Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система глутатиона в обеспечении радиорезистентности животных разных таксономических групп

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Система глутатиона в обеспечении радиорезистентности животных разных таксономических групп"

^^ На правах рукописи

О

УДИНЦЕВ Андрей Валерьевич

СИСТЕМА ГЛУТАТИОНЛ В ОБЕСПЕЧЕНИИ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ЖИВОТНЫХ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП

03.00.01 - радиобиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Военно-медицинской академии

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук профессор КАРПИЩЕНКО А.И., кандидат медицинских наук ГРЕБЕНЮК А.Н.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук ЛУКАШИН Б.П.,

доктор медицинских наук профессор КОЗЛОВ A.B.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исотедоватсл1.скип инсппуг Военной медицины МО РФ.

Зашита состоится 2S октября 1997 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 106.03.08 в Воеино-меднцинской академии (194044, Санкт-Петербург. ул.Лебедепа. 6).

С диссертацией можно ошакомитьси и фчтшмеитальнои библиотеке Военно-медицинской академии.

Автореферат разослан _"_ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационно! о соке га доктор медицинских наук профессор

ЧУРСИН и г.

Актуальность. Оценка последствий воздействия ионизирующих излучений и проблема зашиты человека от их действия приобретаю в настоящее время особую остроту. Широкое применение ионизирующих излучении в промышленности, сельском хозяйстве, научных исследованиях, клинической медицине, развитие ядерной энергетики способствуют расширению числа лиц, вольно или невольно соприкасающихся с энергией атома.

Необходимость поиска новых, более эффективных средств химической защиты организма от повреждающего действия ионизирующих излучении, особенно, облучения в малых дозах (Антушевич А.Е. и соавт., 1994; Владимиров В.Г., Красильников И.И., 1994; Легеза В.И. и соавт., 1993), вызывает потребность в дальнейшем, более глубоком изучении патобиохимических процессов, развивающихся в клетках и тканях в ответ на действие данного экстремального фактора. Развитие окислительного стресса, сопровождающегося накоплением в тканях активных форм кислорода и продуктов пероксидации, рассматривается в качестве важного звена в патогенезе радиационно-индуцированной гибели клеток (Барабой В.А. и соавт., 1991; 5!ез Н., 1985). Вследствие этого, изучение системы обмена глутатиона как одной из ключевых биохимических систем, обеспечивающих многоуровневую и эффективную защиту клетки от повреждающего действия продуктов пероксидации, всегда привлекало внимание радиобиологов.

В последнее десятилетие особое внимание исследователей привлечено к изучению роли тиол-дисульфидного обмена клеток и тканей как важного механизма регуляции процессов жизнедеятельности, значение которого сравнивалось даже со значением фосфорилирования белков (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990). Показано, что система обмена глутатиона играет ключевую роль в поддержании тиолового статуса клеток, значительное преобладание восстановленной (тиоловой) формы глутатиона над окисленной (дисульфидной) рассматривается в качестве важнейшего компонента "редокс-буфера" клеток и тканей, а сам факт изменения соотношения двух форм данного соединения при действии модуляторов окислительного стресса различного генеза может быть одним из

звеньев в патогенезе клеточной гибели. По мнению ряда авторов (Büttke Т.М., Sandstrom P.A., 1994; Haimovitz-Friedman A. et al., 1994), запуск феномена апоптоза под действием любых индукторов опосредуется развитием в тканях окислительного стресса, а непосредственным "сигналом" для его активации является снижение соотношения внутриклеточных концентрации восстановленной и окисленной форм глутатиона (Beaver J.Р., Waring P., 1995). Таким' образом, выяснение особой роли глутатиона в регуляции основополагающих внутриклеточных процессов и патогенезе нарушений жизнедеятельности клеток и тканей при действии экстремальных факторов внешней среды создает новые перспективы к поиску средств активного воздействия на данные процессы, что представляет несомненный интерес ямя современной (»положи и медицины.

11с ль_работьи оценить значение системы глутатиона в

обеспечении радпоустойчивостп животных и вклад в радпозашптное действие серосодержащих радиопротекторов.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- изучить-внутривидовые (межлпнейпые и межсезонные) и межвидовые различия, показателей системы глутатиона тканей лабораторных животных и их связь с различиями исходного уровня радпорезистентноети:

- оценим, динамику показателей системы глутатиона при облучении » малой до je:

- определить характер и величину изменений пока отелей системы глутатиона при облучении в сублегальпой .кие;

- исследовать динамику 'показателей системы глутатиона при модификации пистампном oiio.ioi ических эффект» облучения в малой до je:

- оценить изменения показателей сие(емы ктуштпона при. модифицированном ппегамииом облучении в полуде i алы юн дозе.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка показателей системы глутатиона тканей лабораторных животных при действии экстремальных факторов радиационной природы. Проведен анализ динамики соотношения концентрации восстановленной и окисленной форм глугатнона как ключевого звена поддержания тиолового статуса клеток и тканей. Выявлены значительные корреляционные связи между различиями показателей системы глутатиона и меж- и внутривидовыми различиями радиочувствительности у грызунов. Установлено, что модификация цистамимом биологических эффектов облучения в полулетальной дозе предотвращает в поздние сроки развитие патобиохимических процессов, приводящих к окислительному повреждению тканей.

Практическое значение работы заключается в том, что полученные в ходе диссертационного исследования данные могут послужить основанием для использования показателей системы глутатиона в качестве тестов для оценки исходного уровня радиорезистентности. Объяснение одного из возможных биохимических механизмов реализации радиозащитногр действия цистамина создает новые подходы к целенаправленному поиску высокоэффективных радиомодифицирующих средств.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедрах Клинической биохимии и лабораторной диагностики, Военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии. В процессе выполнения работы подано и защищено авторскими свидетельствами 3 рационализаторских предложения.

Апробация работы проведена на итоговой конференции военно-научного общества слушателей Военно-мелининской академии (Санкт-Петербург, 1994), научно-практической конференции "Актуальные вопросы военно-морской ппиены.

токсикологии, радиологии" (Обнинск, 1994), научно-практической конференции "Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, включающих обзор 'литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение и выводов. Работа изложена на 177 страницах машинописного текста, содержит 7 рисунков и 18 таблиц. Список литературы состоит из -218 источникор, из них 79 отечественных и 139 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень интенсивности метаболизма в системе глутатиона как 1! раднопоражаемых. так и в радиоустопчивых тканях во многом определяет меж- и внутривидовые различия радиорезистентности организмов в целом.

2. Введение цистамина в радиозашитной дозе предотвращает нарушения в системе глутатиона в радиочувствительных, и, в меньшей степени, в радиоустойчивых тканях экспериментальных животных', что может являться одним из возможных механизмов противолучевою действия радиопротектора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ И ССЛ ВДОВАМИ Я

Экспериментальные исследования выполнены на 222 белых беспородных крысах-самцах массой 1X0-220 г и И)К мышах-самцах трех липни - BAl.ll/c (36 особей). СВА (36 особен) и белых беспородных (36 особей) весим ¡8-20 I. Общее однократное равномерное рентгеновское облучение животных: крыс в дозах 0.25 и 7.2 Гр и мышеи в дот 0.25 и 6.2 Гр осуществляли на рен1геио1ераие1пической успшовке РУМ-17

(180 кВ, 15 мА, фильтр 0.5 мм Си + 1.0 мм А1, мощность дозы 0.26 Гр/мин). Направление облучения: спина-грудь.

Цистамин в дозе 90 мг/кг, разведенный ex tempore на воде для инъекций, вводился крысам рнутрибрюшинно в виде раствора с рН 7.2-7.3 за 25-30 мин до облучения в объеме 0.2 мл на 100 г массы. Животным контрольной группы в тех же условиях внутрибрюшинно вводился физиологический раствор.

У животных опытных и контрольных групп в тканях селезенки, головного мозга, печени, почек и эритроцитах определялись содержание восстановленной (ВГ) и окисленной форм, глутатиона (ОГ), уровень свободных сульфгидрильных групп белков (СГБ) и активность ферментов обмена глутатиона и сопряженных биохимических процессов - глутапон-редуктазы (ГР), глутатион S-трансферазы (ГТ), глутатион-пероксидазы (ГП), глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и каталазы, а в ткани почек также и 7-глутамилтранспептидазы. Изучение вышеперечисленных показателей проводилось через сутки после облучения мышей в дозах 0.25 и 6.2 Гр, а также через 1 и 5 суток после чистого и модифицированного цистамином облучения крыс в дозах 0.25 Гр и 7.2 Гр.

Содержание ВГ определяли методом G.L.Ellman (1959) в нашей модификации, заключавшейся в осаждении белков в гомогенатах или гемолизате эритроцитов раствором сульфосалиииловой кислоты. Концентрацию ОГ определяли в том же биологическом материале по методу P.Eyer, D.Podhradsky (1986) в модификации, заключавшейся в осаждении белка сульфосалиииловой кислотой и удалении несвязаьшегося избытка тиолпривного агента N-этилмалеимида щелочным гидролизом. Содержание СГБ оценивалось методом G.Bellomo и соавт. (1990)! Определение активности у-глутамилтранспептидазы в гомогенате почек определяли по методу S.S.Tate и A.Meister (1985), активность выражали в мкмоль/(г тканимин).

Определение активности других ферментов системы глутатиона и смежных биохимических систем проводили в гемолизате эритроцитов или в цитозольной фракции, полученной после центрифугирования гомогенатов тканей в течение часа при 150000 g на ультрацентрифуге L8-M ("Beckman", США).

Активность глутатиоп-псроксшшы (ГП) определяли по методу А.Н.Гавриловои и Н.Ф.Хмары (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила, глутатион S-трансфсразы (ГТ) - методом W.H.Habig и W.B.Jakoby (1981), глутатпон-редуктазы (ГР) - по I.Carlbcrg и B.Mannervik (1985), глюкозо-6-фосфат легпдрогеназы (Г-6-ФДГ) - по A.Romberg и соапг. (1955), катал азы - по. М.А.Королюку (1988). Расчет активности ферментов производился на грамм белка или гемоглобина (в гемолизате эритроцитов), определенных методом Лоурп и модификации G.L.Peterson (1977) и гемоглобиннианидным методом соответственно.

Статистическую обработку результатов проводили на компьютере IBM РС/АТ-386 с использованием пакета прикладных программ Statgraphics 7. В .каждом группе рассчитывали средние значения, среднее квадратнческое отклонение ¡1 ошибку среднего. Достоверность различии но сравнению с соответствующим контролем оценивали по t-крнтершо Сгыоден/а. Приведенные в тексте п таблицах значения представляли в пиле Xcp:tmv Определение связи межлннеиных и межвидовых различий радиочувствительности животных, оцененных по величине с показателями системы

глутатпона проводили методом корреляционного анализа с расчеюм коэффициента корреляции Zsy и оценкой его точное!м н надёжности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПССЛ1:Д()ВЛПИ1( К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

а результате проведенных исследовании выявлена связь ряда показателен спаемы глутатпона тканей лабораторных животных с Biiyipn- и межвидовыми различиями исходного уровня ралиорезистентносш. Более mio. при облучении как в малой." так и в сублетальных лозах, а также при 'модификации нистампном их oiio.Toi ичсскнх эффект», был установлен ряд закономерностей динамики показателей cmcicmm [дугатиона. которые могут в не ко юрой степени обьяспять иаюбиохимию радпацнот.1о-ипдупирог.,1пцых изменений метаболизма клеток и тканей, а также механизм ралиозашп тою дена вия инстамина.

1. Изучение особенностей обмена глутатиона у интактных крыс п мышей линий СВА, белых беспородных и ВАЬВ/с

При изучении исходного состояния системы глутатиона в тканях мышей трех линий была отмечена тенденция к более низкому содержанию восстановленной формы глутатиона и активности Г-6-ФДГ в тканях селезенки лиши"! мышей со снижением их исходного уровня радиорезистентности: СВА, белые беспородные, ВАЬВ/с (табл.1), хотя статистически достоверной связи указанных величин с величиной ЛД50/30 обнаружено не было. Вместе с тем, обнаружена сильная положительная корреляционная связь уровня полулетальной дозы . мышей трех лннлй с активностью в данной радиочувствительной ткани ГП, характеризующаяся коэффициентом корреляции 2ху=0.758 (р<0.05). Созданная на основании регрессионного анализа математическая модель, связывающая данные показатели: ЛД5р/зо(Гр)= 2.806+0.740-А,,, (ммоль/(г белка-мин)),- имела высокий коэффициент детерминации - 112=57.44 % (¡КО.05). Сильная положительная корреляционная связь величин тканевой активности ГП с исходным уровнем рад неустойчивости целостного организма 'мышей трех линий была обнаружена также и в относительно радиоустойчивых тканях головного мозга, почек и эритроцитов: гху соответственно 0.816 (р<0.01), 0.712 (р<0.01) и 0.758 (р<0.01). Указанные данные подтверждают мнение В.И.Кулинского, Л.С.Колесниченко (1993) и В-ЕЗапс^гот, Б.Ь.Магкктс! (1990) о ведущей роли ГП для защиты клеток при активации процессов пероксидации. •

Если в ткани селезенки обнаружена тенденция к более низкой активности Г-6-ФДГ у мышей с более высоким исходным уровнем радиационной устойчивости, то межлинейные различия активности Г-6-ФДГ в эритроцитах и ткани головного мозга интактных мышей имели направленность, сходную с описанной для ГП. Связь между величиной активности фермента в эритроцитах и ЛД50/30 характеризовалась коэффициентом корреляции 0.812 (р<0.05). Обнаруженная положительная корреляционная связь величин активности Г-6-ФДГ ткани мозга и полулегальной дозы была статистически недостоверна.

Таблица 1.

Состояние системы глутатиоиа в ткани селезенки крыс и мышей

Показатель Мыши линии СВА Беспородные мыши Мыши линии ВА1_В/с Крысы (весна) Крысы (осень)

Концентрация В Г, мкмоль/г ткани 2-0.Si0.09 2.16±0.14 2.66±0.14 3.00Ю.12 3.79±0.11

Концентрации О Г. нмодь/ г ткани 41.8+1.7 45.1 ±2.0 41.4±3.5 . 38.4+1.8 44.Ш.7

Концентрации СП>, мкмоль/г ткани 8.32+0.19 8.65±0.28 8.57+0.14 13.8+0.4 12.9+0.3

Активность Г-6-ФДГ. мкмоль/О белка мин) 57.4-12.1 58,9+2.4 62.4+1.8 43.2±4.3 47.2±2.5

Активность Г Р. мкмоль/(г белка-мин) 63.5+3.2 70.2±3.3 , 64.8±1.5 55.7±5.3 74.2±2.0

Активность ГГ. м к мо. 1 ь/( г бед камин) 93.9±3.7 Ю4.4±4.3 ' Ю2.0±6.3 43.6+2.1 42.6±2.7

Активность П1. м мол ь/( г бел ка-м и и) 5.68+0.12 4.68±0.19 4.35+0,09 4.10±0.22 4.41±0.23

Активность каппазы, ммодь/(г бедка мин) 70.2±2.3 74.9+2.7 61.5+2.7 60.0+7.7 49.9±3.2

Вместе с тем, именно с тенденцией к высокой активное!и фермента в ткани мозга более радпоустойчивых линий мышей можно связать исходно более низкий уровень содержания ОГ, и, следовательно, высокий уровень соотношения концентраций ВГ/ОГ в тканях. Коэффициент корреляции между величинами концентрации ОГ в ткани головного мозга мышей и уровнем ЛДзо/зо составил -0.973 (р<0.001).

В проведенном эксперименте было показано, что ткани крыс, более радиоустойчивых по сравнению с мышами любой из линий, характеризовались рядом особенностей состояния системы глутатиона. 'Гак, в ткани селезенки у крыс обнаружен значительно более высокий по сравнению с показателями мышеи любой из линий уровень восстановленной формы глутатиона и соотношения концентраций ВГ/ОГ, белковых тиолов, но более низкая активность Г-6-ФДГ, ГГ и каталазы. Следует отметить, что корреляционная связь величин полулегальной дозы для мышей линий' ВЛ1.В/с, белых беспородных, СВА и белых беспородных крыс и активности Г-6-ФДГ (-0.552) и катглазы (0.376) была статистически достоверна (р<0.05). Активность Г'П в ткани селезенки крыс была несколько ниже, чем обнаруженная у мышей любой из линий, в то время как в ткани печени и эритроцитах - выше. Так, активность фермента в тканях печени интактных мышей линий ВАЬВ/с, белых беспородных и СВА составила соответственно 2:14+0.22, 2.25±0.17 и 2.16±0.25 ммоль/(г белка-мии), а в ткани печени крыс - 5.74±0.29 ммоль/(г белка-мин). В эритроцитах мышей данный показатель находился соответственно на уровне 1.11Ю.07, 0.96±0.03 и 1.48±0.17 ммольДг гемоглобина-мип), а у крыс - 1,70±(). 15 ммоль/(г гемоглобина-мин). Таким образом, результаты проведенною эксперимента позволяют высказать предположение о значении тканевой активности ГП в обеспечении как внутри-, так и межвидовых различий исходного уровня радиорезистентности.

Осенью, по сравнению с весной, практически все ткани крыс характеризовались как достоверно более высоким уровнем ВГ, так и более высоким восстановительным потенциалом системы тиол-дисульфилиого обмена, оцененным по соотношению концентрации двух форм глутатиона. Слелует также отметить обнаруженный в осеннем эксперименте более

высокий уровень активности ГП и ГР ткани селезенки крыс. Указанные межсезонные различия состояния системы обмена глутатиона, вероятно, могут иметь значение в поддержании в осенний период по сравнению с весной более высокою относительного уровня радиационной устойчивости. что отмечено в работах М.Поспшпила, И.Ваха (1986), Ь.К.11.Г:к!и8 сч а1. (1977).

2. Особенности обмена глугатиона у мышей и крыс при облучений

В результате проведенных исследований установлено, что облучение в дозе 0.25 Гр вызв'-ию значительные изменения показателей системы глутатиона тканей мышей и крыс. Так, через сутки после облучения в тканях селезенки, печени и почек мышей разных по радиочувствительности линий, и крыс наблюдалась тенденция к росту соотношения концентраций' ВГ/()Г. В тканях селезенки мышей линий ВЛ1.ВД' » С'ВЛ соотношение концентраций В Г/О Г повысилось соответственно с 65.7±3.4 до 92.2±3.0 (р<0.0П и с 50.4±4.2 до 105.2±6.1 (р<0.01). Тенденция к росту определялась и в тканях селезенки белых беспородным мышей - с 50.3*5.0 до 62.213:2 (р">0.05). У крыс соотношение копией фаний. ВГ/ОГ на 1 сутки после облучения н малой до$е также нофастало - с 7S.li4.ft до 1 16.10.2 (р<0.05) (ттбд. 2). Следует о1мсшп>, чю изменения сооиюшення двум (|)орм глукпиопа у мышей и крыс .были сникщы как с изолированным рос I ом содержания восстановленной формы глутатиона. например, в 1каня\ юлонною мопа. печени и почек, так и с параллельным снижением уровня ОГ - в тканях селезенки. В то же время, в динамике акппшосш основных ферментов системы путашоиа у облученным фьпупов не отмечалось выраженным общим 1енденпии. Например, у мышеи линии СВД чере 1 сутки после радиапионнот войеиепшя определялось снижение акппшосш П1 в 1Кани ссле^нки - с 5.63±0.14 до 4.54:0.23 ммоль'и белка-мин) (р- 0.0|), кчиениия к снижению активносш фермента о1мечена и у белым беспородным и м!>нней лпнпп ВД1.В/С. ю же время, у крыс отмечен бод?е чем 40 г7-нын рос! ак1ивиоеп1 I II в отнс! па облучение в малой лозе.

Динамика показателей-системы глутатиоиа в ткани селезенки интактных и облученных в лозе 0.25 Гр крыс

Показатель Интактные 1 сутки -контроль 1 сутки -облучение 5 сутки -контроль 5 сутки -облучение

Конценграини НГ. мкмоль/г ткани 3.0010.12 3.03+С.11 3.41+0.09* 3.11+0:24 3.19+0.10

Концентрация О Г. нмоль/ г 1Кани 38.4-1.7 36.1±2.9 29.2+4.4 36.7±2.8 54.2±6.1*

КонненГрання СТГ>, мкмоль/г 1каин 13.810.4 13.>±0.3 11.0+0.2" 14.2±0.2 11.4±0.3"

Активность Г 6-ФДГ. мкмоль/(т белка мин) 43.21:4.3 . 47.1+3.7 ■ 42.5+1.7 44.2±5.6 50.7±7.6

Активность П\ м к м ол ь/( г бел ка- м и н) 55.7±5.3 58.9±6.6 64.6±1.8 52.3±7.4 67.5+6.3

Активность ГГ, м к.мол ь/( 1 бел ка- м и н) 43.6±2.1 45. Ы.6 70.3+7.6" 46.2±2.9 47.3±2.2

Активность ГП, мм ол !>/( I бел ка ■ м и н) 4.10+0.22 4.09±0.24 5.73±0.48* 4.33+0.28 4.53±0.40

Акт и вн ост ь катала з ы, м м ол ь/ (г бе л к а • м и п) 60.0±7.7 61.2±4.3 52.3+5.2 64.1+9.7 82.4±9.4

Примечание: * — р<0.05, ** — р<0.01 но сравнению с ложнооблучснным контролем

Ткани облученных и малой дозе крыс характеризовались и рядом других особенностей динамики изучаемых показателей по сравнению с мышами, что, вероятно, связано с разной биологической эффективностью облучения п указанной дозе для этих видов животных. Так, у крыс как через I, так и 5 суток после облучения в малой дозе отмечалось снижение уровня белковых тиолов тканей селезенки (табл. 2), головного, мозга и печени. По нашему мнению, этот эффект не может быть связан с уменьшением относительного содержания белка в исследуемых тканях. Эго подтверждают и результаты исследований АЛепсйусгко и М.Ого/с!/ (1992), которые констатировали отсутствие влияния низкодозового облучения на белковый обмен печени крыс и относительное содержание протеинов в ткани данного органа. Через 5 суток после радиационного воздействии в малой дозе статистически значимых различий соотношения двух форм глутатпона или активности исследуемых ферментов его обмена в исследованных тканях крыс, по сравнению с ложнооблученным контролем не отмечалось.

В результате проведенных исследований установлено, что через сутки после облучения белых беспородных мышей и крыс в дозах соответственно 6.2 Гр и 7.2 Гр в динамике показателей системы глутатиона и тканях селезенки, головного мозга, иечепн и почек имеется сходная динамика показателем системы обмена глутатиона: рост содержания ВГ, соотношения концентрации ВГ/ОГ и активности ГП. Например, содержание ВГ в тканях селезенки белых беспородных мышей и крыс в указанным срок повысилось соответственно с 2.22+0.08 до3.05±0.10- мкмоль/г. тиши (р<0.01) и с 3.74+0.12 до 4..иЦ().22 мкмоль/г ткани (р<0.05). В то же время, через сутки после облучения в дозе 6.2 Гр динамика показателей системы глутатпона в ткани селезенки мышей трех линий существенно различалась (табл. 3). Так, у мышей наиболее радиорезнстентной линии - СВА - был отмечен рост соотношения чвух форм глутатиона, превосходящий определенный у белых беспородных мышей (рис. 1). Напротив, у мышей наиболее радиочувствительной линии - ВАЬВ/с -определялось достоверное • снижение данного показателя. Сходная с обнаруженной в ткани селезенки- тенденция к снижению соотношения концентраций ВГ/ОГ через сутки мосле

Динамика показателей системы тлутатноиа в ткани селезенки через сутки после облучения мышей в лозе 6.2 Гр

Показатель СВА, контроль СВА, облучение Беспородные, контроль Беспородные, облучение ВАЬВ/с, контроль ВАЬВ/с, облучение

Концентрация ВГ, мкмоль/г ткани 2.10±0.08 2.54+0.14" ■ 2.22Ю.08 3.05Ю.10" 2.68±0.11 2.69Ю.12

Конпеш рання О Г, нмоль/г ткани • 41.7±2.5 28.6+5.6* 44.1+2.0 45,9+5.7 40.8+3.2 49.6+1.6*

-Концентрация СГВ, мкмоль/г ткани 8.44±0.22 #'.82+0.34 . 8.65+0.28 8.87±0.09 8.63+0.19 8.92±0.27

Активность Г-6-ФДГ, мкмольДг белка-мин) 57.0+3.3 56.6±3.8 59.3+2.0 64.9±2.3 . 62.0+1.7 61.2+4.1

Активность ГР, мкмольДг.бслка-мип) 64.8+2.9 103.5±4.8" 70.1±2.8 96.7±3.5" 63.3±1.6 80.0+3.7"

Активность ГГ, м к мол ь/( г бел ка ■ м и н) 92.8±3.9 128.1±4.5" 104.3±3.3 119! 1±5.7* 106.9+4.1 116.9+6.3

Активность ГП, ммоль/(г белкампн) 5.6310.14 6.05±0.07* 4.74Ю.27 ■ 4.94+0.17 4.37+0.12 4.13+0.08

Активность катал азы, ммольДг белка мпн) 73.2И.8 75.8±7.2 73.3±2.8 74.012.6 62.8±3.7 49.9+1.8*

Примечание: * — р<0.05, ** — р<0.01 по сравнению с ложнооблученпым контролем

75

50

25

О

контроль облучение контроль облучение контроль. облучение BALB/c Беспородные СВА

Рис. 1. Динамика соотношения концентраций восстановленной и окисленной форм глутатиона в ткани селезенки мышей через сутки после облучения в дозе 6.2 Гр. По оси абсцисс: линии мышей и показатели. . По оси ординат: величина соотношения концентраций ВГ/ОГ (отн. ед.)

облучения в дозе 6.2 Гр была обнаружена и в тканях головного мозга и почек мышей линии BALB/c: с 33.9±0.9 до 27.7±1.3 (р<0.05) и с 126.2±5.3 до !17.9±8.9 (р>0.05). Поскольку, по мнению J.E.Thompson и соавт. (1987), H.Jaeschcke и J.R.Mitchell (1988), рост содержания ОГ и снижение соотношения в тканях концентраций ВГ/ОГ являются надежным и чувствительным маркером окислительного стресса, развитие данного процесса в тканях мышей с наименьшим исходным уровнем радиоусгойчивостн уже через сутки • после сублетального радиационного воздействия может являться отражением патобпохимических процессов, ведущих к гибели данной группы животных. В проведенном эксперименте' обнаружены также

р<0.01

р<0.05

р<0.05

7Т

существенные различия динамики активности ферментов системы глутатиона в тканях мышей трех линий. Так, через сутки после облучения в дозе 6.2 Гр в тканях селезенки, головного мозга, печени и почек белых беспородных и линии СВА мышей наблюдался рост активности ГП. В указанный срок после облучения мышей линии СВА в перечисленных тканях было отмечено также достоверное увеличение активности ГР и ГТ.

Снижение соотношения двух форм глутатиона. являющееся отражением развития в тканях окислительного стресса, в ткани селезенки облученных крыс отмечалось в более поздние сроки после радиационного воздействия в полулетальной дозе. Если через сутки после радиационного воздействия соотношение концентраций ВГ/ОГ в данной ткани крыс повысилось с 85.9±3.3 до 137.7±5.8 (р<0.01), то через 5 суток было отмечено понижение данного показателя но сравнению с ложнооблученным контролем с 88.3+4.1 до 48.3±3.7 (р<0.01). Инициация процессов перокепдацип в тканях лабораторных животных в указанные сроки, на наш взгляд, может быть связана с запуском эндогенных прооксидаптиых систем клеток. Например, Е.П.Шелепнпой и соавг. (1991) описан механизм активации .генерации ксантипокспдазон тканей активных форм кислорода при . радиаинонно-ппдунпрованном росте концентрации пуринбвых продуктов - деградации нуклеиновых кислот и 'связанной с 'лим конверсии дегидрогепазной формы фермента в оксида шую.

3. Особенности метаболизма глутатиона в тканях крыс при модификации нистамнном биологических эффектов облучения

Цистамин окатывал существенное влияние на динамику изучаемых пока (ате.тсн ' системы глутатиона как при введении интактпым животным, так и при предварительном введении его хтя модификации биологических зффектов облучения крыс в дозах 0.25 и 7.2 Гр. Динамика показателен системы глутатиона в ткани селезенки крыс при модификации цистамнном биологических эффектов облучения, в дозе 0.25 Гр приведена в таблице 4.

, Таблица 4.

Динамика показателей системы глутатиона в ткани селезенки крыс при модификации цистамином облучения в дозе 0.25 Гр

Показатель Интает-ные Контроль облучения 1 сутки Контроль препарата 1 сутки Модифицированное облучение 1 сутки Контроль облучения 5 сутки Контроль препарата 5 сутки Модифицированное облучение 5 сутки

Концентрация ВГ, мкмоль/г ткани 3.00+0.12 3.34+0.11 3.58+0.10 3.88±0.16" 3.06Ю.13 3.78±0.06 3.91±0.08"

Концентрация ОГ, мкмоль/г ткани 38.4+4.8 28.7+5.0 34.9+3.5 27.6±6.1 56.7±4.8 47.3±10.2 45.3±4.9

Концентрация СГБ, мкмоль/г >кани 13.8+0.4 11.3+0.5 11.6±0.2 10.8±0.4 11.2±0.2 11.6+0.2 10.1+0.4*.+

Активность Г-6-ФДГ, мкмольДг белка-мин) 43.2±4.3 43.3+6.1 . 44.2±2.1 56.9±4.9+ 52.3±3.3 56.6+5.6 64.3+2.9*

Активность ГР, мкмольДг белка-мин) 55.7±5.3 63.1+2.3 74.2±14.6 62.5±4.4 63.9±4.9 58.7±4.2 57.9+1.4

Активность ГТ, мкмольДг белка-мин) 43.6±2.1 67.6+3.5 55.7+3.8 56.2±1.<3* 47.3±2.8 52.3±2.7 50.4±3.5

Активность ГП, ммольДг белка-мин) 4.10±0;23 5.84±0.56 4.00+0.32 5.28+0.38 4.27±0.46 4.23Ю.10 4.53±0.13

Активность каталазы, ммольДг белка-мин) 60.0+7.7 55.4+4.5 72.1+10.7 64.5±6.6 80.5±5.8 50.5±3.4 56.3±2.7"

Примечание: * — р<0.05, ** — р<0.01 по сравнению с контролем облучения;

+ — р<0.05 по сравнению с контролем введения препарата.

Необходимо отметить, что изменения показателей системы глутатиона ткани селезенки лабораторных . животных под действием цистамина в радиозашитноп дозировке пли облучении в малой дозе характеризуются рядом общих черт. Так, через 1 и 5 суток после фармакологического или радиационного воздействий в указанной ткани лабораторных животных отмечается рост содержания ВГ и снижение уровня СГБ, что, вероятно, свидетельствует о неспецпфическом характере выявленных изменений. При модификации цистамином биологических эффектов облучения в малой дозе отмечается более выраженный сдвиг показателей системы глутатиона по сравнению с исходными данными. Следует отметить, что рост соотношения концентраций ВГ/ОГ. активности Г-6-ФДГ и снижение уровня СГБ в тканях селезенки крыс оказываются достоверными не только по сравнению с пнтактными животными, но и с показателями животных групп контроля облучения и контроля введения препарата. Предварительное перед облучением в дозе 0.25 Гр введение крысам цистамина вызывает также эффект снижения содержания белковых тнолов в тканях головного мозга и печени: с 9.38±0.14 до 8.33±0.24 мкмоль/г ткани и с 17.2+0.7 ло 13.4±0.4 мкмоль/г ткани соответственно.

При модификации цистамином биологических эффектов облучения крыс в дозе 7.2 Гр в динамике показателей системы глутатиона был обнаружен ряд закономерностей, позволяющих высказать предположение о возможной - роли модификации глугатионового статуса тканей в механизме радиозашитного действия цистамина. Так, через сутки после модифицированного цистамином облучения в. полулегальной дозе не выявлялось статистически значимых 'изменений в содержании двух форм глутатиона по сравнению с данными контроля облучения. Вместе с тем, через 5 суток после модифицированного радиационного воздействия была отмечена практически полная компенсация радпанионно-пнлуиированного сдвига в соотношении концентрации ВГ/ОГ, отражающего активацию в тканях окислительного стресса. Так, сниженное в указанный срок при изолированном действии полулетального облучения в ткани селезенки соотношение концентраций ВГ/ОГ с 85.9+3.3 до 46.8±4.2. при модифицированном облучении составило 83.2±7.1

(р<0.01 по сравнению как с контролем облучения, так и контролем введения препарата). В ткани почек предварительное перед облучением в дозе 7.2 Гр введение радиопротектора обеспечило рост соотношения концентраций ВГ/ОГ с 46.1±2.8 до 71.6+5.7 (р<0.01), что превысило значение интактных животных -53.9±3.0. Увеличение значений указанного показателя по сравнению с изолированно облученными животными было отмечено и в ткани головного мозга: с 28.2±1.6 до 40.3±3.2 (р<0.01) при значениях интактных животных - 48.0±2.1.

Механизм изменений тиолового статуса, оцененного по соотношению концентраций восстановленной и окисленной форм глутатиона, вероятно, связан с индуцированным введением цистамина ростом активности во всех изученных тканях Г-6-ФДГ - фермента, лимитирующего скорость редокс-циклирования глутатиона. Необходимо отметить, что через 5 суток после модифицированного радиационного воздействия активность фермента в тканях селезенки - б8.6±1.7 мкмоль/(г белка-мин) и почек - 55.8±3.3 мкмоль/(г белка-мин) крыс статистически значимо (р<0.01) превосходила обнаруженную в тканях Животных группы контроля облучения, а в ткани селезенки - и контроля введения препарата.

Таким образом, данные литературы и результаты собственных и&следований позволяют рассматривать систему глутатиона в качестве одной из важных биохимических систем, ответственных за радиационную устойчивость клеток и тканей животных. Современные воззрения на роль системы глутатиона в процессах регуляции тиол-дисульфидного равновесия позволяют по-новому оценить роль глутатиона в обеспечении жизнедеятельности клеток в условиях радиационных воздействий, а также объяснить отдельные пути и механизмы реализации радиозащитного эффекта серосодержащих радиопротекторов.

ВЫВОДЫ

1. Значения активности ГП в тканях селезенки, головного мозга, почек и эритроцитах и активности Г-б-ФДГ в эритроцитах имеют сильную, положительную корреляционную связь с величиной ЛД50/30 мышей трех различных по радиочувствительности линий: BALB/c, белых беспородных и СВА. Зависимость величины полулетальной дозы от активности ГТ в эритроцитах и концентрации ОГ в тканях головного мозга и печени с межлинейными различиями радиорезистентности носит сильный отрицательный характер.

2. Повышение радиорезистентности крыс в осенний период сопровождается более высоким содержанием и тканях селезенки, головного мозга, печени, почек и эритроцитах периферической крови содержания ВГ, а в ткани селезенки - н более высокой активностью ГР и ГП по сравнению с аналогичными показателями, оцененными в весенний период.

3.' Большая радиоустойчивость крыс по сравнению с мышами может быть связана с достоверно более высоким уровнем восстановленной формы глутатиопа и белковых тиолов в ткани селезенки при низкой активности Г-б-ФДГ, ГТ и каталазы, а также повышенной активностью ГП в ткани печени и эритроцитах.

4. Вне зависимости от исходного уровня радиочувствительности животных, через сутки после облучения мышей и крыс в лозе 0.25 Гр на фоне незначительных изменений активности Г-б-ФДГ, ГР, ГП и IT в тканях селезенки, головного мозга, печени и ночек грызунов наблюдается рост соотношения концентраций В Г/О Г. К 5 суткам после радиационного воздействия в малой лозе статистически значимых различий соотношения двух форм глутатиопа или активности исследуемых ферментов его обмена по сравнению с ложпооблученным контролем не отмечается.

5. Через сутки после облучения белых беспородны* мышей в дозе 6.2 Гр и белых беспородных крыс в лозе 7.2 Гр в тканях селезенки, головною мозга, печени п почек наблюдается увеличение содержания ВГ, соотношения концентраций РГ/ОГ и активности ГП. В указанный срок после облучения мышей

линии СБА наряду с повышением -содержания ВГ и ростом активности ГП в указанных тканях отмечается достоверное увеличение активности ГР и ГТ. В то же время, через сутки . после облучения в дозе 6.2 Гр в тканях селезенки, головного мозга и почек мышей линии ВАЬВ/с определяется снижение соотношения концентраций ВГ/ОГ. Активация окислительного стресса в исследуемых тканях крыс выражена меньше и развивается лишь к 5-м суткам после облучения в полулетальной дозе.

6. Введение цистамина для модификации биологических эффектов облучения крыс в дозе 0.25 Гр приводит через 1 и 5 суток после радиационного воздействия к увеличению соотношения концентраций ВГ/ОГ, активности Г-6-ФДГ и снижению уровня СГБ в ткани селезенки, а также снижению содержания белковых тиолов в тканях головного мозга и печени.

7. При модификации цистами ном биологических эффектов облучения крыс в дозе 7.2 Гр через 5 суток после облучения наблюдается увеличение активности Г-6-ФДГ в ткани селезенки, что устраняет радиационио-индуцированное снижение соотношения концентраций ВГ/ОГ. В тканях головного мозга й почек крыс аналогичная динамика активности Г-6-ФДГ и соотношения концентраций ВГ/ОГ наблюдается как через 1, так и через 5 суток после модифицированного цистамином облучении в полулетальной дозе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В выполненных исследованиях показано, что при действии малых доз ионизирующих излучений происходит нарушение функционирования некоторых звеньев системы обмена глутатиона организма, В связи с этим, при изучении механизмов действия и нормирования дозовой нагрузки персонала при действии ионизирующих излучений представляет интерес изучение состояния системы глутатис а клеток, являющихся потенциальной мии.еныо повреждающего действия радиации. В процессе медицинского наблюдения за специалистами, профессионально связанными с действием ионизирующих излучений, было бы целесообразно исследовать

динамику активности Г-6-ФДГ и ГП эритроцитов как клеток, в которых, как в зеркале, отражаются малейшие нарушения постоянства тиол-дисульфидного равновесия организма.

2. Объяснение одного из возможных механизмов

реализации радиозащитного действия цистамина может

послужить основанием для проведения целенаправленного поиска радиопротекторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

VI. Определение концентрации восстановленного глутатиона в неочищенных гомогенатах ткани мозга // Итоговая конференция военно-научного общества слушателей академии.-Л.: ВМедА, 1991.- С.248.

2. Выделение клеточных органелл ткани мозга крысы методом центрифугирования в градиенте иерколла // Итоговая конференция военно-научного общества слушателей академии.-Л.: ВМедА.- 1992.- С.31 (Соавт. Д.В.Булавин).

3. Субклеточное распределение ферментов системы глутатиона в ткани головного мозга крысы // Цитология.- 1993.-N.6/7.- С.58-63 (Соавт. Л.А.Кожемякин, Д.В.Булавин,

B.В.Смирнов).

4. Система глутатиона при облучении в малой дозе и при действии цистамина // Конкурсная работа итоговой

..конференции- военно-научного общества слушателей академии.-СПб., 1994,- 49 с,

5. Система глутатиона при облучении в малой дозе // Актуальные' вопросы военно-морской гигиены, токсикологии, радиологии; Материалы науч.-нракт. конф,- Обнинск, 1994.-

C.95-96 (Соавт. А.Н.Гребешок, В.В.Смирнов).

6. Определение содержания окисленного глутатиона для прогнозирования исхода лучевого поражения // Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы: Материалы науч.-иракт. конф.- СПб, 1996,- С. 188-189 (Соавт. А:И.Карпишенко, А.Н.Гребешок).

7. Влияние цистамина на состояние системы глутатиона // Радиан, биол. Радиоэкод,- 1997 (В печати, соавт. А.Н.Греоешок).

Тип , s~lliu.fi .)л- .4$ '-ир .'¿о ¿7,