Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и исследование транспортных форм противоопухолевых лекарственных веществ на основе альфа-фетопротеина и полимерных наночастиц

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез и исследование транспортных форм противоопухолевых лекарственных веществ на основе альфа-фетопротеина и полимерных наночастиц"

На правах рукописи

?Т о О Л

• О ; с Бобрускин Алексей Игоревич

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ ФОРМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

;

Работа выполнена медицинской

в Московском научно-исследовательском институте медицин

экологии

Комитета здравоохранения Правительства г. Москвы

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

B.Ю Катуков

Кандидат химических наук

C.Э. Гельперина

Доктор биологических наук,

профессор В.И. Киселёв

Кандидат биологических наук Н.Н. Белушкина.

Московская государственная академия

Ведущая организация. тонкой химической технологии

им. МБ. Ломоносова

Зашита состоится -—

1Г п 171.02.01. при Центре медико-

на заседании Диссертадаонтл о --ста

биологических и экологических проблем

по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра Медико-биологических и экологических проблем.

Автореферат разослан <<4^^.2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

/2/У ^ В.В. Отраднова

кандидат биологических наук

Г / "

• »

Актуальность проблемы. Повышение избирательности действия противоопухолевых препаратов является актуальной проблемой современной химиотерапии. Одним из наиболее интересных путей решения этой проблемы является использование различных макромолекулярных систем доставки лекарственных веществ (ЛВ).

Транспорт JIB в опухоль с помощью макромолекулярных носителей может быть пассивным или активным. Концепция пассивного транспорта основана на способности опухолевой ткани накапливать макромолекулы и коллоидные частицы в результате нарушенного оттока лимфы и повышенной проницаемости капилляров, питающих опухоль (Maeda H., 1991, Davis S.S. et al., 1986; Wright J.J. et al, 1992). Для осуществления активного транспорта ЛВ используют высокоспецифичные механизмы, основанные на взаимодействии лиганда-векгора, входящего в состав системы, с рецепторами на поверхности опухолевых клеток. Создание макромолекулярных систем для активного транспорта ЛВ в клетки опухоли представляет особый интерес; при этом ключевую роль играет выбор вектора. В качестве векторов часто используют антитела, факторы роста, липопротеины и т.п. Однако рецепторы к этим лигандам присутствуют и в здоровых клетках, поэтому такие системы не обладают достаточной специфичностью, хотя и проявляют высокую цитотоксичность в опытах in vitro. В то же время известно, что многие опухолевые клетки экспрессируют рецепторы, активно связывающие оякофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), при этом содержание этих рецепторов в здоровых тканях весьма незначительно (Naval J. et al, 1985; Geuskens M. et al., 1991). Ранее было показано, что избирательность действия ряда противоопухолевых препаратов может существенно возрастать в результате конъюгирования их с АФП (S.E. Severin et al, 1995), однако для оценки терапевтического потенциала систем на основе АФП необходимы дальнейшие исследования.

Среди систем пассивной доставки перспективными представляются полимерные наночастицы. По ряду фармакологических параметров наночастицы схожи с липосомами, важным преимуществом наночастиц является высокая стабильность. Наночастицы получают из различных полимеров, как природных

(альбумин, желатин, дексгран), так и синтетических (полистирол, полиметилме-такрилат, полиалкилцианоакрилаты). Полиалкилцианоакрилаты - доступные, малотоксичные, биодеградируемые полимеры, применяющиеся в медицине как основа хирургического клея. В водных растворах наночастицы из полиалкил-цианоакрилатов образуют устойчивые коллоидные системы, пригодные для внутривенного введения. Препараты на основе таких наночаетиц являются удобной лекарственной формой, их можно стерилизовать и хранить в лиофили-зовашюм виде. Опираясь на многочисленные литературные данные, можно полагать, что применение наночаетиц в качестве носителей противоопухолевых JIB позволит снизить побочные эффекты.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка методов синтеза транспортных форм известного противоопухолевого антибиотика доксо-рубицина и нового препарата терафтала на основе АФП, разработка методики включения терафтала в наночастицы из полибутилцианоакрилата и изучение цитотоксического эффекта и противоопухолевой активности полученных транспортных форм.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие за-

- разработать методы синтеза коныогатов докхорубицина1Г терафтала с-_

АФП;

- разработать метод включения терафтала в наночастицы из полибутилцианоакрилата;

- исследовать внутриклеточный транспорт систем доставки доксоруби-цина на модели мышиного лимфолейкоза Р388 in vitro;

- оценить цитотоксический эффект конъюгатов доксорубицина и терафтала с АФП и коллоидных транспортных форм этих препаратов;

- оценить противоопухолевую активность полученных систем при химиотерапии экспериментальных опухолей у мышей;

- оценить накопление препаратов терафтала в печени и коже мышей.

! •

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые синтезированы конъюгаты доксорубицина с АФП с использованием в качестве сшивающих агентов аконитового ангидрида и глутарового альдегида. Показано, что конъюгат с pH-чувствительным аконитовым спейсе-ром проявляет высокую противоопухолевую активность. Получены косвенные данные о возможности активного внутриклеточного транспорта этого конъюга-та.

Впервые получен конъюгат терафтала с АФП; показана его высокая противоопухолевая активность.

Разработана методика включения терафтала в наночастицы из полибу-тилцианоакрилата. Показано, что применение наночастиц в качестве носителей терафтала позволяет значительно снизить уровень препарата в коже, при этом уровень терафтала в печени не повышается.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Ргос. 2nd World Meeting APV/APGI, Paris, France, 1998; Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., Controlled Release Society, Inc., Paris, France, 2000. Диссертационная работа апробирована 13 октября 2000 г. на научном семинаре МНИИМЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Структура и объём работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на страницах печатного текста и иллюстрирована рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследования

Синтез коньюгатов

1) Синтез коньюгата доксорубицина (ДОКО с АФП с использованием глутарового альдегида ШОКС-Га-АФГП. Реакцию проводили в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4) в течение 40 мин при следующем соотношении реагентов: ДОКС-глутаровый альдегид-АФП (12:4:1). Получили следующие продукты реакции: высокомолекулярный конъюгат ДОКС-Га-АФП (I) -М.м>300 кДа, содержание ДОКС 6 моль/моль АФП; ДОКС-Га-АФП (П) (ди-мер АФП) - содержание ДОКС 1 моль/моль белка; ДОКС-Га-АФП (Ш) (мономер АФП) - содержание ДОКС 1 моль/моль АФП. Аналогичным методом синтезировали конъюгат с бычьим сывороточным альбумином (Докс-Га-БСА).

2) Синтез конъюгата доксорубицина с АФП с помощью аконитового ангидрида (ДОКС-Ак-АФП). Синтез проводили в три стадии. Вначале синтезировали N-аконигил-доксорубицин, затем активировали карбоксильные группы остатка аконитовой кислоты N-оксисукцинимидом. Полученный активированный эфир без выделения вводили в реакцию с белком с 15-кратным избытком. -СодержаыаеЛОКС в конъюгате ДОКС-Ах-АФП составляло 4 моль/моль. Аналогичным методом синтезировали конъюгат ДОКС^Ак-БСАт-____

3) Синтез конъюгата ДОКС-декстран-АФП. Синтез проводили в три стадии. Декстран (М.м. 70 кДа) окисляли периодатом натрия. К полученному ди-альдегиддекстрану прибавляли ДОКС, через 12 ч низкомолекулярные компоненты отделяли и прибавляли АФП. В результате получали конъюгат следующего состава: ДОКС-декстран-АФП (12:1:1) (моль/моль).

4) Синтез конъюгата терафтала с АФП. Конъюгат терафтала (окгакар-бокси-4,5-фталоцианин кобальта) с АФП синтезировали также с использованием метода активированных эфиров. Для этого вначале с помощью дициклогек-силкарбодиимида получали пентафторфениловый эфир терафтала, который без выделения использовали для синтеза конъюгата. При добавлении 20 экв. эфира

t I

терафтала к 1 экв. белка получали конъюгат ТФ-АФП с содержанием терафтала 10 моль/моль.

Для отделения полученных конъюгатов от низкомолекулярных веществ использовали гель-фильтрацию на колонке FDC (Pharmacia). Дальнейшую очистку конъюгатов осуществляли на колонке Superóse HR 12 (Pharmacia). Содержание белка в конъюгатах определяли по методу Лоури; содержание ДОКС и ТФ определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Ultrospec 2000 (Pharmacia) при длинах волн 480 нм и 670 им, соответственно.

Получение коллоидных форм терафтала и доксорубицина на основе нано-частиц из полпбутилциаиоакрилата. Наночастицы (НЧ) были получены методом анионной полимеризации бутилцианоакрилата в 1% растворе декстрана (М.м. 70 кДа) в 0,00 IN НС1. Для этого к 20 мл полимеризационной среды при интенсивном постоянном перемешивании прибавляли 200 мкл бутилцианоакрилата, затем через 40 мин прибавляли 50 мг доксорубицина или терафтала. Через 2-3 ч смесь нейтрализовали О,IN NaOH и лиофилизировали после добавления 3% в/о маннита в качестве криопротекгора. Средний размер НЧ, определённый методом лазерного светорассеяния, не превышал 400 нм. Степень включения активного ингредиента в НЧ рассчитывали как разность между общей концентрацией вещества в лекарственной форме и концентрацией свободного ЛВ, которую определяли следующим образом: НЧ осаждали ультрацентрифугированием, затем в супернатанте измеряли концентрацию свободного JIB спектрофотометрическим методом. В полученных НЧ степень включения активного вещества составляла до 90%.

Определение каталитической активности транспортных форм терафтала.

Каталитическую активность конъюгата ТФ-АФП и ТФ, ассоциированного с НЧ, определяли спектрофотометрическим методом (С.А. Борисенкова и др., 1998) по реакции окисления аскорбиновой кислоты при исходных концентрациях СтвНУбхЮ"4 М, Cak=7,0x10'4 М, рН 6,9 и t=18°C.

Культивирование клеток и определение цитотоксической активности препаратов. В работе использовали клеточные линии мышиного лимфолейкоза Р388 и карциномы молочной железы человека MCF-7Vít (линия, чувствительная к доксорубицину) и MCF-7AdrR (линия, резистентная к доксорубицину). Клетки культивировали в пластиковых кулыуральных флаконах (Costar) в среде RPMI 1640 (Sigma) для линии Р388 и DMEM (Sigma) дня линии MCF-7, содержащей 10% фетальной сыворотки (Sigma), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажнённой атмосфере, содержащей 5% СОг, при 37°С. Ци-тотоксическую активность препаратов определяли по методу Моссмана (MossmanT., 1983).

Исследование внутриклеточной доставки конъюгатов доксорубицина в клетки мышиной лимфоцитарной лейкемии Р388. К клеткам (1х106), отмытым от среды и помещенным в PBS, добавляли исследуемые препараты в конечной концентрации 3,5 мкМ по ДОКС и инкубировали в течение двух часов при 37°С. Затем клетки отмывали и добавляли 0,2% раствор додецилсульфата натрия (SDS) в PBS для лизиса клеток. Осадок отделяли центрифугированием, "к'гшпентряпито iTnK^fJ-тrr^^'гтf»p^^ятянт;^-nppp^[|f'^я'Tp^ фдуориметрическим МеТОДОМ с помощью флуоркмсгра FP-550 (Jasco) при длинах волн Явот6. =480 нм и

^-эмисси=560 нм.

Влияние человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) на внутриклеточную доставку конъюгатов оценивали, добавляя в среду 10-кратный избыток ЧСА.

Определение противоопухолевой активности препаратов. Исследование противоопухолевой активности транспортных форм доксорубицина проводили на мышах-самках с перевитыми подкожно солидными опухолями лимфолейкоза Р388. Группа положительного контроля получала доксорубицин в эквивалентных дозах.. Для оценки терапевтической эффективности препаратов ис-

пользовали стандартные критерии: торможение роста опухоли (ТРО) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ) животных по сравнению с интактным контролем. Статистическую обработку результатов проводили с использованием ^критерия Стьюдента.

Исследование противоопухолевой активности конъюгатов ДОКС-Га-АФП и ДОКС-Ак-АФП проводили на мышах-самках лшгои БВА/2. Препараты вводили на 10-й день после перевивки опухолей подкожно однократно в дозе 0,2 мг/кг. Мышей забивали на 22-й день, измеряли вес опухоли и рассчитывали ТРО.

Исследование противоопухолевой активности конъюгата ДОКС-декстран-АФП проводили на мышах-самках линии ВБРь Лечение начинали через 48 ч после перевивки опухолей. Препараты вводили трехкратно внутривенно с интервалом в 96 часов в дозах 0,28 мг/кг (ДОКС-декстран-АФП) и 0,2 мг/кг (ДОКС-НЧ). Измерение размеров опухоли проводили 1 раз в 4 дня. Наблюдение за животными проводили до их гибели.

Аналогичную схему лечения применяли для изучения противоопухолевой активности коллоидного препарата ДОКС-НЧ на мышах-самках линии ОВА/2. Препараты вводили в дозе 2 мг/кг (по ДОКС).

Исследование противоопухолевой активности конъюгата ТФ-АФП проводили на мышах СЗНА с перевитыми в плевральную полость асцитными опухолями гепатомы 22. Группа положительного контроля получала ТФ в эквивалентных дозах. Препараты вводили однократно внутриплевралыю в дозе 30 мг/кг через 24 часа после перевивки опухоли. Сразу после введения тестируемых веществ в ту же полость вводили раствор аскорбиновой кислоты в дозе 66 мг/кг. Наблюдение за животными проводили до их гибели.

Изучение распределения по органам коллоидной формы терафтала. Тераф-тал, ассоциированный с наночаспщами, и свободный препарат вводили однократно внутривенно беспородным белым крысам обоего пола в дозе 15 мг/кг. Через определенные промежутки времени (5 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч и 15

ч после введения препаратов) крыс декапитировали, извлекали органы и определяли в них уровень накопления ТФ. Для этого ткани промывали PBS, взвешивали, гомогенизировали с 1% раствором SDS, гомогенат центрифугировали. К супернатанту прибавляли смесь диметилформамид-ацетон (1:1) для разрушения частиц и определяли концентрацию терафтала спектрофотометрическим методом.

Результаты и их обсуждение

Получение коыъюгатов доксорубицина и терафтала с АФП и БСА. Результативность лечения во многом зависит от фармакокинетических параметров лекарственного препарата. Так, недостаточная эффективность химиотерапии рака часто обусловлена недостаточным накоплением JIB в опухоли, в то время как побочные эффекты связаны с распределением ЛВ в здоровые органы и ткани. Например, кардиотоксичность ДОКС вызывается его накоплением в сердечной мышце. ТФ, представитель фталоцианинового ряда, является новым противоопухолевым препаратом, применяющимся для каталитической терапии. При лечении ТФ также выявлены осложнения, связанные с особенностями распределения этого препарата, например, поражение кожных покровов. С другой стороны, известно, что макромолекулярные носитетГнетгакапливаютея-в-серд--це или коже. Таким образом, зная специфику пассивного распределения мак-ромолекулярных носителей в организме, можно предположить, что их использование позволит снизить токсичность доксорубицина и терафтала при одновременном повышении противоопухолевого эффекта. Специфичность системы возрастет, если в ее состав будет включен вектор для активного транспорта.

Создание системы для направленной доставки ЛВ с помощью АФП является сложной задачей. Для осуществления направленного транспорта необходимо, чтобы АФП в составе конъюгата сохранял способность связываться с рецептором и индуцировать активный эндоцитоз. Также необходимым условием является сохранение противоопухолевой активности J1B, входящего в состав конъюгата. Важным фактором является тип связи между JIB и АФП, опреде-

ляющий устойчивость конъюгата к гидролизу и, в конечном счете, распределение JIB на уровне организма и клеток.

Основной механизм цитотоксического действия доксорубицина заключается в повреждении ДНК. Очевидно, что для осуществления цитотоксического действия антибиотика необходимо проникновение его в ядро, то есть конъю-гат должен высвобождать антибиотик внутри клетки. Действительно, литературные данные свидетельствуют, что присоединение молекулы ДОКС непосредственно к белковой цепи с образованием амидной связи приводит к получению малоактивных конъюгатов, т.к. амидная связь относительно устойчива в физиологических условиях. Конъюгаты, в которых ДОКС присоединен к носителю лабильной связью через боковую цепь (спейсер), проявляют высокую активность (Kopecek J. et al., 2000, Soyez H. Et al., 1996 ). В соответствии с этим нами выбраны методы синтеза для получения систем доставки, в которых ДОКС присоединен к белку через лабильный спейсер.

Синтез конъюгата с помощью глутарового альдегида. В конъюгате, синтезированном с помощью глутарового альдегида, ДОКС присоединён к белку через лабильную в физиологических условиях азометииовую связь (основание Шиффа). Длина спсйсера не менее шести углеродных атомов.

Синтез конъюгата с помощью аконитового ангидрида. Из литературных данных известно, что при взаимодействии цис-аконитил-доксорубицина с аминогруппами белка образуется рН-чувствительная связь, которая устойчива в нейтральной среде, но гидролизуется при рН<6 (Shen W-C et al., 1981). Таким образом, конъюгат, в котором JIB присоединено к носителю через аконитовый спейсер, устойчив в кровотоке и выделяет активное начало только в лизосомах (рН~5).

Синтез коньюгата ДОКС с АФП с аконитовым спейсером осуществляли по модифицированной методике (Shen W-C et al., 1981) путем взаимодействия доксорубицина с цис-аконитовым ангидридом с образованием N-цис-аконитил-доксорубицина, который после активации карбоксильных групп N-оксисукцинимидом эффективно вступал в реакцию с белком. Разработанный нами метод синтеза исключает стадию выделения промежуточных продуктов и,

таким образом, позволяет повысить выход конечного продукта. Метод также исключает образование внутри- и межмолекулярных сшивок белка.

Степень модификации АФП также является существенным фактором, определяющим биологические свойства конъюгата. С одной стороны, для достижения цитотоксического эффекта необходимо создать в клетке достаточно высокую концентрацию ЛВ; с другой стороны, при высоких степенях модификации вероятна потеря специфичности АФП, что приведет к снижению активности системы. Действительно, попытка увеличить содержание доксорубицина в конъюгате ДОКС-Ак-АФП с 4 моль/моль до 12 моль/моль привела к потере в активности: показатель ТРО снизился в три раза.

Для получения системы с высоким содержанием антибиотика мы использовали ставшую классической модель Рингсдорфа (Шг^ёог!' Н., 1975), в которой ЛВ и вектор связаны с общим макромолекулярным носителем. Содержание ЛВ в такой системе может быть достаточно высоким.

В соответствии с этой моделью мы синтезировали систему доставки доксорубицина, в которой носителем является декстран, а вектором - АФП. Декст-ран был выбран, поскольку он доступен, не токсичен, подвержен биодеградации, и легко подвергается различным модификациям, поскольку обладает

лучения гидролизуемого конъюгата декстран был окислен периодатом натрия. Взаимодействие ДОКС с диальдегидными группами носителя привело к образованию оснований Шиффа, что обеспечивало способность системы выделять антибиотик в кислой среде. Выбранный нами метод синтеза также позволил избежать внутри- и межмолекулярных сшивок АФП.

- Механизм цитотоксического действия ТФ основан на его способности

v катализировать реакцию автоокисления аскорбиновой кислоты с образованием кислородосодержащих радикалов: супероксид-анион-радикала (>Ги гидроксил-радикала ОН~, которые обладают высокой цитотоксической активностью (Вольпин М.Е. и др., 1996, Aust S.D. et al., 1985). Последовательное введение ТФ и аскорбиновой кислоты вызывает каскад цитотоксических реакций, вклю-

функциональных групп. Дня по-

чая повреждение цитоплазматической мембраны, нуклеиновых кислот и митохондрий.

ДОКС-Ш2 +

СО

I

ш

I

(а)

ТФ -(- АФП

(б)

Рис. 1. Гидролиз рН-чувствительной связи в конъюгатах: (а) ДОКС-Ак-АФП; (б) ТФ-АФП

ТФ легко образует комплексы с белком, теряя при этом каталитическую активность, что, по всей видимости, объясняется формированием координационных связей между центральным атомом кобальта в молекуле фталоцианина и атомами азота и ароматическими фрагментами молекулы белка. Таким образом, для восстановления каталитической активности конъюгат должен выделять ТФ внутри клетки.

Мы предположили, по аналогии с аконитовым спейсером, что наличие соседней карбоксильной группы в молекуле ТФ обеспечит рН-чувствительный характер амидной связи между карбоксильными группами ТФ и аминогруппами АФП (см. рис. 1). Тогда при попадании в лизосому конъюгат будет гидроли-зоваться, выделяя свободный ТФ. Исходя из этого предположения, присоеди-

нение ТФ к белку осуществляли методом активированных эфиров без введения спейсера. Действительно, как видно из табл. 1, каталитическая активность конъюшга ТФ-АФП, определенная в реакции окисления аскорбиновой кислоты, полностью отсутствовала. Однако дитотоксическая активность коньюгата в каталитической паре с аскорбиновой кислотой превышала активность свободного ТФ более чем в 10 раз (см. табл. 6), что подтверждает наше предположение о возможности выделения ТФ в клетке.

Таблица 1

Каталитическая активность транспортных форм терафтала в реакции окисления аскорбиновой кислоты

Образец WakxIO"6, М/МИИ

ТФ 22

ТФ-АФП 0

ТФ-НЧ 17

Можно ожидать, что синтезированная транспортная форма терафтала позволит снизить его системную токсичность, поскольку цитотоксический эф-

[ только при попадании в клетку.

Получение коллоидных форм терафтала и доксорубицина. Для получения наночастиц можно использовать различные алкилцианоакрилаты. Скорость биодеградации и токсичность образующихся полимеров падает с ростом длины и гидрофобности алкилыюго радикала (Kreuter J., 1994). Наиболее удачным сочетанием этих параметров обладают полибутилцианоакрилат и полиизогексил-цианоакрилат.

В данной работе наночастицы получали из бутилцианоакрилата. Обычно для включения ЛВ в полимерную матрицу наночастиц вещество вносят в по-лимеризационную среду. Такой метод позволяет получать наночастицы, в которых JIB равномерно сорбировано в объёме полимерной матрицы, причем содержанием ЛВ может быть достаточно высоким. Однако известно, что JIB, в

молекуле которых присутствуют полярные ионогенные группы, могут вступать в реакцию полимеризации, нарушая процесс образования наночастиц (Kreuter J., 1994). Так проведите полимеризации бутилцианоакрилата в среде, содержащей терафтал, приводило в основном к получению агломератов. Для того чтобы получить коллоидную форму терафтала, мы модифицировали метод Куврё (Couvreur Р., 1984), внося терафтал в полимеризационную среду через 40 мин после начала полимеризации, когда процесс формирования мицелл мономера завершен. Разработанная нами методика позволяет получать наночастицы с высоким содержанием терафтала (до 0,25 г/г полимера) и узким распределением по размерам. Следует также отметить, что процесс протекает с высоким выходом: до 90% терафтала, присутствующего в полимеризационной среде, сорбируется в наночастицах.

Аналогичным методом были синтезированы наночастицы, содержащие противоопухолевый антибиотик доксорубицин. Данный препарат вступает в реакцию полимеризации алкилцианоакрилатов, что, с одной стороны, приводит к частичной потере активности антибиотика (Douglas S.J., 1984), а с другой стороны, ускоряет реакцию полимеризации, приводя к получению частиц с неконтролируемым распределением по размерам. Наша методика позволила получить высокоактивную коллоидную форму доксорубицина с узким распределением частиц по размеру.

Цитотоксическая активность конъюгатов доксорубицина с АФП и БСА.

Для изучения цитотоксической активности конъюгатов использовали клетки линий MCF-7 и Р388, экспрессирующие рецепторы для связывания АФП.

Исследование продуктов взаимодействия ДОКС и АФП с глутаровым альдегидом показало, что только высокомолекулярный продукт реакции ДОКС-Га-АФП (I) проявляет высокую цитотоксическую активность в отношении клеток MCF-7wt. Цитотоксичность конъюгатов ДОКС-Га-АФП (II) и ДОКС-Га-АФП (Ш) не превышала цитотоксичность свободного антибиотика (табл. 2). Вероятно, высокую цитотоксическую активность высокомолекуляр-

ного конъюгата, можно объяснить эффективным пассивным внутриклеточным транспортом, что подтверждают также данные по изучению внутриклеточной доставки конъюгатов (стр. 16). Конъюгаты (II) и (Ш) менее активны, поскольку эффективность неспецифического эндоцитоза падает с уменьшением молекулярной массы субстрата. Из табл. 2 также видно, что коньюгат ДОКС-Га-АФП (I) проявляет высокую цитотоксическую активность в отношении клеток карциномы молочной железы МСР-7Л11гК, резистентных к доксорубицину. Преодоление резистентности, вероятно, объясняется тем, что коньюгат, в отличие от свободного антибиотика, проникает в клетку путем эндоцитоза, что позволяет ему обходить известные механизмы резистентности, связанные с экспрессией мембранных белков типа §р 170. Эти данные хорошо коррелируют с данными других авторов о преодолении резистентности с помощью макромолекулярных систем доставки (Ока\уа К. й а!., 1993, 81аз1лу М. с! а!., 1999).

Таблица 2

Цитотоксическая активность конъюгатов доксорубицина*

Препарат Цитотоксичность Ю50, мкМ

МСР-7 МСР-7АагК Р388

ДОКС 0,30 20 0,20

ДОКС-Га-АФП (I) 0,03* 4* 0,02*

ДОКС-Га-АФП (П) 0,20 14* -

ДОКС-Га-АФП (П1) 0,30 12* -

ДОКС-Га-БСА (I) 0,04* 7* 0,05*

ДОКС-Га-БСА (П) 0,20 15* -

ДОКС-Га-БСА (Ш) 0,24 17 -

ДОКС-декстран-АФП 0,10* 6* -

* приведены средние значения ПС» по трём экспериментам для каждого типа клеток (р<0,05)

Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотокси-ческой активности конъюгага ДОКС-Га-БСЛ в отношении клеток МСР-7 и Р388. Как видно из табл. 2, конъюгат ДОКС-Га-БСА I также преодолевает резистентность клеток карциномы молочной железы МСР-7ЛМ\ что подтверждает наше предположение о природе этого явления.

Цитотоксическая активность конъюгата ДОКС-декстран-АФП была выше, чем у свободного антибиотика. Данный конъюгат также преодолевает резистентность клеток МСР-7АсИ\

Конъюгаты ДОКС-Ак-АФП и ДОКС-Ак-БСА не проявляли цитотокси-ческой активности в изученном диапазоне концентраций.

Цитотоксическая активность доксорубицина, ассоциированного с наноча-стицами из полпбутнлцианоакрилата. Цитотоксическую активность ДОКС-НЧ также изучали на клетках МСР-7м, МСР-7Л1№ и Р388.

Из табл. 3 видно, что используемый нами метод включения ДОКС в на-ночастицы позволяет сохранить цитотоксические свойства антибиотика. Также видно, что коллоидная форма антибиотика, как и другие системы доставки эффективно обращает резистентность клеток линии МСР-7Л*'\

Таблица 3

Цитотоксическая активность доксорубицина, ассоциированного с наночастицами*

Цитотоксическая активность

Препарат 1С5о, мкМ

Р-388 МСР-7 МСР-7Аагк

ДОКС 0,2 0,28 28

ДСЖС-НЧ 0,1 0,15 2

* приведены средние значения 1С50 по трём типичным экспериментам для каждого типа клеток

Исследование процесса интернализации клетками Р388 конъюгатов док-сорубицина с АФП и доксорубицина, ассоциированного с наночастицами.

Исследование накопления конъюгатов ДОКС-Га-АФП и ДОКС-Ак-АФП в клетках мышиного лейкоза Р388 при 37°С показало, что оба конъюгата способны эффективно накапливаться внутри клеток (рис.2).

НДОКС □ ДОКС-Га-АФП □ ДОКС-Ак-АФП □ ДОКС-НЧ

Рис. 2. Уровень накопления транспортных форм доксорубицина _клетками Р388 при различных условиях инкубации.

Присутствие 10-кратного избытка ЧСА в среде инкубации снижало накопление конъюгата ДОКС-Ак-АФП более чем в 2 раза и практически не влияло на накопление конъюгата ДОКС-Га-АФП (I). Ранее было показано наличие общих рецепторов к АФП и сывороточному альбумину (Tores J.M. et al., 1992; Alava A.A. et al., 1999). Можно предположить, что конъюгат ДОКС-Ак-АФП проникает в клетку по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза и конкурирует с ЧСА за связывание с рецепторами. Это предположение также подтверждается тем, что и конъюгат ДОКС-Ак-БСА вытесняется 10-кратным избытком БСА. Полученные данные являются косвенным доказательством того, что созданная нами система позволяет осуществить направленный транспорт доксорубицина в клетки опухоли, что также подтверждается ее высокой проти-

воопухолевой активностью. Конъюгаты, полученные с помощью глутарового альдегида, представляют собой продукты неконтролируемых межмолекулярных сшивок АФП и, по всей видимости, не обладают способностью связываться с рецепторами, что коррелирует с данными других авторов (Платэ Н.А. и др., 1986).

Эксперименты по определению накопления ДОКС-НЧ в клетках Р388 проводили в аналогичных условиях. Видно, что наночастицы обеспечивают эффекгивный транспорт ДОКС внутрь клетки.

Исследование противоопухолевой активности коньюгатов доксорубицияа

с АФП. Из данных, представленных на рис. 3, видно, что при лечении мышиного лямфолейкоза наиболее эффективным оказался конъюгат ДОКС-Ак-АФП. Однократное введение этого коньюгата привело к снижению массы опухоли в 4 раза по сравнению с контролем; показатель ТРО составил 77%.

8 £

с

Рис.3. Влияние конъюгатов доксорубицина на развитие лимфолейкоза Р 388 у мышей

Можно предположить, что преимущество данной системы обеспечивается ее конструкцией, сочетающей возможность осуществления активного транспорта к опухолевым клеткам благодаря наличию вектора с контролируемым выделением, которое обеспечивается рН-чувствительным спейсером.

Конъюгаг ДОКС-Га-АФП также проявил значительную противоопухолевую активность по сравнению со свободным доксорубицином, приводя к снижению массы опухоли в 2 раза. Показатель ТРО для этого коньюгата в 3 раза превышает аналогичный показатель свободного антибиотика.

Активность конъюгагов, полученных с применением глутарового альдегида, вероятно, объясняется их эффективным транспортом в клетку и возможностью выделения антибиотика в физиологических условиях. Эта структура обеспечивает пассивный транспорт конъюгата в клетки опухоли как in vitro, так и in vivo.

Конъюгат ДОКС-декстран-АФП также показал значимый противоопухолевый эффект в отношении лимфолейкоза Р388 (табл. 4). При трёхкратном внутривенном введении в дозе 0,28 мг/кг показатель ТРО этого конъюгата был в 2 раза выше, чем у свободного ДОКС.

____Таблица 4

Противоопухолевый эффект конъюгата ДОКС-декстран-АФП" на модели лимфолейкоза Р388 у мышей

Препараты Доза ТРО, %

дни опыта

8 12 15

ДОКС 0,28 мг/кг х 3 38 28 35

ДОКС-декстран-АФП 0,28 мг/кг х 3 80* 50* 39

*р<0,05

Исследование противоопухолевой активности коллоидной формы доксо-рубицина. Как видно из табл. 5, трехкратное введение ДОКС-НЧ в дозе 2 мг/кг

мышам с солидным вариантом лимфолейкоза Р388 привело к увеличению продолжительности жизни животных на 34% по сравнению с контрольной группой.

Таблица 5

Противоопухолевый эффект доксорубицина, ассоциированного с наночастицами, на модели мышиного лимфолейкоза Р388 у мышей

Препараты Доза ТРО, % УПЖ,

Дни опыта %

8 12 15

ДОКС 2 мг/кг х 3 33 36 36 21

ДОКС-НЧ 2 мг/кг х 3 42* 52* 41* 34

*р<0,05

Изучение биологических свойств транспортных форм терафтала. Из данных, приведешшх в табл. 6, видно, что в каталитической паре с аскорбиновой кислотой цитотоксическая активность конъюгата ТФ-АФП в отношении клеток линии МСР-7 превышает активность свободного ТФ более чем в 10 раз.

Разработанный нами метод включения терафтала в наночастицы позволяет сохранить его каталитические свойства, при этом цитотоксическая активность ТФ-НЧ превышает активность свободного ТФ в -1,5 раза (табл. 6).

Таблица 6

Цитотоксическая активность транспортных форм терафтала в отношении клеточной линии МСР-7 *

Препарат Цитотоксичиость 1С50, мкМ**

Терафтал 10

ТФ-АФП 1

ТФ-НЧ 6

* приведены средние значения 1С50 по трём экспериментам, ** р<0,05

Исследование противоопухолевой активности коньюгата терафтала с АФП. Для изучения противоопухолевой активности коньюгата использовали модель чувствительной к ТФ асцитной гепатомы 22.

Таблица 7

Противоопухолевый эффект коньюгата ТФ-АФП на модели асцитной гепатомы 22 у мышей

Препараты Доза, Мг/кг УПЖ, % Излеченные животные (%)

ТФ 30 33 0

ТФ-АФП 30 100 67%

Из результатов, представленных в табл. 7, видно, что в каталитической паре с аскорбиновой кислотой конъюгат ТФ-АФП в дозе 30 мг/кг по терафталу проявляет высокий противоопухолевый эффект. Эффект состоял в излечении 67% животных.

Изучение распределения коллоидной формы терафтала по органам. Из-

русп го чтп вигуягий уровень накопления фталоцианинов в коже является серьезным побочным эффектом, лимитирующим применение этих препаратов в клинике. Литературные данные, а также наши собственные исследования свидетельствуют о том, что наночастицы распределяются преимущественно в органах ретикулоэндотелиальной системы и не накапливаются в коже.

Действительно, в условиях нашего эксперимента определен высокий уровень свободного ТФ в коже (максимальная концентрация препарата составляет 8,3+0,59 мкг/г), который сохраняется до 9 часов (рис. 4). Применение на-ночастиц позволяет снизить уровень ТФ в коже примерно в 2 раза. С другой стороны, известно, что накопление коллоидных носителей в печени лимитирует возможности их применения. В связи с этим представляло интерес изучить накопление ассоциированного с наночастицами ТФ в коже и печени. Как видно

из результатов нашего эксперимента (рис. 5), ассоциация ТФ с наночастицами не приводит к повышению концентрации препарата в печени.

Рисунок 4. Уровень накопления терафтала в коже здоровых крыс, р<0,05 (п=5)

Время, час ТФ - ТФ-НЧ

Рис 5. Уровень накопления терафтала в печени здоровых крыс, р<0,05 (п=5)

Таким образом, применение наночастиц очевидно позволит снизить токсичность ТФ и, в то же время, не приведет к усилению гепатотоксичности препарата.

Выводы

]. Разработаны методики синтеза трех типов конъюгатов доксорубицина с АФП с помощью глутарового альдегида, аконитового ангидрида и ди-альдегиддекстрана. Во всех полученных конъюгатах антибиотик связан с носителем через лабильные в физиологических условиях спейсеры.

2. Синтезирован конъюгат терафтала с АФП с помощью метода активированных эфиров. Получена коллоидная форма терафтала на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата.

3. Наибольшую противоопухолевую активность показал конъюгат доксорубицина с аконитовым спейсером: торможение роста опухолей у мышей с солидным вариантом лимфолейкоза Р388 превышало аналогичные показатели доксорубицина и коньюгата доксорубицина, полученного с помощью глутарового альдегида, в 4 и 1,5 раза, соответственно.

4. Все синтезированные транспортные формы способны эффективно доставлять доксорубицин в клетки линии Р388.

5. Применение синтезированных нами макромолекулярных систем доставки позволяет преодолеть резистентность опухолевых клеток к доксору-бицину.

6. Конъюгат терафтала с АФП проявил высокую противоопухолевую активность, обеспечив выживаемость 67% животных с гепатомой 22.

7. Применение наночастиц в качестве носителей позволяет в 2 раза снизить концентрацию терафтала в коже.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. G.K. Gerassimova, Z.S. Smirnova, S.E. Gelperina, A.I. Bobruskin, A.I. Sot-nichenko and S.E. Severn. In vivo evaluation of antitumour efficacy of the a-fetoprotein (AFP)/ doxorubicin conjugates for site-specific drug delivery. Proc. 2nd World Meeting APGI/APV, Paris, France, 25/28 May 1998, p. 11831184.

2. N.K. Vlasenkova, T.I. Solntseva, G.K. Gerassimova, S.E. Gelperina, A. Bobruskin, and S.E. Severin. Evaluation of alpha-fetoprotein conjugates with doxorubicin in vitro. Proc. 2nd World Meeting APGI/APV, Paris, France, 25/28 May 1998, p. 1019-1020.

3. S. Steiniger, S.E. Gelperina, A.I. Bobruskin, S.E. Severin, J. Kreuter. Electron-dense nanoparticles: a new tool in investigating cell uptake mechanisms. Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., Controlled Release Society, Inc., Paris, France, 27, 2000, 6117.

4. C.B. Луценко, Н.Б. Фельдман, Г.В. Финакова, Г.А. Посыпанова, А.И. Бобрускин, С.Э. Гельперина, К.Г. Скрябин, О.Л. Калия, Г.Н. Ворожцов, С.Е. Северин. Направленный транспорт фталоцианина (Со) к опухолевым клеткам-мишеням с помощью а-фетопротеина и эпидермалыюго фактора роста. Вопросы биологической и фармацевтической химии, №1, 1999, с. 40-44.

Автор выражает благодарность за помощь при проведении экспериментов к.х.н. Е.Г. Гивенко (МГУ), д.х.н. С.А. Борисенковой (МГУ), к.м.н. З.С. Смирновой (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.м.н. Н.В. Андроновой (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.м.н. Е.М.Трещалиной (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.б.н. Н.Б. Фельдман (МНИИМЭ), к.б.н. Г.А. Посыпановой (МНИИМЭ), к.х.н. А.И. Сотниченко (МНИИМЭ).

Автор также выражает глубокую признательность д.б.н. E.IO. Москалёвой за ценные советы при написании диссертационной работы.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бобрускин, Алексей Игоревич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПАССИВНЫЙ ТРАНСПОРТ РАСТВОРИМЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В ОПУХОЛЬ

Введение

1. ТРАНСПОРТ МАКРОМОЛЕКУЛ ЧЕРЕЗ

СТЕНКИ СОСУДОВ

1.1. Транспорт макромолекул через стенки нормальных капилляров

1.2. Эндотелий центральной нервной системы

1.3. Проницаемость синусоидных капилляров

1.4. Фильтрация через эндотелий почечных клубочков

1.5. Экстравазация в зонах воспалительного процесса

1.6. Экстравазация в капиллярах, питающих опухоль

2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ, ВЛИЯЮЩИЕ НА

СКОРОСТИ ЭКСТРАВАЗАЦИИ

3. ПРОНИКНОВЕНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛ В ЛИМФАТИЧЕСКУЮ СИСТЕМУ

4. НАКОПЛЕНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛ В

ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ

5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МАКРОМОЛЕКУЛ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИХ НАКОПЛЕНИЕ В ОПУХОЛИ

6. НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПАССИВНОГО ТРАНСПОРТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В ОПУХОЛЬ

6.1. Неокарциностатин

6.2 Митомицин С

6.3 Доксорубицин 39 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение и очистка АФП

2.2 Получение конъюгатов 46 2.2.1. Синтез конъюгата доксорубицина с АФП с использованием глутарового альдегида (ДОКС-Га-АФП) 46 2.2.2. Синтез конъюгата доксорубицина с АФП с использованием аконитового ангидрида (ДОКС-Ак-АФП)

2.2.3. Синтез конъюгата ДОКС-декстран-АФП

2.2.4. Синтез конъюгата терафтала с АФП

2.3. Получение коллоидных форм противоопухолевых препаратов на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата

2.3.1. Получение коллоидных форм терафтала и доксорубицина на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата

2.3.2. Получение наночастиц из полибутилцианоакрилата

2.4. Культивирование клеток

2.5. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro

2.5.1. Определение цитотоксической активности транспортных форм доксорубицина

2.5.2. Определение цитотоксической активности транспортных форм терафтала

2.6. Исследование доставки транспортных форм доксорубицина в клетки мышиного лимфолейкоза Р 388 in vitro

2.7. Исследование противоопухолевой активности препаратов

2.8 Вычисление критериев противоопухолевой активности

2.9. Изучение накопления терафтала в печени и коже здоровых крыс

2.9.1. Электронная микроскопия

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение конъюгатов доксорубицина и терафтала с АФП и БСА

3.2. Получение коллоидных форм терафтала и доксорубицина

3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов доксорубицина с АФП и БСА

3.4. Цитотоксическая активность доксорубицина, ассоциированного с наночастицами из полибутилцианоакрилата

3.5. Исследование процесса интернализации клетками Р388 конъюгатов доксорубицина с АФП и доксорубицина, ассоциированного с наночастицами

3.6. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов доксорубицина с АФП

3.7. Исследование противоопухолевой активности коллоидной формы доксорубицина

3.8. Изучение биологических свойств транспортных форм терафтала

3.9. Исследование противоопухолевой активности конъюгата терафтала с АФП.

3.9.1 Изучение распределения коллоидной формы терафтала по органам

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и исследование транспортных форм противоопухолевых лекарственных веществ на основе альфа-фетопротеина и полимерных наночастиц"

Повышение избирательности действия противоопухолевых препаратов является актуальной проблемой современной химиотерапии. Одним из наиболее интересных путей решения этой проблемы является использование различных макромолекулярных систем доставки лекарственных веществ (ЛВ).

Транспорт JIB в опухоль с помощью макромолекулярных носителей может быть пассивным или активным. Концепция пассивного транспорта основана на способности опухолевой ткани накапливать макромолекулы и коллоидные частицы в результате нарушенного оттока лимфы и повышенной проницаемости капилляров, питающих опухоль (1,2,3). Для осуществления активного транспорта JIB используют высокоспецифичные механизмы, основанные на взаимодействии лиганда-вектора, входящего в состав системы, с рецепторами на поверхности опухолевых клеток. Создание макромолекулярных систем для активного транспорта JIB в клетки опухоли представляет особый интерес; при этом ключевую роль играет выбор вектора. В качестве векторов часто используют антитела, факторы роста, липопротеины и т.п. Однако рецепторы к этим лигандам присутствуют и в здоровых клетках, поэтому такие системы не обладают достаточной специфичностью, хотя и проявляют высокую цитотоксичность в опытах in vitro. В то лее время известно, что многие опухолевые клетки экспрессируют рецепторы, активно связывающие онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), при этом содержание этих рецепторов в здоровых тканях весьма незначительно (Naval J. et al., 1985; Geuskens M. et al., 1991) (4,5). Ранее было показано, что избирательность действия ряда противоопухолевых препаратов может существенно возрастать в результате конъюгирования их с АФП (S.E. Severin et al, 1995) (6), однако для оценки терапевтического потенциала систем на основе АФП необходимы дальнейшие исследования.

Среди систем пассивной доставки перспективными представляются полимерные наночастицы. По ряду фармакологических параметров наночастицы схожи с липосомами, важным преимуществом наночастиц является высокая стабильность. Наночастицы получают из различных полимеров, как природных (альбумин, желатин, декстран), так и синтетических (полистирол, полиметилметакрилат, полиалкилцианоакрилаты). Полиалкилцианоакрилаты - доступные, малотоксичные, биодеградируемые полимеры, применяющиеся в медицине как основа хирургического клея. В водных растворах наночастицы из полиалкилцианоакрилатов образуют устойчивые коллоидные системы, пригодные для внутривенного введения. Препараты на основе таких наночастиц являются удобной лекарственной формой, их можно стерилизовать и хранить в лиофилизованном виде. Опираясь на многочисленные литературные данные, можно полагать, что применение наночастиц в качестве носителей противоопухолевых JIB позволит снизить побочные эффекты.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бобрускин, Алексей Игоревич

Выводы

1. Разработаны методики синтеза трех типов конъюгатов доксорубицина с АФП с помощью глутарового альдегида, аконитового ангидрида и диальдегиддекстрана. Во всех полученных конъюгатах антибиотик связан с носителем через лабильные в физиологических условиях спейсеры.

2. Синтезирован конъюгат терафтала с АФП с помощью метода активированных эфиров. Получена коллоидная форма терафтала на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата.

3. Наибольшую противоопухолевую активность показал конъюгат доксорубицина с аконитовым спейсером: торможение роста опухолей у мышей с солидным вариантом лимфолейкоза Р388 превышало аналогичные показатели доксорубицина и конъюгата доксорубицина, полученного с помощью глутарового альдегида, в 4 и 1,5 раза, соответственно.

4. Все синтезированные транспортные формы способны эффективно доставлять доксорубицин в клетки линии Р388.

5. Применение синтезированных нами макромолекулярных систем доставки позволяет преодолеть резистентность опухолевых клеток к доксорубицину.

6. Конъюгат терафтала с АФП проявил высокую противоопухолевую активность, обеспечив выживаемость 67% животных с гепатомой 22.

7. Применение наночастиц в качестве носителей позволяет в 2 раза снизить концентрацию терафтала в коже.

Автор выражает благодарность за помощь при проведении экспериментов к.х.н. Е.Г. Гивенко (МГУ), д.х.н. С.А. Борисенковой (МГУ), к.м.н. З.С. Смирновой (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.м.н. Н.В. Андроновой (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.м.н. Е.М.Трещалиной (НИИ ЭДиТО РОНЦ), к.б.н. Н.Б. Фельдман (МНИИМЭ), к.х.н. Г.А. Посыпановой (МНИИМЭ), к.б.н. А.И. Сотниченко (МНИИМЭ).

Автор также выражает глубокую признательность д.б.н. Е.Ю. Москалёвой за ценные советы при написании диссертационной работы.

Заключение

В результате проведённых исследований были синтезированы конъюгаты доксорубицина с АФП с помощью глутарового альдегида, аконитового ангидрида и диальдегиддекстрана. Во всех полученных конъюгатах антибиотик связан с носителем через лабильные в физиологических условиях спейсеры. Также был синтезирован конъюгат терафтала с АФП с помощью метода активированных эфиров. Были получены коллоидные формы доксорубицина и терафтала на основе наночастиц из полибутилцианоакрилата. Разработанная методика позволяет получать наночастицы с высоким содержание доксорубицина и терафтала, а также с узким распределением частиц по размерам.

При исследовании цитотоксической активности транспортных форм доксорубицина была выявлена высокая цитотоксическая активность конъюгата доксорубицина с АФП, полученного с помощью глутарового альдегида, в отношении всех клеточных культур, используемых в экспериментах. Следует отметить, что данный конъюгат имел также высокую цитотоксическую активность в отношении клеток МСБ-7Дс1г11, резистентных к доксорубицину. Включение доксорубицина и терафтала в наночастицы предложенным в работе методом, позволяет сохранить цитотоксические свойства данных препаратов. Коллоидная форма ДОКС, как и другие системы доставки, эффективно обращала резистентность клеток линии МСР-7МгК

Эксперименты по изучению противоопухолевой активности транспортных форм доксорубицина на модели мышиного лимфолейкоза Р388, перевиваемого подкожно, показали высокую противоопухолевую активность конъюгата доксорубицина с АФП, полученного с помощью аконитового ангидрида. Полученные результаты подтверждают, что противоопухолевая эффективность действия исследуемых конъюгатов зависит как от природы векторной молекулы, так и от типа связи между лекарственным веществом и векторной молекулой. Введение коллоидных форм доксорубицина мышам с перевитым подкожно лимфолейкозом Р 388 приводило к увеличению средней продолжительности жизни животных по сравнению с контролем. Следует также отметить высокую противоопухолевую активность конъюгата терафтала с АФП на модели асцитной гепатомы 22 у мышей. Эффект состоял в излечении 67% животных.

Изучение распределения коллоидной формы терафтала по органам показало высокий уровень накопления терафтала в коже, который сохраняется до 9 часов. Применение наночастиц позволяет снизить уровень терафтала в коже примерно в 2 раза. Уровень накопления терафтала, ассоциированного с наночастицами, не превышает уровня накопления в печени свободного терафтала.

Полученные результаты могут служить основой для создания эффективных противоопухолевых препаратов направленного действия на основе альфа-фетопротеина и полимерных наночастиц из полибутилцианоакрилата, а также снизить побочные эффекты, связанные с применением свободных противоопухолевых препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бобрускин, Алексей Игоревич, Москва

1. Maeda Н. SMANCS and polymer-conjugated macromolecular drugs: advantages in cancer chemotherapy. Adv. Drug Deliv. Rev., 6, 181-202, 1991.

2. Davis S.S., Ilium L. Colloidal delivery systems opportunities and challenges, in Site-specific Drug Delivery. Tomlinson E. and Davis S.S., Eds., John Wiley&Sons, Chichester, U.K., 1986, 93-103.

3. Wright J. J., Ilium L. Active targeting of microcapsules and microspheres to specific regions. In: Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, Ed. Donbrow M., CRC Press Boca Raton London 1992, 281297.

4. Naval J., Villacampa M.-J., Goguel A.-F. and Uriel J. Cell-type specific receptor for alpha-fetoprotein in a mouse T-lymphoma cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82, p. 3301-3305.

5. Douglas S.J., Davis S.S., Ilium L. Nanoparticles in drug delivery. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 3, 233-256, 1987.

6. Bundgaard H. Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1985.

7. Duncan R. Lysosomal degradation of polymers used as drug carriers. Crit. Rev. Biocompat., 2, 127-135, 1986.

8. Kopecek J., Duncan R., Targetable polymeric prodrugs. J. Control. Rel., 6,315-323, 1987.

9. Tomlinson E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 1, 87-104, 1987.

10. Drobnik J., Rypacek F. Soluble synthetic polymers in biologic systems. Adv. Polymer Sci., 57, 2, 1984.

11. Joyner W.L. Kern D.F. Microvascular permeability to macromolecules and its dynamic modulation. Adv. Drug Deliv. Rev., 4, 319-325, 1990.

12. Seymour L.W., Ulbrich K., Strohalm J., Kopecek J., Duncan R. Pharmacokinetics of polymer-bound adriamycin, Biochem. Pharmacol., 39, 1125-1143, 1990.

13. Mayerson H.S., Wolfram C.G., Shirley H.H., Wasserman K. Regional differences in capillary permeability. Am. J. Physiol., 198, 155 163, 1960.

14. Bundgaard M. Transport pathways in capillaries in search of pores. Annu. Rev. Physiol, 42, 325-335, 1980.

15. Palade G.E., Simionescu M, Simionescu N. Transport of solutes across the vascular endothelium, in Transport of Molecules in Cellular Systems, Silverstein S.C., Ed. Dahlem Konferenzem, Berlin, 1978.

16. Firrell J.C., Lewis G.P., Youlten L.J.F. Vascular permeability to macromolecules in rabbit paw and sceletal muscle: a study with a mathematical interpretation of transport processes. Microvasc. Res., 23, 294-299, 1982.

17. Renkin E.M. Multiple pathways of capillary permeability. Circ. Res., 41, 735-757, 1978.

18. Taylor A.E. Granger D.N. Exchange of macromolecules across the microcirculation, in Handbook of Physiology, Vol. 6, Microcirculation, Part 1, Renkin E.M., Michel C.C. Eds., Waverly Press, Baltimore, MD, 1984, 467-477.

19. Wagner r.C., Casley-Smith J.R. Endothelial vesicles, Microvasc. Res., 21,267, 1981.

20. S.K. Hobbs, F. Yuan, L.G. Cima, R.K. Jain, Tumor microvascular pore cutoff size: Implications for macromolecules and particle drug delivery, Int. J. Microcirc.: Clin Exp. 16 (Supp. 1) (1996), 218.

21. Rippe B., Kamiya A., Folkow B. Transcapillary passage of albumin, effects of tissue cooling and increase in filtration and plasma colloid osmotic pressure. Acta Physiol. Scand., 105, 171-178, 1979.

22. Robinson P.J. Osmotic opening of the blood-brain barrier and brain tumor chemotherapy. Methods in Neurosciences, 21, 35-50, 1994.

23. Bocci V. Catabolism of therapeutic proteins and peptides with implications for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev., 4, 149-161, 1990.

24. Rypacek F., Drobnic J., Chmelar V., Kalal J. The renal excretion and retention of macromolecules; the chemical structure effect. Pfluegers Arch., 392,211-218, 1982.

25. Arfors K.-E., Rutili G., Svensjo E. Microvascular transport of macromolecules in normal and inflammatory conditions. Acta Physiol. Scand., 463, 93-99, 1979.

26. Majno G., Palade G.E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopy study. J. Biophys. Biochem. Cytol., 11, 607-613, 1961.

27. Fox J., Galey F., Wayland H. Action of histamine on the mesenteric microvasculature, Microvasc. Res., 19, 108-114, 1980.

28. Grega G.J., Adamski S.W., Svensjo E. Is there evidence for venular large junctional gap formation in inflammation? Microcirc. Endothelium Lymphatics, 2, 211-218, 1985.

29. Love W.G., Farr S.J., Kellaway I.W., Williams B.D. Liposome accumulation within inflamed tissue: gamma scintigraphic evidence, Proc. Int. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 17, 377-382, 1990.

30. Seale L., Love W.G., Williams B.D., Kellaway I.W. Accumulation of polymers within inflammatory tissue. Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 18, 386-389, 1991.

31. Love W.G., Amos N., Kellaway I.W., Williams B.D. Specific accumulation of cholesterol-rich liposomes in the inflammatory tissue of rats with adjuvant arthritis. Ann. Rheum. Dis., 49, 611-618, 1990.

32. Larsen G.L., Henson P.M. Mediators of inflammation, Annu. Rev. Immunol., 1,335-341, 1983.

33. Dvorak H.F., Nagy J.A., Dvorak A.M. Structure of solid tumors and their vasculature implications for therapy with monoclonal antibodies. Cancer Cells, 3, 77-85,1991.

34. Blood C.H., Zetter B.R. Tumor interactions with the vasculature: angiogenesis and tumor metastasis, Biochim. Biophys. Acta, 1032, 8995, 1990.

35. Dewey W.C. Vascular-extravascular exchange of I-plasma proteins in the rat. Am. J. Physiol., 197, 423-431, 1959.

36. Song C.W., Lewitt S.H. Quantitative study of vascularity in walker carcinoma 256, Cancer Res, 31, 587-595, 1971.

37. Ackerman N.B., Hechmer P.A. Studies on the capillary permeability of experimental liver metastases. Surg. Gynecol. Obstet., 146, 884-890, 1978.

38. O'Connor S.W., Bale W.F. Accessibility of circulating immunoglobulin G to the extravascular compartment of solid rat tumors. Cancer res., 44, 3719-3722,1984.

39. Heuser L.S., Miller F.N. Differential macromolecular leakage from the vasculature of tumors. Cancer, 57, 461-468, 1986.

40. Underwood J.C.E., Carr I. The ultrastructure and permeability characteristics of the blood vessels of a transplantable rat sarcoma. J. Pathol., 107, 157-164, 1972.

41. Ward J.D., Hadfield M.G., Becker D.P., Lovings E.T. Endothelial fenestrations and other vascular alterations in primary melanoma of the central nervous system. Cancer, 34, 1982-1991, 1974.

42. Yamada K., Ushio Y., Hayakawa T., Kato A., Yamada N., Mogami H. Quantitative autoradiographic measurements of blood-brain permeability in the rat glioma model. J. Neurosurg., 57, 394-400, 1982.

43. Peterson H.I. Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Raton, FL, 1979.

44. Dvorak H.F., Nagy J.A., Dvorak J.T., Dvorak A.M. Identification and characterization of the blood vessels and fibrin deposition. Am J. Pathol, 133, 95-104, 1988.

45. Nagy J.A., Brown L.F., Senger D.R., Lanir N., Van der Water L., Dvorak A.M., Dvorak H.F. Pathogenesis of tumor stroma generation: a critical role for leaky blood vessels and fibrin deposition. Biochim. Biophys. Acta, 948, 305-313, 1988.

46. Brown L.F., Dvorak A.M., Dvorak H.F. Leaky vessels, fibrin depositions and fibrosis a sequence of events common to solid tumors and to many other types of disease. Am. J. Resp. Dis., 140, 1104-1112, 1989.

47. Senger D.R., Peruzzi C.A., Feder J., Dvorak H.F. A highly conserved vascular permeability factor secreted by a variety of human and rodent tumor cell lines. Cancer Res., 46, 5629-5634, 1986.

48. Jain R.K. Delivery of molecular and cellular medicine to solid tumors. J. Cont. Rel. 53, 49-67, 1998.

49. Jain R.K. Vascular and interstitial barriers to the delivery of therapeutic agents in tumors. Cancer Metastat Rev., 9, 253-257, 1991.

50. Jain R.K. Transport of molecules in the tumor interstitium: a review, Cancer Res., 47, 3039-3051, 1987.

51. Chang R.L.S., Veki I.F., Troy J.L., Deen W.M., Robertson C.R., Brenner B.M. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys. J., 15, 887-898, 1975.

52. Ulbrich K., Konak C., Tuzar Z, Kopechek J. Solution properties of drug carriers based on poly(N-(2-hydroxypropyl)methaciylamide) containing biodegradable bonds. Macromol. Chem., 188-195, 1261, 1987.

53. Sprincl L, Exner J, Sterba O, Kopecek J. New types of synthetic infusion systems. III. Elimination and retention of poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide in a test organism. J. Biomed. Mater. Res. 10, 953-957, 1976.

54. Renkin E.M, Gilmore J.P. Glomerular filtration, in Handbook on Physiology, Sect. 8, Orloff J. and Bekker R.W, Eds, Waverly Press, Baltimore, MD, 1973, 185-198.

55. Rennke H.G, Venkatachalam M.A. Glomerular permeability of macromolecules. Effect of molecular configuration on the fractional clearance of uncharged dextrans and neutral horseradish peroxidase in the rat. J. Clin. Invest., 63, 713-719, 1979.

56. Hardwicke J, Hulme B, Henry Jones J, Ricketts C.R. Measurement of glomerular permeability to polydisperse radioactivity-labelled macromolecules in normal rabbits. Clin. Sci, 34, 505-511, 1968.

57. DeGennes P.I. Reptilation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. J. Chem, Phys, 55, 572-575,1971.

58. Bohrer M.P., Deen W.M., Robertson D.R., Troy J.L., Brenner B.M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. J. Gen. Physiol., 74, 583-591, 1979.

59. Jargensen K.E., Moller J.V. Use of flexible polymers as probes of glomerular size. Am. J. Physiol., 236, F103, 1979.

60. Brenner B.M., Beeuwkes R. The renal circulations. Hosp. Pract., 35, 4651, 1978.

61. Bohrer M.P., Baylis C., Humes H.D., Glassock R.J., Robertson C.R., Brenner B.M. Permselectivity of the glomerular capillary wall. Facilitated filtration of circulating polycations. J. Clin. Invest., 61, 7281, 1978.

62. Michels L.D., Davidman M., Keane W.F. Glomerular permeability to neutral and anionic dextrans in experimental diabetes. Kidney Int., 21, 699-707, 1982.

63. Pietra G.G., Fishman A.P., Lanken P.N., Sampson P.M., HansenFlaschen J. Permeability of pulmonary endothelium to neutral and charged macromolecules. Ann. N.Y. Acad. Sci., 401, 241-247, 1982.

64. Kern D.F., Bell D.R., Blumenstock F.A. The effect of charge on albumin permeability and uptake in the lung. Microvasc. Res., 3, A241, 1983.

65. Deen W.M., Satvat B., Jamieson J.M. Theoretical model for glomerular filtration of charged solutes. Am. J. Physiol., 238, F126, 1980.

66. Kern D.F., Swanson J.A. Determinants of charge selectivity across pulmonary microvasculature, FASEB J., 3, A1390, 1989.

67. Lanken P.N., Hansen-Flaschen J.H., Sampson P.M., Pietra G.G., Haselton F.R., Fishman A.P. Passage of imcharged dextrans from blood to lymph in awake sheep. J. Appl. Physiol., 59, 580-587, 1985.

68. Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer therapy: mechanism of tumoritropic accumulationof proteins and the antitumor agent SMANCS, Cancer Res., 44, 238244, 1984.

69. Jain R.K., Baxter L.T. Mechanisms of heterogeneous distribution of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumor: significance of interstitial pressure. Cancer Res., 48, 7022-7032, 1988.

70. Clauss M.A., Jain R.K. Interstitial transport of rabbit and sheep antibodies in normal and neoplastic tissues. Cancer Res., 50, 3487-3495, 1990.

71. Nugent L.J., Jain R.K. Extravascular diffusion in normal and neoplastic tissue, Cancer Res., 44, 238-244, 1984.

72. Gerlowski L.E., Jain R.K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues, Microvasc. Res., 31, 288-300, 1986.

73. Knudson W., Biswas C., Li X.-Q., Nemec R.E., Toole B.P. The role and regulation of tumour-associated hyaluronan, in The Biology of Hyaluronan, Evered, D., Wlielan J., Eds., Ciba Foundation Symposium No 143, Wiley, Chichester, U.K., 1989, 150-161.

74. Poste G. Drug targeting in cancer chemotherapy, in Receptor-Mediated Targeting of Drugs, Gregoriadis G., Poste G., Senior J., Trouet A., Eds., Plenum Press, New York, 1985, 427-465.

75. Babson A.L., Winnick T., Protein transfer in tumor-bearing rats. Cancer Res., 14, 606-609, 1954.

76. Hradec J. Metabolism of serum albumin in tumor-bearing rats. Br. J. Cancer, 12, 290-298, 1961.

77. Day E.D., Planinsek J. A., Pressman M.D. Localisation of radioiodinated rat fibrinogen in transplanted rat tumors. J. Natl. Cancer. Inst., 23, 799806, 1959.

78. Dewey W.C., Bale W.F., Rose R.C., Marrack D. Localisation of antifibrin antibodies in human tumors. Acta Un. Int. Contra Cancrum, 19, 185-192, 1963.

79. Rossing N. Albumin metabolism in neoplastic diseases. Scand. J. Clin. Invest., 22, 211-220,1968.

80. Peterson H.I., Appelgren K.L. Experimental studies on the uptake and retention of labelled proteins in a rat tumor. Eur. J. Cancer, 9, 543-551, 1973.

81. Shibata K., Okubo H., Ishibashi H., Tsuda-Kawamura K., Yanase I. Rat glycoprotein: uptake by inflammatory and tumor tissue. Br. J. Exp. Pathol., 59, 601,1978.

82. Butler T.P., Grantham F.H., Gullino P.M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res., 35, 30843092, 1975.

83. Busch H., Greene H.S.N. Studies on the metabolism of plasma proteins in tumor-bearing rats. Yale J. Biol. Med., 27, 339-347, 1955.

84. Busch H., Fujiwara E., Firszt D.C. Studies on the metabolism of radioactive albumin in tumor-bearing rats. Cancer Res., 21, 371-378, 1961.

85. Som P., Ostor Z.H., Matsui K., Guglielmi G., Persson B.R.R., Pellettieri M.L., Srivastava S.C., Richards P., Atkins H.L., Brill A. 97Ru-transferrin uptake in tumor and abscess. Eur. J. Nucl. Med., 8, 491-499, 1983.

86. Cerrotini J.C., Isliker H. Transport d'agents cytostatique par les proteins plasmatiques. I. Penetration de la serumalbumine dans les cellules tumorales. Eur. J. Cancer, 3, 111-118,1967.

87. DeCarvalho S., Rand H.J., Lewis A. Coupling of cyclic chemotherapeutic compounds to immune gamma-globulins. Nature, 202, 255-265, 1964.

88. Magnenant S., Schindler R., Isliker H. Transport d'agents cytostatique par les proteins plasmatiques. III. Activite antitumorale in vitro de conjugates cytostatique-azoproteines. Eur. J. Cancer, 5, 33-41, 1969.

89. Seymour L.W. Passive tumor targeting of solute macromolecules and drug conjugates. CRC Crit. Rev. Tlier. Drug Carrier Sys., 9, 135-187, 1992.

90. Szekerke M., Wade R., Whisson M.E. The use of macromolecules as carriers of cytotoxic drugs. I. Conjugates of nitrogen mustards with proteins, peptidylproteins and polypeptides. Neoplasma, 19, 199-207, 1972.

91. Szekerke M., wade R., Whisson M.E. The use of macromolecules as carriers of cytotoxic drugs. III. Nitrogen mustard-protein complexes. Neoplasma, 19, 211-221, 1972.

92. Pittman R.C., Carew T.E., Glass C.K., Green S.R., Taylor C.A. Jr., Attie A.D. A radioiodinated intracellulary trapped ligand for determining the sites of plasma protein degradation in vivo. Biochem J., 212, 791799, 1983.

93. Sinn H., Schrenk H.H., Friedrich E.A., Schilling U., Maier-Borst W. Design of compounds having an enhanced tumor uptake, using serum albumin as carrier. Nucl. Med. Biol. 17, 819-825, 1990.

94. Takakura Y., Fujita T., Hashida M., Sezaki H. Disposition characteristics of macromolecules in tumor-bearing mice. Pharm.Res., 7, 339-348, 1990.

95. Maeda H., Takeshita J., Yamashita A. Lymphotropic accumulation of an antitumor antibiotic protein neocarzinostatin. Eur. J. Cancer, 16, 723728, 1980.

96. Kobayashi A., Oda T., Maeda H. Protein binding of macromolecular anticancer agent SMANCS: characterization of poly(styrene-co-maleic acid) derivatives as an albumin-binding ligand. J. Bioact. Compat. Polymers, 3, 319-328, 1989.

97. Maeda H., Polymer conjugated macromolecular drugs for tumor-specific targeting, in Polymer Site-Specific Pharmacotherapy A.J. Domb, Ed. John Wiley&Sons Ltd., New York, 1994, 95-116.

98. Duncan R., Folkman J., Regelson W. SMANCS, Jpn. J. Cancer Res. 86, 1234-1235, 1995.

99. Maeda H., Matsumoto T., Konno T., Iwai K., Ueda M. Tailor-making of protein drugs by polymer-conjugation for tumor targeting: a brief review on SMANCS. J. Protein Chem., 3, 181-191, 1984.

100. Ohtsuka N., Konno T., Miyauchi Y., Maeda H. Anticancer effects of arterial administration of the anticancer agent SMANCS with lipiodol on metastatic lymph nodes, Cancer, 59, 1560-1567, 1987.

101. Matsumura Y., Kimura K., Yamamoto T., Maeda H. Involvement of kinin-generated cascade in enhanced vascular permeability in tumor tissue. Jpn. J. Cancer Res., 79, 1327-1335, 1988.

102. Goldberg J.A., Murray T., Kerr D.J., Willmott N. The use of angiotensin II as a potential method of targeting cytotoxic microspheres in patients with intrahepatic tumour. Br. J. Cancer, 63, 308-317, 1991.

103. Tokunaga Y., Iwasa T., Fujisaki J., Sawai S., Kagayama A. Liposomal sustained release delivery systems for intravenous injection. III. Antitumor efficacy of lipophilic Mitomycin C prodrug-bearing liposomes. Chem Pharm. Bull., 36, 3565-3571, 1988.

104. Sasaki H., Kakutani T., Hashida M., Sezaki H. Caracterization of liposomes and an emulsion containing mitomycin C or lipophilic mitomycin C prodrugs. J. Pharm. Sci., 75, 1166-1173, 1986.

105. Kaneo Y., Tanaka Y., Hashida M., Kimura T., Sezaki H. Physicochemical and antitumor characteristics of high molecular weight prodrugs of mitomycin C. Chem Pharm. Bull., 30, 2951-2960, 1982.

106. Takakura Y., Matsumoto S., Hashida M., Sezaki H. Physicochemical properties and antitumor activities of polymeric prodrugs of mitomycin C with different regenerated rates. J. Cont. Rel. 10, 97-106,1989.

107. Duncan R., Dimitrijevic S., Evagorou E.G. The role of polymer conjugates in the diagnosis and treatment of cancer. S.T.P. Pharma 6(4), 237-263, 1996.

108. Yeung T.K., Hopewell J.W., Rezzani G., et al. Reduced cardiotoxicity of doxorubicin administered in the form of N-(hydroxypropyl)methacrylamide conjugates: an experimental study in the rat. Cancer Chemother. Pharmacol., 29, 105-111, 1991.

109. Bibby M.C. Double J.A., Duncan R. Activity of polymer-bound doxorubicin PK1 and doxorubicin in experimental murine colon tumors. Proc 1st Int. Symp. on Polymer Therapeutics , London, 1996.

110. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. J.Biol. Chem. 1951,193, 265-275.

111. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Meth, 1983, 65, 55-63.

112. Kopecek J, Kopecekova P, Minko T, Lu Z-R HPMA copolimer-anticancer drug conjugates: design, activity, and mechanism of action. Eur., J., of Phar., and Biopharm. 2000, 50,61-81.

113. H. Soyes, E. Schacht, S. Vanderkerken The crucial role of spacer groups in macromolecular prodrug design. Adv. Drug Delivery Rev. 1996,21,81-106.

114. Shen W.C. and Ryser H.J.P. Cis-aconitil spacer between daunomycin and macromolecular carriers: a model of pH-sensitive linkage releasing drug from a lysosomotropic conjugate. Biochem. Byophys. Res. Commun. 1981, 102, 1048-1054.

115. Ringsdorf H, Structure and properties of pharmacologically active polymers. J. Polym. Sci. Polym. Symp. 1975, 51, 135-153.

116. De Marre A., Soyez H., Scacht E., Shoaibi M.A., Seumour L.W., Rihova B. Synthesis and evaluation of macromolecular prodrugs of mitomycin C. J. Cont. Rel., 36, 87-97, 1995.

117. Vasey P., Duncan R., Twelves C., Kaye S.B., Strolin-Benedetti M, Cassidy J. Clinical and pharmacokinetical phase I study of PK1 (HPMA) copolymer of doxorubicin. Annals of oncology, 7, 97-112, 1996.

118. Duncan R., Drug-polymer conjugates: potential for improved chemotherapy. Anti-Cancer Drugs, 3, 175-210, 1992.

119. Cassidy J., Duncan R., Morrison G.J., Strohalm J., Plocova D., Kopecek J., Kaye S.B. Activity of N-(hydroxypropyl)methacrylamide copolymers containing daunomycin against a rat tumor model. Biochem. Pharmacol., 38, 875-879, 1989.

120. Duncan R., Seymour L.W., O'Hare K.B. et al. Preclinical evaluation of polymer-bound doxorubicin. J. Cont. Rel. 19, 331-346, 1992.

121. O'Hare K.B., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Kopeckova P. Polymeric drug carriers containing doxorubicin and melanocyte stimulating hormones: in vitro and in vivo evaluation against murine melanoma. J. Drug Targeting, 1, 217-229, 1993.

122. Kreuter J. Nanoparticles in: Colloidal drug delivery systems. Ed. Kreuter J., Marcel Dekker, New York, 1994.

123. Couvreur P., Kante В., Lenaerts V., Scailteur V., Roland M. and Speiser P. Tissue distribution of antitumor drugs associated with polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. J. Pharm. Sci., 1980, 69, 199202.

124. Okawa K., Hatano Т., Yamada K., Joh K., Takada K., Tsukada Y. and Matsuda M. Bovine serum albumin-doxorubicin conjugate overcomes multidrug resistance in a rat hepatoma. 1993, 53, 42384242.

125. Tores J.M., Geuskens M., Uriel J Activated human T lymphocytes express albumin binding proteins which cross-react with alpha-fetoprotein. Eur.J.of Cell Biology 1992, 57, 222-228.

126. Alava M., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specific uptake of alfa-fetoprotein and albumin by rat Moriss 777 hepatoma cells. Tumor Biology 1999, 20, 52-64.

127. Платэ H.A., Васильев A.E. Физиологически активные полимеры. Москва «Химия», 1986, 234с.

128. Мануйлов К.К., Кашина Л.Б. Новый метод расчета коэффициента распределения ткань-кровь для физиологическихмоделей фармакокинетики. Антибиотики и химиотерапия, 1990, № 5, с. 35-36.

129. Скидан И.Н., Тихонова Е.В., Гуляев А.Е и др. Химико-биологические аспекты направленного транспорта лекарственных веществ на полимерной основе. В кн.: Поиск и создание методов получения фитопрепаратов. Алматы, 1997, С321-333.росс;; TOCЛ;-'