Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка"

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

На правах рукописи

Ямпольский Илья Викторович

Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка

специальность - 03.00.04 - биохимия

1 5 ОКТ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2009

003479659

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Инстит биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РА

Научные руководители:

доктор биологических наук Константин Анатольевич Лукьянов доктор химических наук Виктор Кузьмич Потапов

Официальные оппоненты:

Формановский Андрей Альфредович, доктор химических наук, заведующий груп органического синтеза ИБХ РАН.

Смушкевич Юрий Исаевич, доктор химических наук, профессор кафе органической химии Российского химико-технологического университета Д.И.Менделеева

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук

Защита состоится 21 октября 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационн совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганичес химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 21 сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

РАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

туалыюсть проблемы. Бурно развивающиеся в последние годы технологии 1уоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические оцессы. Одним из важнейших инструментов изучения живой клетки являются 1уоресцентные маркеры, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми руктурами или процессами в режиме реального времени. Особенно широко пользуются генетически кодируемые метки - флуоресцентные белки семейства леного флуоресцентного белка GFP, а также некоторые химические флуоресцентные асители.

лки семейства GFP широко известны благодаря уникальному механизму рмирования хромофорной группы. В отличие от обычных ферментов, производящих кую-либо одну реакцию множество раз, флуоресцентные белки в ходе своего зревания один раз проводят 2-3 совершенно разные реакции, приводящих к синтезу омофора внутри молекулы белка за счет модификаций собственных аминокислотных татков. Исследования последних лет показали большое разнообразие спектральных рактеристик и структур хромофоров в GFP-подобных белках.

штез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой ределения химического строения нативных хромофоров. В настоящее время нтгеноструктурный анализ стал основным методом исследования структуры омофоров в различных флуоресцентных белках. В то же время, кристаллографическое тределение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и оинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Несмотря на то, что валентная структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно тановленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также акционной способности возбужденного состояния остаются недостаточно ученными. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных единений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия вестных структур хромофоров.

ким образом, синтез модельных соединений позволяет установить строение омофоров в белках, изучить спектральные характеристики их и их аналогов, делировать влияние белкового окружения. В перспективе модельные соединения гут быть использованы при изучении механизмов созревания и функционирования омофоров, а также с целью создания новых флуоресцентных красителей с шкальными свойствами.

ели и задачи исследования. Целью работы было изучение взаимосвязи структура -ектральные свойства в ряду хромофоров флуоресцентных и окрашенных белков -мологов GFP, а также исследование структур хромофоров двух белков: пурпурного омобелка asFP595 (Anemonia sulcata) и желтого флуоресцентного белка zFP538 oanthus sp.).

рамках сформулированной цели были поставлены задачи:

• Разработать метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромофор окрашенного белка asFP595, изучить его спектрохимическое поведение в различных условиях.

• Разработать новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-оно имеющих функционапизированный этенильный заместитель в положении имидазола. С использованием этого метода синтезировать хромоф флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма Синтезировать структурные аналоги хромофора Kaede, соответствующие заме1 гистидина и/или тирозина в хромофоре на другие аминокислоты. Изучит сольватохромные и кислотно-основные свойства в данном ряду хромофоро Изучить ауксохромные свойства заместителей в хромофоре Kaede.

• Синтезировать хромофор желтого флуоресцентного белка ZFP538. Выясни структурную основу его сложного рН-зависимого спектрального поведения.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервь разработаны методы синтеза хромофоров флуоресцентных и хромобелков - гомолог GFP, поглощающих и флуоресцирующих в красной области видимого спектр Указанные хромофоры представляют собой 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-он несущие заместители с различными функциональными группами в положении имидазола. Впервые синтезированы хромофоры пурпурного хромобелка asFP59 красного фотоконвертируемого флуоресцентного белка Kaede и желто флуоресцентного белка ZFP538. Синтетические хромофоры позволили провеет детальный анализ ауксохромных свойств заместителей в данном ряду окрашенны соединений, а также их сольватохромных и кислотно-основных свойств. На осно полученных данных был предложен ряд перспективных направлений для направленног изменения свойств флуоресцентных и окрашенных белков. Выявлена химическ природа сложного спектрального поведения хромопептидов из белка zFP53 приведшего к неправильному определению их структуры. Уточнена структу хромофора zFP538. Обнаружена необычная перегруппировка 2-ацил-5-арилиден-3, дигидро-4#-имидазол-4-онов в уникальные производные 2,6-дикетопиперазин встречающиеся в природе среди метаболитов грибов. Полученные в настоящей рабо флуорогены (красители, практически нефлуоресцентные в свободном состоянии растворе, но приобретающие яркую флуоресценцию после прочного связывания целевой молекулой, например, белком или ионом металла) и их аналоги могут найт применение для различных флуоресцентных методов детекции.

Апробация полученных данных и публикации. Основные материалы диссертаци были доложены на международном симпозиуме Advances in Science for Drug Discover (Москва, 2005) а также на IX чтениях памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москв< 2009). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах и состой из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной част выводов и списка цитируемой литературы, включающего 141 ссылку. Диссертаци содержит 14 рисунков, 25 схем и 7 таблиц.

СНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Синтез и свойства хромофора красного хромобелка asFP595 (Anemonia sulcata)

ромофор красного хромобелка asFP595 представляет собой 2-ацетил-5-(4-|дроксибензилиден)-3-метил-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-он 2.1.4 и образуется в зультате гидролиза промежуточно образующегося N-ацилимина. В настоящей работе i разработали метод синтеза 2-ацил-5-(арилиден)-3-алкил-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-I, который был применен для синтеза целевого модельного соединения.

1 Синтез

бщий метод синтеза 5-(арилиден)-3-алкил-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов включает разование азлактона по реакции Эрленмейера, его аминолиз первичным амином с следующей циклизацией. Мы применили этот подход для синтеза 2-этил-5-(4-адроксибензилиден)-3-метил-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-она 2.1.3 (Схема 1). кисление 2.1.3 1 эквивалентом диоксида селена в диоксане привело к целевому единению 2.1.4 с выходом 60%. Спектры ЯМР 'Н и 13С полностью согласуются с левой структурой. В частности, пик с химическим сдвигом 192.8 м.д. в спектре ЯМР С соответствует ключевой карбонильной группе в ацетильном заместителе.

о

-^N-'-V™

f [] EtCOjNa

н о

j| ch,nh2

2.1.3, 94%

хема 1 Синтез хромофора хромобелка asFP595.

1.2 Спектральные свойства

Длина волны, нм

Рис. 1 Кислотно-основное спектрофотометрическое титрование хромофора азРР595.

Спектр абсорбции соединения 2.1.4 - модельного соединения хромофора хромобелк азРР595 обладает отчетливой рН-зависимостью. В водном растворе при кислы значениях рН максимум поглощения наблюдается при 418 нм, а в нейтральных слабощелочных - при 520 нм. Переход между этими двумя спектральными формам оказался полностью обратим, а также был определен рКа перехода, равный 7.1. М1 приписываем этот переход обратимому депротонированию гидроксильной групп хромофора (структуры 2.1.4а и 2.1.4Ь, Рис. 1), аналогично хорошо изученном поведению хромофора вРР.

При значениях рН>11.0, модельный хромофор претерпевает необратимое разложени (время полужизни 20 минут при рН 12) с образованием сложной смеси продуктов

максимумами поглощения при 36 и 330 нм (Рис. 2). При увеличепи рН скорость разложения возрастае (время полужизни менее 1 с при р! 14).

Рис. 2 Необратимое разложени хромофора 2.1.4 при рН 12. Кривые 1-отвечают спектрам, зарегистрированныь соответственно через 0, 2, 5, 11, 45, 100 200 минут после приготовления раствор хромофора.

300 ' 350 ' 400 ' 450 ' 500 550 ~600 Длина волны, нм

рирода растворителя оказывает большое влияние на положение максимума поглощения ионной формы хромофора 2.1.4Ь (Таблица 1).

аблица 1 Параметры спектров поглощения хромофора 2.1.4 в различных створителях. Спектры нейтральной и анионной форм были измерены в растворах, держащих 10 шМ НС1 и 10 тМ №ОН соответственно._

створитель

ода

танол

Пропанол

МФА

Максимум поглощения, нм (коэффициент экстинкции, М"'см'')

Нейтральная (2.1.4а)

форма

418 (35.000)

425 (40,000)

428 (39,000)

422 (38,000)

Анионная (2.1.4Ь)

520 (47.000)

542 (72,000)

552 (73,000)

572 (87,000)

форма

аиболее длинноволновый максимум поглощения наблюдался в ДМФА и составил 572 м, что очень близко к максимуму поглощения белка аэРР595 (568 нм) (Рис. ЗА).

400 500 600 Длина волны, нм

700

400 500 Длина волны, нм

ис. 3 Сравнение спектров поглощения (А) и возбуждения-эмиссии (В) раствора хромофора 2.1.4Ь в МФА (тонкие черные линии) и нативного белка а$РР595 (жирные серые линии). Для каждой пары шин спектр эмиссии лежит в более длинноволновой области.

аствор анионной формы хромофора 2.1.4Ь (рН 8.3) обладает слабой красной луоресценцией с пиком при 603 нм (Рис. ЗВ) и квантовым выходом 2.1*10"3. Нативный лок аБрР595 обладает флуоресценцией с такой же длиной волны, но, что римечательно, с меньшим на порядок квантовым выходом (2.2*10'4). Близкое сходство ектров поглощения и флуоресценции синтетического хромофора и природного белка озволяет предположить, что анион 2.1.4Ь воспроизводит структуру хромофора в белке, нание спектральных характеристик модельного хромофора позволяет оценить стинный коэффициент экстинкции природных белков, содержащих этот хромофор, частую, коэффициенты экстинкции СРР-подобных белков рассчитывают, измеряя "~щее содержание белка в растворе. Такой подход дает заниженные и плохо спроизводимые результаты в связи с неполным созреванием белка, которое в свою чередь определяется условиями экспрессии (например, значения коэффициента стинкции ОвЯес!, полученные различными исследователями, составили 22 500, 75 000, 57 000 М''ст"'. В образцах денатурированного (например, под действием кислоты или

5

щелочи) белка, аминокислотное окружение практически не влияет на спектральны характеристики хромофора, что позволяет достоверно оценить концентрацию зрелог белка, измеряя поглощение хромофора. Денатурированный азРР595 в кислой сред имеет пик поглощения при 430 нм, совпадающий с пиком поглощения хромофора кислом 2-пропаноле. Вычисленный на основании значения коэффициента экстинкци протонированного хромофора, коэффициент экстинкции нативного аБРР595 составляе около 150 ООО М"'сгп"'. Это значение намного выше предложенного ранее (56 ООО М"'сп ') на основании общей концентрации белка. Такая заниженная оценка могла быт вызвана присутствием больших количеств незрелого авРР595 в образце.

1.3 Обсуждение

В настоящей работе представлен первый синтетический хромофор красного БР подобного белка. Разработан эффективный метод синтеза целевого соединения с общи выходом 41%. Ключевой стадией этого метода является окисление метиленовой групп в положении 2 гетероциклического кольца диоксидом селена.

В работе Мартынова с соавторами [МаЛупоу, 2001] на основании непрямых методо была предложена структура хромофора азРР595, содержащая вместо имидазолоновог кольца шестичленный дигидропиперазиновый гетероцикл в причудливой зарядово форме (Рис. 4).

Рис. 4 Структура хромофора хромобелка asFP595, предложенная Мартыновым и соавт.

Кристаллографические исследования недвусмысленно указывают на ошибочность тако структуры. По-видимому, Мартынов и соавторы ошибочно приписали пик хромопептид asFP595 с m/z 564.6 в спектре MALDI-TOF катион-радикалу [М']+. Если предположит что пик с массой 564.6 отвечает молекулярному иону [М+Н]\ то молекулярная масс хромопептида 563.6 в точности соответствует структуре хромофора представленной настоящей работе.

В работе Заграничного и соавторов также была предпринята попытка определени структуры хромофора asFP595 [Zagranichny, 2004]. В этой работе утверждается, чт разрыв пептидной цепи по связи между карбоксильным углеродом Cys64 и амидны азотом Met65 приводит к образованию N-незамещенной иминной группы в положении гетероциклического кольца. Такой вывод был сделан на основании сходств спектрофотометрического поведения хромопептидов, полученных ферментативны протеолизом asFP595 и аналогичных пептидов из zFP538. Однако не было представлен

.О'

ямых свидетельств (ЯМР или МС) наличия незамещенной иминогруппы. Хорошо вестно, что незамещенные кетимины подвержены быстрому гидролизу в водных створах, и поэтому такой фрагмент не мог бы остаться неизменным в указанных в ботах Заграничного и соавт. условиях выделения и очистки. Другой аргумент против 1. ичия в структуре хромофора а$РР595 незамещенной иминогруппы следует из •роения и химических свойств ацилиминов. Ацилиминная группа является наиболее роятным предшественником зрелых хромофоров гРР538 и азРР595. В то же время, N1-шлимины подвержены нуклеофильной атаке не по карбоксильному углероду, апример, сольволизом в метаноле) а по связи С=Ы, что в случае с аБрР595 привело бы к эомофору 2.1.4, содержащему оксо-, а не иминогруппу в положении Са метионина 65. аконеи, многочисленные рентгеноструктурные исследования подтверждают наличие в руктуре нативиого гРР538 6-членного тетрагидропиридинового цикла, содержащего ойную связь С=1Ч, сопряженную с имидазолоновым ядром, общим для СРР-подбных лков. Соответствующий хромопептид был зафиксирован Заграничным с соавторами, был признан артефактным. Таким образом, мы предполагаем, что предложенная граничным с соавторами структура хромофора азРР595, содержащая незамещенную шногруппу, является ошибочной.

се известные структуры хромофоров СРР-подобных белков содержат общее 5-илиден-3,5-дигидро-4//-имидазол-4-оновое ядро. Природа заместителя в положении 2 шдазолона ключевым образом влияет на спектральные свойства белка. Хромофор ТР595 несет в этом положении карбонильную группу. Как показано в настоящей боте, наличие такого заместителя обеспечивает очень большой батохромный сдвиг (по авнению с хромофором йРР) в ~ 50 и ~ 100 нм в спектрах поглощения нейтральной и 1ионной форм, соответственно. Сходной величиной батохромного сдвига обладает илиминная группа (в хромофоре ОэЯес! и аналогичных белков). Другие изученные местители обладают меньшими ауксохромными свойствами. Например, иминогруппа =М в гРР538 обеспечивает батохромный сдвиг в 81 нм (для анионной формы, по авнению с анионной формой хромофора ОРР). Как следует из спектральных свойств омофора Каеёе и его структурных аналогов, сопряженные связи С=С обеспечивают е меньший батохромный сдвиг, ромофор 2.1.4 оказался нестабильным в водных растворах в щелочной среде, что гласуется со свойствами денатурированного щелочью аэРР595. В ходе щелочной ■градации хромофора 2.1.4 вначале образуется вещество с пиком поглощения при 368 м (Рис. 2В). По-видимому, этот пик соответствует пику при 380 нм в спектре натурированного азРР595, который был ранее отнесен к обратимо протонированному хромофору. Мы полагаем, что спектральная форма с пиком при 368 м (Рис. 2В) соответствует продукту гидролиза 5-членного цикла в 2.1.4, а спектральная орма с пиком при 330 нм - продуктам дальнейшего гидролиза. Возможно, одним из одуктов гидролиза 2.1.4 является 4-гидроксибензальдегид (максимум поглощения в елочном водном растворе 330 нм). В то же время, в ходе процесса щелочной градации 2.1.4 наблюдается накопление спектральной формы с максимумом при 450 м. Эта форма становится ясно различимой на поздних стадиях процесса деградации ривая 7 на Рис. 2В). Также, в ходе деградации увеличивается отношение поглощения ри 450 и при 520 нм. Предположительно, форма при 450 нм представляет собой омофор ОРР-типа. Однако, для выяснения механизма и строения продуктов гидролиза .1.4 требуются дальнейшие исследования.

Значения максимумов поглощения хромофоров вРР и а5рр595 сильно зависят о природы растворителя. В частности, длина волны максимума поглощения анионно формы 2.1.4Ь увеличивается в следующем ряду: вода < этанол < 2-пропанол диметилформамид (Таблица 1). Мы считаем, что данная зависимость в большей степен определяется не полярностью растворителя (как утверждается в работах №у/а), бренстедовской кислотностью растворителя. Мы предполагаем, что водородные связ образуемые фенольным кислородом со своим окружением (белковое окружение ил растворитель) способствуют увеличению энергии возбуждения, приближая поведени анионной формы хромофора к нейтральной форме 2.1.4а.

В диметилформамиде анионная форма 2.1.4Ь обладает спектральными свойствам близкими к спектральным свойствам нативного аэРР595 (положения и формы пико поглощения, возбуждения и эмиссии). Таким образом, мы считаем, что данная форм соответствует состоянию хромофора в белке. Неожиданно, мы обнаружили, чт квантовый выход флуоресценции свободного хромофора в растворе намного выше, че квантовый выход азРР595. Как правило, для флуоресцентных белков верно обратно Например, хромофор вИР практически не флуоресцирует в растворах при комнатно температуре, но при этом обладает очень высоким квантовым выходом флуоресценции составе нативного белка. Принято считать, что безызлучательный сброс энерги возбужденного состояния происходит за счет фотоизомеризации хромофора, которая нативном ОРР затруднена аминокислотным окружением. Отсутствие флуоресценции аэРР595 и других вРР-подобных хромобелков остается до конца не объясненным н данный момент. Наши данные свидетельствуют, что аминокислотное окружение азРР595 способствует безызлучательной потере энергии возбужденным состояниек делая хромофор даже менее флуоресцентным, чем в растворе. В свою очередь, из этог следует, что биологическая функция азРР595 связана скорее с поглощением света, чем флуоресценцией.

Синтез и свойства хромофора красного фотоконвертируемого белка Каес1е гаскуркуШа 8еоЛгоу1) и его структурных аналогов

ромофор красного фотоконвертируемого белка Каеёе представляет собой (52)-5-(4-1дроксибензилиден)-2-[(Е)-2-(1Н-имидазол-5-ил)винил]-3-метил-3,5-дигидро-4Я-идазол-4-он (НУС). Он образуется из трех аминокислотных остатков (Шз-Туг-01у) липептидной цепи белка Кае(1е под действием света с длиной волны 350-420 нм. В де настоящей работы нами было получено соединение НУС, а также его структурные 1алоги, соответствующие тройкам аминокислот Тгр-Туг-01у, Р11е-Тгр-01у, Туг-Тгр-1у. Лэп-Туг-Оу. Р11е-Туг-01у и Туг-Туг-01у. Эти соединения были названы в ответствии с однобуквенным обозначением аминокислот \УУС, Р\УС, YWG) N¥0, УС, и УУС, соответственно (Рис. 5).

он он он он

НУв УУв ГУв НУв

Хромофор Каейе

(красная форма)

ОН

ша тага FWG

ис. 5 Структура хромофора Каеёе (НУС) и его аналогов.

. / Синтез

кислением легкодоступных 2-метил-5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов 2.2.1 иоксидом селена в кипящем диоксане были получены альдегиды 2.2.2 (Схема 2).

4-итийа2о1у1

3-Ыо1у1

саын2

С6Н5

4-НОСвН4

Хромофор НУС и/УО N¥0 РУО УУО

Хромофор Р\ЛЮ УШ

хема 2 Синтез хромофора Каес]е и его аналогов.

Однако, в случае исходного соединения 2.2.1а целевой альдегид оказался неустойчивым и разлагался с образованием неидентифицированных продуктов при попытк хроматографической очистки. Защита фенольного гидроксила действием трет бутилдиметилхлорсилана и диизопропилэтиламина на неочищенный исходный альдеги позволила существенно улучшить устойчивость продукта в условиях хроматографии альдегид 2.2.2а был получен с общим выходом 57%. Следует отметить, что при хранени' при температуре -20°С в течение месяца наблюдалось значительное разложени альдегида 2.2.2а. Защищенные по фенольной группе производные 2.2.1а не давал требуемых альдегидов при действии диоксида селена, а также других окислителе" Исходное соединение 2.2.1Ь, содержащее индольный фрагмент, окислялось д соответствующего альдегида 2.2.2Ь с выходом 73%. Целевые хромофоры были получен по реакции Виттига взаимодействием защищенных альдегидов 2.2.2а и 2.2.2Ь соответствующими фосфониевыми солями 2.2.3 (Таблица 2).

Таблица 2 Условия и выходы в реакции Виттига между альдегидами 2.2.2 фосфониевыми солями 2.2.3.

Альдегид Фосфониевая соль

Продукт (выход, %)

2.2.2а

2.2.2а 2.2.2а 2.2.2а

2.2.2а

2.2.2Ь 2.2.2Ь

о

н (2.2.3а)

4-(ТВ80)С6Н4СН2РРЬзВг (2.2.3Ь) ВпРРЬзВг (2.2.3с) Н2ЫСОСН2РРЬ3Вг (2.2.3с1) -РРИз^Вг

N

Вос (2.2.3е) 4-(ТВ80)С6Н4СН2РРНзВг (2.2.3Ь) ВпРРИзВг (2.2.3с)_

НУС (5)!а]

УУв (23)[а1 РУС (53)[Ь] N¥6 (49)м

,[Ь,с]

\VYG08)1

YWG (42)[Ь] Р\Ув (44)[Ь]

м2М водный ЫаОН / СН2С12. 1Ь| (-ВиОК / <-ВиОН.

,с| После удаления защитной группы Вос.

Во всех случаях наблюдалась высокая стереоселективность с преобладанием продуктов Е-конфигурацией вновь образующейся двойной связи (соотношение > 15:1) характерной константой спин-спинового взаимодействия около 15 Гц. Низкий выхо продукта в синтезе НУС может быть вызван побочной реакцией депротонировани имидазольного цикла в соединении 2.2.3е с последующим элиминированием молекуль трифенилфосфина с образованием диазафульвенового интермедиата 2.2.4 вмест требуемой нуклеофильной атаки илида 2.2.5 на альдегид 2.2.2а (Схема 3).

2.2.3а

хема 3 Реакционная способность фосфониевой соли 2.2.3а.

побочные продукты

ри использовании стерически затрудненного трет-бутилата калия в качестве основания нный побочный процесс преобладал, и образование хромофора НУв не наблюдалось, ля получения НУС использовалась двухфазная система водный раствор КаОН -хлорметан. В остальных случаях оба способа проведения реакции Виттига давали авнимые результаты.

2 Спектральные свойства

ак мы и ожидали, спектры поглощения хромофора белка Каеёе дикого типа НУС 'ладают отчетливой рН-зависимостью. В водных растворах протонированная форма меет максимум поглощения при 430 нм (Таблица 3). С увеличением рН пик при 430 им еретекает в пик при 490 нм с изосбестической точкой при 447 нм и рКа 7.7 (Рис. 6А), ы относим данное превращение к депротонированию фенольной гидроксильной уппы, аналогично поведению остальных хромофоров СРР-подобных белков. Других ектральных переходов в диапазоне рН 3-14 для НУС не наблюдалось. Природа астворителя оказывает небольшое влияние на величину коэффициента экстинкции и оложение максимума абсорбции протежированной формы НУО (Рис. 6В). Напротив, в елочных условиях спектры поглощения хромофора НУС сильно различаются в висимости от растворителя. Большой сдвиг в длинноволновую область наблюдается в яду растворителей вода - этанол - изопропанол - ДМФА - ДМСО (Рис. 6С, Таблица 3). о сравнению с модельными хромофорами 1.11, содержащими одну или две двойные вязи С=С, сопряженных с хромофором вРР, спектры поглощения НУй лежат в более линноволновой области спектра за счет увеличения системы сопряженных л-ектронов.

налоги хромофора Каеёе обладают, за некоторыми исключениями, схожими висимостями спектров от рН и растворителя (Таблица 3 и Рис. 7). Как и ожидалось, ромофор Р\¥С не обладает спектральным переходом в интервале рН 5-10, так как в его труктуре отсутствует ответственная за этот переход фенольная гидроксо-группа. )днако, для этого хромофора наблюдается батохромный спектральный переход с рКа 1.6, связанный, по-видимому, с депротонированием индольного атома азота. При изких значениях рН индол-содержащие хромофоры (\УУС, Р\УС и У\УО бнаруживают спектральный переход с рКа = 2.5 - 3.5, давая формы со значительным атохромным смещением. Коэффициенты экстинкции данных форм также значительно озрастаюг (Таблица 3, Рис. 1С). Вероятно, данный переход объясняется

протежированием атома азота индола. Впрочем, для выяснения структур! протонированных \УУС, Р\УС и УУУС требуются дополнительные спектроскопически исследования. Остальные Каес1е-подобные хромофоры обладают сходным спектральны, переходом, но при значительно более низком рН (рКа « 1.5). Аналогичный переход с рК 1.5 описан для хромофора вРР, а также для соединений 1.11. Он соответствуе протонированию N-3 имидазолонового цикла. Хромофор в отличие от остальны представителей ряда, обладает наиболее длинноволновым поглощением в ДМФА, а не ДМСО.

Таблица 3 Спектральные свойства хромофора Каес1е НУв и его аналогов.

Максимум поглощения, нм (с, мМ см'1) в нейтральной среде8 рКа (вода) Максимум поглощения, нм (б, мМ"'см"') в основной средеь Максимум испускания (Ф)с

О <4 X X о щ ж <2 си < © ег О и ег О к i О (3 X о £ < © О и ч"

НУО 430 (41) 443 (40) 444 (41) 446 (40) 448 (37) 7.7 490 (53) 502 (79) 514 (80) 557 (77) 565 (80) 582 (0.005)

У/Ув 460 (7) 462 (15) 460 (16) 460 (14) 465 (14) 8.1 494 (21) 509 (24) 532 (27) 580 (27) 595 (27) 615 (0.017)

Р\УО 455 (И) 456 (23) 460 (25) 456 (20) 462 (19) 11.6 498" (13) 508 (23) 526 (26) 556 (22) 563 (24) 625 (0.016)

У\Уй 462 (8) 466 (30) 468 (26) 464 (23) 468 (22) 8.3 496 (27) 509 (34) 533 (40) 567 (38) 577 (44) 610 (0.017)

ЫУО 424 (27) 433 (19) 433 (18) 431 (21) 435 (18) 7.6 510 (35) 531 (36) 548 (30) 564 (34) 543 (25) 642 (0.005)

РУв 425 (28) 437 (29) 451 (26) 437 (27) 438 (28) 7.8 492 (43) 513 (45) 526 (44) 553 (49) 572 (50) 635 (0.009)

УУО 436 (30) 459 (35) 483 (42) 445 (22) 447 (29) 7.8 506 (49) 522 (61) 531 (60) 556 (59) 588 (59) 625 (0.016)

а В воде при рН 5 или в чистых растворителях. " В воде при рН 10 или в растворителях, содержащих 50 мМ ЫаОН. с В ДМФА + 50 мМ №ОН. ''При рН 13

Все хромофоры - аналоги Каеёе в щелочных растворах ДМФА и ДМСО обладаю заметной красной флуоресценцией с квантовыми выходами, превышающими таковы хромофоров вРР и аБР595 (Табл. 3, Рис. 7). Наибольшими квантовыми выходам (порядка 0.017) обладают хромофоры - производные триптофана УУУв и УУУв (дл сравнения, измеренный нами квантовый выход хромофора СТР в щелочном ДМФ составил 0.00005). Возможно, объемный остаток триптофана затрудняе фотоизомеризацию, и таким образом препятствует безызлучательному сброс возбуждения.

л*/// /1 ?//

^10

320 400 450 500 550 600

-----ЕЮН

----¡РгОН

---ОГ.'Р

-омэо

400 450 500 550 600 650 _Длина волны, пт_

10'

1 .о.»' //

И«- ,/у

1 10 4 ч //

| 02 V'*'- /

00.

400 450 500 550 600 650 Длина волны,пт

400 500 Длина волны,лт

с. 6 Спектры поглощения хромофора в. (Л) Спектры поглощения растворов в в буферных растворах при различных (В и С) Спектры поглощения мофора НУС в различных творителях при рН 3.5 (В) и 10.1 (С).

Рис. 7 Спектры поглощения хромофоров -структурных аналогов хромофора Каеёе. (Л) Спектры поглощения индол-содержащих хромофоров (УУУС, Г\УС и У\УС) в щелочном ДМФА. (В) Спектры поглощения хромофоров РУС, N¥0 и УУС в щелочном ДМФА. (С) спектры поглощения хромофора \УУС (15 мкМ) в буферных растворах при рН 2.1 (пунктирная линия), 7.0 (штриховая линия) и 9.8 (сплошная линия).

спектрах эмиссии хромофора НУв в ДМФА и ДМСО наблюдаются максимумы при 2 и 598 им соответственно. Таким образом, ДМФА хорошо моделирует окружение омофора в белке Каеёе, где наблюдается максимум флуоресценции при 582 нм.В стоящей работе уже было отмечено сходство спектров раствора синтетического омофора в щелочном ДМФА со спектрами нативного белка а$РР595. В отличие от оих структурных аналогов, а также от хромофоров СРР и азРР595, хромофор НУС еет в спектре эмиссии хорошо различимое плечо при 620-640 нм (Рис. 6А). Такое ечо (пик) в длинноволновой области является характерной особенностью всех белков, мологичных Кае(1е. Таким образом, можно сделать вывод, что за такую особенность рмы спектров эмиссии Каес!е и родственных ему белков отвечает остаток гистидина.

Хромофор Максимум поглощения, нм (с, мМ"1 см"1)

рКа (Н20) Н20 ЕЮН 'РЮН ДМФА ДМСО

3.5 507 512 521 509 500

(23) (27) (30) (25) (23)

Р\¥С 2.6 491 486 509 480 477

(24) (21) (27) (25) (21)

У\¥й 2.8 508 510 523 511 496

(32) (32) (40) (26) (22)

300 400 500 600

Все из исследованных нами структурных аналогов хромофора Каеск обладают эмисси при больших длинах волн, чем сам НУС (Табл. 3 и Рис. 7). Неожиданно, наибол длинноволновой эмиссией обладает хромофор N¥0. В щелочном ДМФА максимум возбуждения и эмиссии N¥0 приходятся на 570 и 642 нм соответственно, ч соответствует большому стоксовскому сдвигу (Рис. 8Е). В случае успешного создан функционального мутанта Каес!е с заменой Н65Ы, такой мутант будет являть представителем новой группы дальне-красных фотоконвертируемых флуоресцентнь белков.

Серия синтезированных в настоящей работе структурных аналогов хромофора Кае позволяет непосредственно сравнить ауксохромные свойства некоторых заместител (аминокислотных остатков) (Таблицы 3 и «Симметричные» соединения \УУв и У\Ув обладают почт идентичными максимумами поглощения в нейтральных щелочных условиях. Только в щелочных ДМФА и ДМС максимум поглощения \УУО немного сдвигается длинноволновую область по сравнению с У\¥0. Как ожидалось, п-гидроксифенильный заместитель обеспечива больший батохромный сдвиг, чем фенильная группа (УУС РУС). Из сравнения спектров поглощения Р\УС и РУ следует, что незаряженный индольный заместите обеспечивает больший батохромный сдвиг, ч незаряженный п-гидроксифенил. Однако, депротонированном состоянии эта разница исчезает.

А

нуа

355

УЧ.

400 500 600 Длина волны, пт

Рис. 8 Спектры флуоресценции хромофора Каес1е и его струкгурн аналогов. (А-Е) Спектры возбуждения (пунктирная линия) и эмисс (сплошная линия) растворов НУС, \¥УС, УУС, РУС и N¥0 щелочном ДМФА.

Флуоресцентные белки являются сложными молекулами к со структурной, так и со спектроскопической точки зрени Модельные соединения уже доказали свою эффективное при изучении спектрального поведения флуоресцентн белков. В частности, описанные в настоящей рабо модельные хромофоры и их спектральные характеристи

гут быть использовапы для предсказания оптических свойств Kaede-подобных белков х хромофоров с помощью квантово-химических расчетов.

сколько нам известно, в настоящей работе впервые описано депротонирование дольного фрагмента в составе GFP-подобного хромофора. Измеренный нами рКа ого депротонирования составляет 11.6 (для индольной группы WYG), что намного ныне, чем для самого индола (рКа 17 в воде). Мы обнаружили, что модельное •динение, соответствующее хромофору в составе CFP (GFP-Y66W, структура 2.2.1Ь, ема 2) в щелочных условиях переходит в спектральную форму с батохромным игом около 80 нм (данные не приведены). По-видимому, данное состояние тветствует депротонированному индольному фрагменту. Возможно, введение ювных остатков в окружение хромофора ECFP (или аналогичных мутантов) позволит лучить новый (и потенциально практически значимый) тип флуоресцентных белков, ержащих в хромофоре депротонированный остаток триптофана, ним из наиболее интересных результатов данной части работы мы считаем наружение большого батохромного сдвига в хромофоре NYG. В свете полученных шых, а также учитывая небольшой размер остатка Asn, представляется спективным создание функционального мутанта Kaede His65Asn. В настоящее время I проводим исследования механизма образования хромофоров красных уоресцентных белков, в том числе Kaede. Если механизм образования хромофора ede не включает непосредственное участие имидазольного цикла остатка гистидина, в этом случае замена His65Asn с сохранением функциональных свойств-является инципиально возможной. Также интересным представляется создание мутатнов уоресцентных белков, содержащих остаток аспарагина в хромофоробразующей триаде юложении 66 (вместо остатка тирозина). В этом случае можно ожидать образование 1их флуоресцентных белков, содержащих новый тип хромофора, и соответственно, адающих необычным фотофизическим поведением. Работы по созданию подобных тантов в настоящее время ведутся в нашей лаборатории.

интез и свойства хромофора желтого флуоресцентного белка YFP (Zoanthus sp.)

лтый флуоресцентный белок zFP538 из кораллового полипа Zoanthus проявляет икальные спектральные свойства, промежуточные между свойствами зеленых и сных флуоресцентных белков (А.тахех=528 нм, ^тах,ет=538 нм) [Matz, 1999 #409]. омофор этого белка образован остатками лизина, тирозина и глицина. Недавно были бликованы противоречивые версии структуры хромофора zFP538 [Zagranichny, 2004; mington, 2005; Pletneva, 2007].

настоящей работе синтез модельного соединения был использован для разрешения тиворечий между кристаллографическими и биохимическими данными. Данный ход позволил выяснить структурную основу сложных спектральных превращений мофора, описанных в работе Заграничного и соавт.

Синтез

я получения структуры 2.3.5 был применен разработанный в настоящей работе ход, включающий окисление диоксидом селена на ключевой стадии (Схема 4).

ОАс

ВосШ(СН2)5СООН , ВосНН(СН2)5СОИНСН2СООН

VI)

.МН^^СН^ЫНВос ¡У)

т

о

ш

I 2.3.2

2.3.5

Схема 4 Синтез хромофора гРР538 (в нециклизованной форме 2.3.5). ¡) а)гидрохлорид этилового эфи глицина,спиртовой NaOH, ОСС Ь) водный N8011, этанол, 50°С затем НС1 (78%) н) ИСС, затем ацетоксибензальдегид, ЫаОАс ш) МеЫНг ¡V) СэгСОз, ДМФА, кипячение 5 мин (64% на 3 стадии) БеОг, диоксан, кипячение (51%) уО СН2С|2, ТРА, комн. темп., 30 мин (100%)

Нами был синтезирован имидазолон 2.3.3, содержащий Вос-защищенный аминопентильный заместитель в положении 2 имидазолона путем стандарта последовательности превращений, включающей образование азлактона по Эрленмейе его нуклеофильный аминолиз, и циклизацию дегидротирозинового производного 2.3.2 щелочных условиях. В данной части работы нам удалось подобрать оптимальн! условия для трансформации 2.3.2 в 2.3.3, а именно нагревание в ДМФА с карбонат цезия в качестве основания. Данные условия позволяют достичь количественн выходов, при этом время реакции сокращается до нескольких минут. Мы опробова данные условия на различных примерах (данные не приведены). В предшествующ работах подобное превращение осуществлялось путем продолжительного (несколь часов) нагревания в водной или спиртовой среде с гидроксидами или кapбoнaтa^ щелочных металлов в качестве оснований. В тех случаях, когда в положениях 2 и имидазолона находятся простейшие алкильные заместители, оба метода дают хорош

ходы, но последний метод является преимущественным в случае объемных мстителей или при протекании побочных реакций.

идазолон 2.3.3 был подвергнут окислению БеСЬ в разбавленном диоксановом творе с образованием Вос-защащенного предшественника 2.3.4 хромофора гРР538. последней стадии была удалена защита с аминогруппы выдерживанием 2.3.4 с 20% твором трифторуксусной кислоты в дихлорметане при комнатной температуре в ■ение 15 минут, что привело к образованию 2.3.5 в виде трифторацетата.

Хшшческие и спектральные свойства

смотря на то, что структура 2.3.5 не воспроизводит состояние хромофора в нативном тке гРР538, мы ожидали, что 2.3.5 самопроизвольно превратится в циклический имин .7 за счет внутримолекулярной циклизации (схема 5).

2.3.6

2.3.7

ема 5 рН-Зависимые химические превращения хромофора гРР538.

йствительно, мы наблюдали упомянутое превращение при защелачивании раствора «|)торацетата 2.3.5 (увеличение рН от 5.5 до 8.9) в воде или изопропаноле. Данные 1Р убедительно показали, что в кислой среде (020 или дейтероизопропанол) состояние ества описывается структурой линейного аминокетона 2.3.5. В частности, шческий сдвиг сигнала С-10 в спектре ЯМР |3С был равен 196.0 м.д. (020), что актерно для карбонильной группы (Таблица 5).

Таблица 5 Химические сдвиги ЯМР 'Н и |3С соединений 2.3.5, 2.3.6 и 2.3.7, по даннь спектров 'Н, 13С, НМВС, HSQC, COSY и TOCSY.

Номер атом аа 2.3.5" 2.3.6" 2.3.7 е

1Н IJC 'Н "С 'Н IJC

1 160.7 160.0 161.7

2 6.90 115.9 6.95 116.0 6.61 120.3

3 8.00 136.6 8.09 136.7 8.02 137.2

4 125.8 125.6

5 7.27 137.5 7.69 142.7 7.21 135.5

6 136.4

7 171.8 164.7 171.5

8 3.27 28.3 3.22 25.3 3.43 29.5

9 152.5 158.7 151.9

10 196.0 156.1 161.8

11 3.04- 25.2 2.79 31.6 2.76 d 26.1

3.13

12 1.66- 21.8, 1.77- 21.6, 1.78 19.1

1.80 26.3 1.83 26.0

13 1.661 СА 1.67 22.0

14 1 .OU 3.04- 39.1 3.09 39.2 3.84 50.2

3.13

" Нумерация атомов в соответствии со схемой 5. ь Раствор 3 мг/мл в смеси Н20-020, рН 3.3, 20°С. с Раствор 7мг/мл в изопропаиоле -(18, насыщенном С82ССЬ.

(| Интегральная интенсивность уменьшена в -10 раз, из-за обмена с дейтерием из растворителя.

Также, не наблюдался кросс-пик между СН2-14 и С-10 в спектре С-Н НМВС (нумерац атомов на схеме 5). Спектр ЯМР 'Н в 020 при рН 8.7 был сложным, и включал набор нескольких различных сигналов от каждой группы протонов (данные не приведен Однако такой вид спектра не был результатом разложения 2.3.5, т.к. при подкислен образца до рН 5.5 спектр 'Н оказывался идентичным таковому до подшелачиван Сложный вид спектра ЯМР 'Н при рН 8.7 (возможно отражающий сложи конформационное поведение, вызванное затрудненным вращением вокруг некотор связей) затруднил однозначное определение структуры. Для преодоления этой трудное мы использовали насыщенный раствор карбоната цезия в дейтероизопропаноле качестве растворителя для ЯМР. В этом случае нам удалось наблюдать в спектрах од набор сигналов, соответствующих циклическому имину 2.3.7. В частности, в спектре 1 химический сдвиг С-10 составил 161.8 м.д., что характерно для иминов, а таю наблюдался интенсивный кросс-пик между СН2-14 и С-10 в двумерном спектре С НМВС. Интересно отметить, что интегральная интенсивностьсигнала от СН2-11 спектре 'Н была снижена примерно в 10 раз. Данный эффект, очевидно, вызв дейтериевым обменом с растворителем за счет имин-енаминной таутомерии. Неожиданно, при рН ниже 5, как в воде, так и в изопропаноле, соединение 2. медленно превращается в производное 2,6-дикетопиперазина 2.3.6, структура которо

ла определена методами ЯМР 'Н, "С, НМВС, HSQC, COSY и TOCSY. По данным х спектров в ходе указанного превращения связанность углеродного скелета не 'терпевает изменений, а химический сдвиг С-10 смещается от 196.0 к 156.1 м.д. азанные химические превращения вызывают значительные изменения в спектрах лощения. В водном растворе трифторацетата 2.3.5 при рН 5.5 максимум в спектре "лощения наблюдается при 417 им (Рис. 9А).

. 9 Спектры поглощения (А-С) и флуоресценции (О-Е) водных растворов модельных соединений 5 -2.3.7. (А) Спектр поглощения 2.3.5 при рН 4.0 (прерывистая линия) и 2.3.7 при рН 8.9 (сплошная ия). (В) Изменение спектра поглощения раствора 2.3.5 при лодщелачмвании среды до рН 8.9. ктры регистрировались с временным промежутком 10 секунд и свидетельствуют о превращении откоживущей промежуточной формы (депротонированный кетон 2.3.5) с максимумом поглощения нм в циклический имин 2.3.7 с максимумом поглощения 468 нм. (С) Спектры поглощения 2.3.6 при 3.0 (прерывистая линия) и при рН 8.0 (сплошная линия). (Э) Спектры возбуждения и эмиссии 2.3.5 рН 4.0 (серым) и 2.3.7 при рН 8.9 (черным). (Е) Спектры возбуждения и эмиссии короткоживущей межуточной формы (депротонированный кетон 2.3.5), записанные моментально после щелачивания раствора 2.3.5 до рН 8.9. (Р) Спектры возбуждения и эмиссии 2.3.6 при рН 3.0 (серым) ри рН 8.0 (черным). На вкладках И-Е для каждой пары спектров возбуждения и эмиссии спектр .ссии лежит в более длинноволновой области.

и увеличении рН до 8.9 максимум поглощения смещается к 468 нм, через откоживущую промежуточную спектральную форму (время полужизни около 8 с), с симумом полгощения при 530 нм (Рис 9А, В). Указанные спектральные превращения ут быть интерпретированы как быстрое депротонирование кетона 2.3.5 (форма с химумом поглощения 530 нм) и последующая циклизация с образованием ротонированного по фенольному гидроксилу циклического имина 2.3.7 (максимум лощения 468 нм).

и продолжительной инкубации 2.3.5 в кислой среде (рН<5) максимум поглощения щается в коротковолновую область (от 417 к 397 нм, Рис. 9С), что соответствует ■вращению 2.3.5 в 2.3.6. В щелочном буфере (рН 8.0) в спектре поглощения 2.3.6

наблюдается максимум при 505 им, что соответствует депротонированию фенольн группы.

Спектры флуоресценции 2.3.5, 2.3.6 и 2.3.7 при различных pH также находятся соответствии с химическими превращениями, показанными на Схеме 5. Соединение 2. в кислом водном рстворе обладает слабой флуоресценцией с максимумами возбужден и эмиссии 419 и 545 нм, соответственно (Рис 9D). При подщелачивании мы наблюд короткоживущий интермедиат (депротонированный кетон 2.3.5) с максимума, возбуждения и эмиссии 530 и 597 нм соответственно (Рис. 9Е), который претерпев быстрое превращение в коротковолновую спектральную форму 2.3.7, максиму возбуждения и эмиссии которой составили 470 и 538 нм (Рис 9D). Структура 2.3.6 кислой и щелочной среде характеризуется максимумами возбуждения и эмиссии 405/5 и 510/579 нм соответственно (Рис. 9F).

3.3 Обсуждение

В 2004 году Заграничный и соавторы сообщили о выделении и характеризац хромопептидов, полученных из zFP538 [Zagranichny, 2004]. Ферментативн гидролизом zFP583 были получены три хромопептида, обозначенных авторами пептиды I, II, и III. Пептид I соответствовал незрелому хромофору GFP-типа, в то вре как пептиды II и III образовались из зрелого желтого белка. Основываясь на спектр поглощения и флуоресценции, а также на неполных данных ЯМР авторы приписали эт пептидам следующие структуры. Пептиду II - структуру линейного аминокетсн аналогичную структуре 2.3.5 в настоящей работе. Пептиду III - необычную и, видимому крайне нестабильную структуру незамещенного кетимина 2.3.8 (Рис.10).

Рис. 10 Структура, приписанная пептиду III Заграничным и соавт. [Zagranichny, 2004].

Причем именно структура 2.3.8 была постулирована авторами как структура хромоф в нативном зрелом zFP538. В то же время, по данным рентгеноструктурного анал кристаллов zFP538 хромофор имеет структуру шестичленного циклического имина 2.3 Заграничный и соавт. объяснили данное несоответствие тем, что, якобы, в структ 2.3.8 может наблюдаться образование циклического аминаля 2.3.9 с вновь образующи хиральным центром в виде смеси двух диастереомеров, что могло привести

он

AspArg

2.3.8

2.3.9

равильной интерпретации данных РСА за счет усреднения дифракционной картины. 1ное предположение на наш взгляд является абсурдным, так как при химической кции внутри белковой глобулы крайне маловероятна низкая стереоселективность. тоящая работа позволяет прояснить кажущееся противоречие между химическими и кристаллографическими данными. Мы обнаружили, что спектральное ¡еденис пептидов II и III из работы [Zagranichny, 2004] практически идентично ктральному поведению соединений 2.3.6, 2.3.5 и 2.3.7. Наблюдается близкое падение максимумов поглощения, возбуждения и эмиссии , а также характерное вление промежуточной спектральной формы с длинноволновым поглощением, людаемое при подщелачивании растворов пептида III и соединения 2.3.5 (Таблица 6).

лица 6 Сравнение спектральных характеристик синтетических хромофоров 2.3.5 -.7 и хромопептидов II and III из работы [Zagranichny, 2004].

Поглощение, им_Возбуждение, нм Эмиссия, нм_

единение_Кислота Щелочь Кислота Щелочь Кислота Щелочь

.6 397(412) 505 (512) 405 (412) 510(512) 530(538) 579(579)

ептид II)

.5 417 (420) 530 (529) 419 530 (528) 545 597 (595)

ептид III

чальная и

омежуточная

рмы)

.7 468(470) 470(475) 538(538)

ептид III конечная

ма)_

I предлагаем следующее объяснение экспериментальных данных, полученных орами [Zagranichny, 2004]. В ходе денатурации, ферментативного гидролиза и матографических процедур при кислых значениях рН, сопровождающих выделение мопептидов II и III, нативный трициклический хромофор (аналогичный 2.3.7) чале претерпевает гидролиз до линейной формы (аналогичной 2.3.5), что приводит к азованию пептида III. При более низких значениях рН пептид III частично или ностью трансформируется в пептид II со структурой 2,6-дикетопиперазина алогичной 2.3.6). Действительно, относительное содержание пептида II было тем .ьше, чем более низкие значения рН использовались для денатурации и выделения мопептидов. Авторам работы [Zagranicl^ny, 2004] не удалось наблюдать сигналы от чевых атомов в ЯМР-спектрах хромопептидов II и III, что привело к неправильному еделению их структуры.

астоящей работе нами впервые описана необычная изомеризация 2-ацилимидазолона роизводное 2,6-дикетопиперазина (превращение 2.3.5 в 2.3.6). Интересно, что 2,6-етопиперазиновый скелет, присутствующий в соединении 2.3.6, встречается в роде среди вторичных метаболитов грибов, в частности во флутимиде. Флутимид и структурные аналоги обладают противовирусной и противомикробной активностью, ется разработка лекарств на их основе. Описанный нами синтез 2-ацилимидазолонов юследующей самопроизвольной перегруппировкой в 2,6-дикетопиперазины может

рассматриваться как новый эффективный метод синтеза аналогов флутимида. Интерес также отметить, что хромофоры, содержащие ядро 2-ацил-5-арилиден-3,5-дигидро-4 имидазол-4-онов встречаются в природных белках, а именно в хромобелке а$РР5' Таким образом, можно предполагать, что перегруппировка, аналогичная превращен! 2.3.5 в 2.3.6 может наблюдаться в природных или генно-инженерных ОРР-подобн белках.

Данное исследование выдвигает аргументы в пользу трициклической иминн структуры хромофора желтого флуоресцентного белка гРР538, выдвинутой автора рентгеноструктурных исследований, а также предлагает интерпретащ экспериментальных данных, полученных при изучении хромопептидов из гРР5 Хромофор гРР538 оказался сложной системой с необычными химическими спектральными свойствами, что вызвало сложности при определении его структуры.

1В0ДЫ

1. Разработан общий метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4Я-имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор окрашенного белка аБрР595, изучено его спектрохимическое поведение в различных условиях. Показана тождественность структуры модельного соединения структуре хромофора в белке.

2. Разработан новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4#-имидазол-4-онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Каес1е (красная форма). Также синтезированы 6 структурных аналогов хромофора Каеёе, соответствующих замене гистидина на другие аминокислоты в хромофоре. Изучены спектрохимические характеристики полученных хромофоров. Показано, что хромофор Каес(е-типа, содержащий остаток аспарагина вместо гистидина обладает наиболее длинноволновым поглощением.

3. Получен хромофор желтого флуоресцентного белка гРР538. Независимо показано, что в нативном гРР538 хромофор существует в форме внутримолекулярного имина. Выявлена химическая природа сложного рН-зависимого спектрального поведения хромофора 2РР538.

4. Обнаружена самопроизвольная перегруппировка 5-арилиден-2-ацил-3,5-дигидроимидазол-4-онов в 3-арилиден-5-алкил-2,б-дикетопиперазины в водных и спиртовых растворах в кислой среде.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Yampolsky, I.V., Remington, S.J., Martynov, V.I., Potapov, V.K., Lukyanov, S., a Lvkyanov, K.A. (2005) Synthesis and properties of the chromophore of the asFP5 Chromoprotein from Anemonia sulcata, Biochemistry 44, 5788-5793.

2. Yampolsky, I.V., Kislukhin, A.A., Amatov, T.T., Shcherbo, D., Potapov, V.K., Lukyanov, and Lukyanov, K.A. (2008) Synthesis and properties of the red chromophore of the gre to-red photoconvertible fluorescent protein Kaede and its analogs, Bioorganic Chemis 36, 96-104.

3. Yampolsky, I.V., Balashova, T.A., Lukyanov, K.A. (2009) Synthesis and spectral a chemical properties of the yellow fluorescent protein zFP538 chromopho Biochemistry 48, 8077-8082

4. Ивашкин П.E„ Ямпольский И.В., Лукьянов K.A. (2009) Синтез и свойства хромофо

флуоресцентных белков, Биоорганическая химия 35, 726-743.

Тезисы докладов на конференциях

1. Yampolsky, I. V., Potapov, V. К., Lukyanov, S., and Lukyanov, К. A. (2005).Synthesis

properties of the chromophore of asFP595 chromoprotein from Anemonia sulc International symposium "Advances in Science for Drug Discovery", Москва, июль 20 сборник тезисов стр. С-54.

2. Ямпольский И.В. Синтез и свойства модельных хромофоров флуоресцентных белк

IX Чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), сборник тезисов с 280-281.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Ямпольский, Илья Викторович

Список сокращений.

Введение.

ГЛАВА 1. Биохимия флуоресцентных белков и их хромофоров (обзор литературы).

1.1 Введение.

1.2 Флуоресцентные белки - гомологи зеленого флуоресцентного белка (GFP).

1.2.1 Краткая история флуоресцентных белков.

1.2.2 Структура GFP-подобных белков.

1.2.3 Биохимия и спектральные свойства GFP-подобных белков.

1.3 Хромофоры флуоресцентных белков.

1.3.1 Методы синтеза хромофоров.

1.3.2 Структурные и химические особенности хромофоров.

1.3.2.1 Кислотно-основные свойства.

1.3.2.2 Цис-транс изомерия. Термическая изомеризация.

1.3.2.3 Окислительно-восстановительные свойства.

1.3.2.4 Прочие химические свойства.

1.3.3 Спектральные свойства хромофоров.

1.3.3.1 Поглощение.

1.3.3.1.1 Структурные факторы.

1.3.3.1.2 Сольватохромные свойства.

1.3.3.2 Флуоресценция.

1.3.3.3 Специфическое влияние окружения на спектральные свойства

1.3.3.4 Фотоизомеризация.

1.3.4 Перспективы.

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение.

2.1 Синтез и свойства хромофора красного хромобелка asFP595 {Anemonia sulcata).

2.1.1 Синтез.

2.1.2 Спектральные свойства.

2.1.3 Обсуждение.

2.2 Синтез и свойства хромофора красного фотоконвертируемого белка Kaede (Trachyphyllia geoffroyi) и его структурных аналогов.

2.2.1 Синтез.

2.2.2 Спектральные свойства.

2.3 Синтез и свойства хромофора желтого флуоресцентного белка YFP {Zoanthus sp.).

2.3.1 Синтез.

2.3.2 Химические и спектральные свойства.

2.3.3 Обсуждение.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1 Материалы, оборудование, программное обеспечение.

3.2 Синтез.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и свойства хромофоров белков семейства зеленого флуоресцентного белка"

Бурно развивающиеся в последние годы технологии флуоресцентной микроскопии позволили визуализировать многие биологические процессы. Одним из важнейших инструментов изучения живой клетки являются флуоресцентные маркеры, дающие возможность проводить наблюдение за целевыми структурами или процессами в режиме реального времени. Особенно широко используются генетически кодируемые метки — флуоресцентные белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP, формирующие хромофорную группу внутри молекулы белка за счет посттрансляционных модификаций собственных аминокислотных остатков. Исследования последних лет показали большое разнообразие спектральных характеристик и структур хромофоров в GFP-подобных белках.

Данная работа посвящена синтезу и изучению химических и. спектральных свойств хромофорных групп GFP-подобных белков. Впервые разработаны методы синтеза хромофоров флуоресцентных и хромобелков — гомологов GFP, поглощающих и флуоресцирующих в красной области видимого спектра. Синтезированы хромофоры пурпурного хромобелка asFP595, красного фотоконвертируемого флуоресцентного белка Kaede и желтого флуоресцентного белка zFP538. Синтетические хромофоры позволили провести детальный анализ ауксохромных свойств заместителей в данном ряду окрашенных соединений, а также их сольватохромных и кислотно-основных свойств. Выявлена химическая природа сложного спектрального поведения хромопептидов из белка zFP538, приведшего к неправильному определению их структуры. Обнаружена необычная перегруппировка 2-ацил-5-арилиден-3,5-дигидро-4//-имидазол-4-онов в уникальные производные 2,6-дикетопиперазина, встречающиеся в природе среди метаболитов грибов. Полученные в настоящей работе флуорогены (красители, практически нефлуоресцентные в свободном состоянии в растворе, но приобретающие яркую флуоресценцию после прочного связывания с целевой молекулой, например, белком или ионом металла) и их аналоги могут найти применение для различных флуоресцентных методов детекции.

ГЛАВА 1. Биохимия флуоресцентных белков и их хромофоров (обзор литературы)

1.1 Введение

Белки семейства зеленого флуоресцентного белка GFP широко известны благодаря уникальному механизму формирования хромофорной группы, а также благодаря возможности их использования в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток для прижизненной визуализации процессов жизнедеятельности отдельных клеток и целых организмов [1, 2]. Отличительной особенностью белков этого семейства является уникальный автокаталитический механизм формирования хромофора. В отличие от обычных ферментов, производящих какую-либо одну реакцию множество раз, флуоресцентные белки в ходе своего созревания один раз проводят 2-3 совершенно разные реакции, приводящих к синтезу хромофора внутри молекулы белка за счет посттрансляционных модификаций собственных аминокислотных остатков.

Первый зеленый флуоресцентный белок был найден в гидроидной медузе Aequorea victoria [3, 4]. Позже в коралловых полипах были открыты желтые, оранжевые и красные флуоресцентные белки, а также нефлуоресцентные хромобелки [2, 5]. Исследования последних лет показали, что спектральное разнообразие белков семейства GFP обеспечивается разнообразием химических структур их хромофоров [6, 7].

Синтез модельных хромофоров флуоресцентных белков тесно связан с проблемой определения химического строения нативных хромофоров.

Доказательство строения GFP-хромофора проходило в несколько этапов.

Вначале первооткрывателем GFP Шимомурой была установлена аминокислотная последовательность пептида, полученного при 6 гидрировании окрашенной фракции лизата GFP и выделен п-гидроксибензальдегид в качестве продукта гидролиза хромофора, показано спектральное сходство синтезированного de novo хромофора и окрашенного продукта протеолиза GFP [8]. Значительно позже, после успешного клонирования гена GFP [4], было проведено сравнение структур белкового и синтетического хромофоров методом масс-спектрометрии [9], а также непосредственное определение структуры нативного белка с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 11]. В настоящее время PC А стал основным методом исследования структуры хромофоров в различных флуоресцентных белках [7]. В то же время, кристаллографическое определение структуры не всегда допускает однозначную интерпретацию и малоинформативно при изучении химии и фотохимии хромофоров. Именно поэтому синтез и изучение низкомолекулярных модельных соединений остаются важными задачами, особенно ввиду возрастающего разнообразия известных структур хромофоров.

Несмотря на то, что ковалентная структура большинства известных белковых хромофоров считается надежно установленной, детали стереохимии, кислотно-основных взаимодействий, а также реакционной способности возбужденного состояния остаются недостаточно изученными. В то же время, перечисленные особенности хромофоров важны для понимания таких процессов, происходящих в нативных белках, как фотоактивация [12], фотопереключение [13], фотообесцвечивание [14], фототоксичность [15], созревание сложных хромофоров и др.

В данном обзоре рассмотрены структурные и биохимические особенности флуоресцентных белков — гомологов GFP, методы синтеза соединений, моделирующих хромофоры GFP-подобных белков, обобщены результаты, полученные при изучении этих соединений, и их использование для объяснения спектральных и биохимических свойств флуоресцентных белков.

1.2 Флуоресцентные белки - гомологи зеленого флуоресцентного белка (GFP)

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ямпольский, Илья Викторович

Выводы

1. Разработан общий метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4//имидазол-4-онов, имеющих ацильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор окрашенного белка asFP595, изучено его спектрохимическое поведение в различных условиях. Показана тождественность структуры модельного соединения структуре хромофора в белке.

2. Разработан новый метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4//-имидазол

4-онов, имеющих функционализированный этенильный заместитель в положении 2 имидазола. С использованием этого метода получен хромофор флуоресцентного фотопереключаемого белка Kaede (красная форма). Также синтезированы б структурных аналогов хромофора Kaede, соответствующих замене гистидина на другие аминокислоты в хромофоре. Изучены спектрохимические характеристики полученных хромофоров. Показано, что хромофор Каеёе-типа, содержащий остаток аспарагина вместо гистидина обладает наиболее длинноволновым поглощением.

3. Получен хромофор желтого флуоресцентного белка zFP538.

Независимо показано, что в нативном zFP538 хромофор существует в форме внутримолекулярного имина. Выявлена химическая природа сложного рН-зависимого спектрального поведения хромофора ZFP538.

4. Обнаружена самопроизвольная перегруппировка 5-арилиден-2-ацил

3,5-дигидроимидазол-4-онов в 3-арилиден-5-алкил-2,6дикетопиперазины в водных и спиртовых растворах в кислой среде.

Благодарности

Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям, Константину Анатольевичу Лукьянову и Виктору Кузьмичу Потапову за всестороннюю помощь в планировании и осуществлении данной работы. Автор благодарит заведующего лабораторией Молекулярных технологий ИБХ РАН Сергея Анатольевича Лукьянова и заведующего лабораторией Структуры и Функций Генов Человека Евгения Давидовича Свердлова, в чьих лабораториях проводилась работа, а также всех сотрудников этих лабораторий, в дружеском коллективе которых автор имеет удовольствие работать. Автор благодарит Вадима Сергеевича Кублицкого и Игоря Адамовича Прохоренко за постоянную помощь. Также автор благодарен своему коллеге Александру Кислухину, работавшему под его руководством, и внесшим вклад в настоящую работу. Автор благодарит своего коллегу Павла Ивашкина за ценные научные дискуссии по теме работы, а также за помошь в оформлении работы. Автор благодарит сотрудников лабораторий ЯМР и масс-спектрометрии ИБХ РАН, в особенности Тамару Андреевну Балашову и Рустама Хусмановича Зиганшина, за помощь в регистрации и расшифровке спектров. Автор благодарен официальным оппонентам Андрею Альфредовичу Формановскому и Юрию Исаевичу Смушкевичу за их ценные критические замечания, которые автор постарался учесть при оформлении работы. Автор также благодарит членов своей семьи и родственников за помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Ямпольский, Илья Викторович, Москва

1. Tsien, R.Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 1998, 67, 509544.

2. Chudakov, D.M., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotech 2005, 23, 605-613.

3. Johnson, F.H., Yo Saiga, O.S., Gershman, C.L., Reynolds, G. Т., Waters, J.R. Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J Cell Comp Physiol 1962, 60, 85-103.

4. Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward, W.W., Prendergast, F.G., Cormier, M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992,111,229-233.

5. Matz, M., Fradkov, A., Labas, Y., Savitsky, A., Zaraisky, A., Markelov, M., Lukyanov, S. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol 1999,17, 969 973.

6. Pakhomov, A.A., Martynov, V.J. GFP family: Structural insights into spectral tuning. Chem and Biol 2008, 15, 755-764.

7. Remington, S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr Opin Struct Biol 2006,16, 714-721.

8. Shimomura, O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBSLett 1979,104, 220-222.

9. Niwa, H., Inouye, S., Hirano, Т., Matsuno, Т., Kojima, S., Kubota, M., Ohashi, M., Tsuji, F. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 13617-13622.

10. Ormo, M., Cubitt, A., Kallio, K., Gross, L., Tsien, R., Remington, S. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 1996, 273, 1392 1395.

11. Yang, F., Moss, L., Phillips, G. The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1996, 14, 1246 1251.

12. Lukyanov, K.A., Chudakov, D.M., Lukyanov, S., Verkhusha, V.V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 2005, 6, 885891.

13. Greenbaum, L., Rothmann, C., Lavie, R., Malik, Z. Green fluorescent protein photobleaching: a model for protein damage by endogenous and exogenous singlet oxygen. Biol Chem 2000, 381, 1251-1258.

14. Bulina, M.E., Chudakov, D.M., Britanova, O.V., Yanushevich, Y.G., Staroverov, D.B., Chepurnykh, Т. V., Merzlyak, E.M., Shkrob, M.A., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol 2006, 24, 95-9.

15. Shimomura, O. Bioluminescence: Principles and Methods 2006, World Scientific.

16. Pinton, P., Rimessi, A., Romagnoli, A., Prandini, A., Rizzuto, R. Biosensors for the detection of calcium and pH. Methods Cell Biol 2007, 80, 297-325.

17. Morise, H., Shimomura, O., Johnson, F.H., Winant, J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 1974, 13, 2656-62.

18. Ward, W.W., Cody, C.W., Hart, R.C., Cormier, M.J. Spectrophotometric identity of the energy transfer chromophores in Renilla and Aequorea green fluorescent proteins. Photochem Photobiol 1980, 31, 611-615.

19. Chalfie, M., Tit, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994, 263, 802-805.

20. Inouye, S., Tsuji, FJ. Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein. FEBS Lett 1994, 341,277-80.

21. Heim, R., Prasher, D.C., Tsien, R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 12501-12504.

22. Verkhusha, V. V., Lukyanov, K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotech 2004, 22, 289-296.

23. Gurskaya, N., Fradkov, A., Terskikh, A., Matz, M., Labas, Y., Martynov, V., Yanushevich, Y., Lukyanov, K, Lukyanov, S. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett 2001, 507, 16-20.

24. Mikhail V. Matz, K.A.L., Sergey A. Lukyanov, Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow. Bioessays 2002, 24, 953-959.

25. Bidina, M., Chudakov, D., Mudrik, N., Lukyanov, K. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochemistry 2002, 3, 7.

26. Surrey, Т., Elowitz, M.B., Wolf, P.-E., Yang, F., NF©dF©lec, F.o., Shokat, K., Leibler, S. Chromophore-assisted light inactivation and self-organization of microtubules and motors. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95, 4293-4298.

27. Tour, O., Meijer, R.M., Zacharias, D.A., Adams, S.R., Tsien, R.Y. Genetically targeted chromophore-assisted light inactivation. Nat Biotechnol 2003, 21, 1505-1508.

28. Bulina, M.E., Lukyanov, K.A., Britanova, O.V., Onichtchouk, D., Lukyanov, S., Chudakov, D.M. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat Protocols 2006, 1, 947-953.

29. Giepmans, B.N.G., Adams, S.R., Ellisman, M.H., Tsien, R.Y. Review The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science 2006, 312,217-224.

30. Remington, S.J., Wachter, R.M., Yarbrough, D.K., Branchaud, В., Anderson, D.C., Kallio, K., Lukyanov, K.A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry 2005, 44, 202-212.

31. Cody, C.W., Prasher, D.C., Westler, W.M., Prendergast, F.G., Ward, W.W. Chemiocal structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent protein. Biochemistry 1993, 32, 1212-1218.

32. Mccapra, F., Razavi, Z., Neary, A.P. The Fluorescence of the Chromophore of the Green Fluorescent Protein of Aequorea and Renilla. J Chem Soc Chem Comm 1988, 790-791.

33. Yang, F., Moss, L.G., Phillips, G.N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1996, 14, 1246-1251.

34. Wachter, R.M. Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein. Acc Chem Res 2007, 40, 120-127.

35. Zhang, L., Patel, H.N., Lappe, J.W., Wachter, R.M. Reaction Progress of Chromophore Biogenesis in Green Fluorescent Protein. J Am Chem Soc 2006, 128, 4766-4772.

36. Barondeau, D.P., Tainer, J.A., Getzoff, E.D. Structural evidence for an enolate intermediate in GFP fluorophore biosynthesis. J Am Chem Soc 2006, 128,3166-3168.

37. Rosenow, M.A., Huffman, H.A., Phail, M.E., Wachter, R.M. The crystal structure of the Y66L variant of green fluorescent protein supports a cyclization-oxidation-dehydration mechanism for chromophore maturation. Biochemistry 2004, 43, 4464-4472.

38. Patterson, G.H., Knobel, S.M., Sharif, W.D., Kain, S.R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J 1997, 73, 2782-2790.

39. Waldo, G.S., Standish, B.M., Berendzen, J., Tenvilliger, T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nat Biotechnol 1999, 17, 691695.

40. Pedelacq, J.D., Cabantous, S., Tran, Т., Terwilliger, T.C., Waldo, G.S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol 2006, 24, 79-88.

41. Chattoraj, M., King, B.A., Bublitz, G.U., Boxer, S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: Multiple states and proton transfer. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93, 8362-8367.

42. Ward, W.W., Prentice, H.J., Roth, A.F., Cody, C.W., Reeves, S.C. Spectral perturbations of the Aequorea green fluorescent protein. Photochem Photobiol 1982, 35, 803-808.

43. Heim, R., Cubitt, А.В., Tsien, R.Y. Improved Green Fluorescence. Nature 1995,373, 663-664.

44. Brejc, 1С, Sixma, Т.К., Kitts, P.A., Kain, S.R., Tsien, R.Y., Ormo, M., Remington, S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 2306-2311.

45. Bell, A.F., Stoner-Ma, D., Wachter, R.M., Tonge, P.J. Light-driven decarboxylation of wild-type green fluorescent protein. J Am Chem Soc 2003, 125, 6919-6926.

46. Wachter, R.M., Elsliger, M.A., Kallio, K., Hanson, G.T., Remington, S.J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Struct Fold Des 1998, 6, 1267-1277.

47. Wachter, R.M., Yarbrough, D., Kallio, 1С, Remington, S.J. Crystallographic and energetic analysis of binding of selected anions to the yellow variants of green fluorescent protein. JMol Biol 2000, 301, 157-171.

48. Mishin, A.S., Subach, F. V., Yampolsky, I. V., King, W., Lukyanov, K.A., Verkhusha, V. V. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that fonns a red chromophore. Biochemistry 2008, 47, 4666-4673.

49. Yarbrough, D., Wachter, R., Kallio, K, Matz, M., Remington, S. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98, 462 467.

50. Quillin, M.L., Anstrom, D.A., Shu, X.K, O'Leary, S., Kallio, K, Chudakov, D.A., Remington, S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata:

51. Dark-state structure at 1.38 angstrom resolution. Biochemistry 2005, 44, 5774-5787.

52. Shu, X.K., Shaner, N.C., Yarbrough, C.A., Tsien, R.Y., Remington, S.J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry 2006, 45, 9639-9647.

53. Ando, R., Hama, II, Yamamoto-Hino, M., Mizimo, II, Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 12651-12656.

54. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K.D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci USA 2004,101, 15905-15910.

55. Mizuno, H., Mai, Т.К., Tong, K.I., Ando, R., Furuta, Т., Ikura, M., Miyawakil, A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Molecular Cell 2003, 12, 1051-1058.

56. Nienhaus, K., Nienhaus, G.U., Wiedenmann, J., Nar, H. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc Natl Acad Sci USA 2005,102, 9156-9159.

57. Shaner, N.C., Patterson, G.H., Davidson, M.W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 2007,120, 4247-60.

58. Schwede, T.F., Retey, J., Schulz, G.E. Crystal structure of histidine ammonia-lyase revealing a novel polypeptide modification as the catalytic electrophile. Biochemistry 1999, 38, 5355-5361.

59. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G.N., Kuipers, O.P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci 2007, 65, 455-476.

60. Devasia, G.M., Shafi, M. Synthesis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones From Amidines. Indian J Chem 1979, 17B, 526-527.

61. Devasia, G.M., Shafi, M. A Convenient Synthesis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Indian J Chem 1981, 20B, 657.

62. Kojima, S., Ohkawa, H., Hirano, Т., Maki, S., Niwa, H., Ohashi, M., Inouye, S., Tsuji, F.I. Fluorescent properties of model chromophores of tyrosine-66 substituted mutants of Aequorea green fluorescent protein (GFP). Tetr Lett 1998,39, 5239-5242.

63. Shaft, P.M. Quantitative synthesis of 2-aryl-4-arylidene-2-imidazolin-5-ones with NaL Curr Sci 1985, 54, 1231-1232.

64. Ekeley, J.B., Ronzio, A.R. The Action of Aromatic Aldehydes upon the Addition Products Obtained from Aromatic Amidines and Glyoxal. J Am Chem Soc 1935, 57, 1353.

65. Kidwai, A.R., Devasia, G.M. A New Method for the Synthesis of Amino Acids. Synthesis of Amino Acids and Their Derivatives through 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-onesl. J Org Chem 2002, 27, 4527-4531.

66. Kjaer, A. Reactions between Imino Esters and alpha-Amino Acid Esters. III. 2-Phenyl-5(4)-imidazolone and its Reactions. Acta Chem Scand 1953, 7, 1030-1035.

67. Rao, Y.S., Filler, R. Geometric Isomers of 2-Aryl(Aralkyl)-4-arylidene(alkylidene)-5(4H)-oxazolones. Synthesis 1975, 1975, 749-764.

68. Tripathy, P.K., Mukerjee, A.K. A Facile Synthesis of N-Substituted 2-Acylamino-2-alkenamides. Synthesis 1985, 1985, 285-288.

69. Yampolsky, I.V., Remington, S.J., Martynov, V.I., Potapov, V.K., Lukyanov, S., Lukyanov, K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 Chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry 2005, 44, 5788-5793.

70. Oumouch, S., Bourotte, M., Schmitt, M., Bourguignon, J.-J. An Expeditious Synthesis of 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Synthesis 2005, 2005, 2527.

71. Henichart, J.P., Bernier, J.L. A Convenient Method for the Preparation of cj-Dialkylaminoalkyl Isothiocyanates. Synthesis 1980, 311-312.

72. He, X., Bell, A.F., Tonge, P.J. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org Lett 2002, 4, 1523-1526.

73. He, X, Bell, A.F., Tonge, P.J. Isotopic labeling and normal-mode analysis of a model green fluorescent protein chromophore. J Phys Chem В 2002, 106, 6056-6066.

74. Bell, A.F., He, X, Wachter, R.M., Tonge, P.J. Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy. Biochemistry 2000, 39, 4423-4431.

75. He, X., Bell, A.F., Tonge, P.J. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore. FEBSLetters 2003, 549, 35-38.

76. Dong, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Solvatochromism of the green fluorescence protein chromophore and its derivatives. J Am Chem Soc 2006, 128, 12038-12039.

77. Nifosi, R., Ferrari, A., Arcangeli, C., Tozzini, V., Pellegrini, V., Beltram, F. Photoreversible dark state in a tristable green fluorescent protein variant. J Phys Chem В 2003, 107, 1679-1684.

78. Dong, J., Abalwerdi, F., Baldridge, A., Kowalik, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Isomerization in Fluorescent Protein Chromophores Involves Addition/Elimination. J Am Chem Soc 2008,130, 14096-14098.

79. Voliani, V., Bizzarri, R., Nifosi, R., Abbruzzetti, S., Grandi, E., Viappiani, C., Beltram, F. Cis-trans photoisomerization of fluorescent-protein chromophores. JPhys Chem В 2008,112, 10714-10722.

80. Hager, В., Schwarzinger, В., Falk, H. Concerning the thermal diastereomerization of the green fluorescent protein chromophore. Monatsh Chem 2006,137, 163-168.

81. Voityuk, A.A., MichelBeyerle, M.E., Rosch, N. Protonation effects on the chromophore of green fluorescent protein. Quantum chemical study of the absorption spectrum. Chem Phys Lett 1997, 272, 162-167.

82. Weber, W., Helms, V., McCammon, J., Langhoff, P. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 6177-6182.

83. Devasia, G.M., Shafi, P.M. Synthesis of Acylamino Acids and Acylamino Acid Amides by Simultaneous Reduction and Hydrolysis of Unsaturated 2,4-Disubstituted 2-Imidazolin-5-ones. Indian J Chem В 1986, 25, 204-206.

84. Kojima, S., Hirano, Т., Niwa, H., Ohashi, M., Inoaye, S., Tsuji, F.L. Mechanism of the redox reaction of the Aequorea green fluorescent protein (GFP). Tetr Lett 1997, 38, 2875-2878.

85. Mustafa, A., Harhash, A.H.E. Grignard Reagents. J Org Chem 1956, 21, 575.

86. Argyropoulos, N.G., Coutouli-Argyropoulou, E., Siacavara, C. 1,3-DipoIar cycloaddition reactions of 4-arylidene-2-phenyl-l,4-dihydroimidazoI-5-ones with nitrile oxides. JHeterocycl Chem 1990, 27, 2097-2100.

87. Girgis, A.S. Facile Regioselective Synthesis of 1,2,6,8-Tetraazaspiro4.4.nona-2,6-dien-9-ones. Zeit Naturforsch В 2000, 55, 222226.

88. El-Maghraby, M.A., El-Ela, A.A., Khalafalla, A.K., El-Shami, E. Synthesis of some New Derivatives of Imidazole Compounds. JInd Chem Soc 1985, 62, 676-680.

89. Kidwai, M., Sapra, P., Bhushan, K.R., Misra, P. Microwave-Assisted Solid-Support Synthesis of Pyrazolino/Iminopyrimidino/Thioxopyrimidino Imidazolines. Synthesis 2001, 2001, 1509-1512.

90. Badr, M.Z.A., Mahgoub, S.A.E.-S. Synthesis and reactions of imidazolinones and triazolo3,4-f.[ 1,2,4]triazines. Indian J Chem В 1989, 28, 829-837.

91. Hayashi, 1., Mizuno, H., Tong, K.I., Furuta, Т., Tanaka, F., Yoshimura, M., Miyawaki, A., Ikura, M. Crystallographic evidence for water-assisted photo-induced peptide cleavage in the stony coral fluorescent protein kaede. J Mol Biol 2007, 372,918-926.

92. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y.X., Verkman, A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J1998, 74, 1591-1599.

93. Wachter, R.M., King, В.A., Heim, R., Kallio, K., Tsien, R.Y., Boxer, S.G., Remington, S.J. Crystal structure and photodynamic behavior of the blue emission variant Y66H/Y145F of green fluorescent protein. Biochemistry 1997, 36, 9759-9765.

94. Voityuk, A.A., Michel-Beyerle, M.E., Rosch, N. Quantum chemical modeling of structure and absorption spectra of the chromophore in green fluorescent proteins. Chem Phys 1998, 231, 13-25.

95. Pruger, В., Bach, T. Synthesis of model chromophores related to the gold fluorescent protein (GdFP). Synthesis 2007, 1103-1106.

96. Dong, J., Solntsev, K.M., Tolbert, L.M. Activation and Tuning of Green Fluorescent Protein Chromophore Emission by Alkyl Substituent-Mediated Crystal Packing. J Am Chem Soc 2009,131, 662-670.

97. Dong, J., Solntsev, K.M., Poizat, O., Tolbert, L.M. The meta-green fluorescent protein chromophore. J Am Chem Soc 2007,129, 10084-10085.

98. Follenius-Wund, A., Bourotte, M., Schmitt, M., Iyice, F., Lami, H., Bourguignon, J.J., Haiech, J., Pigault, C. Fluorescent derivatives of the GFP chromophore give a new insight into the GFP fluorescence process. Biophys J 2003,85, 1839-1850.

99. Wu, L.X., Burgess, K. Syntheses of highly fluorescent GFP-Chromophore analogues. J Am Chem Soc 2008,130, 4089-4096.

100. Voityuk, A.A., Kummer, A.D., Michel-Beyerle, M.E., Rosch, N. Absorption spectra of the GFP chromophore in solution: comparison of theoretical and experimental results. Chem Phys 2001, 269, 83-91.

101. Lewis, F.D., Yang, J.S. Molecular structure and photochemistry of (E)- and (Z)-ethyl 3-(2-indolyl)propenoate. Ground state conformational control of photochemical behavior and one-way E->Z photoisomerization. J Phys Chem 1996,100, 14560-14568.

102. Nielsen, S.B., Lapierre, A., Andersen, J.U., Pedersen, U.V., Tomita, S., Andersen, L.H. Absorption spectrum of the green fluorescent protein chromophore anion in vacuo. Phys Rev Lett 2001, 8722, 8102-8107.

103. Andersen, L.H, Bluhme, H., Boye, S., Jorgensen, T.J.D., Krogh, I~L, Nielsen, I.В., Nielsen, S.B., Svendsen, A. Experimental studies of the photophysics of gas-phase fluorescent protein chromophores. Phys Chem Chem Phys 2004, 6, 2617-2627.

104. Yang, J.S., Huang, G.J., Liu, Y.H., Peng, S.M. Photoisomerization of the green fluorescence protein chromophore and the meta- and para-amino analogues. Chem Comm 2008, 1344-1346.

105. Maddalo, S.L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochem Photobiol 2006, 82, 367-372.

106. Toniolo, A., Olsen, S., Manohar, L., Martinez, T.J. Conical intersection dynamics in solution: the chromophore of Green Fluorescent Protein. Faraday Discuss 2004,127, 149-163.

107. Mandal, D., Tahara, Т., Webber, N.M., Meech, S.R. Ultrafast fluorescence of the chromophore of the green fluorescent protein in alcohol solutions. Chem Phys Lett 2002, 358, 495-501.

108. W&.Litvinenko, K.L., Webber, N.M., Meech, S.R. Internal conversion in the chromophore of the green fluorescent protein: Temperature dependence and isoviscosity analysis. J Phys Chem A 2003,107, 2616-2623.

109. Patterson, G.H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science 2002, 297, 1873-1877.

110. Habuchi, S., Ando, R., Dedecker, P., Verheijen, W., Mizuno, H., Miyawaki, A., Hofkens, J. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. P Natl Acad Sci USA 2005,102, 9511-9516.

111. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W.W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. P Natl Acad Sci USA 1998, 95, 13573-13578.

112. Tretyakova, Y.A., Pakhomov, A.A., Martynov, VI. Chromophore Structure of the Kindling Fluorescent Protein asFP595 from Anemonia sulcata. J Am Chem Soc 2007, 129, 7748-7749.

113. Baird, G., Zacharias, D., Tsien, R. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 11984 11989.

114. Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., Steinbach, P.A., Baird, G.S., Zacharias, D.A., Tsien, R.Y. A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 7877-7882.

115. Layer, R. W. The chemistry of imines. Chem Rev 1963, 63, 489-510.

116. Heng Suen, Y., Kagan, H.B. Iminomagne'siens. III. Proprie'te's d'acylimines et acyle'namines. Bull Soc Chim Fr 1965, 5, 1460-1463.

117. Pakhomov, A.A., Martynova, N.Y., Gurskaya, N.G., Balashova, T.A., Martynov, V.I. Photoconversion of the chromophore of a fluorescent protein from Dendronephthya sp. Biochemistry-Moscow 2004, 69, 901-908.

118. Labas, Y.A., Gurskaya, N.G., Yanushevich, Y.G., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A., Matz, M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 4256-4261.

119. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat Protocols 2006, 1, 960-967.

120. Helms, V. Electronic excitations of biomolecules studied by quantum chemistry. Curr Opin Struct Biol 2002,12, 169-175.

121. Nemukhin, A.V., Topol, I.A., Burt, S.K. Electronic excitations of the chromophore from the fluorescent protein asFP595 in solutions. J Chem Theor Comput 2006, 2, 292-299.

122. Yampolsky, I.V., Balashova, T.A., Lukyanov, K.A. Synthesis and Spectral and Chemical Properties of the Yellow Fluorescent Protein zFP538 Chromophore. Biochemistry 2009,

123. Singh, S.B., Tomassini, J.E. Synthesis of Natural Flutimide and Analogous Fully Substituted Pyrazine-2,6-diones, Endonuclease Inhibitors of Influenza Virus. J Org Chem 2001, 66, 5504-5516.

124. Chinworrungsee, M., Kittakoop, P., Saenboonrueng, J., Kongsaeree, P., Thebtaranonth, Y. Bioactive Compounds from the Seed Fungus Menisporopsis theobromae BCC 3975. J Nat Prod 2006, 69, 1404-1410.