Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Симбиотические свойства, фотосинтез и продуктивность растений гороха, инокулированных стойкими к минеральному азоту клонами клубеньковых бактерий

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Симбиотические свойства, фотосинтез и продуктивность растений гороха, инокулированных стойкими к минеральному азоту клонами клубеньковых бактерий"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАШИ 1НСГИТУТ Ф13ЮЛ0ГП РОСЛЙН I ГЕНЕТИКИ

0хр1менко Св1тлана Михашйвна

УДК 581.557+631.84

СИМБ ЮТИЧНI ВЛАСТИВОСТ1, ФОТОСИНТЕЗ ТА БРОДУКТИВНЮТЬ РОСЛИН ГОРОХУ, 1НОКУЛЮВАНИХ СПЙКЙМИ ДО М1НЕРАЛБНОГО АЗОТУ КЛОНАМИ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕР1Й

03.00.12 - (|цз1одог1я рослин

Автореферат дисертацп на эдобугтя наукового ступени кандидата 61одог1чних наук

кшв - гооо

Дисергащею б рукопис.

Робота Еиконана в 1нститут1 ф1вюлог11 роолин i генетики HAH Украши

Науковий кер1вник: доктор 61олог1чних наук, профеоор, Старченков Юхим Пол1карпович 1нститут iiaiojiori'i роолин i генетики HAH Укра2ни, аав1дувач в1дд1лу 0$iuiirai опоненти: доктор б!олог1чних наук, профеоор, Головко Ераот Анатолиевич Центральной ботан1чний сад iM. М. М. Гришка HAH Украши, аав1дувач вхдд1лу

кандидат бхолог1чних наук, МалиноЕСька- 1рина Михашивна 1нотитут эемлеробства УААН, старший науковий сгпвробхтник

Пров1дна установа: Нацхональний аграрний унхверситет

Захист вЦбудеться ММ 2000 р. о ГОДИН1 на взоз.данн1 спец1ал1еовано1 вчено'1 ради Д 26.S1S.01. ¡нотитуту ф1а1олог11 роолин i генетики HAH Украши sa адресою: 03022, м. ки1в-22, вул. Васильк1вська, 31/17.

Э дисертац1вю можна овнайомитися у б1бЛ10тец1 1нституту ф1э1олог11 рослин i генетики HAH УкраХни,

Автореферат розхсланий 0$ 2000 р.

Вчений секретар спец1ал1вовано"1 вчено! ради

Труханов В.А.

БАТАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуалъв1ат> теми. Азот е одним з основних елемент1в минерального живлення рослин, а тому азотним добривам за характером IX впливу на врожай належить провхдна роль серед анших вщцв добрив. Проблема азотного живлення не може бути виршена т1льки за рахунок х1м!чно1 промисловосг1, в значнз.й м1р1 вона повинна вир!шувагись при допомоз! азотф1ксатор1В, тобто 61олог1чним шляхом (Прянишников Д.Н.1945). Засвоення азоту б1олопчним шшхом мае велике народно-господарське значения для вир1шення задач1 зб1льшення виробництва харчового 1 кормового б!лку, який в наш час е деф1цигом. Основною зернобобовою культурою 1 важливим постачальником рослинного б1лку в кл1матичних умовах Украши е горох. ЕИн м!стить багато ц1нних поживних речовин, зерно його використовуеться в харчов1й промисло-вост15 а кормов1 сорта переробляються на борошно - цгнний концент-рований корм для схльськогосподарських гварин.

Як в1домо, гороху властива дуже низька чутлив1сть на анокуля-ц1ю бульбочковими бакгер!ями. В роботах Доросинського (1973, 1979) 1 Кожемякова (1981, 1989) це явшце пояснюеться такими факторами, як наявнхсть в грун'П велико! к1лькост1 спонтанних 1 часто вхру-лентних, але менш ефективних штам!в бульбочкових бактер1й гороху. Кр1м цих фактор!в, негативний вплив на чуыив!сть рослин гороху проявдяють залишки азотних м1неральних добрив, що знаходяться в грунт! теля вирощування таких просапних культур як кукурудза, цукровий буряк, картопля, оскхльки останн! часто е попередниками гороху.

На протяз1 багатьох рок1в с1льськогосподарськ! культури виро-щували за з-нтенсивною технолог1ею внесениям п1д р1зн! культури тдвшцених доз азотних добрив, що привело до змхни мжробних цено-з!в, появи нових шгам1в бульбочкових бактерш, як! характеризува-лись б!льшою в1рулентн!стю, конкурентоздатнгсто, але меншою ефек-тивн1стю по в1дношеяню до виробничих шташв бульбочкових бактер!й.

Бобово-ризобхальна система гороху - ¡гЫгоЫшп 1ееиштозагиш е б1льш чутлива до впливу азоту при пор1внянн! з симбз.отичними системами 1нших бобових культур. Лгтературн! данг (31гее1ег 1.6., 1985а, 1985, Waterer J.G., 1993) св1дчать про те, що нав!ть при вхдносно иезначних доеах азоту в середовшид виршгуваннн, спостер!-

гаеться пригн!чення процесу симбштично! азотф3.ксацП в рослинах гороху.

У эв'язку з цим актуальною б проблема Шдвшдення р1вня симб1о-тично"! азотф1ксацп у рослин шляхом сгворення 1 застосування для 1нокуляцП штам!в, здатних забезпечувати ефективну азотф1ксац!ю в присутност! морального азоту в субстрат!.

Слад в1дм!тити, що в л1.тератур1 в!дсутн1 роботи про бульбочко-в1 бактер!1 гороху, одержан! шляхом обробки мутагенами, як! здатаи утворювати ефективний бобово-ризоб1альний симбюз з рослинами гороху при йдвищеному вм1ст1 азоту в субстрат!.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-тавдйна робота виконувалась у в1дпов1дност! з планами в1дд1лу сим-б!отично! азот^йксацП на 1991 - 1995 рр. по тем! "Вивчити меха-н1зми ф!з!олого-генетичних процес!в фшсацН азоту з метою форму-вання високопродукгивних азогфшсуючих систем бобових рослин" ДО держ. реестрацП 01.09.10 019962).

Мета 1 задач1 досл1дження. Мета роботи полагала в досл!дженн! симб1отичних властивостей, фотосинтезу та продуктивное^ рослин гороху при застосуванн! для хнокуляцП клон!в бульбочкових бакте-р1й, ст!йких до минерального азоту.

Для виршення ще! мети були поставлен! так1 завдання:

- одержати клони бульбочкових бактерш гороху, ст1йк1 до п3.д-виценого вм1сгу азоту в субстрата, та вивчити 1х симб1отичн! влас-тивост!;

- досл1дити вплив одержаних клон1в на !нтенсивн1сть фотосинтезу, темнового дихання, накопичення азоту 1 гагмент1в в рослинах гороху;

- вивчити вплив нових клон1в на продуктивн1сть та як1с.тъ зерна гороху.

Наукова новизна одержаних результате. Вперше методом х!м1чно-го мутагенезу одержан! стшю. до пдаищеного вм!сту азоту клони бульбочкових бактерш гороху на основ! виробничого штаму КЫгоЫшп 1е£1яптозагит Ьу. уШае 250а.

Досл!дн1 клони бульбочкових бак'терш в присутност1 азоту в субстрат! проявляють покращену в1рулентну, азотф1ксуючу активн!сть ! ефективн1сть при пор1внянн1 з вшидним штамом 250а.

Встановлено, що клони М-1 1 М-4 та IX !золяти 1з бульбочок рослин гороху, 1нокульованих даними клонами, показують п!двищен1

симб!отичн1 властивост! по в!дношенню до контролю (вихдаого штаму 250а) на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельр1гелю, що свЦчить про васл1дуем1сть одержаних вдастивостей i дав можлив1сть вважати Д1 клони мутантами.

1нокуляц1я одержавши клонами бактер1й пгдвщуе :1нтенсивн1сть фотосинтезу i темнового дихання рослин.

Застосування нових клон1в бактер!й збыьшув вм!ст азоту i nir-мент1в на протяз1 вегегацП в рослинах гороху.

Симб1огична система рослин гороху 1 стхйких до азоту клонхв бульбочкових бактер1й характеризуемся б1льш 1нтенсивним процесом утворення бюмаси i покращеною якЮтю зерна.

Щвтстъ досдадаеяь. 0триман1 результата досМджень дозволяють стверджувати моыив!сть одержання ефективних сттаких до пхдвищено-го BMicTy азоту клоШв бульбочкових бактерШ гороху методом xiMi4-ного мутагенезу i дають уявлеяня про вплив "ix на ф1зшлог1чн1 про-цеси 1 продуктивтсть рослин, вирощених в присутност1 авоту в субстрат1. Досл1дя1 клони бактерш можуть бути об'вктами в модель-них системах 6o6osi рослини - ризобП для вивчення npoqeciB ст1й-KOCTi симб1озу до морального азоту, розп1знавання партнергв при утворенн! симб1озу i функцшнування симбЮтично! системи. Одержат клони також можуть бути рекомендован! для ровробки i виготовлення препаратов бульбочкових бактер!й, як1 забезпечуваш б максимальне використання бхолоПчного азоту i одержання еколоПчно чисто! продукт 1.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто проробила вгдпо-в!дну лГературу га оволод1ла необхадними методами досл!джень, брала участь у плаяувашп доел 1дiE, п1дготовц! MaTepiajiiB до друку в наукових журналах. Матер1али дисертацшно! роботи одержано здобува-чем самосг1йно.

Апробац1я результатов дисертацИ. Результата доелдаенъ були представлен! на Республ1канськ1й конференцП, присвяченш пам'ят! чл. кор. АН УРСР Манорика A.B. (Герногпль, 1991); допов1дались i обговорювались на конференцП молодих вчених "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики" (Киев, 1992), а також на конферен-цп молодих вчених "Актуальн1 проблеми ф1з!ологП рослин i генетики", присвячен1й 50-й рачнищ з дня заснування 1нституту фазюлогп рослин i генетики HAH Укра'1ни (Кшв, 1996).

ПубмкацИ'. За матер1алами дисертацП олублжовано 6 po6iT, у тому числ1 3 статт! у пров!дних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертцп. ДисертаШя складаеться is переярку умовник скорочень, вступу, шести розд1л1в qchqbhoi частини, заключения, bhchobkib, списку використаних джерел. Робота викладена на 174 стор1нц1 машинописного тексту, з них 50 стор!нок займають 43 таблиц! та 7 1люстрац1й. Список використаних у po6oTi лхтературних джерел метить 271 найменування, в тому числ1 137 зарубшних, за-гальнш обсягом 33 сторгнки.

0СН0ВНИЙ 3MICT Р0Б0ТИ

У вступнШ частит обгрунтована акгуальн1сть проблеми, подано коротку характеристику роботи, вдшйсть роботи та апробац1ю результате доовджень.

В першому розд!л! представлений огляд в1тчизняно"1 та 3apy6i?K-Ho'i л1тератури по впливу мхнерального азоту на процес симбютичноЗ азотфгксацП у бобових рослин, методах одержання бактер1й з новими властивостями та взаемозв'язку основних ф1з!олог1чних npoaeciB з фшсацхею атмосферного азоту.

Другий роздал включае об'екти 1 методи досл!джень. Досади проводились протягом 1992 - 1994 pp. на спещально обладнаному вегета-ц1иному майданчику 1нституту ф1з1ологп рослин i генетики НАН Укра-!ни. Об'ектами досл1джень були горох (Pisum sativum L.) сорту Сола-ра, бульбочков1 бактерП гороху (Rhizobium leguminosaruin bv. viciae) штаму 250a, клони бактерш, CTiHKi до тдвищеного вм1сту азоту в субстрату та хзоляти клотв М-1 i М-4 i3 бульбочок рослин гороху, хнокульованих даними клонами. Як мутаген використовували етилметансульфонат (EMC) - C2.H5OSO2CH3. Обробку бактерш проводили по методшц, розроблен1й у ВНД1СГМ. Життездаттсть клон!в виражади в процентах колонт, як1 виросли в poeciBi оброблено! суспензП кл!тин, до числа колоний, яй виросли в po3ciBl необроблено! сус-пензп.

Клони выбирали за ознакою бульбочкоутворення в умовах MiKpo-вегетац1йних дослшв в пщан1й культурь В досл1дах використовували посудини на 0,5 кг в промитим стерильним nicKOM, куди вносили 0,2 або 1,2 норми азоту та imii MiHepaibHi елементи по 1,0 норм1 за Гельрп'елем. Титр суспензП бактерхй для 1нокуляц11 становив 109 кл/мл. Досл1ди проводили в 4-кратн1й noBTopHocTi. Для подаль-Ш01 роботи Ыдбирали клони бактерш, яга утворювали найб1лыву

к!льк!сть булъбочок, теля 30 д1б вегетацП.

Ефективн!сть вШбраних кжшв бактер!й та вплив ix на х1д ф1-з1олог1чних npou,eciB в рослинах вивчали в умовах вегетащйних до-слшв в шщанш i грунтовой культурах. В субстрат! вирощування рослин метилось 1,2 норми азоту та iHiuHX м1неральних елемент!в в доз! 1,0 норми за Гельр1гелем. ПростерШзоване 70 Z - ним етило-вим спиртом i промите стерильною водою насшня гороху !нокулювали вШбраними клонами бактер1й. Оптичну густину суспензП бактер1й вим!рювали на спектрофотометр! СФ-26 при довжин1 хвил! 560 нм, !н-фекщйне навантаження Bcix дослгдних клошв i штаму складало 109 кл/мл. В схему досл1ду були включен! контрольн1 варганти - без !нокуляцп (абсолютний контроль) i з обробкою нас1ння сусленз!ею бульбочкових бактер1й штаму £50а (контроль) та 1нокуляц1я окремими одержаними клонами бактер1й. Повторн1сть досл1ду шестикратна. В кожнш посудши 1псля проривки залипали по п'ять рослин. Ефектив-HicTb клон1в визначали по Maci cyxo'i речовини надземно'1 частини ! корен!в на прогязг вегетацп та по мае! зерна i кото якост1. Проводилось доелдаення динам!ки утворення i наростання кореневих бульбочок гороху та вивчення ix азотф1ксуючо'1 активност! по в1д-новленню ацетилену в етилен за методом Хард! [Hardy R.W.F. et al., 1968] на газовому хроматограф! "Chromatograph - 504".

Азотф1ксуючу активн!сть виражапи в наномолях утвореного етиле-ну на рослину за годину.

1нтенсивн1сть фотосинтезу та дихання вим1рювали за допомогою включеного по диференц1йн1й схем! оптико-акустичного газоанал1за-тора ПАМ - 5 [Киризий Д.А., 1981]. Вм!ст загального азоту визна-. чали методом К'ельдаля в модифшацП Чмельово! i Тютеревох [Плеш-ков Б.П., 1985]. BMicT хлороф1лу визначали спектрофотометричним методом [Починок X.Н., 1976]. Процентний вм!ст б1лку вираховували шляхом множення показника вм1сту азоту на коеф1ц1ент 5,7 [Петербургский A.B., 1968].

При вивченн! впливу клон!в бактерай на 1нтенсивн!сть ф1з!оло-г1чних процес1в в рослинах гороху зразки для анал1з!в в1дбирали в фазах 6-8 листк1в> бутон1зацп, цвгпння i утворення 6o6iB. Ста-тистична обробка даних проведена за Доспеховим (1985).

У третьему роздшг "Реакщя бульбочкових бактер1й на д!ю EMC i симб!отичн1 властивост! одержаних клон!в бульбочкових бактер1й гороху" показано, що життездатн!сть бульбочкових бактер!й гороху

шгаму £50а на бобовому arapi залежить в!д дози мутагену: з! зб1ль-шенням дози в1дбуваеться зниження числа кл1тин, що вижили. Так, найб!лыпий процент киттездатност! бактерш (39,48 %) в1дм1чено при обробц! самою низькою концентрац1ею ЕМС (0,5 %). У BapiaHTi з най-б1льшою концентращею мутагену - 3,0 % сиостер1гався найнижчий ступшь життездатносг! - 1,18 Z. Встановлено, що процент житте-здатност! бульбочкових бактерш гороху, не оброблених мутагеном, знижуеться в залежносй в1д концентрацН мшерального азоту в се-редовиви росту культур, а обробка мутагеном сприяе зб1льшенню жит~ тездатност1 ризоб!й на цих середовищах.

Внасл1док проведено! cepi'i досл1д1в було вдабрано 540 клон!в, здатних утворювати колонп в присутност1 шдвищено! дози азоту -50 мМ/л. Шсля 4-5 пасаяйв здатн!сть до росту 1 утворення колонш збер1гаеться у 79,5 Z. Попередня оцшка в1рулентност1 цих бактер1й проведена в умовах мхкровегетац1иного досл1ду при п1двищеному BMlcTi м!нерального азоту в субстрат!. Встановлено, що ie дослх.д-жених клонхв ZZ Z не утворювали бульбочок, 54 % клон1в утворювали 3-20 бульбочок на рослину на 30-у добу вирощування i т!льки у 24 X клонхв йлькхсть утворених бульбочок досягала 15-40 на рослину, як1 й були використан1 в наших експериментах.

Дан1 вегетацшних дослхд1в (табл. 1) свхдчать, що на вархантах з одержаними клонами спостер1галось б1льш 1нтенсивне протшання процесу бульбочкоутворення на протяз1 онтогенезу при пор1вняшй з контрольними вар1антами, де угворювались др1бн1, неактивнх буль-бочки в невеликхй кхлькост1. Найб1льша маса бульбочок на рослину на протяах вегетацП спостер!галась в фаз1 бутон1вацП i перевшцу-вала в середньому в 2-3 рази масу бульбочок контрольних роолин.

Зг1дно даним по н!трогеназн1й активное^ (табл. 2), досл1джу-BaHi клони бульбочкових бактерш здатн1 активно ф1ксувати атмос-ферний азот в симбхов! з рослинами гороху, як1 вирощувались на тдвищеному фон! азоту в п!щан1й культурь В умовах грунтово! культури слостерд.галось також збхльшення штенсивностх процесу азотф1ксац!1 при застосуванн1 досл1дних клон1в бактерш. В контрольних вар1антах азотф1ксуюча активн1сть була в!дсутня або не-значна.

Вивчався вплив клон1в бактерш М-1, М-3 1 М-4 на хнтенсивн1сть процесу азотфхксащ! при рхзних дозах мтратного азоту в субстрат! (0,2 норми i 1,2 норми азоту по Гельр1гелю). В вар1антах з засто-

Таблица 1

Вшгив 1нокуляцП дослхдниш кдонами бульбочкових бакгерхй рослин гороху, вирощуваних на фон! п!двщеного вм!сту азоту в субстрат! на млыисть ! масу бульбочок

Вегетац!йний досл!д 1993 р.

Вар!анти доол1ду Фаза роавитку рослин

1 6-8 лиоткхв! бутон1зац1я 1 » 1 цвтння | утворення I боб!в г

Без ¡.нокуляцП 3,3 ± 0,3 | 6,0 ± 0,6 4,0 ± 0,6 0

1 3,2 ± 0,1 | 19,0 ± 0,6 | 16,0 ± 0,6 0

1нокуляц!я

штамом 250а 11,0 ± 0,6 19,0 ± 0,6 16,0 ± 0,6 8,0 ± 0,3

13,6 * 1,0 50,2 ± 2,5 39,7 ± 2,2 12,7 ± 1,6.

клоном М-1 37,0 ± 1,2 50,0 ± 1,5 41,6 ± 3,2 32,3 ± 1,2

83,7 ± 6,1 151,7 ± 4,8 136,1 ± 6,7 128,2 ± 5,7

клоном М-2 40,7 ± 0,7 47,0 ± 1,5 27,3 ± 2,1 25,7 ± 2,3

68,4 ± 3,7 116,2 ± 5,6 98,7 t 6,4 84,8 ± 3,6

клоном М-4 37,3 ± 0,3 57,7 ± 1,5 58,1 ± 2,3 59,6 ± 3,2

60,3 + 2,9 182,6 ± 7,4 171,5 + 7,4 159,5 ± 7,7

клоном М-5 44,7 ± 1,2 51,0 1 1,2 27,7 ± 1,5 22,0 ± 1,5

80,5 ± 5,0 112,1 ± 4,4 81,4 ± 3,9 75,9 ± 4,6

клоном М-6 30,3 ± 1,3 62,5 ± 2,3 31,3 ± 0,9 31,7 ± 1,5

66,6 + 3,8 198,0 ± 9,5 129,1 ± 3,3 102,6 ± 5,7

Н1Р05 2,04 6,81 3,11 17,06 5,48 8,67 5,71 7,63

Прюатка: над рискою - к!лпьк!сть бульбочок (штук / рослину); п1д рискою - маса бульбочок (мг / рослину).

Таблиця 2

Н1трогеназна активнз.сть бульбочок гороху в залежносп вд.д хкокуляцН стпкши до гйдвищбно-го вм!сту морального азоту клонами бульбочкових бактер!й (нМ CVH4 / рослину * годину)

Вегетащйнш досийд 1993 р.

1 Вар1аити ДОСЛ1ДУ ..... Фаза роавитку рослин

i i 6-8 жстк1в | бутон1зад1я | цв!т1ння i i утворення боб!в

Без ХНОКУЛЯЦИ ¡ 1 25,4 ± 2,6 | 29,1 + 1,1 i i 1 0 | 0 i

1Н0КУЛЯВД.Я

штамом 250а 42,0 + 3,1 69,2 ± 4,2 5,5 ± 0,36 ■ 0

клоном М-1 736,0 ± 17,1 1374,0 ± 96,1 672,1 ±30,5 281,1 ± 28,1

клоном М-2 338,0 ± 11,5 1559,1 ± 61,6 630,9 i 16,9 238,0 ± 23,7

кланом М-4 656,1 ± 13,1 6085,1 ± 124,8 3026,0 ± 83,1 638,3 ± 41,2

клоном М-5 541,8 ± 16,5 1140,7 ± 44,1 951,2 ± 34,5 536,8 ± 67,2

клоном М-6 506,0 ± 36,1 5586,5 ± 113,2 1041,0 ± 31,7 301,9"+ 63,7

HIP05 47,79 257,5 86,51 61,85

суванням клсшв спостер!галось збхлылення к1лькост! I маси бульбочок при пор1внянн1 з хнокудящею штамом 250а . 1нокулящя досланный клонами сприяла значноиу п!двищенню ацетиленв1дновлюючо! активности при 0,2 нормах азоту. На середовипц з внесениям 1,2 норми азоту в контрольних вар!антах бульбочки не утворювались, тод1 як досл!дн1 клони виявили в1рулентну 1 азотф1ксуючу активн!сть. Бри дан1й норм1 азоту найб1льш1 показники симбготично! активност! в!д-м1чен1 при застосуванн1 клону М-1. 1нокуляц!я одержаними клонами приводить до вбыьшення 1нтенсивност1 прир1сту б1омаси при р!зних р1внях азотного живлення. Вхльш ефективними були клони М-1 1 М-4.

Проводились досл1ди по впливу умов вирощування ризоб1й в чис-т!й культур! на бульбочкоутворення рослия гороху. Показано, що бульбочков! бактерп, як! вирощувааи на живильних середовищах з тдвшценим вм!стом азоту в чистш культуру знижують здатнхсть до бульбочкоутворення, що, можливо, пов'язано з порушенням биосинтезу позакл1тинних вуглевод1в (Носенко Л.В., 1995).

Для вивчення насл1 дуемое« симбштичних властивостей одержаних кжтв проводили дос,л1ди 1з вихХдним штамом 250а, ¡слонами М-1 1 М-4 та 1золятами даних клон!в 1з бульбочок рослин гороху. Як св1д-чать дан! дослщу, клони М-1 ! М-4 та !х !золяти !з бульбочок рослин гороху проявляюсь тдвшцен! сиыб1отичн! властивост1 по в1дно-шенню до контролю (вих1дного штаму 250а) на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельр1гелю, а також б бхльш ефективними по в1дношенню до контролю (вих1дного штаму 250а), що показуе спадковий характер симбхотичних властивостей клон!в 1 дае можлив1сть вважати ц1 клони мутантами.

Таким чином, ¡июни бульбочкових бактер1й гороху, одержан! методом обробки 1х етилметансульфонатом, як! вирощували на живильно-му середовииц з п1двщеним вмхетом азоту, здатн1 утворювати сим-б1отичну систему з рослинами гороху, яка фжсуе азот в присутнос-цього елементу в середовшй росту.

Четвертий розд!л 'Чнтенсивнгсть вуглекислотного газообм1ну рослин гороху при шокуляцП досл1дними клонами бактерш" м!стить результати вегетацайних досл1д1в, як1 показують вплив одержаних клон!в на !нтенсивн!сть фотосинтезу, вм1ст п!гмент1в ! на дихальну активность рослин на протяз! вегетацшного пер!оду. Так, на вар!-антах з 1Нокуляц1ею клонами бактерш спостерхгалась б1льш висока !нтенсивн!сть фотосинтезу на протяз! онтогенезу при пор!внянн1 з

контрольним вар1антом, хнокульованим штамом 250а (табл. 3). Серед вивчених клон1в найб1льшою активн1стю фотосинтезу на протязх онтогенезу вид!лявся вар1ант з 1нокуляц1ею клоном М-1, на ньому спосте-рхгалась також бхльш активна фхксац1я молекулярного азоту, що свхд-чить про т1сний зв'язок цих двох ф1з1ологхчних процес1в. 1нокуляц1я рослин гороху сг1йкими до пхдвищеного вм1сту м1нерального азоту клонами бульбочкових бактер!й сприяв зб1лыденню хнтенсивност1 фотосинтезу також при розрахунку в мг СОг на грам сухо! речовини за годину на протяз1 вегетацхйного перходу.

Досл1дження вм1сту хлороф1лу в онтогенез1 рослин гороху показали, що в фаз1 бутон1зацП вм!ст хлороф1лу "а" в вариантах з хно-куляц1ею клонами бактерхй був вищий, пор1внюючи з вмштом в контроль них рослинах на 17,2 - 34,2 %. Б1льш значне накопичення п!г-мент1в при розрахунку на рослину вхдм1чалось в фазх утворення бо-б1в. Досл1днх рослини в цю фазу мали хлороф1лу "а" 1 "в" на 12,1 -49,8 % б1льше у порхвняшй з контролем. Б1льш хнтенсивно накопичу-вали хлороф1л на протязх вегетацП рослини, хнокульованх клонами М-4 1 М-6. На цих вар!антак спостер1гал.ась також максимальна активность азотфхксацхх (табл. 2), що пхдтверджуе хснування позитивного зв'язку цих двох процес1в. Застосування одержаних клон1в приводило також до збыьшення вм1сту п1гмент1в при розрахунку на грам сухо! речовини на протяз1 вегетацП. Проведений корелящйний ана-л1з даних 1нтенсивност1 фотосинтезу 1 вм1сту хдорофШв "а" 1 " в" виявив 1снування значного позитивного зв'язку в фаз1 бутон1зацП (г - 0,90).

Одержанх данх по впливу досл1джуваних клонхв бульбочкових бактерхй на 1нтенсивн1сть темнового дихання, яке поруч в фотосинтезом 1 азотф1ксавдею е важливим елементом продукщйного процесу рослин, показали, що на вар1антах з хнокулявдею клонами спостер!-галось п1двищення дихально! активност1 рослин в онтогенезх при по-рхвняннх з контролем в розрахунку на рослину, особливо на вар1ан-тах 1з застосуванням клон!в М-1 1 М-2 (табл. 3). Аналогхчна тен-денц1я спастерз.галась 1 при розрахунку на грам сухо! речовини.

Таким чином, одержат дан1 св1дчать, що 1нокулящя гороху но-вими клонами бульбочкових бактер1й сприяе п1двищенню хнтенсивност! фотосинтезу, темнового дихання 1 вм1сту пз.гмент1в в рослинах гороху.

У п'ятому роздШ "Вплив ст!йких до пхдвищеного вм1сту м!не-

Таблиця 3

1нтенсивн1сть вугдекислотного газообм!ну рослин гороху в онтогенез! при 1нокуляц11 дос11лними клонами бульбочкових бактер1й гороху (мг СОг/рослину * годину)

Вегетацшний досл1д 1992 р.

1 1 1 1 Фаза 1 розвитку рослин 1

| д0сл1ду | 1 1 1 1 1 6-8 листк1в | 1 1 буо,он1зац1я | утворення | боб1в |

1 1 1 1 | Без 1нокуляц11 | 1 1 I I 6,9 1 ± 0.07 | { 5,9 ± 0,04 | 6,5 ± 0,05 |

1,8 1 ± 0,06 | 1 2,1 ± 0,05 | 2,0 ± 0,02 |

1 1 1 | 1нокуляц1я | I 1 1 1

1 1 1 1 | штамом 250а | 1 1 1 1 4,8 г ± 0,04 | 6,9 ± 0,06 | 7,3 ± 0,09 |

1,5 ± 0,04 | 2.1 ± 0,05 | 2.0 ± 0.02 |

1 1 | клоном М-1 | 1 1 1 1 6,1 ± 0,08 | 9.2 ± 0.09 | 13,1 ± 0,10 |

1.7 ± 0,04 | 3,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,04 |

1 1 1 1 | клоном М-2 | 1 1 1 1 5,7 ± 0,06 | 7.9 ± 0,08 | 9,7 + 0,09 |

2,0 ± 0,04 | 2,9 ± 0,06 | 3,2 ± 0,05 |

1 1 1 1 | клоном М-3 . | 1 1 4,9 ± 0,05 | 8,7 ± 0,10 | 9,1 ± 0,08 |

1.7 ± 0,02 | 1 2,4 ± 0,03 | 2.6 ± 0,03 | 1

Прим1тка: над рискою - :штенсивн1сть фотосинтезу; п!д рискою -

1нтенсивн1сть темнового дихання.

рального азоту клонхв бульбочкових бактер1й на нагромадження за-гального азоту в надземной частин1 рослин гороху на протяз1 веге-тац1йного пер1одуи встановлено, що досл1дн1 клони бульбочкових бактер1й позитивно впливали на вм1сг азоту в надзешпй мас1 в период дх вегетацП (табл. 4). Так, рослини, !нокульован! клонами М-1, М-2, М-3 1 М-4, в фаз1 бутон!зацИ мдстили його в!дпов!дно 3,24; 3,07; 3,01 1 2,98 1. В контрольних рослинах, 1нокульованих штамом 250а, азоту було 2,78 X, в рослинах абсолютного контролю (без !нокуляцШ - 2,74 В фаз1 утворення боб!в досл!джуван1 рослини мади азоту больше по в1дношенню до контролю на 12,4 -22,2 %. Аналог1чш. дан1 одержан! нами 1 в умовах наступного до-сл!ду. Максимальний вм!ст авоту спостер!гався в фазх бутон1зацп, рослини, !нокульован1 клонами м!стили б1льше азоту при пор1внян-н1 з контролем на 4,17 - 15,48 %. Кореляц1йний анал!з даних по-казуе присутн!сть значнод позитивно"! залежност! в фаз1 бутотзац!! мхж процесами азотф!ксацП 1 накопиченням азоту в надземндй части-Н1 (г - 0,93), м!ж вмдстом хлороф1л1в ! накопиченням азоту (г = 0,93), а також мЬс процесом фотосинтезу 1 накопиченням азоту (г -0,89).

Шостий розд!л "Продуктивность рослин гороху, оброблених до-сл1дними клонами бульбочкових бактер1й, при п1двищеному вмосг! м1-нерального азоту в середовишД вирощування" включае вегетац1йн1 дослгдження по впливу клон!в бактер!й на !нтенсивность утворення боомаси рослин гороху ! на масу зерна рослин гороху та його якдсть. В результат! п1двищення 1нтенсивност1 ф1в1оло1ччних процесса в рослинах п!д впливом дослодних югсшв зб1льшувалось утворення надземно! маси рослин на протяз! вегетац1йного перЮду (табл. 4). Б1льш !нтенсивний прир1ст надземно'х маси в фаз1 бутонозаци , пор1внюючи з контролем, спостер!гався в рослинах, шокульованих клонами М-4, М-5 ! М-6, прибавка маси по даному показнику в1дпо-в!дно складана 38,3 %, 32,7 % 1 40,8 %. 1нтенсивность приросту б1омаси надземно'х частини в нехнокульованих рослинах на протязд вегетац!йного пер1оду була дещо нижча в!дносно контрольних рослин, знокульованих штамом 250а.

Наростання кореневох системи на протязо вегетацП було менш олтенсивним ! в меншй м1р! розр!знялось по вардантам при пор1в-нянк1 в надземного масою. Отже, сШвводношення сухих речовин над-земно! маси ! корен1в на протяз! вегетацП зб1льшувалось.

Таблица 4

Динам1ка вм!сту аагального ааоту 1 нагромадження надвемио! частини рослин гороху в онтогенез! в залеяност! в1д ^окуляцп дошпдними клонами бульбочкових бакгер1й при пЦвищеному bmíctI авоту в субстрат!

Вегетац1йний досл!д 1993 р.

BapiaHTH досл!ду Фаза розвитку рослин

6-8 ЛИСТК1В i бутон1зац1я | утворення I боб!в

Без хнокуляцП 3,11 ± 0,04 0,41 + 0,01 3,15 ± 0,03 | 2,76 ± 0,02 - | - 0,81 ± 0,02 1,96 ± 0,06

1нокуляц1я

штамом 25Ga 2,91 ± 0,03 3,36 ± 0,04 2,87 ± 0,04

0,57 ± 0,02 0,79 ± 0,03 2,48 ± 0,05

клоном М-1 3,07 ± 0,04 0,56 ± 0,01 3,53 ± 0,04 0,95 ± 0,03 3,08 ± 0,02 3,27 ± 0,03

клоном М-2 2,97 ± 0,04 0,61 ± 0,02 3,51 ± 0,03 0,91 ± 0,04 2,98 ± 0,02 2,78 ± 0,03

клоном М-4 3,10 ± 0,04 0,61 i 0,02 3,81 ± 0,05 1,08 ± 0,05 3.40 ± -0,03 3.41 ± 0,04

клоном М-5 3,00 ± 0,03 0,53 ± 0,03 3,50 ± 0,06 1,04 ± 0,04 3,18 ± 0,03 2,64 ± 0,05

клоном М-6 3,05 ± 0,04 0,60 ± 0,02 3,88 ± 0,04 1,11 ± 0,03 3,22 ± 0,03 3,53 ± 0,05

HIP05 0,09 0,04 0,10 0,10 0,09 0,10

Примгтка: над рискою - bmíct аагального азоту (%)-, п!д рискою - нагромадження надземно'1 частини (г cyxo'i речовини / рослину)

ЗПдно даним вегетащйного дослгду, проведеного в умовах грун-roBoï культури, вс! досл1джуван1 клони, як i в щщангй культур!, сприяли п1двшценню !нтенсивноста утворення б!омаси в! пер1од веге-тацП. Б1льш поаитивний ефект був при ОкуляцП клонами М-1 i М-4.

Анализ результат1В дослпджень (табл. 5) дозволяв зробити ви-сновок про позитивний вплив одержаних клонiв на масу зерна рослин гороху i його як!сть. Встановлено, що Мд впливом клон!в М-1, М-2 1 М-4 маса зерна на рослину в середньому за два роки по в1дношенню до контролю, п1двищувалась на 26,9 - 29,8 %., bmïct б!лку в зерн! -на 7,0 - 10,9 X. Б1льш псштний вплив на масу верна i bmIgt б1лку спостер1гався в рослинах з 1нокуляц1ею клоном М-4, прибавка при nopiBHHHHi з контролем складала в1дпов1дно 29,8 % i 10,9 %.

Таким чином, результата досл!джень дають п1дставу стверджувати про можлив1сть одержання ефективних ст1йких до п1двищеного вм1сту азоту клон1в бульбочкових бактер1й методом х!м1чного мутагенезу is застосуванням етилметансульфонату, 1 вперше показати вплив цих клон1в на фШожяччнг процеси i продуктивность рослин, як! куль-тивувались в присутност! морального азоту.

ВЙСНОВКИ

1. Вперше методом xiMi4Horo мутагенезу одержан1 клони бульбочкових бактер1й гороху, здатн1 утворювати ефективний бобово-ризоб!-альний симб1оз з рослинами гороху, вирощуваних при п1двищеному BMicTi морального азоту.

2. Одержан! клони мають покращену вхрулентну i азотф1ксуючу активн1сть при порхвняшп з вих1дним штамом 250а в присутност! Mi-нерального азоту в середовищ вирощуванкя.

3. Клони М-1, М-4 та 1золяти даних клон1в !з бульбочок рослин гороху, проявляють п!двиш,ен1 симб!отичн1 властивост! по вдаошенню до контролю на середовицах з 1,2 норми азоту по Гельр!гелю. Отже, властивгсть клон!в Шдвивдвати хнтенсивтсть симб!отично! азотф!к-сацП е спадковою, що дае можлив1сть ввагкати ui клони мутантами.

4. Досл1дн1 клони бактер1й п1двщують 1нтенсивн1сть фотосинтезу на 7,2 - 66,8 %, дихальну активн1сть на 8,4 - 54,2 BMicr хлорофШв "а+в" на 6,1 - 47,4 % при пор1внянн1 з контрольними ва-р!антами.

5. 1нокуляц!я новими клонами багегер1й сприяе зростанню !нтен-

Таблица 5

Вплив клонiе бульбочкових бактер!й на продуктивность зерна рослин гороху i bmíct б1лку в aepHi

Дан1 в середньому sa вегетащин! досл1ди 1992 - 1993 рр.

BapiaHT» досл1ду Maca зерна на рослину Вм1ст б1лку в зерн!

г • | % | до контролю 1 i на рослину,| % б!лку мг | i прибавка до контролю, %

Без 1нокуляц1! 0,55 ± 0,02 Í 82,31 ¡ 104,97 ¡ 18,96 i i i - 3,8

1нокулящя

штамом 250а 0,67 ± 0,03 100,0 133,80 19,70 0

клоном М-1 0,85 ± 0,03 126.9 184,49 21,58 + 9,5

клоном М-2 0,82 ± 0,03 122,8 173,97 21,07 + 7,0

клоном М-4 0,87 ± 0,03 129,8 193,8В 21,84 + 10,9

HIP05 0,04 . . . . ----------- — 7,75 0,22 ....... . i

cHBHoci'i нагромадасення азоту в рослинах гороху на 3,3 - 20,4 %. на протязх онтогенезу.

6. Застосування одержаних клон!в бактер1й при внесенн1 морального азоту збишшуе наростання надземноi частини на 5,5 -40,0 X, масу зерна на рослину - на 22,8 - 29,8 %, вм1ст б1лку в зернг на 7,0 - 10,9 %.

СПИСОК 0ПУБЛ1К0ВАНИХ ПРАДЬ

1. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Старченков Е.П, Симбиоти-ческие свойства клубеньковых бактерий гороха, образующих клубеньки на фоне повышенного содержания минерального азота // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - т. 26, N 3. - С. 240 - 245.

2. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Киризий Д.А., Старченков Е.П. Влияние инокуляции азогустойчивымы клонами клубеньковых бактерий на интенсивность фотосинтеза и азотфиксацвд у гороха // Физиология и биохимия культурных растений. - 1995. - т. 27, N 3.

- С. 169 - 173.

3. 0хр1менко С.М. Вшшв клон1в будьбочкових бактер1й, стшких до морального азоту, на ф1з1олог1чн1 процеси i продуктивншть рослин гороху У/ Физиология и биохимия культурных растений. - 1998.

- т. 30, N 2. - С. 138 - 143.

4. Мандровская Н.М., Охрименко С.М. Влияние минерального азота на жизнедеятельность клубеньковых бактерий в чистой культуре // Тез. докл. конф. "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений". - Киев, 1991. - С. 44.

5. Охрименко С.М. Использование этилметавсульфовата для получения клонов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к высоким дозам азота // Конференция молодых учёных "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", Киев, 26-28 м&ч 1992 г.: Тез. докл. - К.: ИФРГ HAH Украины, 1992. - С. 46.

6. 0хр1менко С.М. Вплив азотст!йких клон1в бульбочкових бакте-р1й гороху на iнтенсивнiсть деяких ф1з!олог1чних процес1в в росли-нах гороху // Конференция молодих вчених "Актуальн1 проблеми ф1з1о-логП рослин i генетики", Ктв, 9-11 жовтня 1996 р.-. Тези доп. -К.: ¡ФРГ HAH Украгни, 1996. - С. 26.

1?

АН0ТАЦ1Я

Охр!менко C.M. Симбютичнх властивост1, фотосинтез та продук-THBHicTb рослин гороху, шокульованих стшкими до морального азоту клонами бульбочкових бактерхй. - Рукопис.

Дисертац!я на адобутга наукового ступени кандидата б1олог1чних наук за спец1альн1отю 03.00.12 - ф!з1олог1я рослин. - 1нститут 3ioaorii рослин 1 генетики HAH Укра!ни, Ки!в, 2000.

Дисертацш присвячено одержанню клон1в бульбочкових бактер1й гороху, вивченню 'ix здатносг! до утвореиня симб!озу в присутносп пхдвищеного вм1сту морального азоту в субстрат! вирошування рослин i впливу !х на QCHOBHi ф!з1олог!чн1 процеси рослин гороху. Вперше методом xiMi4Horo мутагенезу одержан! клони бульбочкових бактер!й гороху, як! утворюкзть ефективний симб1оз з рослинами гороху при даних умовах, що дае п1дставу вважати ц! клони бактер1й ст!йкими до п!двищеного вм1сту м!нерального азоту.

В умовах вегетацш-шх дослдав (пЩана i грунтов! культури) вивчено вплив одержаних клон!в бульбочкових бактерхй гороху на 1н-тенсивнхсть ф!зхолог!чних процесхв в рослинах гороху сорту Солара, як1 вирощувались на пхдвищеному фон1 азоту (1,2 норми по Гельр1ге-лю) в субстрат!. Показано, що передтхявна хнокуляц1я зерна гороху досл1дними клонами сприяла вб1льшенню 1нтенсивност1 npoueciB буль-бочкоутворения, азотф1ксаци, фотосинтезу, темнового дихання, на-ростання б1омаси, нагромадження в н1й азоту i йгментхв, тдвищен-ню маси i якосг! зерна рослин гороху.

Ключовх слова: спйкх до тдвищеного вм1сту м!нерального азоту клони бульбочкових бактерхй гороху, симб!оз, !нтенсивн!сть ф1з!о-лог1чних npoueciB.

АННОТАЦИЯ

Охрименко С.М. Симбиотические свойства, фотосинтез и продуктивность растений гороха, инокулированных устойчивыми к минерального азоту клонами клубеньковых бактерий. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена получению клонов клубеньковых бактерий гороха, изучению их способности к образованию симбиоза в присутст-

вии повышенного содержания минерального азота в субстрате выращивания растений и влиянию их на основные физиологические процессы растений гороха. Впервые методом химического мутагенеза получены клоны клубеньковых бактерий гороха с такими свойствами, что даёт основание эти клоны бактерий считать устойчивыми к повышенному содержанию минерального азота.

Установлено, что жизнеспособность клубеньковых бактерий гороха штамма 250а на бобовом агаре зависит от дозы мутагена: при увеличении дозы происходит снижение числа выживших клеток. В результате проведенной серии опытов было отобрано 540 клонов, способных образовывать колонии в присутствии повышенной дозы азота - 50 мМ/л. После 4-5 пассажей способность к росту и образованию колоний сохранялась в 79,5 %. Предыдущая оценка вирулентности этих бактерий проведена в условиях микровегетационного опыта в субстрате. Установлено, что из опытных клонов 24 клонов образовывали 15-40 клубеньков на растение, зти бактерии и были использованы в наших последующих экспериментах.

В условиях вегетационных опытов (песчаные и почвенные культуры) изучено влияние полученных клонов на интенсивность физиологических процессов в растениях гороха сорта Солара, которые выращивались на повышенном фоне азота (1,2 нормы по Гельригелю) в субстрате. Данные свидетельствуют, что на вариантах с полученными клонами наблюдается более интенсивное протекание процесса клубенько-обр&зования на протяжении онтогенеза при сравнении с контрольными вариантами, где образовывались мелкие, неактивные клубеньки в небольшом количестве. Опытные клоны бактерий более активно фиксировали атмосферный азот в симбиозе с растениями гороха. В контрольных вариантах азотфиксирущая активность отсутствовала или была незначительной. Инокуляция полученными клонами бактерий увеличивала интенсивность азотфиксацш и образование биомассы не только при повышенном содержании азота (1,2 нормы ), но и при низкой концентрации азота (0,2 нормы). Обнаружено, что клоны М-1, М-4 и изоляты данных клонов из клубеньков растений гороха проявляют повышенные симбиотические свойства по отношению к контролю (исходному штамму 250а), что свидетельствует о наследуемости полученных свойств и даёт возможность считать эти клоны бактерий мутантами. На вариантах с инокуляцией клонами наблюдалася более высокая интенсивность фотосинтеза при расчёте в мг С0г на растение за час и в мг С02 на

грамм сухого вещества за час. Применение клонов приводило также к увеличению содержания пигментов на протяжении вегетации. Опытные клоны повышают дыхательную активность растений в онтогенезе при сравнении с контролем. Установлено, что инокуляция полученными клонами увеличивает содержание азота в надземной массе в период их вегетации. Максимальное содержание азота наблюдалось в фазу бутонизации. Растения, инокулированные клонами содержали больше азота при сравнении с контролем на 4,17-15,48 %. Обнаружено, что в результате повышения интенсивности физиологических процессов в растениях под влиянием клонов увеличивалось образование надземной массы и корней растений на протяжении вегетационного периода как в песчаной, так и в почвенной культурах. Наиболее положительный эффект был при инокуляции клонами М-1, М-4, М-6. Анализ результатов исследований свидетельствует о том, что применение клонов повышает массу зерна растений гороха и улучшает его качество.

Результаты исследований полученных клонов бактерий, по влиянию их на уровень сммбиотического питания и интенсивность физиологических процессов в растениях показывают возможность создания штаммов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к повышенному содержанию минерального азота, с целью максимального использования биологического азота для вырашдвания экологически чистой продукции. Опытные клоны могут быть объектами в модельных системах бобовые растения - ризобии для изучения процессов устойчивости симбиоза к минеральному азоту, распознавания партнёров при образовании симбиоза и функционирования симбиотической системы.

Ключевые слова: устойчивые к повышенному содержанию минерального азота клоны клубеньковых бактерий гороха, симбиоз, интенсивность физиологических процессов.

ANNOTATION

OKhrimenko S.M. Symbiotic properties, photosyntesis and productivity of pea plants, inoculated with clones of nodule bacteria, resistant to mineral nitrogen. - Manuscript.

' The thesis for Ph. D. degree (Biology), speciality 03.00.12 -plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the reception of pea nodule bacterium clones and to investigating of their- ability to create effective

symbiosis in the presence of the increased content of combined nitrogen in growth medium. Pea nodule bacterium clones with property to form effective symbiosis with pea plant under these growth conditions were obtained for the first time owing to chemical mutagene. This indicates gives reason to consider that these clones are resistant to heightened mineral nitrogen content.

The effect of the clones under investigation on the intensity of physiological processes in pea plant (Solara cv) grown against the heightened nitrogen background (1,2 of Gelrigel normal) in the substrate was studied in vegetative experiments (sand and soil cultures). It has been shown that the presowing inoculation of pea grain grown by the above mentioned clones contributed to the increase in the intensity of nodule development, nitrogen fixation, photosynthesis, dark respiration processes, biomass and nitrogen and pigment accumulation, the rise in grain weight and protein contents in it.

Key words: pea nodule bacterium clones, resistant to heightened nitrogen content, symbiosis, intensity of physiological processes.

Пади. до друку 8.02.2000. Формат 60 х 90 '/,6 • rianip офс. Гарштура "Тайме". Друк офс. Ум. друк. арк. 1,25. Обл.-вид. арк. 2,0. Тираж 100 прим. Зам. 12.

Видавництво "ЛОГОС" 01030, Киш-30, вул. Богдана Хмельницького, 10