Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сигнальные белки нервных окончаний GAP-43 и BASP1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захаров, Владислав Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структурные и биохимические свойства белков GAP-43 и BASP

1.1.1 Физико-химические свойства.

1.1.2 Первичная структура белков GAP-43 и BASP1.

1.1.3 Взаимодействие с мембраной.

1.1.4 Фосфорилирование и дефосфорилирование

1.1.5 Взаимодействие с кальмодулином.

1.1.6 Протеолиз белка GAP

1.1.7 Взаимодействие белка GAP-43 с F-актином.

1.1.8 Активация белка Go белком GAP-43..

1.1.9 Гидродинамические свойства белка GAP

1.2 Функциональная роль белков GAP-43 и BASP12?

1.2.1 Участие белков GAP-43 и BASP1 в нейритогенезе и нейрорегенерации:

1.2.1.1 Экспрессия GAP-43 и В ASP 1 в онтогенезе: "GAP-гипотеза"

1.2.1.2 Влияние экспрессии GAP-43 и BASP1 на морфологию клеток и конусов роста.2.

1.2.1.3 Роль белков GAP-43 и BASP1 в нейрорегенерации

1.2.1.4 Сверхэкспрессия GAP-43 и BASP1 в трансгенных мышах

1.2.1.5 Нокаут генов GAP-43 и BASP1 у мышей

1.2.1.6 Молекулярные механизмы функционирования белков

GAP-43 и BASP1.

1.2.2 Роль белка GAP-43 в пластичности нервной системы.

1.2.3 Роль белка GAP-43 в секреции нейромедиатора

1.2.4 Роль белка GAP-43 в регуляции нейронного апоптоза.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы исследования.

2.2 Субклеточное фракционирование нервной ткани.

2.3 Выделение белков GAP-43 и BASP1.

2.3.1 Экстракция белков GAP-43 и BASP1 тритоном Х-100/хлорной кислотой.

2.3.2 Экстракция белков GAP-43 и BASP1 хлороформом/ трихлоруксусной кислотой

2.4 Эндогенный протеолиз белка GAP-43 в синаптосомах и цитозоле.8.

2.5 Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.5.1 Электрофорез в системе уксусная кислота/мочевина.

2.5.2 Электрофорез в системе уксусная кислота/мочевина/тритон Х

2.5.3 Электрофорез с додецилсульфатом натрия

2.5.4 Электрофорез в неденатурирующих условиях...

2.5.5 Окраска белков в полиакриламидном геле

2.6 Двумерный электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.7 Препаративный электрофорез белков

2.8 Иммуноблоттинг белков......

2.9 Пептидное картирование

2.10 Гель-фильтрация

2.11 Другие методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Обнаружение белков, иммунохимически родственных белкам

GAP-43 и BASP1.

3.2 Специфический кальций-зависимый протеолиз белка GAP-43..

3.2.1 Содержание фрагментов белка GAP-43 (GAP-43-2 и GAP-43-3) в мозге крысы

3.2.2 Распределение фрагментов GAP-43-2 и GAP-43-3 в клетке

3.2.3 Протеолиз белка GAP-43 в синаптосомах и цитозоле

3.2.4 Молекулярно-структурные особенности белка GAP-43 как субстрата кальпаина

3.2.5 Кальциевая зависимость протеолиза белка GAP-43 в синаптосомах

3.2.6 Протеолиз белка GAP-43 под действием очищенного кальпаина

3.2.7 Физиологическая значимость специфического протеолиза белка

GAP-43.

3.3 Минорные изоформы белка BASPl.1.

3.3.1 Содержание минорных изоформ белка BASP1 в мозге крысы

3.3.2 Оценка молекулярной массы минорных изоформ белка BASP1..

3.3.3 Миристилирование минорных изоформ белка BASP11.1.

3.3.4 Минорные изоформы белка BASP1 в различных тканях..1.

3.3.5 Минорные изоформы белка BASP1 у различных млекопитающих

3.3.6 Пептидное картирование минорных изоформ белка BASP1 коровы..

3.3.7 Механизм образования минорных изоформ белка BASP

3.4 Гидродинамические свойства белков GAP-43 и BASP

3.4.1 Образование мультимерных комплексов белками GAP-43 и В ASP 1.

3.4.2 Влияние различных факторов на агрегацию белков GAP-43 и BASP1.

3.4.3 Оценка гидродинамических характеристик мономеров

GAP-43 и BASP

3.4.4 Оценка размеров гомомультимерных комплексов белков

GAP-43 и BASP1.

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сигнальные белки нервных окончаний GAP-43 и BASP1"

Актуальность проблемы.

Актуальной проблемой современной нейрохимии является детальное описание на молекулярном уровне процессов, происходящих в нервных окончаниях в ответ внутренние и внешние сигналы. Одно из необходимых условий для понимания этих процессов -максимально полная характеристика присутствующих в нервных окончаниях сигнальных белков. Белки GAP-43 (В-50, neuromodulin) и BASP1 (САР-23, NAP-22) являются одними из ключевых регуляторных белков нервных окончаний (Benowitz and Routtenberg, 1997; Oestreicher et al., 1997; Caroni et al., 1997; Frey et al., 2000). При развитии нервной системы белки GAP-43 и BASP1 играют важнейшую роль в росте нейритов и "навигации" их конусов роста по ориентирующим внеклеточным сигналам, что необходимо для формирования сложной топографии межнейрональных связей. С другой стороны, эти белки участвуют в поддержании пластичности нервной системы взрослого организма: они контролируют усиление или дестабилизацию (пластичность) синапсов, а также реорганизацию синапти-ческих контактов в течение всей жизни.

Белки GAP-43 и BASP1 объединяет целый ряд сходных физико-химических и биохимических свойств (Mosevitsky et al., 1994; Wiederkehr et al., 1997; Frey et al., 2000). Многочисленные данные свидетельствуют, что эти белки являются своеобразными маркерами развития и пластических процессов в нервной системе. Наивысший уровень экспрессии белков GAP-43 и BASP1 в мозге наблюдается во время эмбрионального и раннего постна-тального развития, что связано с участием этих белков в нейрито- и синаптогенезе. В зрелом мозге высокий уровень экспрессии белков GAP-43 и BASP1 сохраняется только в ассоциативных областях, где синапсы наиболее пластичны, и которые участвуют в формировании памяти и обучении. В зрелых нейронах экспрессия белков GAP-43 и BASP1 специфически усиливается при нейрорегенеративных процессах, развивающихся в ответ на различные повреждения нервной системы вследствие травмы или патологических состояний.

Белки GAP-43 и BASP1 являются модуляторами образования новых отростков у нервных клеток и концевого ветвления аксонов. Уровень экспрессии GAP-43 и BASP1 в клетках PC 12 и нейробластомы прямым образом связан с их способностью к образованию нейритов. Даже в клетках не нейронального происхождения (например, в фибробластах) экспрессия GAP-43 и BASP1 индуцирует рост отростков и реорганизацию мембранного цитоскелета. В нейронах содержание белка GAP-43 в конусах роста критическим образом влияет на их морфологию. Подавление экспрессии GAP-43 в культуре сенсорных нейронов спинальных ганглиев с помощью антисмысловых олигонуклеотидов приводит к образованию нейритов со слабо выраженными, нестабильными конусами роста, неспособными отвечать на внешние сигналы и имеющих плохую адгезию к субстрату (Aigner and Caroni, 1995). Сверхэкспрессия белков GAP-43 и BASP1 в трансгенных мышах приводит к усилению ветвления аксонных окончаний нейронов (Caroni et al., 1997). Данный процесс играет важную роль в нейрорегенерации и пластичности нервной системы взрослого организма. Сверхэкспрессия белка GAP-43 приводит также к сильному повышению у мышей способности к обучению (Routtenberg et al., 2000). Одновременная сверхэкспрессия белков GAP-43 и BASP1 значительно увеличивает регенеративные способности нейронов спинальных ганглиев при повреждении их центральных аксонов в спинном мозге (Bomze et al., 2001). Разрушение (нокаут) гена GAP-43 у мышей приводит к тому, что 90-95% мышей умирает вскоре после рождения вследствие сильных отклонений в развитии нервной системы, обусловленных нарушением правильной ориентации конусов роста нейритов при поиске ими клеток-мишеней (Maier et al., 1999; Zhu and Julien, 1999; Zhang et al., 2000). Также показано, что белок GAP-43 способен усиливать процесс освобождения нервными окончаниями нейромедиатора (Hens et al., 1993). В литературе есть также сведения о том, что сверхэкспрессия GAP-43 делает нейроны предрасположенными к клеточной гибели при повреждении аксонов, а отсутствие GAP-43, напротив, делает нейроны толерантными к аксотомии и к некоторым апоптотическим стимулам (Gagliardini et al., 2000; Wehrle et al., 2001).

Известными биохимическими свойствами белков GAP-43 и BASP1 являются их связь с мембраной и актиновым мембранным цитоскелетом, фосфорилирование протеин-киназой С (ПКС) и способность к взаимодействию с кальмодулином. Белок GAP-43 способен активировать нейронный ГТФ-связывающий белок Go (Maekawa et al., 1993, 1994; Oestreicher et al., 1997; Mosevitsky et al., 1997; Laux et al., 2000). Предполагаемый механизм действия белков GAP-43 и BASP1 в конусах роста заключается в регуляции локальной подвижности мембраны и мембранного цитоскелета за счет инициации направленной полимеризации актина, регулируемой ПКС и кальмодулином. Фосфорилирование ПКС остатка Ser41 считается центральным событием в функционировании белка GAP-43. Именно фосфорилированная форма GAP-43 накапливается в растущих филоподиях и ламеллах на переднем фронте конусов роста, в то время как втягиваемые отростки и коллапсирую-щие конусы роста содержат нефосфорилированную форму GAP-43. Фосфорилирование остатка Ser41 белка GAP-43 также играет важную роль в пластичности синапсов. Предположительно, поддержание белка GAP-43 в фосфорилированной форме приводит к долговременному усилению синапсов, возможно, за счет активации белка Go и поддержания пресинаптической мембраны в деполяризованном состоянии. Детали всех упомянутых выше процессов на молекулярном уровне пока остаются неясными. Неизвестно также, какие структурные изменения белка GAP-43 участвуют в регуляции механизмов клеточной гибели. Таким образом, несмотря на обширные данные о роли сигнальных белков GAP-43 и BASP1 в нейроонтогенезе и пластических процессах в нервной системе, молекулярные механизмы их участия в этих процессах остаются нераскрытыми. Поэтому весьма актуальной проблемой остается исследование новых молекулярных аспектов участия белков GAP-43 и BASP1 в регулируемых ими процессах.

Цели и зада чи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование на молекулярно-биологическом уровне новых аспектов функционирования в клетке сигнальных белков нервных окончаний GAP-43 и BASP1. Задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Исследовать специфический протеолиз белка GAP-43, приводящий к образованию двух его фрагментов, лишенных с N-конца 4 и 40 аминокислотных остатков (GAP-435"226 и GAP-4341"226, далее GAP-43-2 и GAP-43-3, соответственно), как способ регуляции сигнальных функций этого белка.

2. Изучить и идентифицировать группу минорных белков, проявляющих иммунохими-ческое сродство к антителам, полученным к белку BASP1.

3. Исследовать необычные молекулярные свойства белков GAP-43 и BASP1, проявляющиеся в аномально больших размерах и массах молекул этих белков, измеряемых с помощью гидродинамических методов.

4. Связать данные, полученные в пунктах 1-3, со специфическими особенностями структуры белков GAP-43 и BASP1 и с их возможными функциями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фрагменты белка GAP-43, лишенные с N-конца 4 и 40 аминокислотных остатков (GAP-43-2 и GAP-43-3), присутствуют в мозге in vivo, а не являются артефактом процедуры их выделения. Их образование обусловлено специфическим кальций-зависимым про-теолизом белка GAP-43 под действием цистеиновой протеазы кальпаин. Специфический протеолиз белка GAP-43, вероятно, является одним из основных путей регуляции его сигнальных функций в нервной клетке.

2. В клетке существует ряд белков, реагирующих с поликлональными антителами к белку BASP1. Эти белки представляют собой укороченные с С-конца фрагменты белка BASP1 и, вероятно, являются его минорными изоформами. Их экспрессия обнаруживается в различных тканях, содержащих белок BASP1, - мозге, почках, семенниках и др. Сходные наборы минорных изоформ белка BASP1 присутствуют в клетках мозга крысы, коровы и человека.

3. Мономерные формы белков GAP-43 и BASP1 имеют сильно асимметричную форму. В физиологических условиях белки GAP-43 и BASP1 образуют гомомультимерные комплексы, состоящие примерно из 15 мономерных молекул. Образование комплексов происходит за счет электростатических межмолекулярных взаимодействий.

Научная новизна работы.

Впервые показано, что фрагменты белка GAP-43 (GAP-43-2 и GAP-43-3) присутствуют в мозге in vivo и являются продуктами специфического кальций-зависимого протео-лиза белка GAP-43. Доказано, что этот протеолиз обусловлен действием цистеиновой кальций-зависимой нейтральной протеазы кальпаин. Показано, что в образовании фрагмента GAP-43-3 участвует m-кальпаин. В первичной структуре белка GAP-43 были выявлены специфические участки, характерные для субстратов кальпаина. Исследовано распределение фрагментов GAP-43-2 и GAP-43-3 по различным субклеточным фракциям. Предложена новая концепция, согласно которой специфический протеолиз белка GAP-43 является важным механизмом регуляции его активности.

Впервые показано, что белок BASP1 содержится в клетке совместно с целым рядом его минорных изоформ, обнаруживаемых с помощью поликлональных антител к белку BASP1. Частично охарактеризованы свойства минорных изоформ белка BASP1. Показано, что они являются фрагментами белка BASP1, имеющими общий с ним миристилирован-ный N-конец и лишенными С-концевых участков различной длины. Исследовано распределение минорных изоформ в различных тканях крысы, а также в мозге различных организмов.

Впервые установлен факт гомомультимеризации белков GAP-43 и BASP1. Полученные результаты позволяют объяснить разрозненные литературные данные, указывающие на необычные гидродинамические свойства белка GAP-43. Ранее эти свойства объясняли высоко асимметричной формой его молекулы, его агрегацией с другими белками или образованием тетрамера. Исследован характер межмолекулярных взаимодействий, обуславливающих мультимеризацию белков GAP-43 и BASP1. Определены форма и размеры мономерных форм белков GAP-43 и BASP1. Оценена масса их мультимерных комплексов. Выдвинута гипотеза о роли мультимерных комплексов белков GAP-43 и BASP1 в контроле локальной динамики плазматической мембраны.

Теоретическое и практическое зна чение работы.

Полученные данные о специфическом кальций-зависимом протеолизе белка GAP-43, обусловленном действием кальпаина, существенно расширяют и дополняют сложившиеся к настоящему времени представления о механизмах функционирования белка GAP-43, как сигнального белка нервных окончаний.

Данные, полученные в ходе изучения минорных изоформ белка BASP1, стимулируют проведение дальнейших исследований, направленных на определение механизма их образования и функциональной роли в клетке.

Полученные данные о мультимеризации белков GAP-43 и BASP1 расширяют список общих физико-химических и структурных свойств этих белков, а также вносят существенный вклад в понимание структурных аспектов функционирования этих белков в клетке.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Захаров, Владислав Викторович

4. ВЫВОДЫ

1. Фрагменты белка GAP-43, лишенные с N-конца 4 и 40 аминокислотных остатков (GAP-43-2 и GAP-43-3), не являются артефактом процедуры выделения белка, а присутствуют в мозге in vivo.

2. Специфический протеолиз белка GAP-43, приводящий к образованию фрагментов GAP-43-2 и GAP-43-3, обусловлен действием цистеиновой кальций-зависимой про-теазы кальпаин. В образовании фрагмента GAP-43-3 участвует ш-кальпаин.

3. В клетке существует ряд минорных изоформ белка BASP1, реагирующих со специфическими антителами к белку BASP1 и являющихся укороченными с С-конца фрагментами белка BASP1.

4. Идентичные наборы минорных изоформ белка BASP1 присутствуют в различных тканях крысы, содержащих белок BASP1 - мозге, почках, семенниках и др. Сходные наборы минорных изоформ белка BASP1 также присутствуют в клетках мозга крысы, коровы и человека, что свидетельствует об их физиологической значимости.

5. Молекулы белков GAP-43 и BASP1 имеют сильно асимметричную (вытянутую либо сплющенную) форму, что проявляется в их необычных гидродинамических характеристиках (высоком значении кажущейся молекулярной массы при гель-фильтрации и большом эффективном молекулярном радиусе).

6. При физиологических условиях среды белки GAP-43 и BASP1 образуют гомомуль-тимерные комплексы, состоящие примерно из 15 молекул и имеющие сильно асимметричную форму.

7. Образование белками GAP-43 и BASP1 мультимерных комплексов обусловлено электростатическими межмолекулярными взаимодействиями. Важную роль в этом явлении могут играть основные и кислые домены, обнаруженные в аминокислотных последовательностях этих белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захаров, Владислав Викторович, Санкт-Петербург

1. Aigner L., Caroni P. (1993) Depletion of 43-kD growth-associated protein in primary sensory neurons leads to diminished formation and spreading of growth cones. J. Cell Biol 123, 417-429

2. Andreasen Т.К., Luetie C.W., Heideman W., Storm D.R. (1983) Purification of a novel calmodulin binding protein from bovine cerebral cortex membranes. Biochemistry 22, 46154618

3. Apel E.D., Byford M.F., Au D., Walsh K.A., Storm D.R. (1990) Identification of the protein kinase С phosphorylation site in neuromodulin.Identification of the protein kinase С phosphorylation site in neuromodulin. Biochemistry 29, 2330-2335

4. Apel E.D., Litchfield D.W., Clark R.H., Krebs E.G., Storm D.R. (1991) Phosphorylation of neuromodulin (GAP-43) by casein kinase—II. Identification of phosphorylation sites and regulation by cahnodutin. J. Biol. Chem. 266, 10544-10551

5. Ami S., Keilbaugh S.A., Ostermeyer A.G., Brown D A. (1998) Association of GAP-43 with detergent-resistant membranes requires two palmitoylated cysteine residues. J. Biol. Chem.273, 28478-28485

6. Asai A., Qiu J., Narita Y., Chi S., Saito N., Shinoura N., Hamada H., Kuchino Y., Kirino T. (1999) High level calcineurin activity predisposes neuronal cells to apoptosis. J. Biol. Chem.274, 34450-34458

7. Babu Y.S., Bugg C.E., Cook W.J. (1988) Structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution./. Mol. Biol. 204, 191-204

8. Baetge E.E., Hammang J.P. (1991) Neurite outgrowth in PC12 cells deficient in GAP-43. Neuron 6, 21-30.

9. Bairoch A. (1991) Prosite: a dictionary of sites and patterns in proteins. Nucleic Acids Res. 19, 2241-2245

10. Bark I.C., Wilson M.C. (1994) Human cDNA clones encoding two different isoforms of the nerve terminal protein SNAP-25. Gene 139, 291-292

11. Barnes J.A., Gomes A.V. (1995) PEST sequences in calmodulin-binding proteins. Mol. Cell Biochem. 149/150, 17-27

12. Benfey M., Aguayo A.J. (1982) Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature 296, 150-152

13. Bengtsson Т., Sarndahl E., Stendahl O., Andersson T. (1990) Involvement of GTP-binding proteins in actin polymerization in human neutrophils. Proc. Natl. Acad Sci. USA 87, 29212925

14. Bennett M.R. (2000) The concept of long term potentiation of transmission at synapses. Prog. Neurobiol. 60, 109-137

15. Benowitz L.I., Lewis E.R. (1983) Increased transport of 44000 to 49 000-dalton acidic proteins during regeneration of the goldfish optic nerve. J. Neurosci. 3, 2153-2163.

16. Benowitz, L. I., Perrone-Bizzozero, N. Г. and Finklestein, S. P. (1987) Molecular properties of the growth-associated protein GAP-43 (B-50). J. Neurochem. 48, 1640-1647.

17. Benowitz L.I., Perrone-Bizzozero N.I., Finklestein S.P., Bird E.D. (1989) Localization of the growth-associated phosphoprotein GAP-43 (B-50, Fl) in the human cerebral cortex. J. Neurosci. 9, 990-995.

18. Benowitz L.I., Routtenberg А. (1997) GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci. 20, 84-91

19. Bernstein B.W., DeWit M., Bamburg J.R. (1998) Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Mol Brain Res. 53, 236250

20. Bhatnagar Y.M., Bellve A.R. (1978) Two-dimensional electrophoretic analysis of major histone species and their variants from somatic and germ-line tissue. Anal. Biochem. 86, 754-760

21. Bisby M.A., Tetzlaff W., Brown M.C. (1996) GAP-43 mRNA in mouse motoneurons undergoing axonal sprouting in response to muscle paralysis or partial denervation. Eur. J. Neurosci. 8, 1240-1248.

22. Bisby M.A. (1988) Dependence of GAP43 (B50, Fl) transport on axonal regeneration in rat dorsal root ganglion neurons. Brain Res. 458,157-161.

23. Blackshear P.J. (1993) The MARCKS family of cellular protein kinase С substrates. J. Biol. Chem. 268, 1501-1504

24. Blanquet P.R. (2000) Casein kinase 2 as a potentially important enzyme in the nervous system. Prog. Neurobiol. 60, 211-246

25. Bliss T.V.P., Collingridge G.L. (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361, 31-39.

26. Bliss T.V., Lome T. (1973) Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356

27. Bliss T.V.P., Douglas R.M., Errington ML., Lynch M.A. (1986) Correlation between long-term potentiation and release of endogenous ammo acids from dentate gyms of anaesthetized rats. J. Physiol. (Lond.) 311, 391-408.

28. Bomze H.M., Bulsara K.R., Iskandar B.J., Caroni P., Skene J.H.P. (2001) Spinal axon regeneration evoked by replacing two growth cone proteins in adult neurons. Nat. Neurosci. 4, 38-43

29. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254

30. Brittis P.A., Silver J. (1995) Multiple factors govern intraretinal axon guidance: a time-lapse study. Mol. Cell Neurosci. 6, 413-432

31. Burry R.W., Perrone-Bizzozero N.I. (1993) Nerve growth factor stimulates GAP-43 expression inPC12 cell clones independently of neurite outgrowth. J. Neurosci. Res. 36, 241-251.

32. Res. Comm. 247, 193-203 Caroni P., Aigner L., Schneider C. (1997) Intrinsic neuronal determinants locally regulate extra-synaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J. Cell Biol. 136, 679692.

33. Caroni P. (1997a) Intrinsic neuronal determinants that promote axonal sprouting and elongation. BioEssays 19, 767-775

34. Caroni P. (1997b) Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of the adulttransgenic mice. J. Neurosci. Meth. 71,3-9 Caroni P. (1998) Neuro-regeneration: plasticity for repair and adaptation. Essays Biochem. 33, 53-64

35. Caroni P. (2001) Actin cytoskeleton regulation through modulation of PI(4,5)P2 rafts. EMBO J. 20, 4332-4336

36. Costello В., Meymandi A., Freeman J.A. (1990) Factors influencing GAP-43 gene expression in

37. Dani J.W., Armstrong D.M., Benowitz L.I. (1991) Mapping the development of the rat brain by

38. Doherty P., Fazeli M.S., Walsh F.S. (1995) The neural cell adhesion molecule and synaptic plasticity. J. Neurobiol. 26,437-446 Dokas L.A., Pisano M.R., Schrama L.H., Zwiers H, Gispen W.H. (1990) Dephosphorylation of

39. Edelman A.M., Blumenthal D.K., Krebs E.G. (1987) Protein serine/threonine kinases. Annu.

40. Frey D., Laux Т., Xu L., Schneider C., Caroni P. (2000) Shared and unique roles of CAP23 and GAP43 in actin regulation, neurite outgrowth, and anatomical plasticity. J. Cell Biol 149, 1443-1453

41. Gamby C., Waage M.C., Alien R.G., Baizer L. (1996b) Analysis of the role of calmodulin binding and sequestration in neuromodulin (GAP-43) function. J. Biol Chem. 271, 26698-26705

42. Harding D.I., Greensmith L., Mason M., Anderson P.N., Vrbova G. (1999) Overexpression of GAP-43 induces prolonged sprouting and causes death of adult motoneurons. Eur. J. Neurosci. 11,2237-2242

43. Hamta Т., Takamia N., Ohmuraa M., Misumi Y, Ikehara Y. (1997) Ca2+-dependent interaction of the growth-associated protein GAP-43 with the synaptic core complex. Biochem. J. 325, 455-463

44. Hassan S.M., Jennekens F.G.I., Veldman H., Oestreicher A.B. (1994) GAP-43 and p75NGFR immunoreactivity in presynaptic cells following neuromuscular blockade by botulinum toxin in rat. J. Neurocytol. 23, 354-363

45. Maekawa S., Maekawa М., Hattori S., Nakamura S. (1993) Purification and molecular cloning of a novel acidic calmodulin-binding protein from rat brain. J. Biol. Chem. 268, 1370313709

46. Matus M (2000) Actin-based plasticity in dendritic spines. Science 290, 754-758 Mcintosh H., Parkinson D., Meiri K.F., Daw N., Willard M. (1989) A GAP-43-like protein in cat visual cortex. Visual Neurosci. 2, 583-591

47. Mosevitsky M.I., Novitskaya V.A., Plekhanov AY., Skladehikova G.Y. (1994) Neuronal protein GAP-43 is a member of novel group of brain acid-soluble proteins (BASPs). Neurosci. Res. 19, 223-228

48. Neve R.L., Ivins K.J., Benowitz L.I., During M.J., Geller A.I. (1991) Molecular analysis of the function of the neuronal growth-associated protein GAP-43 by genetic intervention. Molec. Neurobiol. 5,131-141

49. Oppenheim R.W., Schwartz L.M., Shatz C.J. (1992) Neuronal death, a tradition of dying. J.

50. Perrone-Bizzozero N.I., Weiner D., Hauser G., Benowitz L.I. (1988) Extraction of major acidic

51. Richardson P.M., Issa V.M. (1984) Peripheral injury enhances central regeneration of primarysensory neurones. Nature 309, 791-793 Riederer B.M., Routtenberg A. (1999) Can GAP-43 interact with brain spectrin? Mol. Brain Res. 71, 345-348

52. Simons K., Toomre D. (2000) Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 3141

53. Sudhof T.C. (1995) The synaptic vesicle cycle: A cascade of protein-protein interactions. Nature 375, 645-653

54. Sudo Y., Valenzuela D., Beck Sickinger A.G., Fishman M.C., Strittmatter S.M. (1992) Palmitoy-lation alters protein activity: blockade of Go stimulation by GAP-43. EMBO J. 11, 20952102

55. Schwann cells after axotomy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83,4094-4098 Tao H.W., Poo M. (2001) Retrograde signaling at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 11009-110

56. Tulchin N., Ornstein L„ Davis B.J. (1976) A microgel system for disc electrophoresis. Anal. Biochem. 72, 485-490

57. Van Hooff C O. M., De Graan P.N.E., Oestreicher A.B., Gispen W.H. (1988) B-50 phosphorylation and polyphosphoinositide metabolism in nerve growth cone membranes. J. Neurosci. 8, 1789-1795

58. Yamamoto Y., Sokawa Y., Maekawa S. (1997) Biochemical evidence for the presence of NAP-22, a novel acidic calmodulin binding protein, in the synaptic vesicles of rat brain. Neurosci. Lett. 224, 127-130

59. Yankner В.А., Benowitz L.I., Villa-Komaroff L., Neve R.L. (1990) Transfection of PC12 cells with the human GAP-43 gene: effects on neurite outgrowth and regeneration. Molec. Brain Res. 7, 39-44

60. Yao G.L., Kiyama H., Tohyama M. (1993) Distribution of GAP-43 (BSO/F1) messenger RNA in the adult rat brain by in situ hybridization using an alkaline phosphatase-labelled probe. Molec. Brain Res. 18. 1-16

61. Young E.A., Owen E.H., Meiri K.F., Wehner J.M. (2000) Alterations in hippocampal GAP-43 phosphorylation and protein level following contextual fear conditioning. Brain Res. 860, 95-103

62. Zhang F., Lu C., Severin C., Sretavan D.W. (2000) GAP-43 mediates retinal axon interaction with lateral diencephalon cells during optic tract formation. Development 127, 969-980

63. Zhao W., Ng КГТ., Sedman G.L. (1995) Passive avoidance learning induced change in GAP43 phosphorylation in day-old chicks. Brain Res. Bull. 36, 11-17

64. Zheng X., Bobich J.A. (1998) A sequential view of neurotransmitter release. Brain Res. Bull., 47, 117-128

65. Zhu Q., Julien J.-P. (1999) A key role for GAP-43 in the retinotectal topographic organization. Exp. Neurol. 155, 228-242

66. Zweidler A., Cohen L.H. (1972) A new electrophoretic method revealing multiplicity, tissue specificity and evolutionary variation in histones F2a2 and F2b. Fed. Proc. 31, 926 (abstract)

67. Zweidler A. (1977) Resolution of histones by polyacrylamide gel electrophoresis in presence of nonionic detergents. In Methods in Cell Biology, vol. 17 (New York: Academic Press) pp. 223-233

68. Zwiers H., Schotman P., Gispen W.H. (1980a) Purification and some characteristics of an ACTH-sensitive protein kinase and its substrate protein in rat brain membranes. J. Neurochem. 34, 1689-1699

69. Zwiers H., Verhoef J., Schotman P., Gispen W.H. (1980b) A new phosphorylation-inhibiting peptide (PIP) with behavioral activity from rat brain membranes. FEBS Lett. 112, 168-172

70. Zwiers H., Gispen W.H., Kleine L., Mahler H.R. (1982) Specific proteolysis of a brain membrane phosphoprotein (B-50): effects of calcium and calmodulin. Neurochem. Res. 7, 127137

71. Zuber M.X., Goodman D.W., Karns L.R., Fishman M.C. (1989a) The neuronal growth-associated protein GAP-43 induces fflopodia in non-neuronal cells. Science 224, 1193-1195

72. Zuber M X., Strittmatter S.M., Fishman M.C. (1989b) A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature 341, 345-348