunarro J.A., Weiner M.W. Effects of ethacrynic acid and furosemide on respiration of isolated kidney tubules: the role of ion transport and the source of metabolic energy// J.Pharmacol. Exp.Ther. 1978. V. 206. P.198-206.

67. Cuthbert A.W. Interaction of sodium channels in transporting epithelia: a two-state model// Mol. Pharmacol. 1974. V. 10. P.892-903.

68. Dantzler W.H. Comparison of renal tubular transport of urate and PAH in water snakes: evidence for differences in mechanisms and sites of transport// Comp.Biochem.Physiol. 1970. V. 34. P.609-623.

69. Dantzler W.H. К Effects on PAH transport and membrane permeability in isolated snake renal tubules// Amer.J.Physiol. 1974. V. 227. P. 1361-1370.

70. Dantzler W.H. Comparative aspects of renal function// In: The kidney: physiology and pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press. 1985. P.333-364.

71. Dantzler W.H., Bentley S.K. High К effects on PAH transport and permeabilities in isolated snake renal tubules// Amer.J.Physiol. 1975. V. 229. P. 191-199.

72. Dantzler WH, Bentley S.K. Low Na effects on PAH transport and permeabilities in isolated snake renal tubules// Amer.J.Physiol. 1976. V. 230. P.256-262.

73. Dantzler W.H, Evans K.K. Effect of alpha-KG in lumen on PAH transport by isolated perfused rabbit renal tubules// Amer.J.Physiol. 1996. V. 271. P.F521-F526.

74. Deetjen P., Sonnenberg H. Der tubulare Transport von p-Aminohippursaure// Pfluegers Arch. 1965. V. 285. P.35-44.

75. Des Rosiers С., Di Donato L., Comte В., Laplante A., Marcoux C., David F., Fernandez C.A., Brunengraber H. Isotopomer analysis of citric acid cycle and gluconeogenesis in rat liver.

76. Reversibility of isocitrate dehydrogenase and involvement of ATP-citrate lyase in gluconeogenesis// J.Biol.Chem. 1995. V. 270. P. 10027-10036.

77. Despopoulos A. A definition of substrate specificity in renal transport of organic anions// J.Theoret. Biol. 1965. V. 8. P. 163-192.

78. Despopoulos A., Gallhan P.X. Molecular features of sulfamide transport in renal excretory processesIIAmer.J.Physiol. 1962. V. 203. P. 19-26.

79. Dickman KG., Mandel L.J. Glycolytic and oxidative metabolism in primary renal proximal tubule cultures// Amer. J.Physiol. 1989. V. 257. P.C333-C340.

80. Doval M., Culebras M., Lopez-Farre A., Rengel M., Gougoux A., Vinay P., Lopez-Novoa J.M. Effect of valproate on lactate and glutamine metabolism by rat renal cortical tubules// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1989. V. 190. P.357-365.

81. Dudley RE., Gammal L.M., Klaassen D.D. Cadmium- induced hepatic and renal injury in chronically exposed rats, likely role of hepatic cadmium- metallothionein in nephrotoxicity// Toxicol.Appl.Pharmacol. 1985. V. 77. P.414-426.

82. Edwards R.M., Stack E., Trizna W. alpha-Ketoglutarate transport in rat renal brush-border and basolateral membrane vesicles// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1997, V. 281. P. 1059-1064.

83. Evan A.P., Park Y.S., Solomon S. Changes in structure and function of rat kidney slices produced by low sodiumII Nephron 1978. V. 21. P.209-220.

84. Eveloff J., Morishige W.K., Hong S.K. The binding of phenol red to rabbit renal cortex// Biochim.Biophys.Acta 1976. V. 448. P. 167-180.

85. Farah A., Frazer M., Porter E. Studies on the uptake of N'-methylnicotinamide by renal slices of the dog// J.Pharmacol. Exp. Ther. 1959. V. 126. P.202-211.

86. Forster R.P. Use of thin kidney slices and isolated renal tubules for direct study of cellular transport kinetics// Science 1948. V. 108. P.65-67.

87. Forster R.P. Renal transport mechanisms// Eed.Proc. 1967. V. 26. P. 1008-1019.

88. Forster R.P., Copenhaver J.H. Intracellular accumulation as an active process in a mammalian renal transport system in vitro. Energy dependence and competitive phenomena// Amer J.Physiol. 1956. V. 186. P. 167-171.

89. Forster R P , Hong S.K. In vitro transport of dyes by isolated renal tubules of the flounder as disclosed by direct visualisation. Intracellular accumulation and transcellular movement// J.Cell Comp.Physiol. 1958. V. 51. P.259-272.

90. Foulkes E.C., Miller B.F. Transport of p-aminohippurate from cell to lumen in kidney tubule// Amer.J.Physiol. 1959. V. 196. P.83-85.

91. Foulkes E C., Miller B.F. The role of potassium in renal transport of p-aminohippurate// In. Membrane Transport and Metabolism (Kleinzeller A., Kotyk A. eds.) Praha: Publishing House of the Czechoslovak Academy of Sciences. 1961. P.559-565.

92. Fowler B.A. Mechanisms of kidney cell injury from metals// Environ.Hea.lth Perspect. 1993. V. 100. P. 57-63.

93. Franke H., Barlow C.H., Chance B. Fluorescence of pyridine nucleotide and flavoprotein as an indicator of substrate oxidation and oxygen demand of the isolated perfused rat kidney// Int.J.Biochem. 1980. V. 12. P.269-275.

94. Franke H., Malyusz M., Runge D. Improved sodium and PAH transport in the isolated fluorocarbon-perfused rat kidneyII Nephron 1978. V. 22. P.423

95. FribergL. Cadmium and the kidney// Environ.Health Perspect. 1984. V. 54. P. 1-11.

96. Friedrichs D. On the stimulation of gluconeogenesis by L-lysine in isolated rat kidney cortex tubules// Biochim. Biophys. A eta 1975. V. 392. P.255-270.

97. Friedrichs D., Schoener W. Stimulation of renal gluconeogenesis by inhibition of the sodium pump//Biochim.Biophys.Acta 1973. V. 304. P. 142-160.

98. Gabbay R.A. Quinolinate inhibition of gluconeogenesis is dependent on cytosolic oxaloacetate concentration. An explanation for the differential inhibition of lactate and pyruvate gluconeogenesis//FEBSLett. 1985. V. 189. P.367-372.

99. Gabriels G., Kramer C., Stark U., Greven J. Role of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in the regulation of the renal PAH and dicarboxylate transporters// Fundam. Clin. Pharmacol. 1999a. V. 13. P.59-66.

100. Gabriels G., Werners A., Mauss S., Greven J. Evidence for differential regulation of renal proximal tubular p-aminohippurate and sodium-dependent dicarboxylate transport// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1999b. V. 290. P.710-715

101. Gerencser G.A., Chaisetseree C , Hong S.K. Acetate influence upon the transport kinetics of p-aminohippurate at 37o C in rabbit kidney slices// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1977. V. 154. P.397-400.

102. Gerencser G.A., Hong S.K. Roles of sodium and potassium ions on p-aminohippurate transport in rabbit kidney slices//Biochim.Biophys.Acta 1975. V. 406. P. 108-119.

103. Gerencser G A, Park Y.S., Hong S.K. Sodium dependence upon the transport kinetics of p-aminohippurate in rabbit kidney slices// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1973. V. 144. P.440-444.

104. Gesek F. A., Strandhoy J.W. Alpha adrenoreceptor agonist stimulation of oxygen consumption in rat proximal and distal nephrons// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1989. V. 249. P.529-534.

105. Goegelein H. Ion channels in mammalian proximal renal tubule// Renal Physiol.Biochem. 1990. V. 13. P.8-25.

106. Goldin H., Zmudka M., Tio F., Vasquez A., Preuss H.G. Paraaminohippurate and tetraethylammonium transport in fragments of rat renal cortex// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1973.V. 144. P.692-696.

107. Goldinger J.M., Erasmus B.D., Song Y.K., Koschier F.J , Hong S.K. Effects of SCN and N03 on organic anion transport in rabbit kidney cortical slices// Biochim.Biophys.Acta 1980. V. 598. P.357-365.

108. Goldinger J.M., Khalsa B.D.S., Hong S.K. Photoaffinity labelling of organic acid transport system in proximal tubule// Amer.J.Physiol. 1984. V. 247. P.C217-C227.

109. Gougoux A., Vinay P. Metabolic effects of valproate on dog renal cortical tubules// Can.J.Physiol.Pharmacol. 1988. V. 67. P.88-97.

110. Gougoux A., Zan N., Danserean D., Vinay P. Experimental Fanconi's syndrome resulting from 4-pentenoate infusion in the dogH Amer. J.Physiol. 1989. V. 257. P.F959-F966.

111. Gougoux A., Zan N., Dansereau D., Vinay P. Metabolic effects of 4-pentenoate on isolated dog kidney tubules// Kidney Intern. 1992. V. 42. P. 586-594.

112. Greville G.D. Intracellular compartmentation and the citric acid cycle// In: Citric Acid Cycle. Control and Compartmentation (Lowenstein J.M. ed.) New York and London: Marcel Dekker. 1969. P. 1-136.

113. Gstraunthaler G., Thurner B, Weirich-Schwaiger H., Pfaller W. A novel gluconeogenic strain of OK cells with metabolic properties different from gluconeogenic LLC-PK1 cells// Cellular Physiol.Biochem. 1993. V. 2. P.J78-88.

114. Guder W.G., Purschel S. The intracellular compartmentation of metabolites in isolated kidney cortex tubulesH Int.J.Biochem. 1980. V. 12. P.63-67.

115. Guder W.G., Siess E., Wieland OH Studies on glucose synthesis in rat kidney cell suspensions//FEBSLett. 1969. V. 3. P.31-33.

116. Gullans S R., Brazy PC, Dennis V.W., Mandel L.J. Interactions between gluconeogenesis and sodium transport in rabbit proximal tubule// Amer.,J.Physiol. 1984. V. 246. P.F859-F869.

117. Haberle D.A. Characteristics of p-aminohippurate transport in the mammalian kidney// In: Renal Transport of Organic Substances (Greger R. ed.) Berlin: Springer. 1981. P. 189209.

118. Harris S.I., Balaban R.S., Barrett L., Mandel L.J. Mitochondrial respiratory capacity and Na+-and K+-dependent adenosine triphosphate-mediated ion transport in the intact renal cell// J.Biol.Chem. 1981. V. 256. P. 10319-10328.

119. Hawkins R.D., Kalant H. The metabolism of ethanol and its metabolic effects// Pharmacol.Rev. 1972. V. 24. P.67-157.

120. Hayashi H, Hoshi T. Sodium-dependence of p-aminohippurate transport by rat kidney cortex slices// Arch.Int.Pharmacodyn. Ther. 1979. V. 240. P. 103-115.

121. Hayashi H., Hoshi T. Effect of potassium on p-aminohippurate transport in rat kidney cortex slicesII Renal Physiol. 1982. V. 5. P. 10-17.

122. Hayashi H., Takada M., Arita A. Effects of cadmium on the active transport of sodium by abdominal skin of a bullfrog (Rana catesbiana)// Japan.,J.Physiol. 1977. V. 27. P.337-3 52.

123. Hewitt W.R., Clark R.L., Hook J.B. Investigations on metabolic modulation of p-aminohippurate accumulation by rabbit renal cortical slices// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1976. V. 199. P.498-509.

124. Hillyard S.D., Gonick H.C. Effects of Cd++ on short-circuit current across epithelial membranes. I. Interactions with Ca+* and vasopressin on frog skin// J.Membrane Biol. 1976. V. 26. P. 109-119.

125. Hillyard S.D., Sera R., Gonick H.C. Effects of Cd++ on short-circuit current across epithelial membranes, n. Studies with the isolated frog skin epithelium, urinary bladder and large intestindl JMembrane Biol. 1979. V. 46. P.283-291.

126. Hiltunen J.K. Metabolic effects of pent-4-enoate in isolated rat heart// Biochem.J. 1978. V. 170. P.241-247.

127. Hiltunen J.K., Jauhonen VP., Savolainen M.J., Hassinen I.E. Effects of pent-4-enoate on cellular redox state, glycolysis and fatty acid oxidation in isolated perfused rat heart// BiochemJ. 1978. V. 170. P.235-240.

128. Hirsch G.H. Effects of potassium depletion in rats on renal organic ion transport// Can.J.Biochem. 1974. V. 52. P.90-92.

129. Hoek J.B., Thomas A.P., Rooney T.A., Higashi K., Rubin E. Ethanol and signal transduction in the liver// FASEB J. 1992. V. 6. P.2387-2396.

130. Hohage H., Lohr M., Querl U., Greven J. The renal basolateral transport system for organic anions: properties of the regulation mechanism// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1994. V. 269. P.659-664.

131. Hohage H., Mehrens T., Mergelsberg U., Lohr M., Greven J. Effects of extracellular cadmium on renal basolateral organic anion transport// Toxicol.Lett. 1998. V. 98. P. 189-194.

132. Hohage H., Querl I.U., Morth D.M., Greven J. The basolateral organic cation transport system of rabbit kidney proximal tubules. Influence of inorganic anions// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1996. V. 279. P.1086-1091.

133. Hohenegger M. Lipid metabolism related to kidney function and electrolyte homeostasis// In: Renal Metabolism in Relation to Renal Function (Schmidt U., Dubach U.C. eds.) Bern: 1976. P.99-107.

134. Holcomb T., Curthoys N.P., Gstraunthaler G. Subcellular localisation of PEPCK and metabolism of gluconeogenic substrains of renal cell lines// Amer.J.Physiol. 1995. V. 268. P.C449-C457.

135. Hong S.K., Forster R.P. Further observations on the separate steps involved in the active transport of chlorophenol red by isolated renal tubules of the flounder in vitro// J. Cell.Comp.Physiol. 1959. V. 54. P.237-242.

136. Hong S.K., Park Y.S. Transport of bromcresol green in the rabbit kidney slice// Amer. J.Physiol. 1971. V. 221. P. 1779-1784.

137. Hori R, Okamura M., Takayama A., Hirozane K., Takano M. Transport of organic anion in the OK kidney epithelial cell lind/ Amer. J.Physiol. 1993. V. 264. P.F975-F980.

138. Hori R., Takano M., Okano T., Kitojava S., Inui K.-I. Mechanisms of p-aminohippurate transport by brush border and basolateral membrane vesicles isolated from rat kidney cortex// Biochim. Biophys. A eta 1982. V. 692. P.97-100.

139. Jacquemin E., Hagenbuch B., Stieger B , Wolkoff A.W, Meier P.J. Expression cloning of a rat liver Na-independent organic anion transporter// Proc.N.Y.Acad.Sci. 1994. V. 91. P. 133137.

140. Janssens P., Hems R., Ross B.D. The metabolic fate of lactate in renal cortical tubules// BiochemJ. 1980. V. 190. P.27-37.

141. Jorgensen P L. Structure, function and regulation of Na,K-ATPase in the kidney// Kidney Intern. 1986. V. 29. P. 10-20.

142. Jungwirth A., Paulmichl M., Lang F. Cadmium enhanced potassium conductance in cultured renal epitheloid (MDCK) cells// Kidney Intern. 1990. V. 37. P. 1477-1486.

143. Kahn A.M., Shelat H., Weinman E.J. Urate and p-aminohippurate transport in rat renal basolateral vesicles// Amer J.Physiol. 1985. V. 249. P.F654-F661.

144. Kanai N., Lu R, Bao Y., Wolkoff A.W., Schuster V.L. Transient expression of oatp organic anion transporter in mammalian cells: identification of candidate substrates// Amer.J.Physiol. 1996. V. 270. P.F319-F325.

145. Karnovsky M.J., Himmelhoch H. Seasonal and starvation- induced changes in enzymatic pattern of the frog nephronII Amer J.Physiol. 1961. V. 201. P.781-785.

146. Kasher J.S., Holohan P.D., Ross C.R. Na-Gradient-dependent p-aminohippurate (PAH) transport in rat basolateral membrane vesicles// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1983. V. 227. P. 122-129.

147. Kikuta Y., Hayashi H., Saito Y. Effect of changes in Na electrochemical potential gradient on p-aminohippurate transport in newt kidney// Biochim. Biophys. A eta 1979. V. 556. P.354-365.

148. Kikuta Y., Hoshi T. Role of sodium ions in p-aminohippurate transport by newt kidney// Biochim.Biophys.Acta 1979. V. 553. P.404-416.

149. Kim J.H., Hook J.B. On the mechanism of acetate enhancement of renal p-aminohippurate transportII Biochim.Biophys.Acta 1972. V. 290. P.368-374.

150. Kim Y.K., Choi J.K., Kim J.S., Park Y.S. Changes in renal functions in cadmium- intoxicated ratsII Pharmacology and Toxicology 1988. V. 63. P.342-350.

151. Kinne R. Selectivity and direction: plasma membranes in renal transport// Amer.J.Physiol. 1991. V. 260. P.F153-F162.

152. Kinne R, Kinne-Saffran E. Renal metabolism: coupling of luminal and antiluminal transport processes// In: The Kidney: Physiology and Pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York:: Raven Press. 1985. P.719-737.

153. Kinne R, Schwartz I.L. Isolated membrane vesicles in the evaluation of the nature, localisation and regulation of renal transport processes// Kidney Intern. 1978. V. 14. P.547-556.

154. Kinne-Saffran E., Hulseweh M,, Pfaff C., Kinne R.K.H. Inhibition of Na,K-ATPase by cadmium. Different mechanisms in different species// Toxicol.Appl.Pharmacol. 1993. V. 121. P.22-29.

155. Kinsella J.L., Holohan P.D., Pessah N.I., Ross R. Transport of organic ions in renal cortical luminal and antiluminal membrane vesicles// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1979. V. 209. P.443-450.

156. Kinter W.B. Chlorphenol red influx and efflux, microspectrophotometry of flounder kidney tubulesII Amer. J.Physiol. 1966. V. 211. P. 1152-1164.

157. Kinter W.B., Wong M.D. Peritubular membrane transport of PAH into proximal cells in Necturus kidney slicesII Amer.J.Physiol. 1974. V. 227. P.50-57.

158. Kippen I., Klinenberg J R. Effects of renal fuels on uptake of PAH and uric acid by separated renal tubules of the rabbit// Amer. J.Physiol. 1978. V. 235. P.F137-F141.

159. Klahr S. Methodology for study of kidney intermediary metabolism// In: Methods in Pharmacology, vol.4B: Renal Pharmacology. 1978. P.325-349.

160. Klahr S., Hammerman M. Renal metabolism// In: The Kidney: Physiology and Pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press. 1985. P.699-718.

161. Klein K.L., Wang M.-S., Torikai S., Davidson W., Kurokawa K. Substrate oxidation by isolated single nephron segments of the rat// Kidney Intern. 1981. V. 20. P .29-3 5.

162. Kliger A.S., Eastman S.T., Zachek K.M., Kullick M., Preuss H G. Effect of renal fuels on p-aminohippurate transport in rat renal cortical fragments// Metabolism 1977. V. 26. P.979-988.

163. Kliger A.S., Hollyer R A., Preuss H.G. The mechanism of acetate stimulation of PAH transport in rat kidney fragmentsII Renal Physiol. 1982. V. 5. P. 18-26.

164. Kliger A.S., Resing J. A., Eastman A.H., Eastman S T., Preuss H.G. Effects of medium pH on p-aminohippurate transport in rat kidney fragments// Nephron 1978. V. 20. P.32-39,

165. Knoefel P.K., Huang K.C. Biochemorphology of renal tubular transport: hippuric acid and relative substances// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1959. V. 126. P.296-303.

166. Koschier F.J., Eisner R.W., Holleman D.F., Hong S.K. Organic anion transport by renal cortical slices of harbor seals (Phoca vitulina)// Comp.Biochem.Physiol. 1978. V. 60A. P.289-292.

167. Krebs H.A., Freedland R.A., Hems R., Stubbs M. Inhibition of hepatic gluconeogenesis by ethanolH Biochem.J. 1969. V. 112. P. 117-124.

168. Krebs H.A., Gasqoyne T., Notton B.M. Generation of extramitochondrial reducing power in gluconeogenesis// Biochem.J. 1967. V. 102. P.275-282.

169. Kriz W., Bankir L. A standard nomenclature for structures of the kidney// Amer. J.Physiol. 1988. V. 254. P.F1-F8.

170. Kriz W., Kaissling B. Structural organisation of the mammalian kidney// In: The kidney: physiology and pathophysiology (Seidin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press. 1985. P.265-306.

171. Kurokawa K. Use of isolated single nephron segments to study metabolic heterogeneity of the nephronIIMiner.ElectrolyteMetab. 1983. V. 9. P.260-269.

172. Kutzer M., Meer S., Haller S., Greven J. Basolateral glutarate transport by isolated S2 segments of rabbit kidney proximal tubules// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1996. V. 277. P. 316320.

173. Kwon O., Kwon H.M., Hong S.K., Goldinger J M. Size selected mRNA induces expression of p-aminohippurate transport in Xenopus oocytes// Proc.Soc. Exp. Biol.Med. 1989. V. 192. P.205-208.

174. R., Chan B.S., Schuster V.L. Cloning of the human kidney PAH transporter: narrow substrate specificity and regulation by protein kinase C// Amer. J.Physiol. 1999. V. 276. P.F295-F303.

175. Malvin R.L., Wilde W.S., Sullivan LP. Localisation of nephron transport by stop-flow analysis// Amer. J.Physiol. 1958. V. 194. P. 135-142.

176. Mandel L.J. Metabolic substrates, cellular energy production, and the regulation of proximal tubular transport// Annu.Rev.Physiol. 1985. V. 47. P.85-101.

177. Mandel L.J. Primary active sodium transport, oxygen consumption, and ATP: coupling and regulationH Kidney Intern. 1986. V. 29. P.3-9.

178. Mandel L.J. Bioenergetics of membrane transport processes// In: Membrane Physiology (Andreoli T.E., Hoffman J.F., Fanestil D.D., Schultz S.G. eds.) New York: Plenum Medical Book Company. 1988. P.295-310.

179. Markwell M.A.K., Haas S.M., Beiler L.L., Tolbert ME. A modification of Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples// Analyt.Biochem. 1978. V. 87. P.206-210.

180. Marshall E.K., Vickers J.L. The mechanism of the elimination of phenolsulphophtalein by the kidney II Bull. Johns Hopkins Hosp. 1923. V. 34. P.l-6.

181. Martin G., Durozard D., Besson J., Baverel G. Effect of the antiepileptic drug sodium valproate on glutamine and glutamate metabolism in isolated human kidney tubules// Biochim. Biophys. Acta 1990. V. 1033. P.261-266.

182. Martin G., Michoudet C., Baverel G. Stimulation of glutamine metabolism by the antiepileptic drug, sodium valproate, in isolated dog kidney tubules// Biochem.Pharmacol. 1989. V. 38. P.3947-3952.

183. Masereeuw R., Saleming W.C., Miller D.S., Russel F.G. Interaction of fluorescein with the dicarboxylate carrier in rat kidney cortex mitochondria// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1996. V. 279. P.1559-1565.

184. Masereeuw R, van den Bergh E.J., Bindels R.J., Russel F.G. Characterisation of fluorescein transport in isolated proximal tubular cells of the rat: evidence for mitochondrial accumulation// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1994. V. 269. P. 1261-1267.

185. Masuda S., Saito H., Nonoguchi H., Tomita K, Inui K. mRNA distribution and membrane localisation of the OAT-K1 organic anion transporter in rat renal tubules// FEBS Lett. 1997. V. 407. P. 127-131.

186. Matsushima Y., Gemba M. Stimulatory effect of calcium ions on p-aminohippurate accumulation by rat kidney cortical slices// Renal Physiol. 1981. V. 4. P. 191-198.

187. Maude D.L. Effect of substrates and inhibitors of tricarboxylic acid cycle on proximal tubular fluid transport in vitro// Biochim.Biophys.Acta 1970. V. 215. P.216-219.

188. Maxild J. Role of fatty acid metabolism on renal transport of p-aminohippurate in vitro// Biochim.Biophys.Acta 1971. V. 233. P.434-445.

189. Maxild J. Energy requirements for active transport of p-aminohippurate in renal cortical slices// Arch.Internat.Physiol.Biochim. 1973. V. 81. P.501-521.

190. Maxild J., Moller J.V. Metabolic studies on renal transport of p-aminohippurate in vitro// Biochim.Biophys.Acta 1969. V. 184. P.614-624.

191. Maxild J., Moller J.V., Sheikh M.I. An energy-dependent, sodium-independent component of active p-aminohippurate transport in rabbit renal cortex// J.Physiol.,Lond. 1981. V. 310. P.273-283.

192. Meijer A.J., Van Dam K. The metabolic significance of anion transport in mitochondria// Biochim.Biophys.Acta 1974. V. 346. P.213-244.

193. Meijer A.J., Williamson JR. Transfer of reducing equivalents across the mitochondrial membrane. I. Hydrogen transfer mechanisms involved in the reduction of pyruvate to lactate in the isolated liver cellsIIBiochim.Biophys.Acta 1974. V. 333. P.1-11.

194. Michoudet CBaverel G. Characteristics of acetaldehyde metabolism in isolated dog, rat and guinea- pig kidney tubules// Biochem.Pharmacol. 1987. V. 36. P.3987-3991.

195. Miller D.S. Heavy metal inhibition of para-aminohippurate transport in flounder renal tissue. Sites ofHgC12 actionII J.Pharmacol.Exp.Ther. 1981. V. 219. P.428-434.

196. Miller D.S., Pritchard J.B. Nocodazole inhibition of organic anion secretion in teleost renal proximal tubulesII Amer. J.Physiol. 1994. V. 267. P.R695-R704.

197. Miller DS, Pritchard J.B. Dual pathways for organic anion secretion in renal proximal tubule// J.Exp.Zool. 1997. V. 279. P.462-470.

198. Miller D.S., Stewart D.E., Pritchard J.B. Intracellular compartmentation of organic anions within renal cellsII Amer. J.Physiol. 1993. V. 264. P.R882-R890.

199. Miller J.H. Sodium-sensitive, probenecid-insensitive p-aminohippuric acid uptake in cultured renal proximal tubule cells of the rabbit// Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 1992. V. 199. P.298-304.

200. Misanko B.S., Park Y.S., Solomon S. Effect of hypophysectomy on p-aminohippurate transport kinetics in rat renal cortical slices// J.Endocrynol. 1977. V. 74. P. 121-128.

201. Moller J. V., Sheikh M L Renal organic anion transport system pharmacological, physiological and biochemical aspects// Pharmacol.Rev. 1983. V. 34. P.315-358.

202. Morel F., Chabardes D. Functional segmentation of the nephron// In: The kidney: physiology and pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press. 1985. P.519-530.

203. Murer H., Burckhardt G. Membrane transport of anions across epithelia of mammalian small intestine and kidney proximal tubules// Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol. 1983. V. 96. P. 1-51.

204. Murer H., Gmaj P. Transport studies in plasma membrane vesicles isolated from renal cortex// Kidney Intern. 1986. V 30. P. 171-186.

205. Murthy L., Foulkes E C. Movement of solutes across luminal cell membranes in kidney tubules of the rabbit// Nature 1967. V. 213. P. 180-181.

206. Nagai J., Takano M., Hirozane K., Yasuhara M, Inui K. Specificity of p-aminohippurate transport system in the OK kidney epithelial cell line// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1995. V. 274. P.1161-1166.

207. Natochin Y.V., Chernigovskaya T V. Evolutionary physiology: history, principles// Comp.Biochem. Physiol. 1997. V. 117A. P. 1-17.

208. Nechay B.R., Saunders J.P. Inhibition of renal adenosine triphosphatase by cadmium// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1977. V. 200. P.623-629.

209. Nielsen P., Rasmussen F. Relationships between molecular structure and excretion of drugs// LifeSci. 1975. V. 17. P. 1495-1512.

210. Nikiforov A.A. Effect of acetate on transport of organic acid (fluorescein) in renal proximal tubules of frog// Biochim.Biophys. Acla 1982. V. 686. P.36-46.

211. Nikiforov A.A. Stimulation by aminooxyacetate of fluorescein uptake in rat renal tubules in vitro: role of intracellular alpha-ketoglutarate// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1995. V. 274. P. 1204-1208.

212. Nikiforov A. A., Ostretsova IB. Effects of inhibitors of gluconeogenesis on weak organic acid uptake in rat renal tubules// Biochem. Pharmacol. 1992. V. 44. P.2213-2221.

213. Nikiforov A.A., Ostretsova I B. Stimulatory effect of ethanol on weak organic acid uptake in rat renal tubules// Biochem.Pharmacol. 1994a. V. 47. P.821-825.

214. Nikiforov A. A., Ostretsova I.B. Stimulation of weak organic acid uptake in rat renal tubules by cadmium and nystatin// Biochem.Pharmacol. 1994b. V. 47. P.815-820.

215. Noe B., Hagenbuch B., Stieger B., Meier P.J. Isolation of a multispecific organic anion and cardiac glycoside transporter from rat brain// Proc.N.Y.Acad.Sci. 1997. V. 94. P. 1034610350.

216. Nowak G., Schnellmann R.G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cellsII Amer. J.Physiol. 1995. V. 268. P.C1053-C1061.

217. Ohtomo Y., Aperia A., Sahlgren B., Johansson B.L., Wahren J. C-peptide stimulates rat renal tubular Na+, K(+)-ATPase activity in synergism with neuropeptide YII Diabetologia 1996. V. 39. P. 199-205.

218. Orlov Yu.N;, Zherebtsova M.A., Kazbekov E.N. Affinity identification of organic anion transporters in brush-border membrane vesicles from rat kidney// Biochim.Biophys.Acta 1994. V.1192. P. 117-124.

219. Ostretsova IB., Nikiforov A.A. Weak organic acid uptake in rat renal tubules in vitro: stimulation by pent-4-enoic acid// Comp.Biochem.Physiol. 1997. V. 117C. P. 1-6.

220. Palmer L.G. Epithelial Na channels, function and diversityII Annu.Rev.Physiol. 1992. V. 54. P.51-66.

221. Papa S., Lofrumento N.E., Paradies G., Quagliariello E. The inhibition of succinate oxidation in isolated mitochondria by uncouplers// Biochim.Biophys.Acta 1968. V. 153. P.306-308.

222. Park Y.S., Solomon S. pH-Temperature dependence of organic acid transport in rat kidney slicesI I Amer. J.Physiol. 1977. V. 233. P.F382-F387.

223. Park Y.S., Yoo H.S., Hong S.K. Kinetic transport of organic acids in rabbit kidney slices// Amer. J.Physiol. 1971. V. 220. P.95-99.

224. Pegg D.G., Hook J.B. Glutathione-S-transferases: an evaluation of their role in renal organic anion transport// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1977. V. 200. P.65-74.

225. Podevin R.A., Boumendil-Podevin E.F. Monovalent cation and ouabain effects on PAH uptake by rabbit kidney slices// Amer. J.Physiol. 1977. V. 232. P.F239-F247.

226. Podevin R.A., Boumendil-Podevin E.F., Priol C. Concentrative PAH transport by rabbit kidney slices in the absence of metabolic energy// Amer. J.Physiol. 1978. V. 235. P.F278-F285.

227. Pouliot J.-F., Gougoux A., Beliveau R. Brush border membrane proteins in experimental Fanconi's syndrome induced by 4-pentenoate and maleate// CanJ.Physiol.Pharmacol. 1992. V. 70. P. 1247-1253.

228. Pritchard J.B. Coupled transport of p-aminohippurate by rat kidney basolateral membrane vesiclesII Amer.J.Physiol. 1988. V. 255. P.F597-F604.

229. Pritchard J.B. Rat renal cortical slices demonstrate p-aminohippurate/glutarate exchange and sodium/glutarate coupled p-aminohippurate transport// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1990. V. 255. P.969-975.

230. Pritchard J.B. Intracellular alpha-ketoglutarate controls the efficacy of renal organic anion transport//J.Pharmacol.Exp. Ther. 1995. V. 274. P. 1278-1284.

231. Pritchard J.B., Miller D.S. Comparative insights into the mechanisms of renal organic anion and cation secretion// AmerJ.Physiol. 1991. V. 261. P.R1329-R1340.

232. Pritchard J.B , Miller D.S. Proximal tubular transport of organic anions and cations// In: The Kidney: Physiology and Pathophysiology (Seldin D.W., Giebisch G. eds.) New York: Raven Press, Ltd. 1992. P.2921-2945.

233. Pritchard J.B., Miller D.S. Mechanisms mediating renal secretion of organic anions and cations/IPhysiol.Rev. 1993. V. 73. P.765-796.

234. Pritchard J.B., Miller D.S. Intracellular compartmentation of organic anions and cations during renal secretion// Cellular Physiol.Biochem. 1996. V. 6. P.50-59.

235. Puck T.T., Wasserman K, Fishman A.F. Some effects of inorganic ions on the active transport of phenol red by isolated kidney tubules of the flounder// J.Cell.Comp.Physiol. 1952. V. 40. P.73-88.

236. Quebbemann A.J., Anders M.W. Renal tubular conjugation and excretion of phenol and p-nitrophenol in the chicken: differing mechanisms of renal transfer// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1973. V. 184. P.695-702.

237. Race J.E., Grassl S.M., Williams W.J., Holtzman E.J. Molecular cloning and characterisation of two novel human renal organic anion transporters (hOATl and hOAT3)// BBRC 1999. V. 255. P.508-514.

238. Rennick B.R., Prior M.Z. Effects of autonomic drugs on renal tubular transport of catecholamines in the chicken// J Pharmacol Exp Ther 1965. V. 148. P.267-269.

239. Richards AN., Barnwell J.B. Experiments concerning the question of secretion of phenolsulphonephtalein by renal tubule// Proc.Roy.Soc.,London 1927. V. 102. P.72-91.

240. Rifkin R.J. In vitro inhibition of Na-K and Mg-ATPase by mono-, di- and trivalent cations// Proc. Soc.Exp.Biol.Med. 1965. V. 120. P.802-804.

241. Rognstad R. Gluconeogenesis in the kidney cortex. Flow of malate between compartments// BiochemJ. 1970. V. 116. P.493-502.

242. Rognstad R., Katz J. Gluconeogenesis in the kidney cortex: effects of D-malate and aminooxyacetate// Biochem.J. 1970. V. 116. P.483-491.

243. Rognstad R, Katz J. Gluconeogenesis in the kidney cortex. Quantitative estimation of carbon flow// J.Biol.Chem. 1972. V. 247. P.6047-6054.

244. Ross C.R., Pessah N.I., Farah A. Studies of the uptake and runout of p-aminohippurate and N-methylnicotineamide in dog renal slices// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1968. V. 160. P.381-386.

245. Ross C.R., Weiner I.M. Adenine nucleotides and PAH transport in slices of renal cortex: effects of DNP and CNII Amer. J.Physiol 1972. V. 222. P.356-359.

246. Rover N, Kramer C., Stark U., Gabriels G, Greven J. Basolateral transport of glutarate in proximal S2 segments of rabbit kidney: kinetics of the uptake process and effect of activators of protein kinase A and CI/ Pfluegers Arch. 1998. V. 436. P.423-428.

247. Rumbach L., Cremel G., Marescaux C., Warter J.M., Waksman A. Valproate-induced hyperammonemia of renal origin. Effects of valproate on glutamine transport in rat kidney mitochondria// Biochem.Pharmacol. 1989. V. 38. P.3963-3967.

248. Russel F.G.M., Linden van der P.E.M., Vermeulen W.G., Heiji M., Os van C.H., Ginnekan van C A M. Na and H gradient-dependent transport of p-aminohippurate in membrane vesicles from dog kidney cortex// Biochem.Pharmacol. 1988. V. 37. P.2639-2649.

249. Rutman J.Z., Meltzer L.E., Kitchell JR., Rutman R, George P. Effect of metal ions on in vitro gluconeogenesis in rat kidney cortex slices// Amer.J.Physiol. 1965. V. 208. P.841-846.

250. Sacktor B. L-Glutamate transport in renal plasma membrane vesicles// Mol.Cell.Biochem. 1981. V. 39. P.239-252.

251. Saito H., Masuda S ., Inui K.-I. Cloning and functional characterisation of a novel rat organic anion transporter mediating basolateral uptake of methotrexate in the kidney// J.Biol.Chem. 1996. V. 271. P.20719-20725.

252. Schachter D., Manis J.G., Taggart J.V. Renal synthesis, degradation and active transport of aliphatic acyl amino acids. Relationship to p-aminohippurate transport// Amer. J.Physiol. 1955.V. 182. P.537-544.

253. Schafer J.A., Williams J.C. Transport of metabolic substrates by the proximal nephron// Annu.Rev.Physiol. 1985. V. 47. P. 103-125.

254. Schannon J. The excretion of phenol red by the dog// Amer.J.Physiol. 1935. V. 113. P.602-610.

255. Schmidt U., Dubach U.C. Na+-K+-stimulated adenosinetriphosphatase: intracellular localisation within the proximal tubule of the rat nephron// Pfluegers Arch. 1971. V. 330. P.265

256. Schmitt C., Burckhardt G. Modulation by anions of p-aminohippurate transport in bovine renal basolateral membrane vesicles// Pfluegers Arch. 1993. V. 425. P.241-247.

257. Schoolwerth A C., LaNoue K.F. Transport of metabolic substrates in renal mitochondria// Annu.Rev.Physiol. 1985. V. 47. P.143-171.

258. Schoolwerth AC., Smith B.C., Culpepper R.M. Renal gluconeogenesis// Miner.Electrolyte Metab. 1988. V. 14. P.347-361.

259. Schreiner G.E. Toxic nephropathy due to drugs, solvents and metals// In: Drugs Affecting Kidney Function and Metabolism. Progr. Biochem. Pharmacol., vol.7 (Edwards K.D.G. ed.) Basel: Karger. 1972. P.248-284.

260. SchulzH. Inhibitors of fatty acid oxidation// Life Sci. 1987. V. 40. P. 1443-1449.

261. Segal S ., Thier S O. Renal handling of amino acids// In. Handbook of Physiology. Sect. 8:Renal Physiology (Orloff J., Berliner R.W, eds.).) Washington: American Physiological Society. 1973. P.653-676.

262. Sehr P.A., Bore P.J., Papatheofanis J., Radda G.K. Non-destructive measurement of metabolites and tissue pH in the kidney by 31P nuclear magnetic resonance// Brit. J.Exper.Pathol. 1979. V. 60. P.632-641.

263. Seiler W., Echsel H., Hohenegger M. Further studies on acute cadmium poisoning// Pfluegers Arch. 1978. V. 377, suppl. P.26.

264. Seki G., Coppola S., Yoshitomi K., Burckhardt B.C., Samarzija I., Muller-Berger S., Fromter E. On the mechanism of bicarbonate exit from renal proximal tubular cells// Kidney Int 1996. V. 49. P. 1671-1677.

265. Sekine T., Cha S.H., Tsuda M., Apiwattanakul N., Nakajima N., Kanai Y., Endou H. Identification of multispecific organic anion transporter 2 expressed predominantly in the liver// FEBSLett. 1998. V. 429. P. 179-182.

266. Sekine T., Watanabe N., Hosoyamada M., Endou H. Expression cloning and characterisation of a novel multispecific organic anion transporter// J.Biol.Chem. 1997. V. 272. P. 1852618529.

267. Sheikh M.I., Moller J.V. Gradient-dependent stimulation of renal transport of p-aminohippurate// Biochem.J. 1982. V. 208. P.243-246.

268. Sheikh M.I., Moller J.V. Nature of Na+-independent stimulation of renal transport of p-aminohippurate by exogenous metabolites// Biochem.Pharmacol. 1983. V. 32. P.27452749.

269. Sheikh M.I., Stahl M. Characteristics of accumulation of probenecid by rabbit kidney cortical slices//Amer.J.Physiol. 1977. V. 231. P.F513-F523.

270. Sheikh M.I., Stahl M., Jacobsen C. A comparative study of the accumulation of probenecid and analogues in rabbit kidney tubules in vitro// Biochem.Pharmacol. 1979. V. 28. P. 1522.

271. Shideman F.E., Rathbum R, Stoneman F. Inhibition of the renal tubular transport of p-aminohippurate (PAH) and phenolsulfophthalein as affected by acetate// Amer.J.Physiol. 1952. V. 170. P.31-37.

272. Shideman F.E., Rene R.M. Succinate oxidation and Krebs cycle as an energy source for renal tubular transport// Amer. J.Physiol. 1951. V. 166. P. 104-112.

273. Shimada H., Moewes B., Burckhardt G. Indirect coupling to Na+ of p-aminohippuric acid uptake into rat renal basolateral membrane vesicles// Amer.J.Physiol. 1987. V. 253. P.F795-F801.

274. Silva P. Renal fuel utilisation, energy requirement, and function// Kidney Intern. 1987. V. 32,suppl.22. P.S9-S14.

275. Silverman J. A. Multidrug-resistance transporters//Pharm.Biotechnol. 1999. V.12. P.353-386. Silverman M., Turner R.J. The renal proximal tubule// In. Biomembranes,vol.lO (Manson L A.ed.) 1979. P. 1-50.

276. Slater E C. Application of inhibitors and uncouplers for a study of oxidative phosphorylation//

277. MethEnzymol. 1967. V. 10. P.48-57. Smith B.C., Clotfelter LA, Cheung J.Y., LaNoue K.F. Differences in 2-oxoglutarate dehydrogenase regulation in liver and kidney see comments.// Biochem.J. 1992. V. 284. P.819-826.

278. Soltoff S.P., Mandel L.J. Active ion transport in the renal proximal tubule. I. Transport and metabolic studies// J.Gen.Physiol. 1984. V. 84. P.601-622.

279. Spencer A.M., Sack J., Hong S.K. Relationship between PAH transport and Na,K-ATPase activity in the rabbit kidney// Amer.J.Physiol. 1979. V 236. P.F126-F130.

280. Sperber J. A new method for the study of renal tubular excretion in birds// Nature 1946. V. 158. P.131

281. Stark U., Vanden Bergh H, Rover N., Greven J. Effect of activation of protein kinase A and of protein kinase C on the kinetics of the renal basolateral PAH transporter// Fundam.Clin.Pharmacol. 1998. V. 12. P.44-49.

282. Sullivan LP., Grantham J.A., Rome L, Wallace D, Grantham J.J. Fluorescein transport in isolated proximal tubules in vitro: epifluorometric analysis// Amer.J.Physiol. 1990. V. 258. P.C46-C51.

283. Sullivan L P., Grantham J.J. Specificity of basolateral organic anion exchanger in proximal tubule for cellular and extracellular solutesI! J.Am.Soc.Nephrol. 1992. V. 2. P. 1192-1200.

284. Sweet D.H., Miller D.S., Pritchard J.B. Localization of an organic anion transporter-GFP fusion construct (rROATl-GFP) in intact proximal tubules// Amer.J.Physiol. 1999. V.276. P.F864-F873

285. Sweet D.H., Wolff N. A., Pritchard J.B. Expression cloning and characterisation of ROAT1. The basolateral organic anion transporter in rat kidney// J.Biol.Chem. 1997. V. 272. P.30088-30095.

286. Taggart J. V., Forster R.P. Renal tubular transport: Effect of 2,4-dinitrophenol and related compounds on phenol red transport in the isolated tubules of the flounder// Amer.J.Physiol. 1950. V. 161(1). P. 167-172.

287. Taggart J.V., Silverman L., Trayner E.M. Influence of renal electrolyte composition in the tubular excretion of p-aminohippurate// Amer. J.Physiol. 1953. V. 173. P. 345-3 50.

288. Takada M., Hayashi H. Effects of cadmium ion on the Na,K-ATPase of microsomes obtained from frog skin11 Japan. J.Physiol. 1978. V. 28. P.473-483.

289. Takano M., Hirozane K, Okamura M., Takayama A., Nagai J., Hori R. p-Aminohippurate transport in apical and basolateral membranes of the OK kidney epithelial cells// J.Pharmacol.Exp. Ther. 1994. Y. 269. P.970-975.

290. Takano M., Nagai J., Yasuhara M., Inui K. Regulation of p-aminohippurate transport by protein kinase C in OK kidney epithelial cells// Amer.J.Physiol. 1996. V. 271. P.F469-F475.

291. Tanner G.A., Isenberg M.I. Secretion of p-aminohippurate by rat kidney proximal tubules// Amer.J.Physiol. 1970. V. 219. P. 889-892.

292. Taub M., Saier M.H. Regulation of 22Na transport by calcium in an established kidney epithelial cell line// J.Biol.Chem. 1979. V. 254. P. 11440-11444.

293. Trimble M.E. Palmitate transport by rat renal basolateral membrane vesicles in the presence of albumin// J.Am.Soc.Nephrol. 1993. V. 3. P. 1920-1929.

294. Tse S.S., Bildstein C.L., Lin D., Mamelok R.D. Effects of divalent cations and sulfhydryl reagents on the para-aminohippurate (PAH) transporter of renal basal-lateral membranes// J.Pharmacol.Exp.Ther. 1983. V. 226. P. 19-26.

295. Tsuchiya K., Wang W., Giebisch GWelling P A. ATP is a coupling modulator of parallel Na,K-ATPase-K-channel activity in the renal proximal tubule// Proc Natl Acad Sci USA 1992. V. 89. P.6418-6422.

296. Tune B.M., Burg M B., Patlak C.S. Characteristics of p-aminohippurate transport in proximal renal tubules// Amer.J.Physiol. 1969. V. 217. P. 1057-1063.

297. Uchida S., Endou H. Substrate specificity to maintain cellular ATP along the mouse nephron// Amer .J.Physiol. 1988. V. 255. P.F977-F983.

298. Ullrich K.J. Specificity of transporters for "organic anions" and "organic cations" in the kidney// Biochim.Biophys.Acta 1994. V. 1197. P.45-62.

299. Ullrich K.J. Renal transporters for organic anions and organic cations. Structural requirements for substratesH J.Membrane Biol. 1997. V. 158. P.95-107.

300. Ullrich K.J., Fasold H., Rumrich G., Kloss S. Secretion and contraluminal uptake of dicarboxylic acids in the proximal convolution of rat kidney// Pfluegers Arch. 1984. V. 400. P.241-249.

301. Ullrich K.J., Greger R. Approaches to the study of tubule transport functions// In: The kidney: physiology and pathophysiology (Seidin D.W., Giebisch G. eds.) New York:: Raven Press. 1985. P.427-469.

302. Ullrich K.J., Papavassiliou F. Contraluminal transport of small carboxylates in the proximal tubule of the rat kidney in situ II Pfluegers Arch. 1986. V. 407. P.488-492.

303. Ullrich K.J., Rumrich G., Fritzsch G., Kloss S. Contraluminal para-aminohippurate (PAH) transport in the proximal tubule of the rat kidney. II. Specificity: aliphatic dicarboxylic acidsII Pfluegers Arch. 1987. V. 408. P.38-45.

304. Uwai Y., Okuda M., Takami K., Hashimoto Y., Inui K. Functional characterisation of the rat multispecific organic anion transporter OAT1 mediating basolateral uptake of anionic drugs in the kidney// FEBSLett. 1998. V. 438. P.321-324.

305. Vander A.J. Effect of cadmium on renal tubular sodium transport// Amer.J.Physiol. 1962. V. 203. P.1-5.

306. Veech R.L. Pyridine nucleotides and control of metabolic processes// In: Pyridine Nucleotide Coenzymes. Chemical, Biochemical and Medical Aspects, pt.B. New York: 1987. P.79-104.

307. Vidaver G.A., Shepherd S.L., Lagow J.B., Wiechelman K.J. Glycine transport by hemolysed and restored pigeon red cells. Effects of a Donnan-induced electrical potential on entry and exit kineticsII Biochim.Biophys.Acta 1976. V. 443. P.494-514.

308. Vinay P., Gougoux A., Lemieux G. Isolation of a pure suspension of rat proximal tubules// Amer.J.Physiol. 1981. V. 241. P.F403-F411.

309. Vogel G., Kroger W. Das T^pah der Niere als Na-abhangige Grosse// Pfluegers Arch. 1965. V. 286. P.317-322.

310. Vogel G, Kurten M. Untersuchungen zur Na-Abhanggigkeit der renalen-tubularen HarnstoffSekretion bei Rana ridibunda// Pfluegers Arch. 1967. V. 295. P.42-55.

311. Vogel G., Stoeckert I. Die Bedeutung des Aniones für den renalen tubulären Transport von Na und die Transporte von Glucose und PAH// Pfluegers Arch. 1966. V. 292. P.309-315.

312. Wallenstein S., Zucker C.L., Fleiss J.L. Some statistical methods useful in circulation research// Circuities. 1980. V. 47. P. 1-9.

313. Wasserman K., Becker E L., Fishman A.F. Transport of phenol red in the flounder renal tubule// J.Cell.Comp.Physiol. 1953. V. 42. P.385-393.

314. Depth of uptake// Kidney Intern. 1973a. V. 3. P.214-221. Wedeen R.P., Weiner B. The distribution of p-aminohippuric acid in rat kidney slices. I.

315. Tubular localisation// Kidney Intern. 1973b. V. 3. P.205-213. Weidemann M.J., Krebs H.A. The fixel of respiration of rat kidney cortex// Biochem.J. 1969. V. 112. P. 149-166.

Информация о работе

Никифоров, Анатолий Александрович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Система метаболической регуляции транспорта слабых органических анионов в клетках проксимальных канальцев почки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы