Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез и исследование биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Синтез и исследование биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина"
На правах рукописи
ГРОМОВЫХ Петр Сергеевич
СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ С-КОНЦЕВЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЕРМОРФИНА
03.00.23 - Биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2008
003168002
Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН
Научный руководитель: академик РАН, доктор химических наук, профессор
Мясоедов Николай Федорович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Безуглов Владимир Виленович
кандидат химических наук Кириллова Юлия Геннадьевна
Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В.
Ломоносова
Защита состоится <^>> 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного
совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. (119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.
Автореферат разослан « 2008
г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник
А.И. Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*
Актуальность работы. Боль является одной из наиболее частых причин обращения людей за медицинской помощью, поэтому проблема создания высокоэффективных и безопасных болеутоляющих средств сохраняет свою актуальность (Gureje et al., 2001; Павленко и др. 2002). В настоящее время терапия острой и хронической боли основывается на применении трех основных групп лекарственных средств: опиоидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, и группы веществ из других фармакологических классов, обладающих в качестве побочного эффекта обезболивающим действием (антидепрессанты, антиконвульсанты, анестетики, агонисты аг-адренорецепторов и т.д.). Традиционные подходы в лечении болевых синдромов не всегда эффективны и сопряжены с риском возникновения побочных эффектов.
Наиболее эффективными анальгетиками при лечении большинства тяжелых болевых синдромов (онкологические, постоперационные боли и т.д.) по-прежнему остаются опиоиды, несмотря на то, что их применение ограничено риском развития лекарственной зависимости и эффектами, связанными с передозировкой. В регулировании различных систем организма, в том числе ноцицепции и антиноцицепции, участвуют эндогенные пептиды. Большинство природных пептидных соединений обладает " большим количеством эффектов, что затрудняет создание на их основе лекарственных препаратов, поэтому целесообразен поиск эндогенных опиоидных веществ, отвечающих за появление избирательного анальгетического действия.
Среди опиоидных пептидов дерморфин (Tyr-ß-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-Nfb) обладает самой высокой и продолжительной анальгетической активностью (Stevens et al., 1986, Basso et al., 1985). Однако, как и большинство эндогенных пептидов, дерморфин обладает широким спектром физиологической активности: оказывает влияние на функции сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной и выделительной систем и влияет на различные формы поведения животных (Melchiorri and Negri, 1996). Подобная полифункциональность затрудняет создание селективного анальгетика на основе дерморфина. С этой целью были проведены исследования, направленные на выявление минимального фрагмента дерморфина, сохраняющего анальгетическое действие.
it
В руководстве работой принимала участие к. б. н. Гузеватых Л.С.
Список используемых сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ГЭБ -гематоэнцефалический барьер, ДМ - дерморфин, НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты, ОМР - относительная молярная радиоактивность, ОР - опиоидные рецепторы, ПКМС - подвздошная кишка морской свинки, РРА - радиорецепторный анализ, СПМ - семявыносящий проток мыши, ТСХ -тонкослойная хроматография. ТФУ - трифторуксусная кислота, ТЭА - триэтиламин, ЦНС - центральная нервная система, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, ВОС - /ярет-бушлоксикарбонильная группацВ8|А-бычий сывороточный альбумин; DAGO - [D-Ala2, MePhe4, С1у-о15]-энкефалин. \ ^Тч
Путем укорачивания молекулы дерморфина с С-конца было установлено, что N-концевой тетрапептид Tyr-£>-Ala-Phe-Gly является самым коротким фрагментом, сохраняющим биологическую активность (Broccardo et al., 1981). Установлено, что при протеолизе дерморфина ферментами гомогената мозга основное место разрыва цепочки
- связь Gly4-Tyr5, в результате чего образуются iV-концевой тетра- и С-концевой трипептиды (Negri and Improta, 1984). Сведения о биологических свойствах С-концевого трипептида Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 отсутствуют. Стереохимическая модификация Pro6 в молекуле дерморфина приводит к усилению анальгетической активности (Гузеватых и др. 2002), что указывает на значимость С-концевого участка гептапептида для проявления обезболивающего действия. Поэтому в настоящее время С-концевые фрагменты представляют большой интерес и являются объектом пристального изучения. Они могут быть использованы в качестве основы для создания новых анальгетиков. Для изучения пептидов этой группы необходимо получить их меченые аналоги, позволяющие исследовать взаимодействие пептидов с эндогенной опиоидной системой, изучить кинетику распределения и метаболизма в организме.
Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, № НШ-5638.2006.4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, № 02.445.11.7150, № 02.245.11.7317; 2007-2012 годы, №02.512.11.2124.
Цель работы:
Синтез и изучение биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-£>-Pro-Ser-NH2.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- синтез трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-£>-Pro-Ser-NH2, их ненасыщенного аналога для введения трития Tyr-DX-APro-Ser-NIb и тетрапептида Tyr-£>-Ala-Phe-Gly-NH2 в количествах, необходимых для проведения биологических исследований;
- получение меченных тритием трипептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 в количествах, необходимых для проведения биологических исследований;
- изучение анальгетической активности трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 в сравнении с активностью дерморфина и [1>-Рго6]-дерморфина;
- изучение влияния антагонистов опиоидых рецепторов налоксона и налоксона метиодида на проявление анальгетического действия Туг-Рго-Бег-МНг, Туг-Д-Рго-Зег-ИНг, дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина;
- изучение распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов Туг-[3,4-3Н]Рго-8ег-1ЧН2 и Тут-[3,4-3Н]--0-Рго-8ег-МН2 после однократного внутримышечного введения крысам;
- изучение взаимодействия Туг-[3,4-3Н]-Рго-Зег-МН2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-МН2 с плазматическими мембранами головного мозга крысы;
- радиорецепторный анализ конкурентного вытеснения [3Н]-дерморфина и [3Н]-дерморфина-(1-4) трипептидами Туг-Рго-Бег-ЫИг и Туг-1>-Рго-8ег-МН2;
- изучение взаимодействия дерморфина, [£>-Рго6]-дерморфина, Туг-Рго-Зег-ЫПг, и Туг-£>- Рго-Э ег-МН2, с периферическими опиоидными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки (ц-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (8-опиоидные рецепторы).
Научная новизна
Методами пептидного синтеза в растворе были получены трипептиды Туг-Рго-8ег-Ш2, Туг-^-Рго-вег-ИНг, Туг-£>1-ДРго-8ег-Ш2 и тетрапептид Туг-£>-А1а-Р11е-01у-Ш2.
Впервые получены меченные тритием аналоги дерморфина Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-МН2 и Туг-[3,4-3Н]-.0-Рго-8ег->Ш2 и показано, что наилучшими условиями для их синтеза является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.
Впервые исследовано распределение по органам и динамика выведения С-концевого фрагмента дерморфина Туг-Рго-Зег-1ЧН2 и его стереоизомера Туг-£>-Рго-8ег->Ш2 и установлено, что трипептиды способны проникать в мозг.
Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина Туг-Рго-8ег-ГШ2, Туг-£>-Рго-8ег-№!2 обладают анальгетической активностью сопоставимой или превышающей активность дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина. Установлено, что анальгетический эффект дерморфина, [£>-Рго6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов Туг-Рго-Зег-ЫН2, Туг-0-Рго-8ег-1ЧН2 уменьшается при совместном введении с налоксоном и налоксоном метиодидом, что может предполагать наличие одного из механизмов анальгетического действия С-концевых фрагментов дерморфина, связанного с влиянием на опиоидергическую систему организма.
Впервые радиорецепторными исследованиями выявлены два центра связывания дерморфина с плазматическими мембранами головного мозга крыс и показано, что С-концевые фрагменты Туг-Рго-Зег-№12, Туг-0-Рго-8ег-ТЧН2 взаимодействуют преимущественно с «высокоаффинными» местами насыщения [3Н]-дерморфина и не
влияют на связывание [3Н]-дерморфина с «низкоаффинными» местами связывания на плазматических мембранах головного мозга крыс.
Впервые показано, что трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser-NHh не влияют на связывание JV-концевого фрагмента дерморфина [3H]-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 на плазматических мембранах головного мозга крыс.
Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 имеют низкое сродство к периферическим |i- и 5-опиоидным рецепторам препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши.
Практическая значимость
Подобраны условия химического синтеза С-концевых фрагментов дерморфина и их меченых аналогов. Разработанный метод получения меченных тритием пептидов может быть рекомендован для синтеза меченных тритием препаратов, применяемых в медико-биологических исследованиях.
Получены и исследованы новые пептиды, перспективные для создания на их основе анальгетиков нового поколения. Полученные данные демонстрируют, что трипептиды могут рассматриваться в качестве потенциальных лекарственных веществ.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на четвертом Всероссийском съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), на третьем Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), на семинарах сектора регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН.
Публикации
По основным результатам диссертации опубликовано 7 научных работ. В изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликовано 4 статьи.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, состоящего изЗР? источников. Работа изложена на страницах, содержит ¿У таблиц и а рисунков.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время известно лишь два уникальных семейства природных пептидов, содержащих £>-аминокислотный остаток - это дерморфины и дельторфины (Negri et а!., 2000), при этом оба семейства пептидов обладают высокой биологической активностью и имеют общий предшественник - продерморфин (Amiche et al., 1990). Распределение
дерморфинов в органах и тканях животных свидетельствует о вовлечении их в регуляцию ряда жизненно важных функций, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности организма. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что, являясь мощнейшими анальгетиками, дерморфины эффективны при периферическом введении, действуют преимущественно на спинальном уровне и обладают менее выраженными негативными эффектами, которые характеры для опиоидов (толерантность, физическая зависимость, угнетение процессов дыхания и др.). Поэтому новые аналоги дерморфина, активные при периферическом введении и лишенные побочного действия, представляют большой теоретический и практический интерес в качестве основы для создания новых сильных анальгетиков с легким седативным эффектом. Подход, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН и ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, позволил создать принципиально новую группу соединений, общей формулы А-В-Туг-Рго ф-Рго, ДРго, 1),ДРго, Нур)-В-Х, обладающих анапьгетической активностью (Гузеватых 2005, 2007, 2008). Этот класс пептидов включает в себя С-концевые фрагменты дерморфина и [Д-Рго6]-дерморфина трипептиды Туг-Рго-Зег-КПНг и Туг-£>-Рго-8ег-МН2.
В данной работе химическим синтезом были получены трипептиды Туг-Рго-8ег-МН2, Туг-£»-Рго-8ег-Ш2, Туг-£>1-3,4-АРго-8ег-Ш12, Туг-£>-А1а-РЬе-01у-Ш2, их меченые аналоги Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-МН2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-Ш2. Приводятся результаты исследований анальгетической активности трипептидов, кинетики распределения и накопления в органах и крови крысы, взаимодействие с опиоидергической системой организма.
1. Химический синтез пептидов и их меченых аналогов
Синтез трипептидов Туг-Рго-8ег-Ш2> Туг-О-Рго-Бег-Шг, Туг-Д1-3,4-АРго-8ег-Ш2 проводили в соответствии со схемой 1 (а), а тетрапептида Туг-£>-А1а-РЬе-01у->Щ2 - в соответствии со схемой 1 (б).
Схема 1
Вое-Вос-Вос-Вос-Вос„ Вос-Вос-Вос-
Н-
а
Ту* Рго
О-Рго.дРго
-ОН Н-П
Бег
ш
IV
он
он нЧ-ОМе -ОМе ■Ш2 -Ш2
Вое-. Вос-Вос-Вос-Вос-. Вос-Вос-Вос-
Н-
Туг £»-А1а Р
1е
I
-ОН Н—р ОН Н-|— ОМе
■ОМе
ш
-он н-
ГУ
Ыу
и
-ОМе
-мн2
- МН2
На первом этапе синтеза трипептидов получали дипептиды Boc-Tyr(Boc)-Pro-OH (la), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-OH (Ib) и Boc-Tyr(Boc)-£>L-3,4-APro-OH (Ic) путем конденсации аминокислот с применением методов смешанных ангидридов и активированных эфиров. Синтез трипептидов Boc-Tyr(Boc)-Pro-Ser-NH2 (Illa), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-Ser-NH2 (Tllb), Boc-Tyr(Boc)-DL-3,4-APro-Ser-NH2 (IIIc) осуществляли конденсацией дипептидов (la), (Ib) и (Ic) с метиловым эфиром серина и последующим аммонолизом. Деблокированием соответствующих Вос-производных получали необходимые стандарты свободных пептидов в виде гидрохлоридов, HCl'H-Tyr-Pro (Va), HCl'H-Tyr-D-Pro (Vb), HCl'H-Pro-Ser-NH2 (VI), HCl-H-Tyr-Pro-Ser-NHz (IVa), HCl-H-Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 (IVb), HCPH-Tyr-DL-3,4-APro-Ser-NH2 (IVc).
Синтез дипептида (Ib) и его аналогов (1а), (1с) осуществляли в растворе ацетонитрила при температуре +4 °С. Выход Boc-Tyr(Boc)-£>-Pro-OH составил 81 %. Методом тонкослойной хроматографии было установлено, что полученное соединение имеет фактор удерживания R/, равный 0.52 в хроматографической системе хлороформ-метанол-концентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б) и температуру плавления 75-77 °С. При аналогичных условиях синтеза выход дипептида (1а) составлял 95 %. Дипептид имеет температуру плавления 79-81 °С и фактор удерживания R/ равный 0,26 в хроматографической системе ацетон-бензол-уксусная кислота, 2:1:1 (А).
На второй стадии были синтезированы гидроксисукцинимидные эфиры дипептидов, из которых получали метиловые эфиры трипептидов Boc-Tyr(Boc)-Pro-Ser-ОСНз (IIa), Boc-Tyr(Boc)-D-Pro-Scr-OCH3 (IIb) и Boc-Tyr(Boc)-DI-3,4-APro-Ser-OCH3 (Tic) (Andreeva et al., 1992). Установлено, что наибольший выход при конденсации дипептидов с метиловым эфиром серина НСЬБег-ОСНз был получен при синтезе трипептида (IIa) и составил 96 %. Температура плавления продукта 81-83 °С, фактор удерживания R/ равен 0,27 в хроматографической системе ацетон-бензол-уксусная кислота, 2:1:1 (А).
На третьей стадии синтеза был проведен аммонолиз метиловых эфиров трипептидов и получены амиды трипептидов (Illa), (Illb) и (1Пс). Наибольший выход (98 %) был получен при синтезе амида трипептида (Illa). Амиды трипептидов имеют близкую температуру плавления, варьирующую в пределах 115-129 °С. Завершающая стадия синтеза - деблокирование защитных групп амидов трипептидов. Наибольший выход 97 % составил при синтезе трипептида HCl Tyr-D-Pro-Ser-Nlb.
Синтез тетрапептида Tyr-Z)-Ala-Phe-Gly-NH2 (XII) проводили путем конденсации дипептидов Boc-Tyr(Boc)-Z)-AIa-OH (VII) и Boc-Phe-Gly-ОСНз (VIII), которые получали методами смешанных ангидридов и активированных эфиров (схема 1 (б)). Защитную
группу дипептида Boc-Phe-Gly-OMe деблокировали и осуществляли фрагментную конденсацию дипептидов Boc-Tyr(Boc)-D-Ala (VII) и HClPhe-Gly-OMe (IX). На последних стадиях синтеза проводили аммонолиз и деблокирование защитных групп тетрапептида.
На первой стадии методом смешанных ангидридов в растворе ацетонитрила был получен дипептид (VII), выход которого составил 81 %. Полученное соединение имеет фактор удерживания Rf равный 0,57 в хроматографической системе хлороформ-метанол-концентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б) и температуру плавления 171-173 °С.
На второй стадии с использованием пентафторфенилового эфира Boc-Phe-OPfp и метилового эфира глицина HClGly-ОСИз был синтезирован дипептид (VIH) в растворе диметилформамида. Выход продукта составил 92 %, температура плавления 56-58 °С и фактор удерживания R/ 0,26 в хроматографической системе ацетон-бензол-уксусная кислота, 2:1:1 (А).
На третьей стадии деблокировали защитную группу у дипептида (VIII), при этом выход дипептида (IX) составил 96 %. Путем конденсации дипептидов (VII) и (IX) методом смешанных ангидридов был получен тетрапептид Boc-Tyr(Boc)-£>-Ala-Phe-Gly-ОСНз (X), выход которого составил 82 %, температура плавления 150-153 °С и фактор удерживания распределения R/ 0,41 в хроматографической системе хлороформ-метанол-концентрированный раствор аммиака, 8:1.75:0.25 (Б). Аммонолизом метилового эфира тетрапептида был получен его амид Boe-Tyr(Boc)-_D-Ala-Phe-Gly-NH2 (XI). На завершающей стадии деблокировали защитные группы и был получен тетрапептид (XII). Выход продукта составил 94 %.
Гомогенность полученных продуктов синтеза характеризовали с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия), температурами плавления на плавильном столике фирмы Boetius (Германия). Структуру конечных деблокированных пептидов подтверждали данными масс-спектромегрии, 'Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии.
Важной характеристикой при изучении динамики выведения пептидов является время удерживания пептида, оцениваемое с помощью ВЭЖХ. Установлено, что время удерживания D- и ¿-изомеров Pro-Ser-NHí и пролина было одинаковым и составило 1.49 и 1.76 мин соответственно. Иные результаты получены для D- и L-изомеров Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-£»-Pro-Ser-NH2. Время удерживания для D-изомера больше, чем для L- и составило 14.21 мин и 13.56 соответственно.
Для количественного определения концентрации трипептидов и их фрагментов в органах и тканях крыс были использованы меченые аналоги. В качестве радионуклида в работе использовали 3Н (тритий), так как он относительно доступен и имеет хорошие
характеристики (Шевченко и др. 2003). Учитывая, что в процессе протеолиза деградация грипептидов Tyr-D-Pro-Ser-NH2 и Tyr-Pro-Ser-NHb может проходить с образованием дипептидов Tyr-£>-Pro, £>-Pro-Ser-NH2, Tyr-Pro и Pro-Ser-NI I2 и аминокислот были синтезированы трипептиды, меченные тритием по Pro2.
Синтез меченных тритием типептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 проводили в соответствии со схемой 2.
схема 2
/Р О ,0 о
?Нз / /Р XC"~"g-CH"ci-NH2 сн3 О о c-nh-ch-c~nh2 H3C-C-0-c-nh-ch-C1n^\ н сн2 НзС-C-O-C-NH-CH-C^ ?-- '
СИ, I \ I/ Atr Лл — i. ^ /
N > V«2 НзС-и-и-С-МН-Ш-^ 3Н сн2
H2C V_J 0Н СНз Н2С \ Т он
'H2,Pd0/BaS04 Í^N зн HC1
о о о 0
0=l о X—N-CH-títNH2 0=9
H3C-ÓCH3 h2N.CH-C^N^N.'h 9Н2 HjC 9сНз
CHi 'ЬС \_/ '
НС1 tH3
Зн
он
Использование для введения тритиевой метки твердофазного и жидкофазного гидрирования дегидропролинового предшественника Вос-Туг(Вос)-Ш,-3,4-ДРго-8ег-1Ш2 газообразным тритием в присутствии катализатора показало, что с точки зрения оптимального сочетания выхода и молярной радиоактивности целевого пептида наилучшим синтетическим методом является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития (растворитель - диоксан, катализатор - РсЮ (5%)/Ва804 (95 %), 3 ч при комнатной температуре). Смесь меченых диастереомеров деблокировали и разделяли методом ВЭЖХ, что позволило получить меченые пептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-МН2 и Туг-[3,4-3Н]-Л-Рго-Зег-ЫНг с молярной радиоактивностью - 35 Ки/ммоль, достаточной для проведения исследований распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов.
2. Изучение анальгетической активности пептидов
Изучение анальгетической активности пептидов осуществляли на самцах нелинейных крыс массой 180-250 г и беспородных мышей массой 20-22 г. При оценке болевой чувствительности в тесте отдергивания хвоста учитывали латентный период отдергивания хвоста крысы после погружения его в горячую воду (t° = 56 °С) (ETAmor, 1941). При оценке болевой чувствительности в тесте уксусных корчей регистрировали число корчей у мышей за 30 мин после внутрибрюшинного введения 0.6 % раствора
уксусной кислоты (Chernov et. al., 1967). Пептиды вводили внутрибрюшинно в диапазоне доз 0.1-10 мг/кг веса животного в виде водного раствора за 20 минут до тестирования. Животным опытной группы вводили раствор пептида, а контрольной - эквивалентный объем физраствора.
Влияние трипептидов на соматическую болевую чувствительность оценивали с помощью теста отдергивания хвоста, который характеризует болевую реакцию на раздражение терморецепторов кожи. В результате этого действия возникает спинапьный флексорный (или сгибательный) рефлекс, направленный на устранение хвоста из области повреждающего воздействия. Наличие анальгетического действия проявляется в увеличении времени реакции животного (латентный период) на болевой раздражитель (Bars etal., 2001).
С использованием теста отдергивания хвоста, установлено, что трипептиды Туг-Рго-Ser-NH2 и Tyr-jD-Pro-Ser-NHb в дозах 0.1, 1.0 и 10.0 мг/кг обладают анальгегической активностью. Достоверные отличия латентного периода от контрольной группы наблюдаются через 20,40, 60 и 90 мин после введения всех исследуемых доз трипептидов.
Дерморфин проявляет анальгетическое действие в дозах выше 1 мг/кг. [£>-Рго6]-дерморфин обладает дозо-зависимым анальгетическим эффектом при введении в дозах 0.1 - 10 мг/кг. Так, при введении 0.1 и 1.0 мг/кг доз пептида достоверные отличия регистрировались через 20, 40, 60 и 90 мин, а 10.0 мг/кг - через 20, 40, 60, 90 и 120 мин (таблица 1).
Таблица 1 - Влияние дерморфина, [£)-Ргоб]-дерморфина и их С-концевых
трипептидов на болевую чувствительность в тесте уксусных корчей
Вещество Доза пептида (мг/кг) % от контрольной группы
Контроль (уксусная кислота) 0 100
0.1 42.7*
Дерморфин 1.0 18.9*
10.0 0*
0.1 22.3 *
[£)-Ргоб]-дерморфин 1.0 24.0*
10.0 5.0*
0.1 34.8*
Tyr-Pro-Ser-NH2 1.0 21.3 *
10.0 6.4*
0.1 28.1 *
Tyr-Z>-Pro-Ser-NH2 1.0 26.8*
10.0 1.2*
Примечание: * - достоверность отличий от контроля по U-критерию Вилкоксона-Манна-
Уитни при р<0.05.
Болевая реакция в тесте уксусных корчей возникает вследствие комплексного воздействия на рецепторы висцеральных органов протонами (Н+) и медиаторами воспаления (Bars et al., 2001). Исследования показали, что число корчей за 30 мин в контрольной группе животных составило 38.5±10.1. Трипептид Tyr-Pro-Ser-NH2 дозо-зависимо достоверно снижал количество корчей. Введение 0.1, 1.0 и 10.0 мг/кг доз пептида уменьшало число корчей на 65.2, 78.7 и 93.6 % соответственно. Аналогичный анальгетический эффект установлен и для Tyr-D-Pro-Ser-NH2, который достоверно уменьшал число уксусных корчей при введении 0.1, 1.0, 10.0 мг/кг на 71.9, 73.2 и 98.8 % соответственно.
Введение дерморфина дозо-зависимо уменьшало число корчей. Так, при введении дозы 0.1 мг/кг этого пептида количество корчей уменьшалось на 57.3 %, 1.0 мг/кг - на 81.1 %, а в дозе 10.0 мг/кг - полностью устранялись болевые реакции. При введении [D-Рго6]-дерморфина в дозах 0.1 и 1.0 мг/кг достоверно уменьшается число корчей на 77.7 % и 76.0 % соответственно, а в дозе 10.0 мг/кг - на 95 %.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и TyixD-Pro-Ser-NIb в тесте отдергивания хвоста и уксусных корчей обладают анальгетическим действием, сравнимым с таковым для дерморфина и [£)-Рго6]-дерморфина. Стереохимическая модификация Pro2 трипептида Tyr-Pro-Ser-NHb не приводит к значительному изменению анальгетической активности в отличие от модификации Pro6 дерморфина. Полученные в работе результаты позволяют предположить возможность применения Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в качестве пептидных анальгетиков.
Влияние антагонистов опиодных рецепторов на анальгетическую активность пептидов
Неселективный антагонист |0.-, 5-, к-, и с-опиоидных рецепторов налоксон (Santos-Arteaga et al., 2003) уменьшает анальгетическое действие Tyr-Pro-Ser-NH2 на 54.1 %, а периферический неселективный антагонист ц-, 8-, к- и о-опиоидных рецепторов налоксон метиодид (Ji et al., 2006) - на 48.5 %. Совместное введение Tyr-D-Pro-Ser-NH2 с налоксоном снижает анальгетическую активность на 55.7 %, а одновременное введение с налоксоном метиодидом - на 44.8 %. Таким образом, в тесте отдергивания хвоста налоксон и налоксон метиодид при одновременном введении с пептидами полностью не устраняют анальгетическую активность последних. Аналогичные результаты были получены для дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина. Вероятно, в механизме анапьгетического действия изучаемых пептидов в тесте соматической боли участвует не только опиоидергическая система организма.
В тесте уксусных корчей налоксон и налоксон метиодид полностью устраняли анальгетическое действие Туг-Рго-8ег-]ЧН2, Туг-О-Рго-Бег-Т^Нг , дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина. Следовательно, в механизме анапьгетического действия изучаемых пептидов в тесте висцеральной боли участвует только опиоидергическая система организма.
Не выявлено существенных различий в эффективности блокирования анальгетического действия пептидов налоксоном, проникающим через ГЭБ, и налоксон метиодидом, не проникающим через ГЭБ. Это свидетельствует о преимущественно периферическом анальгетическом механизме действия пептидов.
Таким образом, можно предположить, что при раздражении висцеральных рецепторов кислотой в обезболивающем действии пептидов принимают участие периферические налоксон-чувствительные механизмы. При термическом раздражении рецепторов хвоста, являющихся рецептивным полем спинального флексорного рефлекса, обезболивающее действие пептидов связано не только с периферическим налоксон-чувствительным, но и налоксон-нечувствительным механизмом.
3. Изучение распределения по органам и динамики выведения пептидов
Изучение распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-1КН2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-МН2 проводили на самцах беспородных белых крыс весом 200±20 г. Животным однократно внутримышечно вводили водные растворы (200 мкл) смеси 200 мкКи (0.06 мкмоль) меченого (35 Ки/ммоль) и 198 мкг (0.54 мкмоль) нерадиоактивного пептидов. Динамику выведения пептидов оценивали по результатам анализа образцов крови и органов крыс. Выделение пептидной фракции проводили твердофазной экстракцией, предварительную очистку и анализ - методом ВЭЖХ.
Показано, что после внутримышечного введения трипептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-1ЧН2 и Туг-[3,4-3Н]-Д-Рго-8ег-1ЧН2 присутствуют в крови только в течение пяти минут, причем их концентрация составляет 0.31 %. Это свидетельствует о быстром выведении трипептидов из крови в другие органы, а также их протеолизе под действием ферментов плазмы крови.
Основное накопление трипептида Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-МН2 наблюдается в почках: через 5 минут после введения концентрация пептида составляет 0.84 %, а через 20 минут уже 3.58 %, затем через 80 минут содержание постепенно снижается до 0.23 %. В этот период трипептид уже отсутствует в крови. Аналогичная динамика накопления и выведения трипептида наблюдается в печени и легких. Незначительное количество
трипептида проникает в мозг, при этом наибольшая концентрация отмечается через 20 минут после введения (рисунок 1).
Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными для дерморфина. Показано, что при внутрибрюшинном введении дерморфина основное его количество аккумулируется в почках и печени, где он накапливается и подвергается действию пептидаз и лишь его незначительная часть (0.0005 %) проникает в мозг (Negri and Improta, 1984).
Трипептид Tyr-[3,4-3H]-£>-Pro-Ser-NH2 имеет сходную фармакокинетику с Туг-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и также накапливается в крови только в течение первых 5 минут после введения, при этом концентрация в крови через 5 минут как L-, так и D-изомера различается незначительно.
Иная тенденция отмечается в почках: максимальное количество обоих изомеров отмечается через 20 минут, однако концентрация D- превышает концентрацию L-стереоизомера. Это обстоятельство обусловлено присутствием ¿»-аминокислотного остатка в молекуле трипептида и меньшей скоростью протеолиза (рисунок 1). Аналогичная динамика накопления и выведения трипептида отмечается и в легких.
0,35
0,30
jo 0,25 <а
| 0,20 -га
| 0,15 О 0,10 0,05
0,00
Н 5 мин И 20 мин □ 40 мин
а б
Рисунок 1 - Изменение во времени содержания Н-Туг-[3,4-3Н]Рго-8ег-ЫН2 в легких, мозге, сердце (а) и печени, почках, крови (б)
Следует отметить, что во всех органах аккумулируется значительно больше £>-, чем ¿-трипептида. Так, в сердце в течение первых 5 мин наблюдается почти одинаковое накопление как Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-ЫН2, так и Туг-[3,4-3Н]-0-Рго-8ег^Н2, но затем содержание Тут-[3,4-3Н]-Рго-8ег-КН2 быстро падает, в то время как содержание
Туг-[3,4-3Н]-£1-Рго-8ег-КН2 остается практически неизменным (рисунки 1 и 2). Таким образом, можно сделать утверждение о том, что О- и ¿-стереоизомеры с одинаковой скоростью проникают в кровь, накапливаются в органах, способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и накапливаться в мозге. При исследовании метаболизма трипептидов в органах и крови крыс не удалось детектировать какие-либо радиоактивные метаболиты, кроме изомерных Ь- и £>-пролинов. Это наблюдение, возможно, указывает на высокую скорость протеолитической деградации трипептидов по обеим пептидным связям, независимо от конфигурации пролина.
Рисунок 2 - Изменение во времени содержания Н-Туг- [3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 в легких, мозге, сердце (а) и печени, почках, крови (б)
Во всех тканях крысы образование меченого пролина из L- идет быстрее, чем О-Рго из £>-стереоизомера, что, по-видимому, связано с меньшей скоростью метаболизма D-трипептида. Поэтому меньшее содержание L-трипептида в мозге крысы обусловлено более быстрым его протеолизом. Суммарное количество радиоактивности в мозге крысы в системе Z-трипептид плюс Pro и в системе £>-трипептид плюс D-Pro практически одинаковое. Это может быть связано с тем, что оба изомера трипептида проникают в мозг крысы в одинаковом количестве после их внутримышечного введения, а через 5 минут после введения (первая временная точка) двукратное преобладание D-трипептида связано с более быстрым протеолизом ¿-трипетида.
Исследования показали, что стереохимическая модификация Pro2 влияет на скорость метаболизма, следовательно, этот аминокислотный остаток играет важную роль в устойчивости молекулы трипептидов к воздействию протеолитических ферментов.
Накопление во всех органах и крови крысы большего количества £>-трипептида, чем Ь-трипептида является важным доказательством большей устойчивости к протеолизу пептида, содержащего ¿»-аминокислотный остаток пролина.
4. Изучение рецеиторного механизма действия пептидов
Оценку способности трипептидов взаимодействовать с рецепторами головного мозга крысы проводили радиорецепторным методом, используя Р2 - мембранную фракцию, полученную по стандартной методике (Беляев и др., 1990). Для постановки микроварианта радиорецепторного анализа применяли плоскодонные планшеты "Limbro" (Великобритания), которые практически не сорбируют меченые лиганды. В работе изучали конкурентное связывание меченных тритием пептидов Tyr-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2, Tyr-[3,4-3H]-£>-Pro-Ser-NH2, [3Н]-дерморфина и [3Н]-дерморфина-(1-4). Определение концентрации белка в инкубационной смеси проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1958) с использованием реагентов фирмы «Sigma» (США) на спектрофотометре фирмы «Perkin-Elmer» (ФРГ). Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (BSA).
С помощью радиорецепторного анализа на плазматических мембранах головного мозга крыс было показано, что специфическое связывание (SB), определенное как разница между общим (ТВ) и неспецифическим (NB) связыванием на плазматических мембранах головного мозга крыс, в присутствии избытка (5 мкМ) немеченого лиганда составило в среднем 60 % от ТВ. Исследование кинетики связывания Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Туг-с плазматическими мембранами при 25 °С показало, что SB возрастает в течение первых 10 минут, но затем оно быстро уменьшается и через 20 минут в инкубационной смеси не обнаруживается связанного лиганда (рисунок 3).
В 550 ? 500
» 400 S
8 350
Î 300
8 250
| 200 -& 150
5
g 100
6 50
о
Î
I
-4,
/К \
чк
Время, мин
- Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 ■--»-■ Tyr-[3,4-3H]-D-Pio-Ser-NH2
Рисунок 3 - Кинетика связывания Tyr-[3,4- H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-D-Pro-Ser-NH2 при 25 ° С
Это можно объяснить низкой устойчивостью трипептидов к ферментам, присутствующим в инкубационной смеси, поэтому в дальнейшей работе в качестве известного лиганда опиоидных рецепторов был выбран [3Н]-дерморфин и проводилось исследование конкурентного вытеснения [3Н]-дерморфина* трипептидами Туг-Рго-Зег-и Туг-Д-Рго-Зег-ИНг на плазматических мембранах головного мозга крысы. Изучение кинетики связывания [3Н]-дерморфина Р2 мембранной фракцией головного мозга крысы показало, что равновесное насыщение наступает через 20 мин (рисунок 4, б). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными (АгтсЬе й а1., 1988).
Исследования по выявлению специфического связывания [3Н]-дерморфина при его различных концентрациях с плазматическими мембранами головного мозга крысы показали, что дерморфин имеет две участка насыщения, соответствующие областям 1.5-3 нМ и >5 нМ. (рисунок 4, а).
"д 0,0005
1 2 3 4 5 6 7 Концентрация [3Н]-дерморфина, нМ
—»—контроль - - - Туг-О-Рго-Зег-ЫШ — — Туг-Рго-Зег-Ш2
а
Рисунок 4- Зависимость специфического связывания [3Н]-дерморфина от концентрации в присутствии 5 мкМ дерморфина (контроль), Туг-Рго-Зег-ИНг и Туг-£>-Рго-8ег-1Ш2 (а) и кинетика связывания [3Н]-дерморфина при 25 °С (б)
Анализ кривой насыщения в координатах Скэтчарда также подтвердил наличие двух участков связывания [3Н]-дерморфина. Первому соответствует константа связывания К<| = 0.26 ± 0.07 нМ и концентрация рецепторов Вшах = 24.12 ± 0.66 фмоль/мг белка, второму - Ка=1.70 ± 0.01 нМ и концентрация рецепторов Вшах = 52.94 ± 4.4 фмоль/мг белка. Таким образом, полученные результаты противоречат данным, приведенным в
*[3Н]-дерморфин (Туг-/)-А1а-РЬе-С1у-Туг-[3,4-5Н]-Рго-8ег-ЫН2) был любезно предоставлен В.П. Шевченко (Институт молекулярной генетики РАН)
0,00012 -0,00011 -0,0001
0,00009 - \ 0,00008 \ J 0,00007 ' \ ¡2 0,00006 " \ . J 0,00005 " \
0,00004 - \
0,00003 j ——_____\
0,00002 - _ 0,00001 - Л. ~ --
О 10 20 30 40 50 60
LR, фмоль
Рисунок 5 - Зависимость специфического связывания [3Н]-дерморфина в координатах Скэтчарда
(Amiche et al.,1987; 1988; 1990), где было показано наличие только одного участка специфического связывания дерморфина с рецепторами головного мозга крысы и определена константа связывания, варьирующая от Kd=0.86 нМ до K,j=0.46 нМ (рисунок 5).
Полученные отличия можно объяснить тем, что дерморфин под действием ферментов гомогената мозга гидролизуется с преимущественным образованием N-концевого тетра- и С-концевго трипептидов (Negri and Improta, 1984). Использование меченного тритием дерморфина с меткой по Туг и Туг5 (Amiche et al., 1987; 1988; 1990), содержащейся как в iV-концевом тетра-, так и в С-концевом трипептиде будет показывать наличие одного участка связывания. Использование широкого набора ингибиторов полностью не исключает возможность образования фрагментов [3Н]-дерморфина в инкубационной среде. Можно предположить, что образующийся при гидролизе [3Н]-дерморфина меченый тритием С-концевой трипептидный фрагмент также взаимодействует с рецепторами. Имеются сведения о том, что некоторые гептапептидные аналоги дерморфина, такие как [Ьуз(2)?]-дерморфин, [des-Gly3, Туг4, Pro5, Asn6]-дерморфин, а также пентапептиды [Туг5-МН2]-дерморфин-(1-5) и [Trp4, Asn5-OH]-дерморфин-(1-5) также имеют два участка связывания (Attila et al., 1993).
Для изучения способности С-концевых трипептидов взаимодействовать с местами связывания дерморфина исследовали возможные изменения специфического связывания [3Н]-дерморфина в концентрациях, соответствующих «высоко» (0.5 нМ) и «низкоаффинным» (5 нМ) местам связывания в присутствии Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2. Кривые вытеснения 0.5 нМ [3Н]-дерморфина немеченым дерморфином, Туг-Рго-Ser-NH2 и Tyr-ß-Pro-Ser-NH2 представлены на рисунке 6. Как видно из рисунка, трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 начинают вытеснять [3Н]-дерморфин уже в наномолярной области концентраций и достигают максимального эффекта в
микромолярной. Кривые вытеснения [3Н]-дерморфина обоими трипептидами выходят на плато, соответствующее 50 % специфического связывания.
Концентрация немеченых лигандов, нМ —«— контроль - - ♦ ■ ■ Tyr-Pro-Ser-NH2 - - Tyr-D-Pro-Ser-NH2
Рисунок 6 - Вытеснение 0.5 нМ [3Н]-дерморфина немеченым дерморфином (контроль), Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 Как показал анализ кривой насыщения [3Н]-дерморфина в координатах Скэтчарда,
плотность его «высокоаффинных» мест связывания с мембранной фракцией в 2 раза ниже,
чем «низкоаффинных». По-видимому, трипептиды вытесняют [3Н]-дерморфи№ только из
«высокоаффинных» мест связывания, в первую очередь оккупируемых [3Н]-дерморфином
при использовании его в концентрации 0.5 нМ. По данным, представленным на рисунке 6,
1С5о немеченого дерморфина составила 0.5 нМ, а IC50 для Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 составила
5±1 мкМ, для Tyr-Pro-Ser-NH2 - 8±2 мкМ. г.
Кривые вытеснения 5 нМ [3Н]-дерморфина немеченым дерморфином, Tyr-Pro-Ser-
NH2, Tyr-D-Pro-Ser-Nfflb и DAGO представлены на рисунке 7. Можно предположить, что
при концентрации 5 нМ [3Н]-дерморфин в большей степени связывается с
«низкоаффинными» участками насыщения. Немеченый дерморфин и DAGO дозо-
Концентрация немеченых лигандов, нМ -Ф-контроль — -♦ — Tyr-D-Pro-Ser-NH2 - - ♦ - ■ Tyr-Pro-Ser-NH2 — - DAGO
Рисунок 7 - Вытеснение 5 нМ [3Н]-дерморфина, немеченым дерморфином (контроль), Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Pro-Ser- NH2 и DAGO
зависимо ингибируют связывание [3Н]-дерморфина с рецепторами (1С5о составляет 5.0 и 4.8 нМ, соответственно). В то же время Туг-Рго-вег-КИг и Туг-£>-Рго-8ег->Ш2 практически не влияют на связывание [3Н]-дерморфина с «низкоаффинными» участками насыщения. Только при концентрациях трипептидов, намного превышающих концентрацию меченого дерморфина, наблюдается некоторое его вытеснение. Это предположение подтвердилось при построении кривых насыщения [3Н]-дерморфина в присутствии трипептидов в высоких концентрациях.
Для изучения способности С-концевых трипептидов взаимодействовать с местами связывания Ж-концевого фрагмента дерморфина проводили радиорецепторный анализ меченного тритием [3Н]-Туг-£>-А1а-РЬе-С1у-ЫН2 ([3Н]-дерморфин-(1-4))*. Изучение кинетики связывания [3Н]-дерморфина-(1-4) показало, что при 25 °С равновесное насыщение наступает через 15 мин (рисунок 8, б).
Кривые вытеснения 5 нМ [3Н]-дерморфина-(1-4) дерморфином, Туг-Рго-вег-МНг, Туг-Л-Рго-Бег-МНг представлены на рисунке 8, а. Как видно из результатов, дерморфин дозо-зависимо ингибирует связывание [3Н]-дерморфина-(1-4), при этом С-концевые трипептиды Туг-Рго-Зег-ЫНг и Туг-Д-Рго-Бег-ИНг никак не влияют на связывание [3Н]-дерморфина-(1-4), что может свидетельствовать о взаимодействии с разные местами связывания, при этом трипептиды не имеют сродства к местам связывания Л^-концевого тетрапептида Туг-£)-А1а-Р11е-01у-ЫН2.
—♦-контроль --♦--дерморфин
---♦... Туг-Рго-Зег-1Ш2 - -Туг-»Рго-Зег-МН2 Время, мин
а б
Рисунок 8 - Вытеснение 1 нМ [3Н]-дерморфина-(1-4) дерморфином-(М) (контроль), дерморфином, Туг-Рго-вег-МНг и Туг-Д-Рго-Бег-ЖЬ (а) и кинетика связывания [3Н]-дерморфина-(1-4) при 25 °С (б)
*[3Н]-дерморфин-(1-4) был любезно предоставлен Ю.А. Золотаревым (Институт молекулярной генетики РАН)
Таким образом, можно предположить, что из обнаруженных двух мест специфического связывания дерморфина «низкоаффинные» являются местами N-концевого, а «высокоаффинные» - отражают рецепторное связывание его С-концевого фрагмента. Поскольку фармакологические эффекты дерморфина и С-концевых трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 блокируются антагонистами опиоидных рецепторов, а дерморфин имеет наибольшее сродство и избирательность к ц-опиоидным рецепторам (Melchiorri and Negri, 1996), можно предположить, что исследуемые трипептиды взаимодействуют с опиоидными рецепторами.
Итак, при исследовании влияния С-концевого фрагмента дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH2 на рецепторное связывание [3Н]-дерморфина установлена способность трипептидов взаимодействовать с высокоаффинными местами насыщения дерморфина. Можно предположить, что один из механизмов анальгетического действия С-концевых трипептидов связан с взаимодействием с опиоидергической системой организма.
5. Изучение взаимодействия с периферическими опиоидными рецепторами
Взаимодействие с периферическими опиоидными рецепторами исследуемых соединений оценивали по их способности ингибировать стимулируемое электрическими импульсами сокращение препаратов, полученных из гладкой мышечной мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (¡i-опиоидныс рецепторы) и семявыносящего протока мыши (8-опиоидные рецепторы) (Hughes et al., 1975; Lemaire et al., 1978). Сравнительную оценку опиоидной активности дерморфина, [Д-Рго6]-дерморфина и их С-концевых трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 проводили по показателю концентрации ингибирования 1С5о.
Специфическое связывание пептидов с периферическим опиоидными рецепторами определяли по изменению амплитуды сокращения препаратов, полученных из гладкой мышечной мускулатуры подвздошной кишки морской свинки (ц-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (5-опиоидные рецепторы) после добавления исследуемого вещества. Для построения кривых ингибирования использовали пептиды дерморфин, [D-Рго6]-дерморфин, Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 в концентрациях от 1 нМ до 1000 мкМ.
Данные расчета концентраций ингибирования (IC50) количественно показали, что дерморфин и [£>-Рго6]-дерморфин уменьшают амплитуду сокращения препаратов ПКМС в два раза в наномолярной области: их IC50 составляют 26 ± 5 и 30 ± 6 нМ соответственно.
Концентрация ингибирования 1С5о препарата СПМ составляет для дерморфина 90 ± 19 и
[£>-Рго6]-дерморфина - 87 ± 11 нМ (таблица 2).
Таблица 2 - Взаимодействие дерморфина, [£>-Рго6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов с периферическими опиоидными рецепторами препаратов ПКМС и СПМ
Пептид Концентрация ГС50
11 5 ц/5
Дерморфин 26 ± 5 нМ 90 ± 19 нМ 0,29
[£>-Рго6]-дерморфин 30 ± 6 нМ 87 ± 11 нМ 0,34
Туг-Рго-Эег-Шг 33 ± 9 мкМ 650 ± 65 мкМ 0,07
Туг-£>-Рго-8ег-Ш2 40 ± 6 мкМ 530 ±60мкМ 0,057
Трипептиды Туг-Рго-8ег-№12 и Туг-£>-Рго-8ег-ЫН2 снижают амплитуду сокращений препаратов СПМ и ПКМС только в микромолярной концентрации, при этом их ингибирующий эффект гораздо менее выражен, чем у дерморфина и [£>-Ргоб]-дсрморфина. Трипептиды взаимодействуют преимущественно с ц-, чем с 6- рецепторами: при добавлении Туг-Рго-Зег-МНг эффект больше в 14 раз, Туг-£>-Рго-8ег->Ш2 - в 25 раз. Установлено, что физиологический эффект всех пептидов обратим и снимается при добавлении в камеру раствора налоксона. Таким образом, можно предполагать, что механизм анальгетического действия трипептидов Туг-Рго-Бег-ОТг и Туг-1)-Рго-8ег-МН2 возможно связан с их влиянием на опиоидергическую систему организма.
Заключение
Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о высокой биологической активности трипептидов Туг-Рго-Бег-МЬ и Туг-£>-Рго-8ег-МН2, а, следовательно, и важности С-концевого участка молекулы дерморфина на проявление его физиологической активности. Химическим синтезом были получены два стереоизомера трипептидов, их ненасыщенный аналог и меченные тритием по пролину трипептиды. Было установлено, что трипептиды Туг-Рго-8ег->Ш2 и Туг-£>-Рго-8ег-КН2 проявляют анальгетическую активность, доказанную тестами отдергивания хвоста и уксусных корчей. Анальгетический эффект трипептидов сравним с таковым для дерморфина и его стереоизомера [£>-Рго6]-дерморфина, и блокируется антагонистами опиоидных рецепторов. Это свидетельствует о возможном участии опиоидергической системы в механизме анальгетического действия трипептидов.
Трипептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-Ш2 и Туг-[3,4-3Н]-£»-Рго-8ег-Ш2 после внутримышечного введения попадают в кровяное русло, способны преодолевать
гематоэнцефалический барьер и проникать в мозг и другие органы. Радиорецепторными исследованиями выявлены два центра связывания дерморфина на плазматических мембранах головного мозга крыс, при этом С-концевые фрагменты Туг-Рго-Зег-М-Ь и Туг-Д-Рго-8ег-ЫН2 взаимодействуют преимущественно с «высокоаффинными» местами насыщения [3Н]-дерморфина и не влияют на связывание ¿У-концевого фрагмента дерморфина [3Н]-Туг-£>-А1а-РЬе-01у-КН2. Изученные трипептиды с низким сродством взаимодействуют с периферическим ц-опиоидными рецепторами и не взаимодействуют с 8-опиоидными рецепторами. В заключение можно сказать, что трипептиды Туг-Рго-Зег-1ЧН2 и Туг-Д-Рго-Эег-КНг могут быть предложены в качестве основы для создания новых анальгетиков.
ВЫВОДЫ
1. Синтезированы трипептиды Туг-Рго-8ег-?Ш2, Туг-О-Рго-Эег-МНг, Туг-£>1-ДРго-8ег-1ЧН2 и тетрапептид Ту1ч0-А1а-Р11е-01у-МН2, методами смешанных ангидридов и активированных эфиров в количествах, необходимых для проведения биологических исследований.
2. Получены меченные тритием Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-КН2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег->1Н2 и установлено, что наилучшими условиями синтеза с точки зрения оптимального сочетания выхода и молярной радиоактивности является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.
3. Показано, что в тестах соматической и висцеральной боли анальгетическое действие Тут-Рго-Зег-ЫНг и Туг-0-Рго-8ег-КН2 сравнимо с активностью дерморфина и [О-Рго6]-дерморфина. Анальгетический эффект Туг-Рго-Зег-ИНг, Туг-0-Рго-8ег-МН2, дерморфина и [Г>-Рго6]-дерморфина блокируется неселективными антагонистами опиоидных рецепторов налоксоном и налоксоном метиодидом. Результаты свидетельствует о том, что анальгетическое действие трипептидов реализуется через опиоидергическую систему организма.
4. Изучена кинетика распределения и накопления трипептидов Туг-[3,4-3Н]-Рго-Бег-МНг и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-МН2 в организме крысы. Максимальное накопление меченых трипептидов наблюдается в печени и почках. Единственными детектируемыми радиоактивными метаболитами является [3,4-3Н]Рго и [3,4-3Н]-0-Рго.
5. Показано, что трипептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-]ЧН2 и Туг-[3,4-3Н]-£»-Рго-8ег-Ш2 способны проникать в мозг крысы.
6. Установлено, что дерморфин имеет два места связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы.
7. Трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-ß-Pro-Ser-NH2 имеют места специфического связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы. Оба изомера связываются с высокоаффинными местами связывания дерморфина и не взаимодействуют с низкоаффинными. Трипептиды не взаимодействуют с местами связывания дерморфина-(1-4).
8. Трипептиды Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NPh обладают меньшим сродством (ICso около 1(Г5 М) к периферическим |1-опиоидным рецепторам препарата ПКМС по сравнению с дерморфином и [£>-Рго6]-дерморфином (IC50 около 10"9 М) и, в отличии от дерморфина и [¿)-Рго6]-дерморфина, не взаимодействуют с 8-опиоидными рецепторами препарата СПМ.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Громовых П.С., JI.C. Гузеватых, К.В. Шевченко, JI.A. Андреева, Л.Ю. Алфеева, В.П. Шевченко, И.Ю. Нагаев, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов. Синтез, фармакокинетика и метаболизм С-концевого трипептида дерморфина и его диастереомера //Биоорганическая химия. 2007. Т.ЗЗ. № 6. С. 581-587.
2. Громовых П.С., Гузеватых J1.C., Шевченко К.В., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием фрагментов дерморфина и исследование кинетики распределения радиоактивности в органах крысы при их внутримышечной инъекции. //Радиохимия. 2007. Т. 49. № 1. С. 93-95.
3. Гузеватых JI.С., Воронина Т.А., Емельянова Т.Г., Андреева JI.A., Громовых П.С., Мясоедов Н.Ф., Середенин С.Б. Сравнительный анализ анальгетической активности дерморфина, [£>-Рго6]-дерморфина и их С-концевых трипептидов //Известия РАН. Серия биологическая. 2007. Т 5. С. 1-6.
4. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля A.A., Гузеватых JI.C., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Использование меченного тритием дерморфина для исследования взаимодействия С-концевого фрагмента дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-£>-Pro-Ser-NH2 с опиоидными рецепторами. //Доклады Академии наук. 2008. Т. 419. № 2. С. 276-278.
5. Громовых П.С., Шевченко К.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Синтез С-концевых аналогов дерморфина и исследование фармакокинетики и метаболизма при внутримышечном введении этих пептидов. //Материалы Четвертого съезда Общества биотехнологов России. Пущино. 2006. С. 58.
6. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля A.A., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. Использование меченного
тритием дерморфина для исследования взаимодействия С-концевого аналога дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-D-Pro-Ser-NH2 с опиоидными рецепторами. //Тезисы III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. 2007. С. 66. 7. Громовых П.С., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А. А., Гузеватых JI.C., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П. Использование меченного тритием Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 для изучения его рецепторного связывания с мембранной фракцией головного мозга крыс. //Тезисы III Российского симпозиума «Белки и пептиды». Пущино. 2007. С. 67.
Заказ № 179/04/08 Подписано в печать 21.04.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5
ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Громовых, Петр Сергеевич
Введение
1 Обзор литературы
1.1 Боль, система ноцицепции и антиноцицепции
1.2 Опиоидные рецепторы
1.3 Анальгетики
1.3.1 . Опиоидные. анальгетики
1.3.2 Нестероидные противовоспалительные средства
1.3.3 Опиоидные пептиды
1.4 Природные дерморфины
1.4.1 Фармакокинетика и фармакодинамика дерморфинов
1.4.2 Физиологические свойства дерморфинов
1.5 Синтез дерморфипа и его аналогов
1.6 Основные методы введения тритиевой метки в органические 52 соединения /
2 Экспериментальная часть
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Синтез дипептидов
2.1.2 Синтез трипептидов
2.1.3 Синтез тетрапептида
2.2 Исследование кинетики распределения меченых 76 трипептидов в органах и крови крысы
2.3 Исследование анальгетической активности пептидов
2.4 Проведение радиорецепторного анализа
2.5 Изучение взаимодействия с периферическими опиоидными 83 рецепторами
3 Результаты и их обсуждение , 86 3.1 Химический синтез пептидов и их меченых аналогов
3.1.1 Получение трипептидов
3.1.2 Получение меченых аналогов трипептидов
3.2 Исследование анальгетической активности и кинетики 99 распределения в организме С-концевых фрагментов дерморфина
3.2.1 Влияние пептидов на соматическую болевую 100 чувствительность
3.2.2 Влияние пептидов на висцеральную болевую 106 чувствительность
3.2.3 Оценка влияния антагонистов опиоидных рецепторов на 108 анальгетическое действие пептидов
3.3 Изучение распределения по органам и динамики выведения 113 пептидов
3.4 Изучение взаимодействия дерморфина, |Т)-Рго6]-дерморфина 124 и их С-концевых фрагментов с опиоидными рецепторами
3.4.1 Радиорецепторный анализ
3.4.2 Изучение взаимодействия с периферическими опиоидными 134 рецепторами
Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и исследование биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина"
Боль является одной из наиболее частых причин обращения людей за медицинской помощью (Павленко и др. 2002; Gureje et al., 2001), поэтому проблема создания высокоэффективных и безопасных болеутоляющих средств сохраняет свою актуальность. В настоящее время терапия острой и хронической боли основывается на применении трех основных групп лекарственных средств: опиоидов, нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), и группы веществ из других фармакологических классов, обладающих в качестве побочного эффекта обезболивающим действием (антидепрессанты, антиконвульсанты, местные анестетики, агонисты а.2-адренорецепторов и т.д.). Традиционные подходы в лечении болевых синдромов не всегда дают желаемого результата и сопряжены с риском возникновения побочных эффектов.
Наиболее эффективными анальгетиками при лечении большинства тяжелых болевых синдромов (онкологические, постоперационные боли и т.д.) по-прежнему остаются опиоиды, несмотря на то, что их применение ограничено риском развития лекарственной зависимости и эффектами, связанными с передозировкой. В регулировании различных систем организма, в том числе ноцицепции и антиноцицепции, участвуют эндогенные пептиды. Большинство природных пептидных соединений обладает полифункциональным действием, что затрудняет создание на их основе эффективных лекарственных препаратов, поэтому целесообразен поиск эндогенных опиоидных веществ, отвечающих за появление избирательного анальгетического действия.
Среди опиоидных пептидов уникальной структурой и самой высокой продолжительной анальгетической активностью обладает дерморфин (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2) (Basso et al., 1985; Stevens et al., 1986).
B руководстве работой принимала участие к. б. н. Гузеватых JI.C.
Однако, как и большинство эндогенных пептидов, дерморфин имеет широкий спектр физиологической активности: оказывает влияние на функции сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной и выделительной систем и влияет на различные формы поведения животных (Melchiorri and Negri, 1996). Подобная полифункциональность затрудняет создание селективного анальгетика на основе дерморфина. Для этого были проведены исследования, направленные на выявление минимального фрагмента дерморфина, сохраняющего анальгетическое действие. Путем укорачивания молекулы дерморфина с С-конца было установлено, что N-концевой тетрапептид Tyr-D-Ala-Phe-Gly является самым коротким фрагментом, сохраняющим биологическую активность (Broccardo et al., 1981). Сведения о биологических свойствах С-концевого трипептида и его стереоизомера Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 отсутствуют. Также было показано, что стереохимическая модификация Pro6 в молекуле дерморфина приводит к усилению анальгетической активности (Гузеватых и др. 2002), что указывает на значимость С-концевого участка гептапептида для проявления его обезболивающего действия.
Установлено, что при протеолизе дерморфина основное место разрыва цепочки ферментами гомогената мозга - связь Gly4-Tyr5, т.е. образуются N-концевой тетра- и С-концевой трипептиды (Negri and Improta, 1984). Поэтому в настоящее время С-копцевые фрагменты представляют большой интерес и являются объектом пристального изучения. Они могут быть использованы в качестве основы для создания новых анальгетиков. Для изучения пептидов этой группы необходимо получить их меченые аналоги, позволяющие исследовать взаимодействие пептидов с эндогенной опиоидной системой, изучить кинетику распределения и метаболизма в организме.
Цель работы. Синтез и изучение биологических эффектов С-концевых фрагментов дерморфина Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- синтез трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2, их ненасыщенного аналога для введения трития Tyr-DZ,-APro-Ser-NH2 и тетрапептида Tyr-D-Ala-Phe-Gly-NH2 в количествах, необходимых для проведения биологических исследований;
- получение меченных тритием трипептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и о
Tyr-[3,4- H]-£>-Pro-Ser-NH2 в количествах, необходимых для проведения биологических исследований;
- изучение распределения по органам и динамики выведения меченных тритием трипептидов Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-Z)-Pro-Ser-NH2 после однократного внутримышечного введения крысам;
- изучение анальгетической активности трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Туг-Z)-Pro-Ser-NH2 в сравнении с активностью дерморфина и дерморфина;
- изучение влияния антагонистов опиоидых рецепторов налоксона и налоксона метиодида на проявление анальгетического действия Tyr-Pro-Ser-NH2, Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2, дерморфина и [£>-Ргоб]-дерморфина;
- изучение взаимодействия Tyr-[3,4-3H]-Pro-Ser-NH2 и Tyr-[3,4-3H]-Z>-Pro-Ser-NH2 с плазматическими мембранами головного мозга крысы; л
- радиорецепторный анализ конкурентного вытеснения [ Н]-дерморфина и о Н]-дерморфина-(1-4) трипептидами Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2;
- изучение взаимодействия дерморфина, [£)-Ргоб]-дерморфина, Туг-Рго-Ser-NH2, и Tyr-Z>Pro-Ser-NH2, с периферическими опиоидными рецепторами препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки (ц-опиоидные рецепторы) и семявыносящего протока мыши (8-опиоидные рецепторы).
Защищаемые положения:
1. Оптимальными условиями синтеза С-концевых аналогов дерморфина, [£>-Рго6]-дерморфина, Tyr-Pro-Ser-NH2 и Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2 является синтез в растворе с использованием тетрабутиламмонийных солей, методов смешанных ангидридов и активированных эфиров.
2. Жидкофазное гидрирование - оптимальный метод введения тритиевой метки для трипептидов.
3. Анальгетическая активность С-концевых аналогов Туг-Рго-8ег-ЫН2, Туг-£-Рго-8ег-№-Ь и [£)-Рго6]-дерморфина сравнима с активностью природного дерморфина.
4. Трипептиды Туг-Рго-8ег-1\тН2, Туг-£)-Рго-8ег-МН2 имеют участки связывания с рецепторами ЦНС, взаимодействуя с высокоаффинными местами связывания дерморфина.
5. Анальгетическое действие дерморфина, [£)-Рго6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов связано с взаимодействием с опиоидной системой организма.
Научная новизна
Методами пептидного синтеза в растворе были получены трипептиды Туг-Рг6-8ег-МН2, Туг-0-Рго-8ег-]ЧН2, Туг-/31-ДРго-8ег-1ЧН2 и тетрапептид Туг-£-А1а-РЬе-01у-№12.
Впервые показано, что наилучшими условиями для получения меченых аналогов дерморфина является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.
Впервые исследовано распределение по органам и динамика выведения С-концевого фрагмента дерморфина Туг-Рго-8ег-МН2 и его стереоизомера Туг-£-Рго-8ег-№12 и установлено, что трипептиды способны проникать в мозг.
Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина Туг-Рго-8ег-1ЧН2, Туг-£)-Рго-8ег-ЫН2 обладают анальгетичесой активностью сопоставимой или превышающей активность дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина. Установлено, что анальгетический эффект дерморфина, [£)-Рго6]-дерморфина и их С-концевых фрагментов Туг-Рго-8ег-МН2, Туг-£)-Рго-8ег-ЫН2 уменьшается при совместном введении с налоксоном и налоксоном метиодидом, что может предполагать наличие одного из механизмов анальгетического действия С-концевых фрагментов дерморфина, связанного с влиянием на эндогенную опиоидную систему организма.
Впервые радиорецепторными исследованиями выявлены два центра связывания дерморфина с плазматическими мембранами головного мозга крыс. С-концевые фрагменты Туг-Рго-8ег-1ЧН2, Туг-£)-Рго-8ег-№-12 взаимодействуют преимущественно с «высокоаффинными» местами
3 3 насыщения [ Н]-дерморфина и не влияют на связывание [ Н]-дерморфина с «низкоаффинными» местами связывания.
Впервые показано, что трипепгиды Туг-Рго-8ег-ЫН2, Туг-0-Рго-8ег-ЫН2 не влияют на связывание А^-концевого фрагмента дерморфина [3Н]-Ту1чО-А1а-РЬе-01у-ЫН2 на плазматических мембранах головного мозга крыс.
Впервые показано, что С-концевые фрагменты дерморфина и дерморфина Туг-Рго-8ег-1ЧН2 и Туг-0-Рго-8ег-]\ГН2 имеют низкое сродство к периферическим \х- и 6-опиоидным рецепторам препаратов изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыпосящего протока мыши.
Практическая значимость
Подобраны условия химического синтеза С-концевых фрагментов дерморфина и их меченых аналогов. Отработанный метод получения меченных тритием пептидов может быть рекомендован для синтеза меченных тритием препаратов, применяемых в медико-биологических исследованиях.
Получены и исследованы новые пептиды, перспективные для создания на их основе анальгетиков нового поколения, с минимальным количеством побочных эффектов.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на четвертом Всероссийском съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), на третьем Российском симпозиуме «Белки и пептиды»
Пущино, 2007), на третьем Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), на семинарах сектора регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН.
Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 7 научных работ. В изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликовано 4 статьи.
Список используемых сокращений
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ГЭБ - гемато-энцефалический барьер ДМ - дерморфин
НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты
ОМР - относительная молярная радиоактивность
ОР - опиоидные рецепторы
ПКМС - подвздошная кишка морской свинки
РРА-радиорецепторный анализ
СПМ - семявыносящий проток мыши
ТГП - тест горячей пластины
ТОХ - тест отдергивания хвоста
ТСХ - тонкослойная хроматография
ТФУ - трифторуксусная кислота
ТЭА - триэтиламин
ЦНС - центральная нервная система
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
ВОС - mpem-бутилоксикарбонильная группа
BSA-бычий сывороточный альбумин
DALDA- [D-Arg2, Ьу54-]ЧН2]-дерморфин-(1-4)
DADLE - [£>-А1а, £>-Ьеи]-энкефалин
DAGO - [£>-А1а2, MePhe4, 01у-о15]-энкефалин
NB - неспецифическое связывание
SB — специфическое связывание
ТВ - общее связывание
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Громовых, Петр Сергеевич
ВЫВОДЫ:
1. Синтезированы трипептиды Туг-Рго-8ег-КН2, Туг-/)-Рго-8ег-ТчГН2, Туг-£)£-АРго-8ег-ЫН2 и тетрапептид Туг-/)-А1а-РЬе-С1у-ЫН2, методами смешанных ангидридов и активированных эфиров в количествах, необходимых для проведения биологических исследований.
2. Получены меченные тритием Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег->Ш2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-МН2 и установлено, что наилучшими условиями синтеза с точки зрения оптимального сочетания выхода и молярной радиоактивности является жидкофазное гидрирование в атмосфере газообразного трития.
3. Показано, что в тестах соматической и висцеральной боли анальгетическое действие Туг-Рго-8ег-1ЧН2 и Туг-/}-Рго-8ег-ЫН2 сравнимо с активностью дерморфина и [£>-Рго6]-дерморфина. Анальгетический эффект Туг-Рго-8ег-ТМН2, Туг-/}-Рго-8ег-1ЧН2, дерморфина и [£)-Ргоб]-дерморфина блокируется неселективными антагонистами опиоидных рецепторов налоксоном и налоксоном метиодидом. Результаты свидетельствует о том, что анальгетическое действие трипептидов реализуется через опиоидергическую систему организма.
4. Изучена кинетика распределения и накопления трипептидов Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-КН2 и Туг-[3,4-3Н]-£>-Рго-8ег-МН2 в организме крысы. Максимальное накопление меченых трипептидов наблюдается в печени и почках. Единственными детектируемыми радиоактивными метаболитами являются [3,4-3Н]Рго и [3,4-3Н]-£>-Рго.
5. Показано, что трипептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег->1Н2 и Туг-[3,4-3Н]-£)-Рго-8ег-№12 способны проникать в мозг крысы.
6. Установлено, что дерморфин имеет два места связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы.
7. Трипептиды Туг-Рго-8ег-МН2 и Туг-£)-Рго-8ег-КН2 имеют места специфического связывания на плазматических мембранах головного мозга крысы. Оба изомера связываются с высокоаффинными местами связывания дерморфина и не взаимодействуют с низкоаффинными. Трипептиды не взаимодействуют с местами связывания дерморфина-(1-4).
8. Трипептиды Туг-Рго-8ег->Щ2 и Туг-£>-Рго-8ег->1Н2 обладают меньшим сродством (1С50 около 10"5 М) к периферическим ц-опиоидным рецепторам препарата ПКМС по сравнению с дерморфином и [1)-Рго6]-дерморфином (1С5о около 10"9 М) и, в отличии от дерморфина и [1)-Рго6]-дерморфина, не взаимодействуют с 5-опиоидными рецепторами препарата СПМ.
Заключение
В настоящее время поиск лекарств, в частности, анальгетиков на основе пептидов является перспективным направлением. Анализ большого количества работ отечественных и зарубежных исследователей, посвященных дерморфину и его аналогам, показал, что пептиды проявляют высокую физиологическую активность (Negri et al., 2000). Однако из-за ряда недостатков, связанных с их полифункциональным действием, они не могут быть использованы для создания лекарственных препаратов нового поколения. Долгое время считали, что С-концевой фрагмент дерморфина не влияет на проявление его анальгетической, а важна роль TV-концевого тетрапептидного фрагмента дерморфина Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH. Установление факта усиления активности дерморфина со стереохимически модифицированным С-концевым Pro6 побудило интерес к изучению С-концевого фрагмента трипептида Tyr-Pro-Ser-NH2 и его стереоизомера Tyr-Z)-Pro-Ser-NH2, поскольку при протеолизе дерморфина образуются //-концевой тетрапетид и С-концевой трипептид. С другой стороны, предположение о том, что физиологическое действие дерморфина может быть связано с влиянием каждого из метаболитов, также послужило основанием для предпринятого исследования.
Химическим синтезом были получены два стереоизомера трипептидов, их ненасыщенный аналог и меченные тритием по пролину трипептиды. Наилучшими условиями для получения меченых препаратов с точки зрения выхода и молярной радиоактивности является жидкофазное гидрирование.
Результаты полученных исследований свидетельствуют о высокой анальгетической активности трипептидов Tyr-Pro-Ser-NH2 и Туr-Z)-Pro-Ser-NН2, а, следовательно, и важности С-концевого участка молекулы дерморфина в проявлении его физиологического действия. Это было доказано тестами отдергивания хвоста и уксусных корчей. Анальгетический эффект трипептидов сравним с таковым для дерморфина и его стереоизомера [£>-Рго6]-дерморфина или превосходит его, при этом он блокируется антагонистами опиоидных рецепторов налоксоном и налоксон метиодидом. Способность налоксона метиодида блокировать анальгетический эффект пептидов свидетельствует об участии периферических опиоидных рецепторов в механизме анальгетического действия.
Трипептиды Туг-[3,4-3Н]-Рго-8ег-КН2 и Туг-[3,4-3Н]-Л-Рго-8ег-Ш2 попадают в кровяное русло, преодолевают гематоэнцефалический барьер, накапливаются в мозге и других органах. На основании этих данных можно предположить, что, попадая в мозг даже в незначительных количествах, трипептиды могут воздействовать на центральную нервную систему.
Радиорецепторным методом были выявлены два центра связывания дерморфина на плазматических мембранах головного мозга крыс и определены константы связывания каждого из них (К0| = 0.26 ± 0.07, К02 = 1.7 ± 0.01 нМ), а также концентрации мест связывания (ВтаХ1 = 24 ± 0.66 и Втах2 = 53 ± 4.4 фмоль/мг белка). Установлено, что С-концевые фрагменты Туг-Рго-8ег-№-12 и Ту г-Л-Рго-8ег-ЫН2 взаимодействуют преимущественно с «высокоаффинными» местами насыщения [3Н]-дерморфина и не влияют на связывание ТУ-концевого фрагмента дерморфина-(1-4) [3Н]-Туг-^-А1а-РЬе-С1у->Щ2. На основании этого результата можно предположить, что «высокоаффинные» участки являются местами связывания С-концевого, а «низкоаффинные» - а ТУ-концевого фрагментов молекулы дерморфина.
Изученные трипептиды с низким сродством взаимодействуют с периферическим ц-опиоидными рецепторами и не взаимодействуют с 5-опиоидными рецепторами в отличие от дерморфина и [£>-Ргоб]-дерморфина, что было установлено на препаратах, полученных из изолированных органов подвздошной кишки морской свинки и семявыносящего протока мыши.
Выполненные исследования позволяют рассматривать трипептиды Туг-Рго-8ег-1ЧН2 и Туг-£)-Рго-8ег-КН2 как основу для создания новых анальгетиков.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Громовых, Петр Сергеевич, Москва
1. Бабаян Э.А., Гаевскпй A.B., Бардин Е.В. Правовые аспекты оборота наркотических, психотропных, сильнодействующих, ядовитых веществ и прекурсоров. М. МЦФЭР. 2000. 187 с.
2. Батурина Е.Ю., Сарычева Н.Ю. Парадоксальные соотношения эффективности интраназального и внутрибрюшинного введения дерморфинов крысам //БЭБиМ. 1988. №2 С. 177-179.
3. Бездетко Г.Н., Герман A.B., Хасина Э.И. Исследование фармакокинетики и механизма действия гликозидов элеутерококка. V. Метаболизм и кинетика связывания с компонентами крови. //Хим.-фарм. журнал. 1982. № 5. С. 528-531.
4. Букринская А.Г., Проказова Н.В., Шапошникова Г.И. Роль ганглиозидов в рецепции и проникновении в клетку вируса гриппа. //Докл. АН СССР, Биохимия. 1982. Т. 263. № 6. С. 1481-1484.
5. Бабаков A.B., Абрамычева Н.Ю., Билуши C.B., Шевченко В.П. Исследование взаимодействия фузикоцина с плазматическими мембранами высших растений. //Биол. Мембраны. 1990. Т. 7. № 2. С. 107-112.
6. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. Практический курс. M ФАИР-ПРЕСС. 1999. 720 с.
7. Гершкович A.A., Кибирев В.К. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев: Наукова думка. 1992. 360 с.
8. Герман A.B., Бездетко Г.Н., Митрохин Ю.И. Исследование фармакокинетики и механизма действия гликозидов элеутерококка. II.145
9. Распределение элеутерозид В по органам и субклеточным фракциям. //Хим.-фарм. журнал. 1982. № 1. С. 26-30.
10. Гомазков O.A. Функциональная биохимия регуляторных пептидов //М. Наука. 1992. 160 с.
11. Гомазков O.A. Физиологически активные пептиды //М. Институт биомедицинской химии РАМН. 1995.
12. Гузеватых Л.С., Емельянова Т.Г., Усенко А.Б., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Воронина Т.А., Мясоедов Н.Ф. Влияние Pro6 в дерморфина на анальгетическую активность. // Известия АН, серия биол., 2002. №4, С. 472476.
13. Джеймс Б. Гомогенное гидрирование. М. Мир. 1976. 570 с.
14. Емельянова Т.Г., Усенко А.Б. Физиологические аспекты дерморфина и его аналога Т)А1а4.-дерморфина. //ДАН. 1996. Т.36 №2. С. 272-273.
15. Зайцев Д.А., Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием пептидов высокотемпературным твердофазным каталитическим изотопным обменом. //Докл. АН. 1990. Т. 313. № 3. С. 619-622.
16. Зозуля A.A., Пацакова Э., Кост Н.В. Изучение взаимодействия эндогенных опиатов с лимфоцитами периферической крови человека. // Журн. невропат, и псих. им. Корсакова. 1982. Т. 82. № 5. С. 60-63.
17. Зозуля А.А, Степура О.Б., Кост Н.В, Акатова Е.В., Пак JI.C., Мартынов А.И. Эндогенные опиоиды при заболевании сердечно-сосудистой системы. //Кардиология. 1999. №7. С. 40-48.
18. Зозуля A.A., Пшеничкин С.Ф. Опиоиды и иммунитет. //Итоги науки и техники. Серия Иммунология. ВИНИТИ. М. 1990. Т.25. С. 48-120.
19. Золотарев Ю.А., Борисов 10.А. Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена в гидроксипролине под действием спилловер-трития. //Изв. АН. Сер. хим. 1999. №6. С. 1056-1060.
20. Золотарев Ю.А. Синтез и исследование меченных тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций. //Диссертация на соискание степени доктора химических наук. ИМГ РАН. Москва. 1998. 68 с.
21. Золотарев Ю.А., Ласкеров Е.В., Козик B.C., Дорохова Е.М., Розенберг С.Г., Борисов Ю.А., Мясоедов Н.Ф. Исследование твердофазного изотопного обмена водорода в L-аланине. //Изв. АН. Сер. хим. 1997. №4. С. 757-762
22. Коршунова Г.А., Сумбатян H.B. Дерморфин: синтез аналогов и структурно-функциональные отношения //Биоорганическая химия. 1989. Т. 15. №7. С. 869-895.
23. Кукушкин M.JL, Решетняк В.К. Механизмы возникновения острой боли и хронических болевых синдромов //Materia Medica. 1997. Т. 3. № 15. С. 5-21.
24. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные нейропептиды, стресс и адаптационная защита сердца. //Томск. Изд-во Томского ун-та. 1994. С. 352.
25. Михеева И.Г., Курасова О.Б., Верещагина Т.Г., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля A.A. Опиоидные пептиды экзогенного происхождения бета-казоморфины и питание детей грудного возраста. //Педиатрия. 2003. №5. С. 96-99.
26. Мясоедов Н.Ф., Золотарев Ю.А., Пенкина В.И. и др. Исследование хроматографического метода разделения рацематов, меченных тритием аминокислот Получение и выделение радиоактивных изотопов. //Тез. Докл. Совещ. Ташкент. 1980. С. 53.
27. Нагаев И. Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. Экспресс-метод введения тритиевой метки в фармпрепараты. //Радиохимия. 1999. Т. 41. № 4. С. 263-264.
28. Осипова H.A., В.А. Беренев, Г.Р. Арбузова. Нестероидные противовоспалительные препараты (ацелизин) в послеоперационном обезболивании и интенсивной терапии //Анаст. и реанимат. 1994. № 4. С. 4156.
29. Савюк В. Я. Боль и обезболивание. Сибирский государственный медицинский университет. Томск. 1997. С. 1-2.
30. Усенко А.Б., Емельянова Т.Г. Дерморфин структурно-функциональные закономерности в ряду фрагментов и аналогов //Научная конференция ИХФ РАН. 1998. С. 89-90.
31. Усенко А.Б., Емельянова Т.Г., Мясоедов Н.Г. Дерморфины -природные опиоиды с уникальной первичной структурой, определяющей специфику их биологической активности. //Изв. АН. Сер. биол. 2002. №2. С. 192-204.1
32. Харкевич Д.А. Фармакология. М. Изд-во «ГЭОТАР-Медиа». 2005. 735 с.
33. Чурюканов В., Чурюканов М. Фармакология болеутоляющих средств. //Врач. №4. 2002. с. 29-33.
34. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием биологически активных соединений для исследования актуальных проблем биологии и медицины. //М. Физматлит. 2005. Т.2. С. 484-538.
35. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Меченные тритием липофильные соединения. М. Изд-во "Наука". 2003. 246 с.
36. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Введение метки жидкофазным селективным гидрированием в андростерон и факторы, влияющие на этот процесс. //Радиохимия. 2002. Т. 44. №4. С. 346-348.
37. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Введение тритиевой метки в некоторые ненасыщенные биологически активные соединения изотопным обменом с тритиевой водой //Радиохимия. 1999. Т. 41. № 6. С. 7983.
38. Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Каменский A.A., Левицкая Н.Г., Шевченко В.П., Гривенников H.A.,
39. Мясоедов Н.Ф. Кинетика проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении. //Биоорган, химия. 2006. Т. 32. № 1. С. 64-70.
40. Ярыгин К.Н., Зайцев С.В., Варфоломеев С.Д. Наркомания. Нейропептид-морфиновые рецепторы //М. Изд. МГУ. 1993.
41. Ambo A., Sasaki Y., Suzuki К. Synthesis of carboxyl-terminal extension analogs of dermorphin and evaluation of their opioid receptor-binding and opioid activities. //Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1994. Vol. 42. № 4. P. 888-891.
42. Amiche M, Sagan S, Мог A, Delfour A, Nicolas P. Characterization of the receptor binding profile of 3H.-dermorphin in the rat brain. //Int. J. Pept. Protein Res. 1988. Vol. 32. № 6. P. 506-511.
43. Amiche M, Delfour A, Nicolas P. Structural requirements for dermorphin opioid receptor binding. //Int. J. Pept. Protein. Res. 1988 (6). Vol. 32. № 1. P. 2834.
44. Amiche M., Delfour A., Nicolas P. Opioid peptides from frog skin. EXS. 1998. Vol. 85. P. 57-71.
45. D'Amour F.E. and Smith D.L. A method for determining loss of pain sensation. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1941. Vol. 72. P. 74-79.
46. Andre Т., Ulberg S. Radioactive Tetracycline. //J. Amer. Chem. Soc. 1957. Vol. 79. №1. P. 494-498.
47. Andreeva L. A., Alfeeva L. Y., Potaman V. N., Nezavibat'ko V. N. Use of tetrabutylammonium salts of amino acids in peptide synthesis. //Int. J. Peptide Res. 1992. №39. P. 493-496.
48. Ankier S.I. New hot plate tests to quantify antinociceptive and narcotic antagonist activities. //Eur. J. Pharmacol. 1974. Vol. 27. № 1. P. 1-4.
49. Audigier Y., Mazarguil H., Gout R., Cros J. Structure-activity relationships of enkephalin analogs at opiate and enkephalin receptors: correlation with analgesia. //Eur. J. Pharmacol. 1980. Vol. 63. № 1. P. 35-46.
50. Augustine R.L., Tompson M.M. Heterogeneous catalysis in organic chemistry. 6. An experimental description of the nature of the hydrogenation sites present on dispersed platinum catalysts. //J. Org. Chem. 1987. Vol. 52. P. 19111915.
51. Ballantyne J.C. Opioids for chronic nonterminal pain. //South. Med. J. 2006. Vol. 99. № 11. P. 1245-1255.
52. Bamigbade T.A., Langford R.M. Tramadol hydrochloride: an overview of current use. Hosp. Med. 1998. Vol. 59. № 5. P. 373-376.
53. Le Bars D., Gozariu M., Cadden S.W. Animal models of nociception. //Pharmacol. Rev. 2001. Vol. 53. № 4. P. 597-652.
54. Basso N., Marcelli M., Ginaldi A., De Marco M. Intrathecal dermorphine in postoperative analgesia. //Peptides. 1985. Vol. 6. № 3. P. 177-179.
55. Benoiton N.L. Chemistry of peptide synthesis. //CRC Press. 2006. P.
56. Berezowska I., Chung N.N., Lemieux C., Wilkes B.C., Schiller P.W. Cyclic dermorphin tetrapeptide analogues obtained via ring-closing metathesis. Acta Biochim Pol. 2006. Vol. 53. № 1. P. 73-76.
57. Bergelson L.D., Bukrinskaya A.G., Prokazova N.V., Shaposhnikova G.I., Kocharov S.L., Shevchenko V.P., Kornilaeva G.V., Fomina-Ageeva E.V. Role of gangliosides in reception of influenza virus. //Eur. J. Biochem. 1982. Vol. 128. № 2-3. P. 467-474.
58. Bertolini A., Ferrari A., Ottani A., Guerzoni S., Tacchi R., Leone S. Paracetamol: new vistas of an old drug. //CNS Drug Rev. 2006. Vol. 12. № 3-4. P. 250-275.
59. Bianchi C., Franceschini J. Experimental observations on Haffner's method for testing analgesic drugs. //Br. J. Pharmacol. Chemother. 1954. Vol. 9. № 3. P. 280-284.
60. Blakemore P.R., White J.D. Morphine, the Proteus of organic molecules. //Chem. Commun. (Camb). 2002. Vol. 7. № 11. P. 1159-1168.
61. Budd K. Buprenorphine and the transdermal system: the ideal match in pain management. //Int. J. Clin. Pract. Suppl. 2003. Vol. 133. P. 9-14.
62. Vadivelu N., Hines R.L. Buprenorphine: a unique opioid with broad clinical applications. J. Opioid Manag. 2007. Vol. 3. № 1. P. 49-58.
63. Bodnar R.J., Hadjimarkou M.M. Endogenous opiates and behavior:2002. //Peptides. 2003. Vol. 24. № 8. P. 1241-1302.
64. Bodnar R.J., Klein G.E. Endogenous opiates and behavior: 2003. //Peptides. 2004. Vol. 25. P. 2205-2256.
65. Borg S., Vollinga R.C., Labarre M., Payza K, Terenius L, Luthman K. Design, synthesis, and evaluation of Phe-Gly mimetics: heterocyclic building blocks for pseudopeptides. //J. Med. Chem. 1999. Vol. 42. № 21. P. 4331-4342.
66. Braga P.C., Tiengo M., Biella G., Dall'Oglio G., Fraschini F. Dermorphin, a new peptide from amphibian skin, inhibits the nociceptive thalamic neurons firing rate evoked by noxious stimuli. Neurosci Lett. 1984. Vol. 23. № 52 (1-2). P. 165-169.
67. Broccardo M., Erspamer V., Falconieri Erspamer G., Improta G., Linari G., Melchiorri P., Montecucchi P.C. Pharmacological data on dermorphins, a newclass of potent opioid peptides from amphibian skin. //Br. J. Pharmacol. 1981. Vol. 73. №3. P. 625-631.
68. Broccardo M., Improta G., Nargi M., Melchiorri P. Effects of dermorphin on gastrointestinal transit in rats. //Regul. Pept. 1982. Vol. 4. №> 2. P. 91-96.
69. Brown G.P., Yang K., King M.A., Rossi G.C., Leventhal L., Chang A., Pasternak G.W. 3-Methoxynaltrexone, a selective heroin/morphine-6p-glucuronide antagonist. //FEBS Lett. 1997. Vol. 412. P. 35-38.
70. Bulow H.H. Linnemann M. Berg H. Lang-Jensen T. LaCour S. Jonsson T. Respiratory changes during treatment of postoperative pain with high dose transdermal fentanyl. //Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 1995. Vol. 39. № 6. P. 835-839.
71. Cadet P. Mu opiate receptor subtype. //Med. Sci. Monit. 2004. Vol. 10. N.6. P. 28-32.
72. Cervini M.A., Rossi A.C., Perseo G., de Castiglione R. Antinociceptive and other opioid effects of a new series of dermorphin analogues after subcutaneous administration in the rat. //Peptides. 1985. Vol. 6. № 3. P. 433-437.
73. Chaki K., Sakurada S., Sakurada T., Kisara K., Suzuki K. N-terminal tetrapeptide of dermorphin and D-Arg-substituted tetrapeptides: inactivation process of the antinociceptive activity by peptidase. //Life Sei. 1990. Vol. 46. № 23. P. 1671-1678.
74. Cheng K.J., Cuatrecasas P. Heterogeneity and properties of opiate receptors. //Fed. Proc. 1981. Vol. 40. № 13. P. 2729-2734.
75. Cheng K.J., Cuatrecasas P. Mulpiple opiate receptors. //J. Biol. Chem. 1986. Vol. 254. № 8. P. 2610-2618.
76. Christrup L.L. Morphine metabolites. //Acta Anaesthesiol Scand. 1997. Vol. 41. № 1-2. P. 116-122.
77. Clotz M.A., Nahata M.C. Clinical uses of fentanyl, sufentanil, and alfentanil. //Clin. Pharm. 1991. Vol. 10. № 8. P. 581-593.
78. Craig A.D. Pain mechanisms: labeled lines versus convergence in central processing. //Annu. Rev. Neurosci. 2003. Vol. 26. P. 1-30.
79. Cucumel K., Bagnol D., Moinier D., Fischer J., Conrath M., Cupo A. The rat dermorphin-like immunoreactivity is supported by an aminopeptidase resistant peptide. //J. Neuroimmunol. 1998. Vol. 81. № 1-2. P. 211-224.
80. Darland T, Heinricher MM, Grandy DK. Orphanin FQ/nociceptin: a role in pain and analgesia, but so much more. //Trends. Neurosci. 1998. Vol. 21. № 5. P. 215-221.
81. Darlak K., Grzonka Z., Janicki P., Czlonkowski A., Gumulka S.W. Structure-activity studies of dermorphin. Synthesis and some pharmacological data of dermorphin and its 1-substituted analogues. //J. Med. Chem. 1983. Vol. 26. № 10. P. 1445-1447.
82. Darlak K., Grzonka Z., Krzascik P., Janicki P., Gumulka S.W. Structure-activity studies of dermorphin. The role of side chains of amino acid residues on the biological activity of dermorphin. Peptides. 1984. Vol. 5. № 4. P. 687-689.
83. Debonnel G. Current hypotheses on sigma receptors and their physiological role: possible implications in psychiatry. //J. Psychiatry. Neurosci. 1993. Vol. 18. №4. P. 157-172.
84. DeLeo J.A. Basic science of pain. //J. Bone. Joint. Surg. Am. 2006. Vol. 88. № 2. P. 58-62.
85. Dhawan B.N., Cesselin F., Raghubir R., Reisine R., Bradley P.B., Portoghese P.S., Hamon M. International union of Pharmacology. 12. Classification of opioid receptors. //Pharmacol. Rev. 1996. Vol. 48. P. 567-592.
86. Dirksen R. Opioid receptors and pain. //Pharm. Weekbl. Sci. 1990. Vol. 12, №2. P. 41-45.
87. Do U.H., HongY., Tarn P., Srinivasan P. Synthesis of l-0-hexadecyl-r,2'-H-3.hexadecyl 2-acetyl-sn-glyceryl 3-phosphorylcholine and 1-O-alkyl [P-32]lysophosphatidycholine. //J. Label. Comp. Radiopharm. 1996. Vol. 38. №2. P. 117-127.
88. Dobkin AB, Eamkaow S, Caruso FS. Butorphanol and pentazocine in patients with severe postoperative pain. //Clin. Pharmacol. Ther. 1975. Vol. 18. № 5(1). P. 547-553.
89. Donnerer J., Oka K., Brossi A. et al., Presence and formation of codein and morphine in the rat. //Proc. Natl. Adac. Sci. USA. 1986. Vol. 83. №12. P. 4566-4567.
90. Evans E.A. Tritium and its Compounds. //Butterworth Publishers. London. 1974. 822 p.
91. Ebell M. Tramadol relieves neuropathic pain. Am. //Fam. Physician. 2007. Vol. 75. № 9. P. 1335-1336.
92. Egleton R.D., Mitchell S.A., Huber J.D., Palian M.M., Polt R., Davis T.P. Improved blood-brain barrier penetration and enhanced analgesia of an opioid peptide by glycosylation. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 299. № 3. P. 967972.
93. Elad D., Ginsburg D. Synthesis of morphine. //J. of the Amer. chem. soc. 1954. Vol. 76. P. 312-313.
94. Erspamer G.F, Severini C. Guinea-pig ileum (GPI) and mouse vas deferens (MVD) preparations in the discovery, discrimination and parallel bioassay of opioid peptides. //Pharmacol Res. 1992. Vol. 26. № 2. P. 109-121.
95. Erspamer V., Melchiorri P. Crowth hormone and other biologically active peptides. Eds Pecile A. Muller E.E. Amsterdam Excepta Medica. 1980. P. 185200.
96. Filip J. Synthesis of oronic acid and 2-deoxyuridine labeled with tritium in position 5 with high molar activity. //Radioisotopy. 1970. Vol.11. P. 778-803
97. Filip K., Oleszczuk M., Pawlak D., Wojcik J., Chung N.N., Schillerc P.W., Izdebski J. Potent side-chain to side-chain cyclized dermorphin analogues containing a carbonyl bridge. //J. Pept. Sci. 2003. Vol. 9. № 10. P. 649-657.
98. Filip K., Oleszczuk M., Wojcik J., Chung N.N., Schiller P.W., Pawlak D., Zieleniak A., Parcinska A., Witkowska E., Izdebski J. Cyclic enkephalin and dermorphin analogues containing a carbonyl bridge. //J. Pept. Sci. 2005. Vol. 11. № 6. P. 347-352.
99. Forrest W.H.Jr., Beer E.G., Bellville J.W., Ciliberti B.J., Miller E.V., Paddock R. Analgesic and other effects of the d- and 1-isomers of penzocine. //Clin. Pharmacol. Ther. 1969. Vol. 10. № 4. P. 468-476.
100. Furunes H., Spigset O., Slerdal L. Heroin: a useful analgesic? //Tidsskr. Nor. Laegeforen. 2003. Vol. 23. № 123 (24). P. 3512-3514.
101. Gal T.J., DiFazio C.A., Moscicki J. Analgesic and respiratory depressant activity of nalbuphine: a comparison with morphine. Anesthesiology. 1982. Vol. 57. № 5. P. 367-374.
102. Gear R.W., Miaskowski C., Gordon N.C., Paul S.M., Heller P.H., Levine JD. The kappa opioid nalbuphine produces gender- and dose-dependent analgesia and antianalgesia in patients with postoperative pain. Pain. 1999. Vol. 83. № 2. P. 339-345.
103. Gureje O., Simon G.E., Von Korff M. A cross-national study of the course of persistent pain in primary care. //Pain. 2001. Vol. 92. № 1-2. P. 195-200.
104. Filip K., Oleszczuk M., Wojcik J., Chung N.N., Schiller P.W., Pawlak D., Zieleniak A., Parcinska A., Witkowska E., Izdebski J. Cyclic enkephalin andderraorphin analogues containing a carbonyl bridge. //J. Pept. Sci. 2005. Vol. 11. № 6. P. 347-352.
105. Zola E.M., McLeod D.C. Comparative effects and analgesic efficacy of the agonist-antagonist opioids. //Drug. Intell. Clin. Pharm. 1983. Vol. 17. № 6. P. 411-417.
106. Giagnoni G., Parolaro D., Casiraghi L., Crema G., Sala M., Andreis C., Gori E. Dermorphin interaction with peripheral opioid receptors. //Neuropeptides. 1984. Vol. 5. № 1-3. P. 157-160.
107. Gorechka A., Leplawy M., Zabrocky J., Zwierrak A. Diethyl phosphorobromiodite an effective new peptide-forming agent. //Synthesis. 1978. № 6. P. 474-476.
108. Gyand E.A., Kosterlitz H.W. Agonist and antagonist actions of morphinelike drugs on the guinea-pig isolated ileum. //Br. J. Pharmacol. Chemother. 1966. Vol. 27. №3. P. 514-527.
109. Gumusel B., Hao Q., Hyman A., Chang J.K., Kapusta D.R., Lippton H. Nociceptin: an endogenous agonist for central opioid likel (ORL1) receptors possesses systemic vasorelaxant properties. Life Sci. 1997. Vol. 60. № 8. P. 141145.
110. Gupta K., Kshirsagar S., Chang L., Schwartz R., Law P.Y., Yee D., Hebbel R.P. Morphine stimulates angiogenesis by activating proangiogenic andsurvival-promoting signaling and promotes breast tumor growth. //Cancer Res. 2002. Vol.62. P. 4491-4498.
111. Hameroff S.R. Opiate receptor pharmacology: mixed agonist/antagonist narcotics. Contemp. Anesth. Pract. 1983. Vol. 7. P. 27-43.
112. Hazum E., Chang K.J., Cuatrecasas P. Specific nonopiate receptors for pendorphins. //Science. 1979. V. 205. № 4410. P. 1033-1035.
113. Heel R.C., Brogden R.N., Speight T.M., Avery G.S. Butorphanol: a review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy. //Drugs. 1978. Vol. 16. № 6. P. 473-505.
114. Henderson G., McKnight A.T. The orphan opioid receptor and its endogenous ligand—nociceptin/orphanin FQ. //Trends Pharmacol. Sci. 1997. Vol. 18. №8. P. 293-300.
115. Heyl D.L., Mosberg H.I. Modification of the Phe3 aromatic moiety in delta receptor-selective dermorphin/deltorphin-related tetrapeptides. Effects on opioid receptor binding. //Int. J. Pept. Protein Res. 1992. Vol. 39. № 5. P. 450-457.
116. Hiller J.M., Fan L.Q., Simon E.J. Autoradiographic comparison of 3H.DPDPE and [3H]DSLET binding: evidence for distinct delta 1 and delta 2 opioid receptor populations in rat brain. //Brain Res. 1996. Vol. 719. № 1-2. P. 8595.
117. Hiramatsu M, Kameyama T. Roles of kappa-opioid receptor agonists in learning and memory impairment in animal models. //Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1998. Vol. 20. № 7. P. 595-599.
118. Ho C.L, Li C.H. Beta-endorphin. Biological activity of analogs containing dermorphin and dynorphin sequences: ileum and vas deferens assays. //Int. J. Pept. Protein Res. 1987. Vol. 29. № 1. P. 134-139.
119. Hole K, Tj0lsen A. The tail-flick and formalin tests in rodents: changes in skin temperature as a confounding factor. //Pain. 1993. Vol. 53. № 3. P. 247-254.
120. Hollt V. Opioid peptide processing and receptor selectivity. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1986. Vol. 26. P. 59-77.
121. Houghton I.T., Aun C.S, Wong Y.C., Chan K., Lau J.T., Oh T.E. The respiratory depressant effect of morphine. A comparative study in three ethnic groups. //Anaesthesia. 1994. Vol. 49. № 3. P. 197-201.
122. Huang P., Kehner G.B., Cowan A., Liu-Chen L.Y. Comparison of pharmacological activities of buprenorphine and norbuprenorphine: norbuprenorphine is a potent opioid agonist. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 297. № 2. P. 688-695.
123. Hughes J., Kosterlitz H.W., Leslie F.M. Effect of morphine on adrenergic transmission in the mouse vas deferens. Assessment of agonist and antogonist potencies of narcotic analgesics. //Br. J. Pharmacol. 1975. Vol. 53. № 3. P. 371381.
124. Hurlbut D.E., Evans C.J., Barchas J.D., Lesli F.M. Pharmacological properties of a proenkephalin A-derived opioid peptide: BAM 18. // Eur. J. Pharmacol. 1987. Vol. 138. №3. P. 359-366.
125. Improta G., Broccardo M., Lisi A., Melchiorri P. Neural regulation of gastric acid secretion in rats: influence of dermorphin. //Regul. Pept. 1982. Vol. № 3-4. P. 251-256.
126. Iwatsuki K, Suzuki S, Sato K, Hashimoto H, Yasuda I. Clinical evaluation of a new non-narcotic analgesic, pentazocin. //Masui. 1969. Vol. 18. № 4. P. 292298.
127. Ji Y., Murphy A.Z., Traub RJ. Sex differences in morphine-induced analgesia of visceral pain are supraspinally and peripherally mediated. //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2006. Vol. 291. № 2. P. R307-314.
128. Kamei J. Disseminated coccidioidomycosis with intra- and paravertebral abscesses. //J. Infect. Chemother. 2002 (a). Vol. 8. № 2. P. 198-199.
129. Kamei J. Delta-opioid receptor antagonists as a new concept for central acting antitussive drugs. //Pulm. Pharmacol. Ther. 2002 (b). Vol. 15. № 3. P. 235240.
130. Kilpatrick G.J., Smith T.W. Morphine-6-glucuronide: actions and mechanisms. //2005. Med. Res. Rev. Vol. 25. P. 5. P. 521-544.
131. Kreil G. Peptides containing a D-amino acid from frogs and molluscs. //J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. № 15. P. 10967-10970.
132. Lasagna L. The clinical evaluation of morphine and its substitutes as analgesics. Pharmacol. Rev. 1964. Vol. 16. № 47-83.
133. Lassner J. Serturner and the discovery of morphine. Cah. Anesthesiol. 1993. Vol. 41. № 5. P. 549-553.
134. Lazarus L.H., Wilson W.E., de Castiglione R., Guglietta A. Dermorphin gene sequence peptide with high affinity and selectivity for delta-opioid receptors. //J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. № 6. P. 3047-3050.
135. Lazarus L.H., Wilson W.E., Guglietta A., de Castiglione R. Dermorphin interaction with rat brain opioid receptors: involvement of hydrophobic sites in the binding domain. //Mol. Pharmacol. 1990. Vol. 37. № 6. P. 886-892.
136. Lazarus L.H., Bryant S.D., Attila M., Salvadori S. Frog skin opioid peptides: a case for environmental mimicry. //Environ. Health Perspect. 1994. Vol. 102. № 8. P. 648-654.
137. Lemaire S., Magnan J., Regoli D. Rat vas deferens: a specific bioassay for endogenous opioid peptides. //Br. J. Pharmacol. 1978. Vol. 64. № 3. P. 327-329.
138. Leslie F.M. Methods used for the study of opioid receptors. //Pharmacol. Rev. 1987. Vol. 39 (3). P. 197-249.
139. Lester P.A., Traynor J.R. Comparison of the in vitro efficacy of mu, delta, kappa and ORL1 receptor agonists and non-selective opioid agonists in dog brain membranes. //Brain Res. 2006. Vol. 16. № 1073-1074. P. 290-296.
140. Liebmann C., Schrader U., Brantl V. Opioid receptor affinities of the blood-derived tetrapeptides hemorphin and cytochrophin. //Eur. J. Pharmacol. 1989. Vol.166. № 3. P.523-526.
141. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. № 1. P. 265-275.
142. Lugo R.A., Kern S.E. Clinical pharmacokinetics of morphine. //J. Pain Palliat Care Pharmacother. 2002. Vol. 16. № 4. P. 5-18.
143. Malfloy B., Schwartz J.C. Properties of "enkephalinase" from rat kidney: compartion of dipeptidil-carboxypeptidase and endopeptidase activities. //Biochem. Biophys. Res. Comm. 1982. Vol. 106. 276-285.
144. Mamoon A.M., Barnes A.M., Ho I.K., Hoskins B. Comparative rewarding properties of morphine and butorphanol. //Brain Res. Bull. 1995. Vol. 38. № 5. P. 507-511.
145. Mantyselka P., Kumpusalo E., Ahonen R., Kumpusalo A., Kauhanen J., Viinamaki H., Halonen P., Takala J. Pain as a reason to visit the doctor: a study in Finnish primary health care. //Pain. 2001. Vol. 89. № 2-3. P. 175-180.
146. Mansour A., Fox C.A., Akil H., Watson S.J. Opioid-receptor mRNA expression in the rat CNS: anatomical and functional implications. //Trends. Neurosci. 1995. Vol. 18. № 1. P.22-29.
147. Marastoni M., Salvadori S., Balboni G., Marzola G., degli Uberti E.C., Tomatis R. Synthesis and biological activity of carboxyl terminally extended dermorphins. //Int. J. Pept. Protein Res. 1986. Vol. 28. № 3. P. 274-281.
148. Marastoni M., Salvadori S., Balboni G., Borea P.A., Marzola G., Tomatis R. Synthesis and activity profiles of new dermorphin-(l-4) peptide analogues. //J. Med. Chem. 1987. Vol. 30. № 9. P. 1538-1542.
149. Martin W.R., Eades C.G., Thompson J.A., Huppler R.E., Gilbert P.E. The effects of morphine and nalorphine-like drugs in the nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog. //J. Pharmacol.Exp.Ther. 1976. Vol. 197. P. 517532.
150. McCarberg B.H., Barkin R.L. Long-acting opioids for chronic pain: pharmacotherapeutic opportunities to enhance compliance, quality of life, and analgesia. //Am. J. Ther. 2001. Vol. 8. № 3. P. 181-186.
151. McClung C.A. The molecular mechanisms of morphine addiction. //Rev. Neurosci. 2006. Vol. 17. № 4. P. 393-402.
152. McLoughlin R., McQuillan R. Transdermal fentanyl and respiratory depression. Palliative Medicine. 1997. Vol. 11. № 5. P. 419.
153. Melchiorri P., Negri L. The dermorphin peptide family. //Gen. Pharmacol. 1996. Vol. 27. № 7. P. 99-107.
154. Melzack R., Wall P.D. Pain mechanisms: a new theory. //Science. 1965. Vol. 150. №699. P. 971-979.
155. Melzack R. Pain-an overview. //Acta Anaesthesiol. Scand. 1999. Vol. 43. № 9. P. 880-884.
156. Merskey H., Bogduk N. Classification of chronic pain. Descriptions of Chronic Pain Syndromes and Definitions of Pain Terms. //IASP Press. Seattle. 1994.
157. Miller L.G„ Prichard J.G. Current issues in NSAID therapy. //Prim. Care. 1990. Vol. 17. № 3. P. 589-601.
158. Minami M., Saton M. Molecular biology of the opioid receptors: structures, functions and distributions. //Neurosci. Res. 1995. Vol.23. № 2. P. 121145.
159. Montecucchi P.C., de Castiglione R., Erspamer V. Identification of dermorphin and Hyp6-dermorphin in skin extracts of the Brazilian frog Phyllomedusa rhodei. //Int. J. Pept. Protein Res. 1981 (a). Vol. 17. № 3. P. 316321.
160. Monteillet-Agius G., Fein J., Phan T., Anton B., Lam PI., Zaki P., Miotto K., Evans C.J. Regulation and distribution of members of the opioid receptor family. //Proc. West Pharmacol. Soc. 1996. Vol. 39. P. 69-70.
161. Naber D., Pickar D., Dionne R.A., Bowie D.L., Ewels B.A., Moody T.W., Soble M.G., Pert C.B. Assay of endogenous opiate receptor ligands in human CSF and plasma. //Subst. Alcohol. Action Misuse. 1980. Vol. 1. № 1. P. 83-91.
162. Nagata H., Miyazawa N., Ogasawara K. A concise route to (-) -morphine. //Chem. Commun. 2001. P. 1094.
163. Naqvi T., Raghubir R., Haq W., Tripathi A., Patnaik G.K., Mathur K.B. Synthesis and opioid activity of novel tetrapeptides analogous to sequence (1-4) of dermorphin. //Neuropeptides. 1998. Vol. 32. № 4. P. 333-338.
164. Negri L., Improta G. Distribution and metabolism of dermorphin in rats. //Pharmacol. Res. Commun. 1984. Vol. 16. № 12. P. 1183-1191.
165. Negri L., Lattanzi R., Melchiorri P. Production of antinociception by peripheral administration of Lys7.dermorphin, a naturally occurring peptide with high affinity for mu-opioid receptors. //Br. J. Pharmacol. 1995. Vol. 114. № 1. P. 57-66.
166. Negri L., Lattanzi R., Tabacco F., Scolaro B., Rocchi R.Glycodermorphins: opioid peptides with potent and prolonged analgesic activity and enhanced blood-brain barrier penetration. //Br. J. Pharmacol. 1998 (a). Vol. 124. №7. P. 1516-1522.
167. Negri L, Lattanzi R, Tabacco F, Melchiorri P. Respiratory and cardiovascular effects of the mu-opioid receptor agonist Lys7.dermorphin in awake rats. Br J Pharmacol. 1998 (6). Vol. 124. № 2. P. 345-355.
168. Negri L., Melchiorri P., Lattanzi R. Pharmacology of amphibian opiate peptides. //Peptides. 2000. Vol. 21. № 11. P. 1639-1647.
169. Nikoda V.V., Maiachkin R.B., Bondarenko A.V. Clinical aspects of using patient-controlled analgesia with nonsteroidal anti-inflammatory agents in postoperative period. //Anesteziol. Reanimatol. 2003. Vol. 5. P. 56-59.
170. Nikoda V.V., Shcherbakova G.N., Bondarenko A.V., Andrianov V.A., Titov V.V., Ragimov A.A. Artificial therapeutic feeding in the short bowel syndrome. //Anesteziol. Reanimatol. 2006. Vol. 5. P. 86-89.
171. Oka T., Negishi K., Suda M., Matsumiya T., Inazu T., Ueki M. Rabbit vas deferens: a specific bioassay for opioid kappa-receptor agonists. //Eur. J. Pharmacol. 1981. Vol. 17. № 73 (2-3). P. 235-236.
172. Olszewski P.K., Levine A.S. Minireview: characterization of influence of central nociceptin/orphanin FQ on consummatory behavior. //Endocrinology. 2004. Vol. 145. P. 2627-2632.
173. Paakkari P., Paakkari I., Landes P., Siren A.L., Feuerstein G. Respiratory mu-opioid and benzodiazepine interactions in the unrestrained rat. //Neuropharmacology. 1993. Vol. 32. № 4. P. 323-329.
174. Pachter I.J., Evens R.P. Butorphanol. //Drug Alcohol Depend. 1985. Vol. 14. № (3-4). P. 325-338.
175. Parfitt J.R., Driman D.K. Pathological effects of drugs on the gastrointestinal tract: a review. //Hum. Pathol. 2007. Vol. 38. № 4. P. 527-536.
176. Paroli E. Opioid peptides from food (the exorphins). //World Rev. Nutr. Diet. 1988. Vol. 55. P. 58-97.
177. Pasero C., Manworren R.C., McCaffery M. PAIN Control: IV opioid range orders for acute pain management. //Am. J. Nurs. 2007. Vol. 107. № 2. P. 52-59.
178. Passik S.D., Weinreb H.J. Managing chronic nonmalignant pain: overcoming obstacles to the use of opioids. //Adv. Ther. 2000. Vol. 17. № 2. P. 7083.
179. Pasternak G.W., Snowman A.M., Snyder S.H. An endogenous morphinelike factor in mammalian brain. //Life Sci. 1975. Vol. 16. № 12. P. 1765-1769.
180. Pasternak G.W. Multiple opiate receptors: déjà vu all over again //Neuropharmacology. 2004. Vol. 47. P. 312-323.
181. Pattabiraman N., Sorensen K.R., Langridge R., Bhatnagar R.S., Renugopalakrishnan V., Rapaka R.S. Molecular mechanics studies of dermorphin. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. Vol. 15. № 140 (1). P. 342-349.
182. Pert C.B., Pert A., Tallman J.F. Isolation of a novel endogenous opiate analgesic from human blood. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. № 7. P. 2226-2230.
183. Pert C.B., Snyder S.H. Properties of opiate-receptor binding in rat brain. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. № 8. P. 2243-2247.
184. Pickering G, Loriot M.A., Libert F., Eschalier A., Beaune P., Dubray C. Analgesic effect of acetaminophen in humans: first evidence of a central serotonergic mechanism. //Clin. Pharmacol. Ther. 2006. Vol. 79. № 4. P. 371-378.
185. Piestrzeniewicz M.K., Michna J., Janecka A. Opioid receptors and their selective ligands. //Postepy Biochem. 2006. Vol. 52. № 3. P. 313-319.
186. Pini L.A., Sandrini M., Vitale G. The antinociceptive action of paracetamol is associated with changes in the serotonergic system in the rat brain. //Eur. J. Pharmacol. 1996. Vol. 308. № 1. P. 31-40.
187. Poeaknapo C. Mammalian morphine: de novo formation of morphine in human cells. //Med. Sci. Monit. 2005. Vol. 11. P. 5.
188. Polzonetti-Magni A., Facchinetti F., Carnevali F., Carnevali O., Mosconi G., Pestanino M., Vallarino M., Garcia G. Presence and steroidogenetic activity of beta-endorphin in the ovary. //Biol. Reprod. 1994. Vol. 50. № 5. P. 1059-1065.
189. Portoghese P.S. The design of delta-selective opioid receptor antagonists. //Farmaco. 1993. Vol. 48. (2):243-51.
190. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N. Entry of the synthetic ACTH(4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection. //Neurosci. Lett. 1991. Vol. 127. P. 133-136.
191. Ramachandran S., Lu H., Prabhu U., Ruoho A.E. Purification and characterization of the guinea pig sigma-1 receptor functionally expressed in Escherichia coli. //Protein Expr. Purif. 2007. Vol. 51. № 2. P. 283-292. '
192. Regnard C., Pelham A. Severe respiratory depression and sedation with transdermal fentanyl: four case studies. //Palliative Medicine. 2003. Vol. 17. P. 714-716.
193. Reisine T., Law S.F, Blake A, Tallent M. Molecular mechanisms of opiate receptor coupling to G proteins and effector systems. //Ann N. Y. Acad. Sci. 1996. Vol. 780. P. 168-175.
194. Renda T., Negri L., Tooyama I., Casu C., Melchiorri P. Autoradiographic study on 3H.-[D-Ala2]-deltorphin-I binding sites in the rat brain. //Neuroreport. 1993. Vol. 4. № 10. P. 1143-1146.
195. Richter K., Egger R., Kreil G. D-alanine in the frog skin peptide dermorphin is derived from L-alanine in the precursor. //Science. 1987. Vol. 238. № 4824. P. 200-202.
196. Rosenmund K.W. New method for the preparation of aldehydes. I. //Ber. 1918. Vol. 51. P. 585-594.
197. Rosow C.E. Sufentanil citrate: a new opioid analgesic for use in anesthesia. //Pharmacotherapy. 1984. Vol. 4. № 1. P. 11-19.
198. Rossi G.C., Brown G.P., Leventhal L., Yang K, Pasternak G.W. Novel receptor mechanisms for heroin and morphine-6b-glucuronide analgesia. //Neurosci. Lett. 1996. Vol. 216. P. 1-4.
199. Sakurada S., Chaki K., Watanabe H., Nakata N., Sakurada T., Kisara K., Suzuki K. Antinociceptive mechanisms of D-Arg2.-dermorphin tripeptide analogs. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992. Vol. 263. № 2. P. 793-799.
200. Salvadori S., Marastoni M., Tomatis R., Sarto G. Opioid peptides. Structure-activity relationships in dermorphin tetrapeptides. // Farmaco Sci. 1982 (a). Vol. 37. № 8. P. 514-518.
201. Salvadori S., Sarto G., Tomatis R. Synthesis and pharmacological activity of dermorphin and its iV-terminal sequences. //Int. J. Pept. Protein. Res. 1982 (6). Vol. 19. № 5. P. 536-542.
202. Salvadori S, Marastoni M, Tomatis R, Sarto G. Opioid peptides. Structure-activity relationships in beta- Ala4. dermorphin tetrapeptides. V. Farmaco [Sci]. 1983. Vol. 38. № 9. P. 640-646.
203. Salvadori S., Marastoni M., Balboni G., degli Uberti E., Tomatis R. Synthetic tetrapeptides related to dermorphin: potent long lasting analgesic action following subcutaneous administration. Peptides. 1985. Vol. 6. № 3. P. 127-129.
204. Salvadori S., Marastoni M., Balboni G., Marzola G., Tomatis R. Dehydro-dermorphins. II. Synthesis and biological activity of unsaturated dermorphin hexa and heptapeptides. //Int. J. Pept. Protein Res. 1986 (6). Vol. 28. № 3. P. 262-273.
205. Samii A., Bickel U., Stroth U.5 Pardridge W.M. Blood-brain barrier transport of neuropeptides: analysis with a metabolically stable dermorphin analogue. //Am. J. Physiol. 1994. Vol. 267. № 1. P. 124-131.
206. Sargent D.F., Bean J.W., Schwyzer R. Conformation and orientation of regulatory peptides on lipid membranes. Key to the molecular mechanism of receptor selection. //Biophys. Chem. 1988. Vol. 31. № 1-2. P. 183-193.
207. Sasaki Y., Matsui M., Fujita H., Hosono M., Taguchi M., Suzuki K., Sakurada S., Sato T., Sakurada T., Kisara K. Studies on analgesic oligopeptides. III. Synthesis and analgesic activity after subcutaneous administration of D
208. Arg2.dermorphin and its N-terminal tetrapeptide analogs. //Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1985 (6). Vol. 33. № 4. P. 1528-1536.
209. Sarto G., Degli-Uberti E.C., Salvadori S., Tomatis R. Opioid peptides. Analgesic activity of potent dermorphin tetrapeptides. VI. Farmaco Sci. 1983. Vol. 38. № 9. P. 647-652.
210. Sato T., Sakurada S., Sakurada T., Furuta S., Nakata N., Kisara K., Sasaki Y., Suzuki K. Comparison of the antinociceptive effect between D-Arg containing dipeptides and tetrapeptides in mice. Neuropeptides. 1984. Vol. 4. № 4. P. 269279.
211. Sato T., Sakurada S., Sakurada T., Furuta S., Chaki K., Kisara K., Sasaki Y., Suzuki K. Opioid activities of D-Arg -substituted tetrapeptides. //J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987. Vol. 242. № 2. P. 654-659.
212. Sato T., Sakurada S., Sakurada T., Kisara K., Suzuki K. Comparison of opioid properties between D-Arg-containing dipeptides and tetrapeptides. //Biochem. Pharmacol. 1992. Vol. 43. № 4. P. 717-723.
213. Savoia G., Loreto M., Gravino E. Sufentanil: an overview of its use for acute pain management. //Minerva Anestesiol. 2001. Vol. 67. № 9. P. 206-216.
214. Scalia S., Salvadori S., Marastoni M., Bortolotti F., Tomatis R. Reversed-phase HPLC study on the in vitro enzymic degradation of dermorphin. //Peptides. 1986. Vol. 7. №2. P. 247-251.
215. Schmidhammer H. Opioid receptor antagonists. //Prog. Med. Chem. 1998. Vol. 35. P. 83-132.
216. Sewaid N., Jakubke H.-D. Peptides: Chemistry and Biology. //Wiley-VCH. 2002. 543 P.
217. Simon E.J. In search of the opiate receptor. //Am. J. Med. Sci. 1973. Vol. 266. №3. P. 160-168.
218. Simon E.J. Opioid receptors and endogenous opioid peptides. //Med. Res. Rev. 1991. Vol. 11. № 4. P. 357-374.
219. Shevchenko V.P., Myasoedov N.F. Preparation of Radiolabeled Lipids. Isotopes in the Physical and Biochemical Sciences. Vol. 1. Labelled Compounds (Part A) / Edited by Buncel E. and Jones J.R.: Elsevier. N-Y. USA. 1987. P. 237287.
220. Shevchenko V.P., Myasoedov N.F. Labelled Eicosanoids. //Isotopes in the Physical and Biochemical Sciences. Vol. 1. Labelled Compounds (Part B) / Edited by Buncel E. and Jones J.R.: Elsevier. N-Y. USA. 1991. P. 179-231.2 a
221. Smart D., Lambert D.G. Tyr-£)-Arg -Phe-sarcosine activates phospholipase C-coupled mu2-opioid receptors in SH-SY5Y cells. //Eur. J. Pharmacol. 1996. Vol. 305. № 3. P. 235-238.
222. Stefano G.B., Scharrer B., Smith E.M., Hughes T.K. Jr., Magazine H.I., Bilfinger T.V., Hartman A.R., Fricchione G.L., Liu Y., Makman M.H. Opioid and opiate immunoregulatory processes. //Cri. Rev. Immunol. 1996. Vol. 16. № 2. P. 109-144.
223. Stevens C.W., Yaksh T.L. Spinal action of dermorphin, an extremely potent opioid peptide from frog skin. //Brain Res. 1986. Vol. 385. № 2. P. 300-304.
224. Stillman M.J., Stillman M.T. Appropriate use of NSAIDs: considering cardiovascular risk in the elderly. //Geriatrics. 2007. Vol. 62. № 3. P. 16-21.
225. Sullivan A.F., Dickenson A.H. Electrophysiological studies on the spinal effects of dermorphin, an endogenous mu-opioid agonist. //Brain Res. 1988. Vol. 461. № l.P. 182-5.
226. Swierkosz T.A., Jordan L., McBride M., McGough K., Devlin J., Botting R.M. Actions of paracetamol on cyclooxygenases in tissue and cell homogenates of mouse and rabbit. //Med. Sci. Monit. 2002. Vol. 8. № 12. P. 496-503.
227. Taber D.F., Neubert T.D., Rheingold A.L. Synthesis of (-)-Morphine //J. Am. chem. soc. 2002. Vol. 124. P. 12416-12417.
228. Takagi K., Kameyama T., Yano K. //J. Pharm. Soc. Japan. 1957. Vol. 78. P. 553-556.
229. Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and synaptic plasma membrane fraction of rat cerebral cortex. //Acta Pharmacol. Toxicol. 1973. Vol. 32. P. 313-316.
230. Teschemacher H., Opheim K.E., Cox B.M., Goldstein A. A peptide-like substance from pituitary that acts like morphine. I. Isolation. //Life Sci. 1975. Vol. 16. № 12. P. 1771-1775.
231. Tomboly C., Dixit R., Lengyel I., Borsodi A., Toth G. Preparation of Specifically Tritiated Endomorphins. //J. Labelled. Comp. Radiopharm. 2001. Vol. 44. №5. P. 355-363.
232. Trauner D., Bats J.W., Werner A., Mulzer J., Synthesis of enantiomerically pure morphine alkaloids: The hydrophenanthrene route //J. Org. Chem. 1998. Vol. 63. № 17. P. 5908-5918.
233. Tseng L.F. Evidence for epsilon-opioid receptor-mediated beta-endorphin-induced analgesia. //Trends. Pharmacol. Sci. 2001. Vol. 22. № 12. P. 623-630.
234. Ueda H., Inoue M., Mizuno K. New approaches to study the development of morphine tolerance and dependence. //Life Sci. 2003. Vol. 74. № 2-3. P. 313320.
235. Vadivelu N., Hines R.L. Buprenorphine: a unique opioid with broad clinical applications. //J. Opioid. Manag. 2007. Vol. 3. № 1. P. 49-58.
236. Van Dorp E., Yassen A., Sarton E, Romberg R., Olofsen E., Teppema L., Danhof M., Dahan A. Naloxone reversal of buprenorphine- induced respiratory depression. //Anesthesiology. 2006. Vol. 105. № 1. P. 51-57.
237. Vane J.R., Botting R.M. The mechanism of action of aspirin. //Thromb. Res. 2003. Vol. 110. № 5-6. P. 255-258.
238. Vavrek R.J., Cui R.L., Stewart J.M. Selectivity of minimum structure enkephalins. //Life Sci. 1982. Vol. 31. № 20-21. P. 2249-2252.
239. Vion-Dury J., Cupo A., Tamalet C., Valli M., Jadot G. Neurochemical characteristics of opioid peptides //Presse. Med. 1986. Vol. 15. № 10. P. 475-459.
240. Volterra A., Restani P., Brunello N., Galli C.L., Racagni G. Interactions of (3-casomorphins with multiple opioid receptors: In vitro and in vivo studies in the newborn rat brain. //Development. Brain Res. 1986. Vol. 30. P. 25.
241. Willens J.S., Myslinski N.R. Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and clinical uses of fentanyl, sufentanil, and alfentanil. Heart Lung. 1993. Vol. 22. № 3.P. 239-251.
242. Willkens R.F. NSAID therapy: past, present and future. //Br. J. Clin. Pract. Suppl. 1988. Feb;58:3-5.
243. Wood P.L., Pasternak G.W. Specific mu 2 opioid isoreceptor regulation of nigrostriatal neurons: in vivo evidence with naloxonazine. //Neursci. Lett. 1983. Vol. 37. №3. P. 291-293.
244. Wollemann M, Benyhe S, Simon J. The kappa-opioid receptor: evidence for the different subtypes. //Life Sci. 1993;52(7):599-611.
245. Wu K.K. Control of COX-2 and iNOS gene expressions by aspirin and salicylate, //Thromb. Res. 2003. Vol. 110. № 5-6. P. 273-276.
246. Yamamoto T., Sakashita Y. The role of the spinal opioid receptor likel receptor, the NK-1 receptor, and cyclooxygenase-2 in maintaining postoperative pain in the rat//Anesth. Analg. 1999. Vol. 89. № 5. P. 1203-1208.
247. Yeadon M., Kithen J. Multiple opioid receptors mediate the respiratory depressant effects of fentanyl like drags in the rat. //Gen. Pharmacol. 1990. -№21. - P.655-664.
248. Zadina J.E., Hackler L., Ge L.J. et al. A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. //Nature. 1997. Vol.386. № 6624. P.499-502.
249. Zagon I.S., Goodman S.R., McLaughlin P.J. Characterization of zeta: a new opioid receptor involved in growth. //Brain Res. 1989. Vol. 482. № 2. P. 297305.
250. Zagon I.S., Verderame M.F., Allen S.S., McLaughlin P.J. Cloning, sequencing, chromosomal location, and function of cDNAs encoding an opioid growth factor receptor (OGFr) in humans. //Brain Res. 2000. Vol. 856. № 1-2. P. 75-83.
251. Zagon I.S., Verderame M.F., McLaughlin P.J. The biology of the opioid growth factor receptor (OGFr). //Brain Res. Rev. 2002. Vol. 38. № 3. P. 351-376.
252. Zajac J.M., Bigeard A., Delay-Goyet P., Roques B.P. Affinity states of rat brain opioid receptors in different tissue preparations. //J. Neurochem. 1990. Vol. 54. №3. P. 992-999.
253. Zaki P.A., Bilsky E.J., Vanderah T.W., Lai J., Evans C.J., Porreca F. Opioid receptor types and subtypes: the delta receptor as a model. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996. Vol. 36. P. 379-401.
254. Zech D.F., Grond S., Lynch J., Hertel D., Lehmann K.A. Validation of World Health Organization Guidelines for cancer pain relief: a 10-year prospective study. Pain. 1995. Vol. 63. № 1. P. 65-76.
255. Zioudrou C., Streaty R.A., Klee W.A. Opioid peptides derived from food proteins. The exorphins. //J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. № 7. P. 2446-2449.
256. Zolotarev Yu.A., Kozic V.S., Zaitsev D.A., Dorokhova E.M., Myasoedov N.F. Tritium Incorporation in a-Amino Acids by Isotope Exchange Using Hightemperature Solid-state Catalysis. //J. Label. Comp. Radiopharm. 1991. Vol.29. №5. P. 507-517.
257. Yaksh T.L., Malmberg A.B. Central pharmacology of nociceptive transmission. In: Wall P.D., Melzack R., eds. Textbook of pain. 3rd edn. London: Churchill Livingstone. 1994. P. 65-200.
-
Громовых, Петр Сергеевич
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.23
- Структурно-функциональные особенности в ряду природных и синтетических дерморфинов
- Морфогенетическая активность деморфина и его аналогов в различных клеточных популяциях
- Поиск на основании структурных аналогий опиатоподобных пептидов из нерегуляторных белков
- Эндогенные модуляторы вегетативной регуляции сердца (опиоидергические и адренергические механизмы)
- Влияние модуляциопиоидной система мозга факторами различной природы на высшую нервную деятельность крыс Вистар
