Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕТА-КАРОТИНА И ТЕРМОШОКА КАК ФАКТОРОВ, ПОВЫШАЮЩИХ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМОВ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ БЕТА-КАРОТИНА И ТЕРМОШОКА КАК ФАКТОРОВ, ПОВЫШАЮЩИХ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМОВ"

■ * пвшюпроц cccp

• • III- i - i '

•г'* 'Y'

CtéJ i

ВСЕСОШ1Ш HAyW4CCJ^BATEIfcGJflffl ЖТИТУТ СЕЯЬСКОХОЗЯЙСТВШгЙ ' РАДДОШПИ

На правах рукописи

' ГИКОДВЙДИ Тамара Ивановна

УДК* 577.391.576.311.347. ; "■"■ 57? ¡35214651546 [41 '

ИХШДВАНИЕ /чОРОТША И TEPUCöQia КАК ФАКТОРОВ,

ОЗ. 00. OX - ^дао0кодогм

Л вт opе ф е р а х

:■.■ . V M; I- .у, ч .

диооертавдш на соискание ученой степени: '.' кандидата' йиадотаескюГнаук '

■ ' Обнинок

• •■ • •- Чт f ' V 1' ^ ï.'1'-' i1 л - •

Гжо-с?/¿¡г?с-.

Работа выполнена в~лаборатории молекулярной радиобиологии Института биологической физики АН ОССР.

Научные руководители: член-корреопонцент,доктор биологн-.' ческих наук А.Ы.КУЗИН, ,;

кандидат биологических наук

' и.ы.вижнчик ..

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ,; С.Р.ЛШСШ;;

доктор биологических наук

и.н.шков _ . V

Ведущая организация: лаборатория радиационной биофизика Московского государственного университета им. Ы. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится * 2Х ■ февраля 1989 г. в •' ■ часов на заседании Специализированного совета

Д 120.81.01 ори Всесоюзной научно-исследовательской институте сельскохозяйственной радиологии Госагропрома ОССР по адресу: г.Мосхза, ул. Белинского,4. ■ / ■ .

С диссертацией можно ознакомитьсяв библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии. -

Отзывы просьба направлять по адресу: 2490020, г.Обнинск Калужской обл. , СпецианизирсшанныА совет Д 120.81.01.

Автореферат разослав

- 1989 г.

Ученый секретарь Совета кандидат;биологических наук

Н.И.САНЖАРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКГШКЯИГСА РАБОТЫ

Актуальность теми. Разработка наваг путей повышения радпо-. резистентности организмов является одной из ведущих пройдем современной радиобиологии. Развитие атоыной энергетики, непрерывное расширенна применения человекам nostra ируотвдх излучений a различных областях науки it техники, что иногда может приводить к чрезвычайно острой ситуация в отношении окружающей его среды, делают весьма актуальными исследования всевозможных путей повышения устойчивости организма к пораяащеиу действию радиации (Александров А.П., 1978; Алексахкн Р.Ц.» 1979, 1982; Кузин A.M., 1980).

Повышение радиорезистентности с помощью введения в организм различных радиопротекторов представляет собой давно в интенсивно разрабатываемую область радиобиологии. Этому вопросу посвящен ряд монографий (Бак 3., 1968; Романцев Е.Ф., 1968; Граевокий ЭА, 1969; ГродзинскиЙ Д.Ы.» Гудков И.Н., 1973; Эйдус ДД., 1971, 1979; Ярмонекко С.П., 1979; Мозяуиш A.C., РочинскиЙ Ф.Ю., 1979; Кудряшоэ Ю.Б., Беренфельд b.c., 1932; Гончаренко E.H., Кудряшов Ю.Б., 1985» и др.).

Меньше внимания уделялось возможностям использования физических факторов для повышения радиорезистентности растений (Березина H.U., Нариманов A.A., 1969; Куликов H.B; о соавт., 1971; Аливд Д.К., Тарчевская C.B., 1983; Гудков И,В., 1985).

Настоящая работа по существу является одной из первых райщ ... в которой была изучена возможность повышения радиорезистентности грызунов с помощл препарата "каротина", а растений с помощью физического воздействия — умеренного прогревания. -

Цель работы. Поиски путей повышения радиорезистентности животных и растительных организмов с помощью ранее не исследованных факторов химической и физической природа, соответственно, препарата "каротина" и умеренного прогревания или малых доз U -облучения.

Зая^-^и исследования. В задачи настоящего исследования входило: I. Изменив на крысах и мышах радиозаввггного в терапевтического действия препарата "каротина", а также совместного действия препарата "каротина" а раствора ДНК. 2. Выяснение причин терапевтического действия экзогенной ДНК. 3. Определение оптимальной температуры предварительного умеренного прогревания и величины малых доз предварительного облучения,- вызывающих увеличение термо- в радиорезистентности у щюроотков кукурузы. -4.~ Исследование влияния малых доз облучения или прогревания на

Г-Л=2МЪ£^ ' 1

ti'jiitj сльяая twijiKOTEKa '("-i'.v.-Я epatca t' -j. rt <it:-w

1 i, ; > fi . t

повышение термо- и радиорезистентности проростков кукурузы, 5. Изучение закономерностей а возможных причин развития терио-и радиорезистентности, вызванных предварительным умеренны:« прогреванием или облучением у растений.

flavpîag новизна. Впервые показало радаозасдатное действие препарата "каротина". Выявлено очень ценное свойство препарата — оказывать практически одинаковый защитный эффект как при под&о-хвоы введении, так:и при приеме per оз. Доказана возможность усиления действия "каротина" введением после облучения экзогенной ДНК. Впервые показано, что термо- и радлошок повышает термо-и радиорезистентность. Установлено сходство кинетик развития • этих явлений; отмечено, что в обоих' случаях наблюдается синтез всшых белков, что свадетельствует о близости механизмов наблюдаемых процессов.

Теоретическая и практическая зкдчта-тость работы. Проведение исследование расширило представления о возможностях использования природного антиокснданта / -каротина как одного, так и в комплексе о ДНК для снижения радиационного поражения животных. Выявленное сходство в развития термо- и радиорезистентности под влиянием термо- и раддошока развивает представления о связи радиорезистентности с устойчивостью организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что может представлять интерес для общей радиобиологии. Исследованный препарат "каротин" перспективен для.использования'в практике.

^ттти^ягдга работы. Основные результаты работы докладывались на У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987); на Всесоюзном совещании "Возможные пути снижения канцерогенных рисков, вызванных облучением" (Пущино, 19Э8); на У Всесоюзной школе по радиобиологии (Пермь, 1988),

ДгбддкодИ. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. ;

Объем и структура твтпяптятттт. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, вшшчажвдей описание материалов и методов исследования, результаты исследо-, ваний и обсуядение, заключения, выводов и списка цитированной' дитературы(166 ссылок). Диссертация изложена на 94 страницах ыашинописного текста, содержит 23 рисунка и 4 таблицы.,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 3-х месячных красах-самцах дттщ "Вистар" весом 140-170 г к беспородных белых шаах-самцах весом £0-25 г, которых ссщержаж на обычном виварном раддоне. Всего в работе использовано 644 шши и 346 крыс,

. Облучение животных во всех экспериментах проводили в одно и то же время, с 13 до 15 ч, -лучами 137Се на установке ГУИОС в дозе 7; 7,5; 8 Гр, мощность дозы 2,93 Гр/мин.

Препарат ß-каротина (под названием "каротин") бия получен с помощью микробиологического метода с использованием культура гриба Bioksiea trie рога. Эта технология разработана на Краснодарском комбинате биохимических■я витаминных препаратов им. К, Маркса при участии Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР. I ил "каротина" содержит 2 иг ^-каротина.

Мишей кормили творогом, содержащим "каротин" (на 10 г творога 0,Х мл "каротина"), в те чеша 3-х и 7-да дней до облучения. Крысам "каротин" вводили в объеме 0,1 ид (1,3 иг/кг) подкожно или per ов через зонд в разные сроки до облучения, а спустя 21ч после облучения "каротин" вводили совместно о ДНК (I us, 33,3 мг/кг).

В экспериментах использовали ДНК кз сперш сальдо! (Serra, ФРГ). ДНК растворяли в буфере 0,1 U На ci, 0,01 II дитрат-Еа,. 0,01 Î1 Трис-нс1, pH 7.

Хкнопдашй радиотоксин регактенон выделяли из клубней картофеля, облученных ¡f-дучаыи в дозе 150 Ifc, по методу В. А.Копы-лова с соавт. (1976), хроматографию проводили на бушге ГИ, (ГДР) с растворителем н-бутанод-уксусная кислота-^о (4:1:2) и ка шгастинке "Sllufol» (ЧССР) с растворителем хлороформ-ецетои-муравьиная кислота (6:1:3) восходящим способом. Для выявления на тонкослойной и бумажной хроматограммах исследуемых вещает» использовали хемископ с фильтром 260 нм с флюоресцентным экранам и специфическую реакцию та хинон с к J + крахиал + B^so^. Количественные изменения регактенона проводили та СФ-4А и спектрофотометре uv 7J3 Specord (П£Р). Биологическую активность испытуемых веществ определяли на 3-х суточных проростках кукурузы (сорт Стерлинг) и на семенах огурцов (сорт Зеленоплодные), измеряя прирост корней (см) с 4-го на 5-й день.

Использовали ДЕК из сперык сельди (serra, ФРГ), растворенную в 0,15 M Nsci, рабочий раствор содержал 0,1% ДНК. . . . Исследование влияния радио- и термошока на радиорезистентность проводили на 48-часовых проростках кукурузы (сорт Стер-

лшг). Их прогревали в ультратермостате (точность +0,1°), а. облучали - на установке 1УД0С в дозе I, 2, 3 и 10 Гр при мощности . дозы облучения 3,75 I^/шн. Угнетаыцее действие тепла ила радиации на проростка количественно определяли согласно методике, предложенной Греем и йолесом (gray l.h., scheies a.n., 1951), путем измерения прироста главного корня о 5-го на 6-й день рос- ■: та в дшиностате при 27°. Развитие,,у проростков кукурузы радио- . рэзпотентности под ,'влаянием термошока или относительно малых до облучения (1-3 Гр) определяли по отношению к ингибирувдему рос*" аффекту облучения в дозе 10 Гр, а терморезастентность - по' от ншешш к аффекту прогревания при 45° в течение 30 инк. .

Для изучения роли индукции синтеза белка использовали цик-логексимид (Koch-Light Lab., Швейцария). Проростки кукурузы обрабатывали ' раствором циклогексимида (3,6*1 СГ6 Н), Пробы, подученные аз проростков кукурузы, с одинаковым количеством метки, разделяли одномерным электрофорезом в 12^-ном ПААГ и 0,1£-ном до-дшщлсульфате в« до метод/ Лемда (Хаешти и.к., 1970).

Флюорографию полиакрилашднш: гелей проводили по метод/ Бонера я. Лоски (Boimer J. J., Loakrey M.L., 1974) на рентгеновской пленке атюнз-и, экспозиция 3-е суток. Для количественной сценка фяюорограш просадила декситодетрив на двухволновом сканирую-цеы анализаторе хршатограмм dsa.

Для определения молекулярной массы белков использовали белки-маркеры с известной молекулярной массой: фосфорилазу 93,5 кД, бычий сывороточный альбумнн 68 кД, ингибитор трипсина (из сок) 21 КД.

Статистическую обработку подученных данных провода с использованием критерия Стыэдента (Бейли Н., I9G2).

v РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Модифицирование радиочувствительности организма с помопсыз препарата' "каротина" и ДНК

' Известно, что ^—каротин обладает антиканцерогенным дейст-'Вием (ВиленчивМ.М., 1985; Preceed of eymp. vltamin A#, 19S3j Uooa R.c.' «t «г. , 19S3)« Предполагается, что эффект вызван его автиоксадавтныма свойствами. Соответственно возник вопрос о ра-ддоэадитных свойствах этого соединения.

; В работе, изучали влияние введения препарата "каротина" в различные сроки до и после облучения. Наиболее эффективное защитное действие "каротина" 'проявлялось;при его 2-кратном под- , ' *' • - • ■'■^'■ -V-^i

кожном введении за 19 ч и 4 ч 30 мин до облучения» ФИД защитного действия после подкожного введения препарата "каротина" был невелик (1,09), Сравнивали два метода введения "каротина": подкожно или per OS (через зонд в те же сроки)* Полученные результаты приведены на рис,1.

пга

Рис.1. Влияние "каротина" на выживаемость крыс, облученных в дозе 8 Гр. По оси абсцисс - дни после облучения, по оси ординат — количество ВЫЖИВШИХ ЖИВОТНЫХ* /а, I - контроль (п-бо); 2 - подкожное введение "каротина" (п-ео, ¥ <■ 0,05); 3 - кормление "каротином" (и-ьо, Р < 0,05). и - число животных, использованных в каждой серии опытов.

Эксперименты не только подтвердили защитное действие препарата, ко выявили очень ценное его свойство — давать аналогичный защитный эффект как при подкожном введении, так и при приеме per оа, что значительно упрощает практическое использование препарата.

В следующей серии опытов было проверено защитное действие препарата "каротина" на .беспородных белых мышах. Длительное кормление мшс& (в течение 7 дней) препаратом до облучения повитало (ЭО£б$) их выживаемость (рис.2). При кормлении животных в течение 3-х днеЛ до облучения выживаемость не отличалась от выживаемости контрольных мышей (рис.2).

С цель» увеличения выживаемости крыс введением "каротина" представлялось интересным испытать его действие совместно с ДНК.

Для выявления эффекта совместного действия "каротина* и ДЕК било целесообразно испытать их в условиях, когда они, каждый в отдельности, незначительно влияли на увеличение выживаемости крысь."Каротин" вводили за 4 ч 30 мии до облучения и спустя 24 ч

Рис.2. Зависимость выживаемости мышей, облученных в дозе 8 Гр, от продсшсятвльности их кормления "каротином" до облучения. По оси абсцисс — дни после облучения, по оси ошш-нат - количество -мшиитщ ЖИВОТНЫХ, %. I - контроль (11-280); 2 - корыление в течение 3-х дней

пНе? ~ кормление в течение 7-ми дней (п-40, р 0,05), а — число животных, использованных в каждой серии ОПЫТОВ.

Рвс.З.

...... 5. ..10. 1Б 20 23 30,

Влияние "каротина" и ДНК на выживаемость крас, облучен^ них в дозе ц Гр. По оси абсцисс - дни после облучения, до оси ординат — количество выживших животных. I - контроль (п-160); 2 - введение "Каротина" (1,3 мг/кг) 9й Зй мин ДО облучения и спустя 24 ч после облучения; (а-гэ); 3 - введение раствора ДНК в количестве ЗЗТЗ иг/

посла облучения (п-^5, 0,05).-в — число животных., использованных в каждой серии опытов.

после облучения совместно с ДНК. Согласно данным, представленным на рис.3, одновременное действие двух факторов достоверно ловивало выживаемость крыс до GQ±I7%, при выживаемости в контроле

' 3 1970 г. А.М.Кузин внеказал гипотезу (Кузин A.M., 1970), согласно которой терапевтическое действие экзогенной ДНК может ■ быть обусловлено сорбцией или химическим взаимодействием ДИК с образующимися в тканях облучешгого организма хинощщыми радиотоксинами, что предотвращает их воздействие на ДНК критических тканей. Это предположение било подтверждено в экспериментах, в -которых использовали высокоочшенныЗ хиноидный радиотоксин -регактенон. " , - .

* Раствор регактенона (5-1СГ4 ГЛ) разделяли на две части. К одной из нлх добавляли 0,1^-ыЙ раствор ДНК (1:1), ко второй -соответствующей объем (0,15 (Л NaCi (для выравнивания ионной енлк раствора и концентрации исследуемых кошонантов). Полученные таким путем пробы инкубировала в течение 2-х часов при 37° к разделяли методом одномерной хроматографии на бумаге. Результаты разделения продуктов инкубации представлены на рис.4. Чистый ре-

Схема, хроматограммы исследуемых вешесю. На линии старта (е): I - регактенон, 2 - регактенон+ДНК, 3 - ДНК. Реакция на регактенон после проявления хрома-тограмм реактивом обнаруживается в пятнах 5 и 2 и слабо (следы) в пятно 6. ДНК в УФ наблюдается в пятнах 2, 3, следы - в 4 и 7.

Ы. £ ¿> *

jl а

7

О

гактенон передвигался одним пятном с - 0,33-0,36, давал отчиси-вую реакцию на хинон, Чистая ДНК не сходила с места старта. При хроматографии смеси ДНК и регактенона пятно на старте давало реакции, характерные и для ДНК, н дчт регактенона. При этом выявлена слабая реакция и на свободный регактенон. Обнаружено два новых : ■ пятна,. по-видимому, продукта окисления и распада ДНК под влияни-, • ';. ем регактенона. Пятна 5 и 6 были элщроваш водой, оценки экстин-.: * кдаа: полученных растворов оценивали на спектрофотометре СФ-4А. *;: ,{.Спектрыгэлштов представлены на рис.5. При неоднократном повторении ;этих экспериментов били количественно измерены экстшшции

Рис.5. УФ-спектры блюатов пятая 5 и б с хроматограмм (рис.4).

До оси абсцисс - Л , ни; по оса ординат - Б, экстинкцня.

аналогичных пятен при 310 нм (максимум для хинонов). В среднем экстишодия пятна б .составляла 62% от экстинкции пятна 5. Опыты, проведенные методом тонкослойной хроматографии, подтвердили данные, подученные с помощью бумажной хроматографии.

Таким образом, можно полагать, что ДНК связывает регактепон при физиологических условиях..

" Представлялось важным выяснить биологическое значение явления связывания ДНК о регактенокм. Ддяэтих целей использовали 3-х суточные проростки кукуруза сорта Стерлинг. Проростки по 25 штук помещали в растворы чистого регактенона различной концентрации и в растворы регактенона, выдержанные 2 ч при 37° с 0,1%-ным раствором ДНК, а также в раствор чистой ДНК. Ионная сила была выравнева добавлением соответствующих объемов 0,15 U NaCl. * Исследовали прирост корней за 24 ч. ^

На рас. 6 представлена зависимость угнетения роста корешсов от концентрации регактенона. Чистая ДНК мало влияла ка рост корешков и надземной части. Добавление ДНК к раствору регактенона" (рис.Б) приводило к значительному снижении икгабируищего эффекта. * Полученные результаты хорошо согласуются с данными о связывании регактенона добавленной ДНК. Дополнительные опыты подтвердили-эту точку эрения. Если путем диализа отделить аддукт ДНК+реган-;. - . ...тенета, .то1 токсические свойства регактенона снимаются почти■ пол-; 1 с-. носты>.; В si тих опытах: регактевон, • регактеаоп+ДНК и чистую. ДНК• i ■ помещали. в ■■ дааяизшо^медючиа:.| Рагалтенон ^свободао■ проходал - авевь 'г '.

. та регактенон+ДНгС' ж чистой ДИК. Тест-объектом* в опытах были ' се-

■ Рис.6. .

Защитное действие ДИК при обработке 3-х суточных проростков регактеноном. По оси абсцисс - концентрация регактенона (М); по оси ординат — скорость роста корней с 3-го на 4-и день, в % от контроля. К — контроль, I — регакте» нон+ДНК, 2 - регактенон.

мена огурцов. После 24-часового контакта семян с диализным мешочком семена промывала водой и затем в одинаковых стандартных условиях прорамивали в рулонах и луминостате. На 5-е сутки роста измеряла длину корней и надземной части.

Как видно из таблицы, когда в диализных мешочках содержался чистый регактенон, который легко проникал через пленку мешочка, наблидалось резкое (на 5С$) угнетение развития. Бели наряду с регактеноном в диализном мешочке присутствовала ДНК, то связанный ею регактенон■не проникал через пленку и растения развивалась, как в контроле. Таким образом, в трех независимых сериях экспериментов показано, что ДНК при 37° в физиологическом растворе прочно связывает регактенон. При этом теряется способность последнего проникать через полупроницаемую мембрану к токсически действовать на жизненно важные системы и деление клеток, а следовательно, и на рост и формирование ткани. Из проведенных опытов следует, что ДНК, введенная после тотального облучения животных, может связывать радаотоксикы хиноидной природа и существенно снижать их концентрацию в кровотоке.

Таблица

Влияние продуктов диализа на развитие семян (средние данные из трех опытов)

Содержание диализного . мешочка Рост корня, . % к контролю Рост надземной части, % к контролю

Вода 100 100

^Регактенон1 • 45+4 0,01) 5Q±7 (í¿0,05)

! ,г:"-::Регактенон+ДНК . 95+5 90*8

ДНК 100 100

-4'i . ■' ■■ ■ - "•■'■ ■ ■9

II. Исследование возможности повышения радиорезистентности : . растительного организма с помощью термошока и: закономерностей явления перекрестной термо- и радиорезистентности :

Известно, .что вклетках животныхи растений, подвергнутых прогреванию, развивается'состояние устойчивости:(тёрморезистен-тности) к-последующему воздействию повышенной температуры (Aech-bcmer К*, Вопивг J.J., 1979iLoomle W.F., Vbeeler S.,;19B0). : Полагают, что развитие такого состояния связано о индукцией.синтеза определенного класса (теплсшоковнх) белков (Keyj.L.etei., 1901). Представляло интерес исследовать влияние' теплового шока на радиорезистентность. '■*...

Исследования на проростках кукурузы показали, что их прогревание при 43° в течение IS мин не вызывает угнетения роста корешков с 5-го на 6-й день, в то время как прогревание в течение 30 мин при 45° приводит к достоверному {35$) угнетению роста корешков по отношению к контролю.

Изучение кинетики повышения терморезистентности проростков кукурузы в зависимости от времени после воздействия теплового шока показало, что предварительное прогревание проростков в течение 15 мин при 43° увеличивает их резистентность к последующему прогреванию при 45° (рис.7). Эффект увеличения зависит от Промежутка времени между двумя прогреваниями. Бели промежуток времени составлял 3 мин, то защитный эффект был равен нулю; Затем закономерно развивалось состояние терморезистентности с максимумом спустя 4 ч после теплового шока (при 43°). Если ке промежуток времени между двумя прогреваниями составлял 8 ч, то явление повышения терморезистентности уже не ггаблюдалось.

Полученные данные о повышении теркорезистеитности в результате теплового шока послужили основой для изучения влияния теплового люка на радиорезистентность прбростков. На рис.8 предста-леш результата влияния теплового шока (43°, 15 млн) за 4 ч до воздействия % -облучения (диапазон доз. от I до 10 *

Для исследования индукции терморезистентности под действием малых доз у-радиадии проростки кукурузы облучали в дозах I, 2 и З Гр и спустя разное время подвергали воздействию тепла (45е) в течение-30 иин. Исследование кинетики'развития терморезистент-

160 но 100 ео га

1 г э а

- Рис

. Кинетика развитая состояния терморезистентности, шдуцируемой прогреванием при 43° 15 мин. По оса абсцисс — время инкубации после предварительного прогревания {часы); по оси ординат - прирост корней с 5-го на 6-й день, в % от контроля (45й, 30 мни).

Рис-е-

Влияние предварительного прогревания при 43° в течение 15 мин и циклогекси— мида на суточный рост корня 48-часовых проростков, облученных в различных дозах. По оси абсцисс — доза облучения, Гр; по оси ординат - суточный прирост корней о 5-го на 6-й день, в % от кон-

Р^У*-обручение; 2 - <£-ойлучение«шк-логексимид, проростки кукурузы инкубировали в растворе циклогексимида в течение I ч до и в течение 4 ч после облучения; 3 - тепловой шок за 4 ч до облучения; 4 - тепловой шок за 4 ч до облучения-ншкдогексимид, проростки кукурузы инкубировало в растворе циклогексимида в течение X ч до в в течение. 4 ч после теплового шока.

ности после предварительного облучения в дозах I, 2 иЗ Гр показало, что тершрезистентность достигает максимума спустя 4 ч после предварительного облучения в дозе 2 Гр (рис.9). Кинетика нарастания и падения терморезистентности зависела от промежутка времени после предварительного облучения и почти полностью совпадала с ранее наблюдаемой (рис.7) после воздействия теплового шока кривой, что опять-таки указывало на близость механизмов этих явлений.

В следутадей серии опытов было прослежено индуцирование состояния радиорезистентности в различное время после предварительного ^облучения в дозах I, 2 и 3 Хотя скорость достижения максимума акткващш радиорезистентности при разной дозе предварительного ¿¡"-облучения несколько смещена: во времени, общий ход кривых аналогичен приведенным ранее на рис.7, 9.

На рис.10 представлены данные, показывающие повышение радиорезистентности после предварительного ^-облучения в дозе 2

160 140 100 60 20

12 3 4

Ряс.9.

Кинетика развития состояния терлоре-зистентности, индуцируемой предварительным облучением в дозе 2 Гр. По оси абсцисс - время инкубации после -предварительного прогрева, часа;, по оси ординат - прирост корней с 5-го на 5-й день, в % от контроля (45°, 30 мин). с

рис.10.

Кинетика развития состояния радиорезистентности, индуцируемой предварительным облучением в дозе 2 Гр. По оси абсцисс - время инкубации после предварительного облучения, часы; по оси ординат - прирост корней с 5-го на 6-й день, в % от контроля (10 Гр).

Таким образом, совокупность полученных доннах о сходстве кякетик развитая перекрестной термо- и рвисршислетгносяи, а также о том, что оба состояния индуцируются в одном а том же диапазоне доз (1-3 Гр), .позволяют полагать, что состояния терморезистентности а радиорезистентности индуцируются сходны™ механизмами.

Согласно литературнш данным, посвященным термошоку, повышение терморезистентности связано с образованием термошоковых белков (Loamia W.P., Wheeler 3., 1980; Key J.L. et al,, 1981; JUtechuler M., Iteecarenhee J.P., 1982).

Представляло интерес исследовать синтез белков в период развития термо- и радиорезистентности. С этой целью проростки кукурузы до и после предварительного прогревания йот У -облучения инкубировали в растворе циклогексимида (3,6.10 М), широко используемого.для подавления синтеза белка в клетках (Белова Л.П С соавт., 1976; Вакирова Ф.М., .1982; Ttang Scandalios, 1977). Ко~ решки кукурузы после выдерживания в растворе -шодюгексишда про-'

швали и подвергала воздействию тепла или у-облучения в дозах, * вызывающих отчетливое ингибированяе роста. Исследование влияния циклогексимнда на повышение терморезистентности после теплового шока показало полное снятие эффекта.

Как видно из рис.II, циклогексимид почти полностью снимал также индукцию радиорезистентности. Опыты во влиянию термошока на последувдее £ -облучение были проведены в присутствии цикло-гекскшда и, согласно рис.8, циклогексимид полностью снимал аффект повышения радиорезистентности при сильной угнетении роста проростков.

Рис.II.

1, Кинетика развития состояния радиорезистентности, индуцируемой предварительным облучением в дозе 1$>.

2. Влияние циклогексимида на состояние радиорезистентности.

По оси абсцисс - время инку-* бают после предварительного облучения; по оси ординат — прирост корней о &-го на 6-й день, в % от контроля (10 Гр).

Изучение динамика синтеза белков теплового шока в проростках кукурузы показало (рис, 12), что сразу после терыошокового " воздействия происходит активация синтеза белков с 87, 85, 78, 74, 58 кД (рис.12А, кривая 2), а радисток активирует синтез белков с Кр П4, 32, 28 и 16 кД (рис.12Б, кривая 2).

Со временем интенсивность синтеза белков увеличивается и максимальное включение метки происходит через 2 ч после стрессового воздействия: как прогревания, так а облучения.

Следует отметить, что если сразу после термо- и радисшока происходит активация разных белков, то спустя 2 ч активируется синтез сходных по ■молекулярной массе белков! * термошоком - 114 , 87 , 65 , 74, 52, 33, 1в кД (рис,12А), а радишоксм -114 , 87, 85 , 52 , 42, 16 кД (рис.12Б). Вызванные тепловым и ра-диошоксм изменения в синтезе псиашептидов являются обратимыми. Через 3 ч наблюдается снижение синтеза как радио-, так и термошоков цх белков. Смнако к. 4-и ч все хо наблюдается синтез белков теплового шока с н^ 114, 52 и 33 кД (рис.12А). . " Исходя из вышеизложенных данных об активации терыо- и ра-

02,5 66 21

923 вв •

Рис.12. Денеитограммы тотальных белков корней проростков Zea maya, меченных Ззз-метиокивом при 37°, А; I - контроль; 2, 3, 4 - белка, экстрагированные через О, 2 и 4 ч. соответственно, после прогревания проростков при 43° в течение 15 шт. Б: I - контроль; 2, 3, 4 - бедки, экстрагированные ч<з>ез О, 2 и 4 ч, соответственно, после облучения проростков в дозе 2 Гр.

диошокш синтеза белков со сходной массой а о сходстве канетик развития T9JW0- л радиорезистентности, можно предполагать, что существует определенное сходство механизмов развития явлений, связанных с синтезом термо- и радяотоковых белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

. Проблема защиты организма от лучевого поражения тесно свя-' зана с общебиологичэсгаши вопросами устойчивости организма к воздействии неблагоприятны); факторов. Это обусловлено тем, что в процессе эволюции разнообразные системы клетки и организма в целом, ' обеспечивая общую жизнестойкость организма, вносят свой вклад, и в формирование радиорезистентности; Исхода из цо-

^ложеная о 'тш. что радиорезистентность тесно связана с общебиологической устойчивостью организма к воздействию неблагоприятных . факторов среды, нами была предпринята попытка найти новые пути : повышения радиорезистентности животных организмов с помощью вве-деняя.препарата "каротина" и растительных организмов — с помощью

умеренного прогревания.- ^...... _ ____ . , ' ■

Проведенное исследование -'выявило-ранее неизвестное свойство:.'.

препарата "каротина", содержащего ^-каротин, повышать выживаемость облученных животных. Может представить практический - интерес показанная наш возможность использовать этот препарат для защиты от облучения не только путем инъекций (обычныйпуть введения радиопротекторов), но и при приеме per os.

- В связи с тем, что разные радиопротекторы различаются по механизму, в последнее время в литературе обсуждается возможность использования для защита к терапии лучевых поражений веществ с различным механизмом действия. Таким образом, обнаруженное в работе повытание выдаваемоети тавотник при совместном введении "каротина" и ДНК указывает на перспективность использования такого метода для лечения лучевой болезни.

На высших растениях вами бала, показана возможность повышения их радиорезистентности путем• термоаока. Прослежена кинетика, этого процесса. Впервые на высших растениях продемонстрировано перекрестное влияние термо- и радиошока на повышение термо— и радиорезистентности. Совокупность полученных »ршпгг о кинетике развития явлений термо- и радиорезистентности показывает, что , кинетики юезукциа обоих эффектов сходны.

Сходство кинетик развития перекрестной термо- и радиорези-" стентности, факт, что оба состояния индуцируются в одном и там же диапазоне доз {1—3 Гр) а пнгибируются цнклогексимидом при одной и той ке концентрации, а также результаты опытов по изучению шедукциа термо-. и рададаокових белков методом одномерного электрофореза позволяют полагать* что существенное значение в этих кехшшхмах имеет индукция, соответственно, терыошоковых и радаошоковнх белков»

Подученные нами результаты являются еще одним доказательством правильности представления о том, что радиорезистентность тесно связана с общебиологической устойчивостью организма к неблагоприятным факторам внешней среды.'

* ВЫВОДЫ

+ i X. В опытах на крысах и мышах обнаружено защитное действие .

^-каротина, растворенного в масле (препарат "каротин"), при его введении per оэ и при инъекции за 19 ч и 4 ч 30 мин до облучения.

2. Установлено, что суммарный эффект сочетанного действия "каротина" и раствора ДНК, инъецированного .через 24 ч после облучения в дозе,-близкой к ы>100, больше каждого из эффектов.

обусловленных только "каротином" или только ДНК. : : ^!

1 3. Показано, что одним из возможных механизмов терапевти- -ческого действия ДЦК после облучения является ее способность связывать хиноадный радиотоксин.'

4. В опытах на проростках кукурузы обнаружено, что тепловой. шок (43°, 15 шн) вызывает не только повышение терморезистентно-■ сти, .но и радиорезистентности. . ~ . .

* 5. Установлено, что' облучение проростков кукурузы в малых дозах (I, 2, 3 Гр)' вызывает повышение и радиорезистентности, и терморезист ентности.

б. На проростках кукурузы показано сходство кинетнк разви-•тия терло- и радиорезистентности при воздействии теплового шока или радиошока.

7* Получены данные, указывающие на роль активации синтеза белков а- механизмах повышения термо- и радиорезистентности после действия тепла и облучения в нелегальных дозах.

фснувные py-foppfflTw утп тем^

-I. Кузин A.M., Копылов В.А., Ревин А.Ф., Вагабоза Ы.Э.г Гикошви-ли Т.Н. О механизме терапевтического действия экзогенной ДНК при лучевом поражении. - Радиобиология, 1905,- т.25, вип.5, с.634-638.

2. Гпшпвила Т.И.Вагабова М.Э., Виленчик М.М., Кузин A.M. Индуцируемая теплом и радиацией (перекрестная) радио- и тер— мотолерантнооTb^BjrgogocTicax Zea nays. - Радиобиология, I9B5,

3. Гикошвили Т.Н., Белецкий И.П., Брыекова К.С., Виленчик U.M., 1^зин A.M. Исследование состояния термотолерантности я термо-.токовнх белков в проростках растений. - В кн.: Тез. У Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки", Тбилиси,. 1937, с.304-305,

4. Виленчик U.M., Гикопвили Т.Н.,"Кузин A.U., Москалев Ю.И..

.. .. Степанов А.Н., Коклин А.Е., Бобнева С.М., Кондратенко В.И. Радаозащятное действие природных каротиносодеряашх препаратов; исследование каротинила на белых крысах обоего пола.

■".-.- '-Радиобиология, 1983, т.28, вып.4, 0.542-544.

: 5., Гикошвади-Т.И., Белецкий И.П., Виленчик М.М., Кузин A.M.

- Термотодерантность и радиорезистентность кяжухщруится у ра-■ стений как, í -облучением, ■ так и теплом со сходной кинетикой.

Радиобиология, 1988, т.38, вып.5, с.714-716.

■ 6^'Гикоптили Т.Н., Виленчик М.М., Кузин АЛЛ., Бобнева С.М.

Радиозащитный аффект каротшосодетжадях препаратов и возможность усиления этого эвдокта. - шф. бкшл. научного совета по проблемам радиобиологии, 1989 (в печати).

ÍS

.1-16023 6.01.89 г. 3ак.153бр Тир. 125 экз. Уч.из^.л.-1,0 :! , . Отпечатано на ротапринте в ОНТИ НЦБИ

\

J

/