Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантная система организма при лучевом поражении и в условиях модифицированной радиорезистентности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антиоксидантная система организма при лучевом поражении и в условиях модифицированной радиорезистентности"

. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ' О ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Федченко Ольга Викторовна

АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗМА ПРИ ЛУЧЕВОМ ПОРАЖЕНИИ И В УСЛОВИЯХ

МОДИФИЦИРОВАННОЙ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1994

Работа выполнена в Ростовском государственном медицинскся университете.

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки Российской

Федерации, доктор медицинских.наук, профессор Шепелев А. П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Микашинович З.Й. ' .

доктор биологических наук, профессор Лукаш А.И.

Ведущая организация: • Радиологический научный центр

Российской Академии медицинских наук

Защита состоится " ¿У " 1994 г. в /О час. .

на заседании диссертационного. Совета Д ,084.53.01 при Роотов-!ском государственном медщинском университете .(344022, г.Ростов-на-Дону, пер.НаХичеванскнй, 29).'-••:'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского'универоитета.' : \'

Автореферат разослан

Учений секретарь с I • е ц на л и з ир ова н н ог о с ове та, доцент

Н.Я.Корганов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблема. В современном обществе все более [ичкваетоя использование источников ионизирующего излуче-Это касается многих отраслей промышленности, сельского [йства, медицины,' космонавтики и т.д. В связи с испытаниями ядерного оружия, авариями на атсм-установках наблюдается глобальное радиационное загрязнение ■жающсй среды. Учитывая беспороговость биологического воз-твия ионизирующего излучения, особую актуальность приоб-ют исследования влияния на организм малых и сублетальных облучения, так как отдаленными последствиями этого воздей-я могут являться раковые новообразования, наследственные ©адеиия, радиационное сокращение жизни. Изменение радиочувствительности клеток, тканей,организма лом. имеет большое практическое значение. Радиозащитный эф-обнаруксн для целого ряда веществ, различной химической ктурн, но все известные в настоящее время радиозащитные ства далеко не соответствуют требованиям, которые к ним ъявляются (П.Куна, 1989). Недостатка!*« химических протек-

I

в являются'побочные токсические эффекты и ограниченная олкителыюсть их защитного действия (1-2 часа) (В.И.Куз-в, Г.;86). Радиопротекторы биологического происхождения ываюгся неэффективными, если вводятся непосредственно пе-облучением. Для проявления защитного действия этих препа-в, как правило, требуется их. введение в течение одних и е суток до облучения (В.Г.Владимиров, Т.К.Джаракян, 1982). В последнее время внимание ученых привлекают антпокси-ные Ферменты, поскольку свободнорацикалыше реакции, раз-

- 4 - '

вивающиеся в облученном организме, являются существенными для формирования лучевого поракения (В.А.Гуоев с соавт., 1980). Следует ожидать, что антиоксидантные свойства биохимических компонентов клетки долкны играть вакную роль в обеспечении ее радиорезистентности.

Сведения о функциональном состоянии аятиоксидантной системы в постлучевом периоде в доступной литературе немногочисленны и противоречивы.

В свете изложенного изучение активности антиоксидантных ферментов при радиациошом поракении является весьма актуальным. Знание об особенностях функционирования системы антиокио лительной защиты организма и причинах ее несостоятельности в период развития свободнорадикального поракения могут послужит основой для разработки методов коррекции лучевых поврекдений или предупреждения их препаратами на основе экзогенных антиоксидантных ферментов. , . ' :;

Цель га б от и: выявить особенности изменения, активности ; ферментов антиоксидантной защиты системы крови в динамике поо радиационного периода и обосновать возможность коррекции луче еых поврекдений экзогенными .антиокислительными.ферментами;

Для достижения указанной цели был#■поставлены следующие задачи: ■■"• . - ■'■';.■■-.

1. Изучить активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов и клеток костного мозга в разные сроки после сублетального гамма-облучения. :

2. Разработать технологию получения комплекса супероксид дг.смутазы и каталазы. , ■ •.

3. Разработать оптимальную схему введения препаратов су-

перокоиддисмутазы и каталазы, а также их комплекса , обеспечивавшую радиопротекторный эффект при разных дозах гамма-облучения.

4. Исследовать радиомодифицирующее влияние экзогенных препаратов супероксидцисмутазы, каталазы и их комплекса на' антиоксидантный статус клеток крови и костного мозга при сублетальном гамма-облучении.

5. Определить функциональную активнооть нейтрофилов периферической крови и клеток-фагоцитов костного мозга при субле- . тальном гамма-облучении и в условиях. модифицированной радиорезистентности.

/- Положения, выносимые на защиту:

сублетальное гамма-облучение кивотных в ранние сроки вызывает снижение эффективности механизмов антиоксидантной защиты, следствием чего явилооь усиление перекисного окисления липидов. Возрастание функциональной активности макрофагов костного мозга в ранние .сроки и последующая активация ферментов антиоксидантной.защиты,являются отражением восстановительных реакций организма после сублетального гамма-облучения;

- введение антиоксвдантных ферментов (супероковддисмута-зы, каталазы и их комплекса) животным до облучения защищает клетки костного мозга, 'но не' предотвращает гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, хотя и способствует более раннему восстановлению их уровня а функциональной активности;

- корригирующее действие экзогенных антиоксвдантных ферментов реализуется через увеличение уровня восстановленного глутатиона в ранние сроки постлучевого периода и выраженную

активацию ферментов антиокислительной системы в более поздние сроки;

- новая технология получения комплексного препарата су-пероксиддисмутазы и каталазы.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое изучение активности ферментов внутриклеточной антиоксидантной защиты в динамике пострадиационного периода.

Установлено, что ведущим фактором антиоксидантной защиты клеток костного мозга.является система глутатион-глутатионре-дуктаза.

Впервые установлено, что корригирующее действие экзогенных антиоксидантных ферментов реализуется, в основном, через активацию глутатион-эавиоимой ферментной системы.

Показано, что экзогенные антиоксодантные. ферменты не защищают от гибели лейкоциты периферической крови, но способствуют защите клеток костного мозга. '

. Выявлено, что радиозащитное."действие антиокиолительных , '.' ферментов способствует более раннему восстановлению функодо-нальной активности нейтрофилов периферической крови. - '

Установлена динамика функциональной активности фагоцитирующих клеток костного мозга в.постлучевом периоде..

Разработана оригинальная технология получения бифункционального комплекса супероксидаисмутазы и каталазы. Теоретическая и практическая 'значимость работы:

- доказана эффективность радиозащитного действия антиоксидантных ферментов: сулероксидцискутазы, каталазы и их кдаллекса при сублетальисм гамма-облучении;

- выяснены механизмы модифицирующего влияния экзогенных анти-

• --7 -

оксидантных ферментов на резистентность организма я воздействию ионизирующего излучения;

- установлено, что ведущим фактором защиты костного мозга яв-ляетоя система глутатион-глутатионредуктаза;

- разработана новая технология получения комплекса суперок'сид-дисмутазы и каталазы. Получено разрешение на выдачу патента;

- результаты проведенных исследований и разработанная технология получения комплексного препарата судероксиддисмутазы и каталазы могут быть использованы для создания нового поколе-, ния радиопротекторных препаратов, отличающихся безвредностью и эффективностью.

Апробация работы.Материалы диссертации доложены на 10-м научном семинаре "Кислородные радикалы в химии, биологии, медицине" (Минск, май 1992 г.); 4-й Всесоюзной конференции "Био-антиоксидант" (Москва, июнь 1992 г.). Апробация диссертации проведена на конференции лаборатории разработки и испытания новых лекарственных препаратов НПО, "Биопрепарат" 3 апреля 1994 г., а также на заседании кафедры общей и клинической биохимии Л I Ростовского медицинского университета 13 апреля 1994г.'

(

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 7 научных 'работ', из них' 5 - в центральной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, спгска литературы. Работа изложена на 167 страницах ташиноппсного текста, иллюстрирована 16 рисунками и 19 таблицами. Список литературы Екяючает 102 отечественных и 91 зару-беяннй источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНМ

В работе были использованы антиоксвдаптные ферменты эритроцитов человека: каталаза и супероксидцисмутаза (НПО "Биопрепарат"), а такке комплекс ферментов супероксиддисмутазы и ка-талазы, полученный по разработанной нами технологии.

Активность супероксидцисмутазы в комплексном препарате определяли по методу с.с^1п*егЪоигп (1975), каталазы - по методу М.А.Королюк (1988). Электрофоретическую чистоту комплекса ферментов определяли методом вертикального диск-электрофореза в блоке полиакриламидного геля (Г.Маурер, 1982). Токсичность ферментных препаратов изучали на белых беопород-ных мышах массой 18-20 г (1Ф Н, 2).

Моделирование радиационного поракения проводили о помо-

сл

шью гамма-аппарата "Рокус-М", источник с радионуклидом Со,- . активность 146,6 терабеккерелей, мощность 46 сГр/мин. Определение радиопротекторных свойотв, оптимальных доз и временй введения ферментных препаратов проводили На летально облученных (8,5 Гр) мышах-самцах линии СВА. Наблюдения за кивотныки вели в течение 30 дней. Об эффективности радиопротекции оуди-ли по проценту выкивших кшотных и аредней продолжительности кизни ("Методические .рекомендации по экспериментальна-^ и клиническому изучению радиопротекторов", 1981). Исследование состояния, внутриклеточной системы антиоксидантной защиты организма проводили на сублетально облученных вивотных (3 Гр). Животных забивали декапитацкей на 7, 14, 21, 28-е сутки эксперимента

Активность антиоксидантных ферментов и уровень восстановленного гяутатиона определяли в эритроцитах и клетках костного мозга и пересчитывали с учетом содержания в биологическом ка-1

' ' - 9 -

i • ■ ;

териале гемоглобина- или белка. Активность супероксидцисмутазы (СОД)- определяли по. методу C.C.winterbourn (1975), каталазы -методом Г.А.Бабенко (1976). Глутатионпероксвдазную (ШО) активность определяли с помощью метода С.Н.Власовой (1990), глу-татионредуктазную (ГР) - методом Л.Б.Юсуповой (1989). Уровень восстановленного глутатиона определяли по методу G.L.Eiiman (1959),. Концентрацию малонового диалвдегида (МДА) в плазме крови .определяли с помощью метода Л.И.Андреевой (1988). Определение уровня лейкоцитов периферической крови и мие.локарио-цитов костного мозга проводила унифщированнши методами подсчета в камере Горяева (В.В.Меньшиков, 1987).

, Функциональную активность нёйтрофилов и клеток-фагоцитов коотного мозга,исследовали с помощью хемилюминесцентного метода (H.Faden , N.Maciejewski , 1981) на хемшцоминометрах LKB 1251 (Швеция) и ХЛ 3603 производства СП "Диалог".

Статистическую обработку цифрового, материала проводили общепринятыми методами (Г.Ф.Лакин, 1990).

С У: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ IÍ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами разработана технология получения комплексного пре-,' парата из дратроодтов человека,;состоящего' из ферментов супер-

око иддисмутазы и каталазы в соотношении 1:2 соответственно. . Технология включает в себя стадии и операции, представленные на схеме I. '

' Активность супероксидаисмутазы в I мг комплексного препарата составляет 800-900 ед ., каталазы 28-30000 ед. Электро-•форетическая Чистота - 96$. Разработанная технология получения комплекса супероксидцисмутазы и каталазы не имеет аноло-

- 10 ь-

Эритроциты

Отмывание, гемолиз,, осаждение

итмшзсшис, гсмилда,. ииаадсппа

гемоглобина, центрифугирование

Супернатант I

Удаление балластных белков с помощью изменения рН супернатанта, центрифугирование

Супернатант П

Осаждение ацетоном комплекса супероксидцисмутазы и каталазы, центрифугирование

Комплеко оупероксид-дисмутазы и каталазы

I

Диализ, стерилизующая фильтрация, лиофильное высушивание

Лиофилизированный, очищенный комплекс супероксиддисмутазы и каталазы

Схема I

roa ни в нашей стране, ни за рубежом.

Использованные в работе ферментные препараты суперокоид-дисмутазы, каталазы и комплекса суперокоиддисмутазы и катала-

w ¡

зы исследовали на безвредность. Введение перечисленных препаратов в дозе 1000 мг/кг массы белым беспородным мышам не вызывало их гибели на протяжении 14-ти дней наблюдения, что Позволяло, оценивать их как нетоксичные. " ' У

При изучении радиопротекторных свойств ферментных препаратов были определены оптимальные время введения ферментных, препаратов - I час до облучения и дозы: 5,5 мг/кг для катала-~ зы (30%-ное выживание животных); 25 мг/кг для супероксиддис-мутазы (65^-ное выживание животных); 6 мг/кг для комплекса : ферментов (50#-ное выживание животных).

В работе было изучено влияние сублетального гамма-облучения на состояние факторов антиоксидантной системы эритро-

- II -

I • ■ •' <

цитов и клеток костного мозга.

На 7-е сутки после облучения ншвотних в эритроцитах отмечали достоверное снижение глутатионпероксидазной активности на 22$ и увеличение супероксиддасмутазной на 24$, без существенных изменений уровня восстановленного глутатиона и активностей каталазы и глутатионредуктазы (табл. I). Повышенный уровень активности супероксиддасмутазы, вероятно, в этих условиях не в состоянии обеспечить защитный эффект. Возмошю, что свободнорадикальное нарушение гомеостаза клеток оказывается одной из причин, запускающих цепь адаптивных реакций организма, что и наблюдалось на 14-е сутки постлучевого периода.

Так, в этот срок отмечали общую активацию ферментов антиоксидантной системы эритроцитов: супероксиддисмутазы -на 42$, яаталазы - на 40$, глутатионредуктазы - на 82$ в сравнении с показателями интактных кивотных. Уровень активности глутатион-пероксидазы повышался на 42$ в сравнении с предыдущим срокш, а уровень восстановленного глутатиона увеличивался в сравнении о контролем на 36$. На 21-е и 28-е сутки значения активности перечисленных ферментов и уровень восстановленного глутатиона были в пределах нормы.. •

Нами <5ыдр установлено, чтоантиоксвдантная защита клеток костного мозга, в основном,'представлена глутатионредуктазой и -восстановленным глутатионсм. Активности супероксидцисмутазн и каталазы в них крайне низкие'(порядка нескольких единиц), глутатионпероксидаза отсутствует. В костном мозге на ?-е сутки после оублетального облучения отмечали достоверное снижение активности глутагиойредуктазы на 26%. Это сопровождалось они-кением уровня восстановленного глутатиона в 2,6 раза (табл.2).

Таблица I

Динамика уровня МДА в плазме крови и активности анти-оксидантных ферментов в эритроцитах мышей после сублетального гамма-облучения в дозе 3 Гр

Показатель

Интактные животные -(контроль биологич.)

Контроль облучения

7-е сутки

14-е сутки

21-е сутки

28-е сутки

МДА 8,77+1,05 (нМоль/мл плазмы)

. СОД 67,1+4,6

(усл.ед/г белка)

Каталаза (мг нго2/г ньв мин.)

14,9+0,42

ИГО 0,145+0,009 (мкМоль азвс/г нь в мин.) •

ГР 0,163+0,005

(МОЛЬ N70)111/ I Моль НЬ в сек)

Восстанов- 0,011+ ленный 0,0009"

глутатион (мИоль/г нъ)

23.2+ 2,61"

Р <0,001

83,5+ 4,20"

Р<0,05

14,2+• Р>0,05

0,113+ 0,003

Р<С0,01

0,146+ 0,017"

Р>0,05

0,013+ 0,0002

Р>0,05

11.55+ 0,£ ~

Р< 0,05

Рх<0,01

95,5+ 9,80"

Р<0,05

Р1>0,05

20.9+ 0,24

Р <0,001 Р1<0,001

0,161+ ' 0,004"

Р>0,05

. Р|<0,001

0,298+ О! 017" '

Р<0,р01

Р^<0,001

0,015+ 0,000?

Р<0,01

Р-^О.ОО!

10,68+ 0,16

Р>0,05

Р|>0,05

55,9+ 3,10"

Р>0,06

Р?<0,01

16,8+ 1,13" ;

Р<0,05

Р1<0,001

0,145+ 0,005"

Р>0,05

Р^О.Об

0,189+ 0,007" • '.. Р<Т), 05' Р^О.ОО!

0,013+ 0,001?

Р>0,05 р1>0,05

8,59+ 0,23"

Р>0,05

Р1<0,001

58.4+ 1,1 ~

Р>0,06

Р^>0,05

16,4+ 0,19"

Р<0,05

Р^О.Об

0,142+ •0,002" . ;

р>о,об;

Р|>0,.05 '

0,179+ - ' 0,042"

Р>0,05

Р^О.Сб

0,013+ ■'"" 0,0003

Р>0,05

^>0,05

Примечание: Р - достоверные отличия от показателей интактных кивотных; - достоверные, отличия между сроками ' эксперимента.--

- 13 -

' ' ' . ' . Таблица 2

Динамика уровня вооотановленного глутатиона и

активности глутатионредуктазы костного мозга

мышей после гамма-облучения в дозе 3 Гр

Интактные На фоне облучения Показатель животные -■—

(контроль биологич.) 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки

Восстановленный/ 0,267+ 0,041" 0,098+ 0,010" 0,365+ 0,001" 0,449+ 0,007" 0,442+ 0,015"

глутатион (Мппъ/г Р<0,01 Р<0,05 Р<0,05 Р^.0,05

белка) Р1<0,001 Р1<0,001 Р^О, 05

'ГР' 58,7+ (Моль ШШРН/ 5,0 ~ 43.6+ 3,0 ~ 36,1+ 0,8 ~ 53,6+ 2,ё ~ 63,4+ 3,* "

1 г белка в сек.) Р <0,05 Р<0,01 Р1>0,05 Р>0,05 Р-^О.ОО! Р >0,05 Рр>0,05

Примечание: Р- достоверные отличия от показателей интактных животных;-Р| - достоверные отличия между, сроками эксперимента.

К 14-м суткам отмечали статистически значимое увеличение концентрации восстановленного глутатиона в 3,7 раза по сравнению с предыдущим сроком. Активность глутатионредуктазы продол-кала оставаться ниже нормы. К 21-м суткам уровень глутатиона . продолжал нарастать и превышал контрольные значения на 68$. . 1а 28-е сутки концентрация глутатиона оставалась на том же зысоком уровне. Активность же глутатионредуктазы в эти сроки щходилась в пределах нормы.

Уровень МДА в плазме крови на 7-е сутки пост лучевого юриода возрастал почти в 3. раза, что являлось следствием 'силения свободнорадикалыюго окисления липидов. К 14-м сут-ам наблюдали статистически значимое снижение концентрации

МДА, но тем не менее значения этого показателя оставалиоь .Выше контрольных на 32$. Следствием мобилизации антиоксидантной системы, которую отмечали со второй недели постлучевого периода, явилось снижение уровня МДА до нормальных значений на заключительных этапах эксперимента.

В данном эксперименте степень радиационного поражения оценивали по двум наиболее надежным в-радиобиологии критериям: клеточности костного мозга и уровню лейкоцитов в периферической крови.

На 7-е сутки после облучения наблюдали достоверное снижение уровня миелокариоцитов костного мозга в 1,7 раза. Количе-. ство лейкоцитов в периферической крови уменьшилось на 42$, а '■ их функциональная активность - на 78$ по сравнению с'контролем. К 14-м суткам количество миелокариоцитов костного мозга, а также уровень и функциональная активность лейкоцитов иерифе-ричеокой крови не достигали показателей интактных животных., Лишь'на 21-е сутки уровень миелокариоцитов .восстанавливался>.• ■ до уровня нормы. Количество, же лейкоцитов и их функциональная активность оставались достоверно ниже контрольных значений. Восстановление функциональной активности лейкоцитов перифери- . ческой крови отмечали на 28-е сутки, т.огда ка& уровень их все еще не достигал исходных величин интактных животных..

При изучении интенсивности стимулированной хемилюминес-ценции клеток-фагоцитов костного мозга, к числу которых относятся радиорезистентные стромальные макрофаги, а также'зрелые нейтрофилы, наблюдали выраженное усиление окислительного, метаболизма, особенно проявившееся на 7-е и 14-е.сутки после облучения. Вследствие опустошения костного мозга-на первых

двух неделях постлучевого периода'повышение интенсивности хе-милюминесдендии связано со стимуляцией фагоцитоза, осуществляемого стромальными макрофагами, вызванной накоплением продуктов клеточного распада.

Ряд авторов ( б.С.ВавЪу , 1986; , 1984) связывает

усиление окислительного метаболизма стригальных макрофагов с активной продукцией веществ, стимулирующих гемопоэз. К ним, в частности, относятся эритропоэтины, колонвестимулирующие факторы, интерлейкин-1.

К 21-м суткам интенсивность хемллюминесценции достоверно сниналась вследствие уменьшения факторов, активирующих фагоцитоз, но продолжала оставаться выше нормы. Подтверждением нормализующей функции стромальных макрофагов являлось восстановление до контрольных значений количества миелокариоцитов -костного мозга на 21-е сутки после облучения. Следствием яе восстановления функции' костного мозга являлось повышение уровня, лейкоцитов периферической крови на 28-е сутки эксперимента. Вторая волна повышения интенсивности, стимулированной хемилюминесценции (28-е сутки), возможно, связана с процентным • увеличением зрелых нейтрофдлов в исследуемой суспензии костного мозга вследствие.восстановления ,его'функции.

Таким образом, в ответ на облучение в организме развивалась стрессовая реакция, проявившаяся в резкш усилении в ранние сроки перекисного окисления липидов на фоне снижения эффективности механизмов антиолсидантной: защиты. Следствием деструктивных процессов, развивавшихся в клетках, являлось формирование типичного'костномозгового синдрома: снижение числа миелокариоцитов в костном мозге и.лейкоцитов в периферической

-16 - •

крови. Возрастание функциональной активности строиальных макрофагов костного мозга на 7-14-е сутки после облучения, а также мобилизация ферментов антиоксидантной защита наряду с повышением уровня восстановленного глутатиона на 14-е сутки, рав-' но как и восстановление клеточности костного мозга", функциональной-активности лейкоцитов периферической крови и приближение к нормальным значениям их количества, являлись отражением восстановительных реакций организма пооле сублетального гамма-облучения.

Нами было показано, что защитный эффект антиоксвдантных ферментов, введенных животным за Г час до сублетального облучения а дозах: супероксиддиомутаза - 25 кг/кг, катала за - " 5,5 мг/кг, комплекс супероксиддисмутазы и каталазы - 6 мг/кг - реализуется в ранние сроки после облучения путем повышения уровня восстановленного глутатиона как в эритроцитах, так и в клетках костного мозга. Так,, при коррекции отмечено увеличение содержания глутатиона на 7-е сутки эксперимента в эритроцитах . почти в 2 раза (рис. I), а в костном мозге - в 5 раз до сравнению с теми ке показателями контроля облучения. • . .•

Выраженную активацию ферментов, антиокоидантной системы .. эритроцитов: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы - наблйдали в'более отдаленные сроки после облучения, что свидетельствует в пользу предположения о необходимости более длительного периода для комплексной мобилизации этих факторов внутриклеточной защити (рис. 1,2).

Таким образом, при коррекции экзогенными антиоксидантными ферментами наиболее, ярко проявилась эташюсть "включения", эво-люционно выработанных механизмов аятиокислителыюй защити: использование восстановленного глугатйойа лак не специфического

ол/к 2,0

1,5

1,0

0,5

3,0 Г,5 1,0 0,5

2,0 1,5 Г,О 0,5

/Ч

' .. ^ \ У • •

у \

/ ^

/

/

\

\

/

§ о

ф

ец К

о «

&

о со

СП

ф к

£

£

&

§

о

« ГЯ

со

яя И Еч Ф СП &И

яо

3°

§>5

7 14 21 28

• сутки

Рис.1. Динамика активности глутатионлероксидазы, глутатионредуктазы, уровня восстановленного глутатиона эритроцитов и МДА плазмы крови мышей в условиях модифицированной радиорезистентности.

Показатели интактных животных приняты за единицу.

—. —._ПЮ;______ГР;___восстановленный

глутатион; __ МДА.

оп/к 1,5

1,0

0,5 1.5

1,0

0,5

1,5 ■

1,0

0,5

-ч

ч

а«

ф о ап

к го н

18.

3

ФО я р< (0

а о ч к о го гй н га о га с « м

7 14 21 28

сутки

Рис.2. Динамика активности супероксиддисмутазы, каталазы эритроцитов и уровня МДА плазш крови мышей в условиях модифицированной радиорезистентности. Показатели интактных животных приняты за единицу. ______СОД;'___каталаза; __ ¡\1ДА.

. . - 19 -

универсального фактора "быстрого реагирования" и последующее подключение узкоспециализированных антиоксидантных ферментов.

В ряде работ утверждается, что механизм повышения резистентности клеток при стрессе осуществляется путем увеличения уровня восстановленного глутатиона, в основном, за счет его биосинтеза.

Так, О.К.Гаврилов с соавт. (1985) при изучении метаболизма глутатиона в клетках крови констатировал невозможность импортирования его в эритроциты. Постоянство'ке его поддерживается внутри клетки синтезом de novo. Эти ке авторы утверждают, что возможность интенсивного биосинтеза восстановленного глутатиона необходима эритроцитам при действии окислителей в больших концентрациях.

Подтверждением активации синтетических процессов в эритроцитах при стрессе могут являться данные З.И.Микашанович (1989), полученные в экспериментах на животных при действии травматического шока или.оотрой кровопотери, и свидетельствующие о накоплении АТФ в эритроцитах.

Другим свидетельством интенсификации синтеза глутатиона в клетках в условиях стрес'са являются данные c.H.Rouser (1982), который, исследуя радиозащитный эффект згаЬзана, показал усиление биосинтеза восстановленного глутатиона в макрофагах и увеличение более чем втрое его выхода из этих клеток. Это, по мнению автора, способствовало защите от оксидантов как самих . мононуклеаров, так и окружающей среды.

В нашей работе мл обнаружили аналогичные механизмы повышения резистентности организма к воздействию проникающей радиации. По-вмдглому, экзогенные елтиоксвдаптпые ферменты повышают адаптационные возможности органпзма, характеризующиеся уси-

- 20 -

яоннем метаболических процессов, а также способствуют сохранению потенциала антиоксидантных ферментных сиотем.

В связи с вышеизложенным повышение уровня восстановленного глутатиона на 7-е сутки после облучения в эритроцитах и клетках костного мозга на фоне низкой или неизменной активности глутатионвосстанавливающего фермента.- глутатионредуктазы можно объяснить активацией его синтеза de novo в этих клетках. Переход же на глутатионредуктазный путь поддержания глутатиона "включался" в более поздние сроки постлучевого периода и наблюдался при снижении уровня восстановленного глутатиона до нормальных значений. Вероятно, что в этот период завершается реализация "экстренного" механизма защиты клеток, заключающегося в интенсивном синтезе и расходовании глутатиона, и клетки переходят на обычный путь поддержания глутатиона в- восстановленной .форме - глутатионредуктазную реакцию.

Результатом корригирующего действия экзогенных антиокси- , дантных ферментов явилось предотвращение накопления МДА' в плазме крови'(рис. I), а также сохранение количества миелокариоци-тов. костного мозга на уровне нормы на протяжении всего орока эксперимента. Однако необходимо отметить, что экзогенные ферменты. не защищали от гибёли полиморфноядерные лейкоциты периферической крови, но,'проявляя свое протектшзное действие на клетки костного мозга, способствовали более раннему восстановлен™ их уровня и функциональной активности. Так, при коррекции лучевых повреждений антиоксидантннми ферментами уровень и Функциональная актглнссть нейтрофилов периферической крови восстанавливались к 21-м суткам эксперимента. В контроле ке облучения функциональная активность нейтрофилов восотанавли-ва.чгсь лишь на 28-е сутки, в то.время как их уровень в этот

| - . срок так и не достигал нормальных значений. Другим подтверждением защитного действия экзогенных антиоксидантных ферментов явилось отсутствие выраженной активации стромалышх гжак-рофагов костного мозга, проявившееся в нормальних иначонинх стимулированной хемилюминесценции на ранних сроках постлучевого периода в случае коррекции каталазой и комплексом ката-лазы и супероксидцисмутазы, и в гораздо меньших, чем у контроля облучения, значениях этого показателя При коррекции су-перокс идцисмутаз ой.

В целом результаты проведенных исследований дают представление об особенностях изменения активности ферментов антиок-сидантной защиты системы крови в динамике постлучевого периода; раскрывают механизм радиозащитного действия анткоксидант-ных ферментов (супероксидцисмутазы, каталазы и их комллекса), заключающийся в повышении эндогенного фона восстановленного глутатиона и сохранении потенциала антиокислительных ферментных систем. Представленные результаты дают основание рекомендовать дальнейшее изучение ферментных антиоксидантных препаратов в качестве перспективных радиопротекторов при лучевом поражении средней тяжести. " •. . , . ■ _ , ВЫВОДЫ • '

I. Сублетальное гамма-облучение животных в ранние сроки приводит к подавлению в клетках костного мозга активности глутатионредуктазы и снижению уровня восстановленного глутатиона. В эритроцитах наблодяетси оми-ети- (м^гптимиифоксадмэной активности и повышение супероксвдцш;|/:у,газноИ, без существенных изменений уровня восстановленного глутатиона и активности каталазы и глутатиснредукгази. Олидотвпеи снижения эффективности механизмов антиоксвдантной запиты явилось усиление переписного

окисления липидов. ■

2. Возрастание функциональной активности макрофагов костного мозга на 7-14-е сутки и активация ферментов антиоксидант-ной защити наряду с повышением содержания восстановленного глутатиона на 14-е сутки являются отражением восстановительных реакций организма после сублетального гамма-облучения.

3. В клетках костного мозга активности супероксиддисчута-зы и каталазы чрезвычайно низкие. Выраженные'изменения претерпевает система глутатион-г'лутатионредуктаза, что позволяет, считать ее ведущим фактором антяоксидантной системы клеток костного мозга.

4. Введение, антиоксидантных ферментов (супероксиддисмута-зы, каталазы и их комплекса) животным до облучения защищает клетки костного мозга, но но предотвращает гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, хотя и способствует более раннему, чем у контроля облучения, восстановлению их уровня и функциональной активности*

5. Корригирующее действие экзогенных антиоксидантных ферментов реализуется через увеличение уровня восстановленного глутатиона в ранние сроки постлучевого периода и выраженную активацию ферментов антиоксидантной системы в более поздние сроки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Колориметрический метод определения каталазной активности в эритроцитах (Свечникова Л.В. ,Дкмп?рг.ади H.A., Благородов С.Г.). - // 4-я Всесоюзная конференция "Епоаптиоксидапт", Тез. докл. -!,!., 1992. - T.I. - С.94-95.

2. Изучение антирадикального эффекта каталазы при летальных дозах гамма-облучения (Свечникова Л.В., Благородов С.Г., Шепелев А.П.). - // 4-я Всесоюзная конференция "Еиоанти-оксидант", Тез. докл. -М., 1992. - Т.1. - С.225-226.

3. Способ получения комплекса антиоксидантных ферментов су-пероксидцисмутазы и каталазы из эритроцитов человека Свечникова Л.В., Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева H.A., Кесельман Э.В., Межова И.В.). -й 4696378; Заявл. 30.08.93. "

4. Способ получения каталазы из эритроцитов человека (Благородов С,Г., Свечпикова Л.В., Шепелев А.П.). -JS 4696379; Заявл. 30.08.93.

5. Функциональное состояние аптиОкоидантной системы в пост. лучевом периоде (Шепелев А.П.). - // Известия СКЕЩ ВШ. -

•■ 1993. - Ii 3. - 4. - С.172-177.

6. Радиопротекторное действие препаратов супероксиддисмута-зы, каталазы и их комплекса при сублетальном гамма-облучении // 48-я итоговая конференция студентов, молодых

, ученых,-и специалистов ВШ.' - Ростов-на-Дону, 1994. - С. 17.

7. Хемилюминеоценция-лейкоцитов крови и клеток костного мозга.

-. в условиях' радиомодифицирующего воздействия экзогенных су-

■ пероксйддисмутазы, каталазы и их комплекса // 48-я итоговая конференция молодых ученых,- студентов и специалистов Н.Ш.' - Ростов-на-Дону, 1994. - С. 17.

-Печать офсетная.Объем I п.л.Тиран 100 Заказ ..15.09.94г.Ростовский ЦНТИ.