Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СООТНОШЕНИЯ ВИДОВ ФУЗАРИУМА

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СООТНОШЕНИЯ ВИДОВ ФУЗАРИУМА"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

ЛА _ О Ь/ , Н° правах рукописи

ЭДЕЛЬГАРД ФЕСПЕР

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СООТНОШЕНИЯ ВИДОВ ФУЗАРИУМА

(Специальность № 06.01-11 — фитопатология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -

1974

Диссертационная работа выполнена на кафедре фитопатологии Московской ордена Ленина/и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор сельскохозяйственных наук заслуженный деятель науки РСФСР академик ВАСХНИЛ профессор М. С. Дунин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук проф. 3. Э. Беккер; кандидат биологических наук Е. В. Кувшинова.

Ведущее учреждение—кафедра низших растений МГУ..

4 Автореферат разослан « ?]£?> .Ш. . . . 1974 года.

♦ Защита диссертации состоится 8 апреля 1974 г. в 16 час. на заседании 1-'ченого совета агрономического факультета ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА (10-й корпус). • - .

Просим Вас принять личное участие в работе указанного Совета или прислать.письменный отзыв по данному ' автореферату по адресу: 125008, Москва А-8, Тимирязевская ул., 19, корпус 8, Ученый совет ТСХА.

Отзывы, заверенные печатью, просьба направлять в двух экземплярах. .

Ученый секретарь академии с—>6А0 -х-

доцент • Ф. А. ДевошЛж.

т я

ВВЕДЕНИЕ

Среди многих вопросов биологической науки вообще и микологии в частности, требующих дальнейшей разработки, вопрос о естественной (филогенетической) системе и классификации отдельных групп грибов имеет важное теоретическое и практическое значение, так как помогает выяснению вопросов паразитической специализации (избирательности) фитопато-генных грибов, позволяет лучше обосновать выбор и прнмене--ние севооборотов и других профилактических мероприятий при построении интегрированных систем защиты растений.

Род Fusarium объединяет виды грибов, широко распространенных на разнообразных субстратах. Преобладающее. число видов этого рода может быть отнесено к фитотрофным грибам, вызывающим весьма вредоносные заболевания сельскохозяйственных растений. В общей сложности грибы рода Fusarium поражают около 200 видов культурных растений, принадлежащих к 52 семействам. При этом поражение фуза-риумами ряда сельскохозяйственных культур достигает больших размеров и иногда снижает урожай льна и зерновых культур до 50% (Ранлло, 1950).

Род Fusarium в биологическом отношении представляет весьма полиморфную неоднородную группу видов, классификация которых до сих пор не может считаться достаточно обоснованной. Фенотипическая изменчивость морфологических и физиологических признаков, используемых для разграничения отдельных таксономических единиц в пределах этого рода, весьма усложняет построение системы. Мы неходим из представления о том, что морфологические и физиологические признаки, являющиеся до сих пор главными критериями при решении таксономических вопросов в микологии и фитопатологии, представляют собой только форму выражения генетической информации. Вместе с тем степень и характер выраженности генетической информации, как известно, теснейшим образом связаны с условиями окружающей среды. Этим молено объяснить многочисленные ошибки в классификации грибов, в том числе н грибов рода Fusarium..когда один и тот же

вид разные исследователи относят к различным систематическим единицам. Поэтому, как нам кажется, диагностика грибов нуждается в дополнительных экспериментальных методах, которые тем или иным путем позволяют ознакомиться с генетической конституцией организма.

В последние годы все большее внимание биологи уделяю! белкам, так как они являются материальной основой, участниками всех метаболитических и морфогенетических процессов и определяют все фенотипические свойства живого организма (Липсиц, 1972).

Для изучения свойств белков и их функциональной роли довольно широко используется иммунохимическин (серологический) метод, который характеризуется высокой точностью и специфичностью. Этот метод позволяет вскрыть такие тонкие черты сходства и различии между организмами (растениями и возбудителями их болезней, в том числе и между грибами), которые другими методами не могут быть выявлены. Так как генетические процессы основываются на определенном составе и расположении белков в генетическом материале, высокочувствительный серологический метод может помочь охарактеризовать различия в генотипах даже и близкородственных организмов, что весьма важно для решения спорных вопросов таксономии.

Поэтому мы поставили в этой работе цель—изучить возможность применения серологического метода для уточнения родственных соотношений между отдельными видами рода Fusarium.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы 1.1. Виды подопытных грибов

В качестве тест-объектов мы использовали 8 видов рода Fusarium, принадлежащих, согласно классификации Волленве-бера и Рейнкпнга, к пяти различным секциям:

а) Секция Martiella -

Fusarium solani f. pisi App. et Wr., изолирован из гороха.

б) Секция Liseola

Fusarium motiiliforme Sheld., изолирован из орхидей.

в) Секция Eleyans

Fusarium oxysponun f. dianthi Prill, et Del., изолирован из гвоздики.

2

г) Секция Discolor

Fusarium graminearum Schwabe, изолирован из ячменя.

Fusarium culmorutn (Sm.) Sacc., изолирован из кукурузы.

Fusarium sambucinum Fuck., изолирован из свеклы.

Fusarium heterosporum Nees, изолирован с поверхности склероциев спорыньи ржи.

д) Секция Roseum

Fusarium avenaceum.(Fr.) Sacc, изолирован из яблок.

Для проверки родовой специфичности диагностических антнсыпороток служили грибы Rhizoctonia solani Kiihn u Cyiindrocarpon radicicola (Wr.).

Антигены этих грибов не реагировали ни с одной из полученных антифузарийных сывороток, что подтверждает их родо-специфичность.

Упомянутые виды Fusarium получены из Института микологии (Берлин—Далем), где они были определены под руководством доктора Герлаха.

1.2 Подопытные животные

Для приготовления антисывороток использовали в четырех циклах иммунизации кроликов породы Белый Новозеландский, а в двух циклах иммунизации — породы Шиншилла.

2. Методы

Проведение опытов представлено на схеме I.

Чистые культуры грибов выращивались на жидкой питательной среде Чапека в течение 20 дней в полной темноте при + 21 — 23°С.

Для получения антигена грибница отделялась от культу-ральной жидкости, многократно промывалась дистиллированной водой и лиофилизировалась. В качестве антигена использовали взвесь тонко размолотого мицелиального порошка в «физиологическом растворе.

2.1. Иммунизация

Внутривенная иммунизация кроликов проводилась двумя качественно различными антигенами: культуральной жидкостью и взвесью .мицелия.

2.1.1. Культуральная жидкость — антиген

Культуральная жидкость использовалась нами в качестве антигена для выяснения вопроса о том, насколько антигенно-активнымн являются продукты жизнедеятельности грибов, т,и деляемые в питательную среду, в которой они выращивались. Подготовка этого антигена проводилась следующим образом:

после удаления мицелиальной пленки культуральная жидкость в целях повышения концентрации содержащихся в пен антигенно-активных веществ была дистиллирована в вакууме при температуре +45—50° С до 1/2 первоначального объема. При помощи бактериального фильтра Г5 концентрат очистили, мелкие порции стерильно разливали в пробирки и хранили их при +4° С до применения. Контрольным вариантом служила такая же жидкая среда Чапека, на которой гриб не выращивался, Каждому кролику вводили по 60 мл концентрата куль-туральной жидкости за весь цикл иммунизации (10 внутривенных инъекций).

Схема опытов Fusarium

иммунизация

свежии мицелии 1

лиофилизания 1

сухой мицелии

определение протеина

мпцелиальнын экстракт

антисыворотка

кольцепре-ципнтация

методы двойной диффузии:

а) радиальная двойная диффузия,

б) линейная двойная диффузия

\

иммуноэлектрофорез

Эти опыты показали, что культуральная жидкость не обладает заметной антигенной активностью.

2.1.2. Мицелиальный антиген

Мицелий суспензировали в физиологическом растворе. Количество .сухого мицелия и физиологического раствора при разных Инъекциях показано в таблице 1.

4

В одном из циклов иммунизации использовали адъювант для более интенсивного образования антител. Для 3-й, 4-й, и 8-й инъекции этого цикла иммунизации антиген суспензировали в смеси, состоящей из физиологического раствора и 1%-ного альгината натрия в соотношении 1 : 1 (по объему).

Таблица 1

Схема иммунизации мицелиальным антигеном

Инъекции

Доза (мг) сухого мицелия

Физраствор (мл)

1 2 •л

4

5 О

7

8

10

0,5 1,0 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 5,0 0,0 7,0

1,0 1,0 1,0* 1,0* 1,0 1,5 1,5

1,5*

1,5 1,5

* Антиген в смеси с адъювантом.

Всего за каждый цикл иммунизации каждому кролику в течение 40 дней вводили 34,5 мг полного сухого мицелиалыюго антигена.

2.2. Испытание антисыпороток и характеристика антигенов

Перед иммунизацией брали нормальные сыворотки, которые в последующих серологических испытаниях служили контролем.

В двух циклах иммунизации кровь от иммунизированных кроликов получали на 3-й день после каждой инъекции и на 8-й день после окончания циклов иммунизации, а затем еженедельно еще в течение 7 недель, то есть всего за один цикл кровь брали 17 раз. В остальных циклах иммунизации кровь брали только на 8-й день после окончания каждого цикла.

Кровь бралась из ушной вены в стерильные мерные цилиндры." После взятия ее помещали сначала в термостат при температуре +37°С на два часа, а затем на 16—18 часов в холодильник. В дальнейшем сыворотки обрабатывались по трем следующим схемам:

а) сыворотки центрифугировали при 200 об/мин, соблюдая по возможности стерильные условия, переливали мелкими порциями в стерилизованные пробирки и хранили их при — 18 С без добавления консерванта;

б) после резко выраженного отстоя сыворотки декантировали в стерильные флаконы, добавляли мертиолат (концентрация в сыворотке 1 : 10 000) и хранили их при +4аС;

п) очищенные от осадка сыворотки сливали в стерильные пробирки (по 10 мл) и лиофнлизнровалн их.

Сыворотки, полученные двумя первыми способами («а» и «б»), качественно не отличались и в серологических испытаниях довольно хорошо работали. Однако в лнофилнзирован-ных сыворотках после растворения в физиологическом растворе образовалось -помутнение, которое не удавалось устранить, хотя оно затрудняло чтение серологических реакции.

Спектры антител и их способность характеризовать изучаемые виды Fusarium выявлялись в серологических реакциях кольцепрецнпнташш, иммунодиффузни .в агаровом геле и иммунодискэлектрофореза.

Для серологических реакции in vitro в качестве антигена использовался прозрачный экстракт мицелии. Пытаясь экстрагировать из мицелия растворимые антигенио-актнпные вещества, мы суспензировали грибной порошок в физиологическом растворе в отношении Б мг/мл. Такая концентрация оказалась оптимальной для реакций двойной диффузии в агаровом геле и для реакций кольцелрешшиташш. Экстрагирование проводилось двумя методами:

а) после настаивания в течение 24 часов при комнатной температуре суспензию автоклавпровалн 30 мин. при + 120"С;

б) суспензию помещали на 24 часа в холодильник при +4°а. Затем нерастворимые частицы мицелия отфильтровали. Так как после автоклавирования антигенные свойства грибного экстракта частично утрачивались, можно предположить, что антигенные вещества грибного мицелия являются по своей природе большей частью белками. Но антигенные свойства грибного экстракта после автоклавирования утрачиваются неполностью. Это значит, что антитела, специфичные к вводимому нативному белку, по-видимому, способны реагировать с частично денатурированными белками. Согласно Гауровицу (19G9), такая -перекрестная реактивность объясняется присутствием в молекулах белков особо стабильных детерминантных групп, которые и после денатурации части молекул остаются неповрежденными. Это объяснение основано на представлении о том, что молекула антитела реагирует не с целой макромолекулой антигена, а только с определенными химическими группами, которые детерминируют иммунологическую специфичность белков. Поэтому эти химические группы молекулы антигена называют детерминантами или, согласно Ерне,—эпи-топамн.

Для более подробного ознакомления с антигенной структурой фузарийного мицелия мы при помощи* метода дискэлектро-

фореза в полиакриламидном геле выявили отдельные белковые фракции, которые после иммунодиффузии в агаровом геле свидетельствовали:

а) во-первых, об относительной подвижности антигенно активных веществ и их специфичности — предварительный результат, который подтвердился в дальнейших опытах по методу угловой двойной диффузии при изучении родственных соотношений между изучаемыми видами;

б) во-вторых, реакции иммунодискэлектрофореза указывали на то, что, вероятно, не только белки являются антигенно-активными в грибном мицелии. Природу других антигенно-активных веществ мы не исследовали, но литературные данные (Seeliger, 1958; Torheim, 1963) свидетельствуют о том, что полисахариды грибов могут быть активными антигенами.

Разные серологические методы использовались нами в решении различных детальных вопросов при изучении соотношений между исследуемыми видами.

2.2.1. Метод кольцепреципитации

Метод кольцепреципитации заключается в том, что преци-питирующая антисыворотка насливается на раствор антигена. При этом в плоскости соприкосновения жидкостей образуется преципитат в виде белого «кольца». Метод кольцепреципита-ции, дающий только альтернативный результат, применялся нами для определения титров антисьшороток. В кольцепреци-питации титры оказались в среднем на одну ступень выше, чем в агаровом геле.

2.2.2. Иммунодиффузия в агаровом геле

Пммунодиффузия в агаровом геле выгодна тем, что образующийся преципитат в решетке геля не меняет свое положение и наблюдается довольно долго. Сложность антигенного состава грибов при настоящем уровне исследований оптимально определяется двойной диффузией в агаровом геле, где каждая линия преципитации соответствует по меньшей мере одной реагирующей системе антиген-антитело. Число образующихся линии соответствует минимальному числу иммунологически активных субстанции в такой системе и позволяет сделать вывод о содержании преципитирующих антигенных компонентов и соответствующих им антител. Образование и расположение линий преципитатов позволяет вскрыть степень серологического родства между исследуемыми объектами.

Реакции в агаровом геле осуществлялись в разных вариациях.

2.2.2.1. Радиальная двойная диффузия

Радиальную двойную диффузию использовали з двух модификациях.

2.2.2.1.1. Кругообразно расположенные лунки реагентов

Кругообразно расположенные'лунки для реагентов размещали двояко:

2.2.2.1.1.К При постановке реакции по Оухтерлони в чашках Петри вокруг одной центральной лунки располагали ра-дналыю 8 периферических лунок на расстоянии 10 мм. Диаметр всех лунок 10 мм (рис. 1).

2.2.2.1.1.2. Для реакции компаративной диффузии по Оух-терлони использовали схему расположения лунок, которая представлена на рисунке 2.

Вокруг одной центральной лупки расположены 6 периферических лунок на расстоянии б мм (по радиусам). Диаметры периферических лунок 6 мм, центральной лупки — К) мм.

Принцип этого метода заключается в том, что при реакциях двух антигенных растворов с одной «чнтисывороткон могут образоваться три тина реакции в зависимости от степени родства антигенов (рис. 3).

1. Реакция идентичности — преципитаты соединяются.

2. Реакция родственности — антисыворотка содержит антитела Л и Б. Наличие разных эпнтопов в обоих антигенных растворах демонстрирует разветвленная дуга преципитата (шпора).

3. Реакция неродственности — линии преципитатов идут независимо друг от друга и пересекаются.

2.2.2.1.2. Параллельно расположенные лунки реагентов

Радиальная двойная диффузия параллельно расположенных лунок реагентов должна была наглядно отражать реакции" общих детерминант всех 8 испытуемых антигенов Fusarium с одной из восьми соответствующих антисывороток. В чашках" "Петри'располагались 8 лунок (диаметр 5 мм) в одном ряду на расстоянии 4 мм друг от друга. В каждую лунку помещали антигены одного из изучаемых видов Fusarium (по одной лунке для каждого вида). Напротив лунок с антигенами располагались в один ряд лунки с антисывороткой (8 лунок)—см. рис. 4.

Во все эти 8 лунок заливалась одна и та же антнсыворотка, которая была гомологичной к одному из изучаемых видов Fu-sarium.

Вследствие такого расположения лунок конечная концентрация аттисыворотки, а следовательно, и антител в зоне встречи была выше, чем в вариантах с кругообразным размещением лунок. Кроме того линии преципитации ьсех .восьми антигенов разных видов Fusarium находились в одной горизонтальной зоне поочередно. При этом легче было сравнить и положение, и соотношения между отдельными линиями, можно было сделать заключение о возможной идентичности отдельных преципитатов реагирующих антигенных компонентов.

Put I

о

Puc.2 б

Puc.5

-4) Л-М) "? МЛД. ИЙ ®>c(D

" г sm

/>с^йлршлш? шаа аб Ав;

* *....... ..jv*'»-'***/*" VVYA "-W ** * " "W - ' "

Рис. 4

Щ о 6б о бобо *Ш б б о о о о о

j АС

Рис.б

' ОООООООО

' ооооооо

Рис J

F. oxysporum

Эти соотношении между линиями еще лучше можно было установить, используя такое же параллельное размещение лунок при проведении многомерной диффузии. В опытах многомерной диффузии агар насыщали одним из изучаемых антигенов. Вследствие этого антисыворотка частично истощается, так как общие для изучаемых видов Fusarium компоненты прецн-питировали с соответствующими антителами сыворотки, в которой после этого оставались только специфичные антитела.

2.2.2.2. Линейная угловая двойная диффузия 2.2.2.2.1. Угловая двойная диффузия по Allison и Humphcry

Метод угловой двойной диффузии, описанный Allison и Humphrey (1960), использовался для наблюдения соотношений коэффициентов диффузии реагирующих компонентов в отдельных многокомпонентных системах антигенов н антител, так как при различных соотношениях реагентов положение линий преципитатов бывает различным.

Проводя опыты этого типа в чашках Петри, мы сделали два прямоугольных углубления (лунки) в геле.

Размеры лунок— 1X4 см. Лунки располагались под углом 90° одна относительно другой (рис. 5).

При эквивалентных соотношениях коэффициентов диффузии реагирующих компонентов линия преципитата будет прямой и расположится под углом 45° по отношению к линии старта антигена.

На коэффициенты диффузии влияют, кроме вязкости среды и температуры, относительные концентрации иммунологических реагентов и структура их молекул, которая выражается в форме, размере и весе, а также в строении молекул, то есть в составе их химических детерминант. Эти различные детерминанты молекул антигенов в реакциях с антителами могут образовывать разнообразные комбинации систем антиген — антитело. Реакции таких разнообразно реагирующих систем антиген — антитело характеризуются в агаровом геле расположением линий преципитатов.

2.2.2.2.2. Угловая двойная диффузия — модификация метода по Wilson и Pringle

Угловую двойную диффузию по Wilson и Pringle (1954) мы модифицировали. Один ряд квадратных лунок (5X5 мм) был расположен так, что расстояние между вершинами их углов составляло 3 мм. Параллельно этим лункам для антигенов был расположен ряд таких же лунок для антисыворотки. При этом расстояние параллельно противоположных сторон лунок антигена и антисыворотки было 8 мм (рис. 6).

Как и в радиальной двойной диффузии параллельно расположенных лунок для реагентов (см. 2.2.2,1.2), здесь реагиро-

пали растворы антигенов восьми различных видов Fusarium с одной антнсывороткой, гомологичной к одному из антигенов. Линейная сравнительная двойная диффузия позволяла лучше оценить родственные реакции, так как дуги преципитатов были более изогнутыми и образование шпор более заметным. Этот метод мы использовали для уточнения результатов при сравнительных определениях степени сходства общих детерминант антигенов. :

РЕЗУЛЬТАТЫ 3. Характеристика антисывороток

Для характеристики полученных сывороток мы определяли увеличение количества антител и их распад после окончании иммунизации. Сроки взятия крови см. 2.2. При титровании сывороток в агаровом геле по Оухтерлони (см. рис. 1) первые преципитаты были обнаружены только после пятой инъекции. Этот факт согласуется с тем, что титр антител в сыворотке нельзя определить правильно до тех пор, пока в иммунизированном организме ив его сыворотке сохраняется избыток антигена. После каждой из дальнейших инъекции титр сывороток (количество антител) увеличивался. Подъем титра достиг своей высшей точки, как и ожидалось, после десятой (последней) инъекции. Затем концентрация антител в сыворотке уменьшалась. Динамика накопления антител в организме во время иммунизации и после нее'выражается кривой. При испытанных нами антигенах максимальное количество антител образуется непосредственно после последней инъекции. В тече: иие восьми недель после последней (10-й), инъекции антитела в сыворотке крови иммунизированных животных сохраняются, но их суммарное количество постепенно снижается. Через год после иммунизации мы не обнаружили антител. Образование антител к фузарийным антигенам вообще оказалось очень слабым. Титр антисьшороток колебался в среднем от 1 : 8 до 1:32. Использование адъюванта (альгината натрия), как описано в схеме иммунизации (см.табл. 1), не .стимулировало образования антител/Этот факт.объясняется, по нашему мнению, тем, что адъювантное действие имеет в основном большое значение при иммунизации низкомолекулярными хорошо растворимыми антигенами. Но так как,мы использовали полный антиген, т. е. раздробленный грибной организм, действие адъюванта ослабляется или даже снимается. Эти корпускулярные антигены ведут себя как более мелкие молекулы в присутствии адъювантов. Они служат адъювантамн сами для себя.

Гетерогенность антител, соответствующих различным де-терминантным группам в каждой молекуле антигена, очень

затруднила получение специфических реакции между изучавшимися нами видами фузарнума. Исходя из представления о том, что каждая молекула антигена одного вида имеет в большинстве специфичные к данному виду детерминанты, можно было ожидать, что количество соответственных им антител, как правило, должно быть выше, чем количество антител, соответствующих антигенным детерминантам, общим для групп видов или для рода фузариум. В связи с этим ожидалось также, что видоспецифические антитела могут быть выявлены в сыворотке в самом начале обнаружения антител и в конце обнаружения. Мы попытались найти эти точки па кривой титров, при которых сыворотки показали относительно высокую специфичность. Эти точки в различных вариантах отличались местоположением на кривой. В среднем для всех вариантов сыворотки после пятой и шестой инъекции и через пять недель после десятой инъекции были наиболее видоспе-цифичиыми. Однако абсолютная специфичность сыворотки к гомологичному антигену исследуемого вида фузарнума нигде не наблюдалась. Сложность заключается в том, что титры различных типов антител варьируют и достигают максимума в разное время. Известно, что уровень антител в сыворотке зависит в основном от соотношения скорости их образования и скорости распада. Оба процесса — образование и распад антител — происходят п сенсибилизированном организме одновременно. Поэтому практически не представляется возможным в одной сыворотке определить тот момент, когда образование антител к видоспецифичным детерминантам полного грибного антигена достигает максимума. Этот факт побуждал нас вести дальнейшие наблюдения за специфичностью серологических реакции, серологическим сходством и родственностью вариантов при использовании антисывороток, содержащих самое высокое суммарное количество антител, то есть сывороток, получаемых после десятой инъекции.

При оценке специфичности сывороток мы использовали три критерия: момент взятия крови, разбавление сыворотки и скорость реакции в серологическом тесте. Испытание этих критериев основано на представлении, что гетерогенный антиген гриба содержит видоспецифичных детерминант в одной молекуле больше, чем родо- или семейственно-специфичных. Следовательно, появляющиеся преципитаты реакции этих видоспецифичных детерминант должны быть самыми ранними и наблюдаться при разбавлении сывороток. Принимая во внимание иммунореактивность подопытных животных, эти реакции позволяют характеризовать антигенный материал по степени родственности. Результаты этих опытов показывают, что действительно самые ранние реакции, появляющиеся в. серо-

логическом тесте, и реакции самых разбавленных сывороток выражают относительно самую высокую' специфичность. Как раз эти реакции вскрывают соотношения между изучаемыми видами, так как они показывают, какие антисыворотки содержат достаточное количество антител, специфичных к детерминантам гетерологичных антигенов, чтобы эти антитела смогли образовать самые ранние из появляющихся преципитатов. Эти в большом количестве находящиеся гетероспеци-фнчные антитела еще способны при разбавлениях сывороток давать видимые преципитаты, когда другие гетероспецифич-ные антитела, находящиеся в меньшем количестве, уже не дают видимых реакции. Поэтому, мы считаем, что один вид тем более родствен другому, чем больше его антпсьгооротка содержит антител, специфичных* к антигенным детерминантам другого вида.

Так, при учете этих трех критериев (момент взятия крови, разбавление сыворотки и скорость реакции в серологическом тесте) наблюдалось, в реакциях по Оухтерлони антигенное родство между изучаемыми видами, которое подтверждалось .дальнейшими опытами. - :

4. Изучение компонентов комплексных систем антигенов-антител. характеризующих родственные соотношения исследуемых видов Fusarium

'"При помощи метода линейной угловой двойной диффузии (см. рис. 5 и раздел 2.2.2.2.1) мы характеризовали количественные соотношения иммунологических компонентов в комплексных системах антиген-антитело и их качественные особенности. Критерием в данном случае считали расположение линии преципитатов.

Известно, что крупно- и мелкомолекулярные белки отличаются по своей электрофоретическон подвижности. Также должны различаться крупные и мелкие молекулы антигена по своим коэффициентам диффузии в агаровом геле. Можно ожидать, что мелкие — более подвижные — молекулы антигена, вероятно, содержат меньше детерминант в одной молекуле, чем крупные молекулы, и тем самым они являются более специфичными. Этим можно объяснить то явление, что при реакциях фузарнйных: антигенов с антифузарийными сыворотками линии преципитатов, расположенные под относительно большим углом а°, являются более -видеспецифичными или специфичными для групп видов. Наибольшую специфичность показывают, кроме того, и линии преципитатов, образующие с краем лунки антигена маленькие углы и°. Их специфичность мы объясняем более быстрой диффузией антител, специфичных к данному антигену. К тому же, так как их количество в

сыворотке больше, то они находят эквивалентные соотношения для преципитации со своими антигенами ближе к краю лунки антигена, чем антитела, присутствующие в меньшем количестве. Вывод о том, что специфические антитела содержатся в больших количествах, подтвердили и ранее описанные реакции по Оухтерлонп при учете разбавлении сывороток и скоростей реакции.

Эти наблюдения дали нам основание именно линии преципитатов, расположенные по отношению к краю лунки с антигеном под относительно маленькими и большими углами а0, считать основными для характеристики родственных отношений между видами Fusarium.

Дополнительные опыты основаны на методе компаративной диффузии по Оухтерлонп (см. рис. 2 и раздел 2.2.2.1.1.2.), позволяющем у двух антигенных растворов установить иммунологическую идентичность, различия или родственность антигенов. Эти опыты проведены нами при дальнейших исследованиях комплексных систем. Все результаты, полученные методами компаративной диффузии по Оухтерлонп, линейной угловой диффузии по Allison и Humphrey и при модифицированном методе угловой диффузии по Wilson и Pringle, подтверждают основные родственные связи между исследуемыми видами, которые были выявлены и в опытах двойной диффузии по Оухтерлонп при учете вышеназванных критериев.

Но наиболее пригодным методом, способным повышать видовую специфичность реакций, является многомерная диффузия, при которой в сыворотке нейтрализуются общие эпитопы, свойственные другим изучаемым видам. Этим методом мы уточнили результаты других опытов и на общей основе полученных данных сделали выводы о серологических соотношениях исследуемых видов фузариума (см. схему на рис. 7).

Как показано на этой схеме, наиболее близкие соотношения характерны для F. avenaceum, F. heterosporum и F. sam-bucinum. Так же тесно связаны F. graminearum н F. culmorum.

Обе эти группы имеют до некоторой степени сходные эпитопы. Их реакции указывают, кроме того, на более слабую связь видов этих групп с F. moniliforme. Наряду с этим имеет место сходство антигенов F. oxysporum и F. moniliforme. F. solani no этим показателям занимает обособленное место. Несмотря на более активную связь с группой, состоящей из F. avenaceum, F. heterosporum и F. sambucinum, этот вид дает с другими видами главным образом родоспецифические реакции.

Сопоставляя упомянутые серологические соотношения между видами Fusarium с существующими таксономическими классификациями представителен этого рода, можно отметить следующее:

Серологическое, родство видов F. graminearuni, culmorum, F. heterosporum и F. sambucinum подтверждает таксономические группировки Wollenweber и Reinking. (1935) гак же, как и Booth (1971), согласно которым эти виды включаются в одну секцию — Discolor. Более близкие родственные отношения этих видов нашли отражение и в классификации Snyder и Hansen (1945), которые включили их в один вид— F. roseum. Но соотношения между упомянутыми четырьмя видами серологически." дополнительно дифференцируются по интенсивности реакции. Наиболее близкое родство обнаружено попарно между F. graminearum и F. culmorum, с одной стороны, и F. heterosporum и F. sambucinum, — с другой стороны.

С последней группой, состоящей из F. heterosporum и F. sambucinum, серологически 'наиболее родствен ,:F. avenaceum. Наши данные подтверждают соответствующую классификацию этих видов по Snyder и Напвеп/псскольку эти, авторы включают F. avenaceum вместе с упомянутыми видами в один вид— F. roseum. Wollenweber и Reinking (1935), так же как и Билай (1955), включают F. avenaceum в секцию Roseum, a Booth (1971) относит его к секции Arthrosporiella.

Вид F. solani во всех существующих классификациях относится к секции Martiella (Wollenweber и Reinking, Билай, Booth) или по Snyder и Hansen в вид F.. solani. Серологическое поведение F. solani подтверждает обособленное положение этого вида, поскольку он реагирует с другими видами л основном родоспецифично. - Но при всем этом F. solani по серологическим данным более близко связан с группой видов, состоящей из F. heterosporum, F. sambucinum и F. avenaceum. Эти наши данные согласуются с точкой зрения Booth'a, который считает, что секция Arthrosporiella, включающая в себя и F. avenaceum, близка к секции Martiella.

В отношении серологически близких видов F. oxysporutn и F. moniliforme наши данные совпадают с классификацией В. И. Билай, включавшей эти виды в одну секцию — Elegans.

Из этих сравнений таксономических группировок по морфологическим признакам и серологических соотношений между видами рода Fusanum видно, что определенные серологические методы пригодны для уточнения родственных отношений между видами в пределах рода. *.

Заключение : -

1. Современные системы классификации грибов рода Fusarium основаны на морфологических и культуральных признаках, которые весьма изменчивы под влиянием условий окружающей среды. По-видимому, этим в большинстве случаев можно объяснить такие факты, когда один и тот же вид разные

исследователи относят к различным таксономическим едшш-: цам. Так как материальной основой всех морфогенетическнх и метаболитнческих процессов являются белки, то при изучении свойств б ел коз могут быть улучшены критерии для построения естественной (филогенетической)' системы классификации представителей рода Fusarium.

2. Для получения диагностических антисывороток пригоден антиген в виде лиофилизированного и затем гомогенизированного мицелия из 20-дневных культур подопытных грибов, выращенных на жидкой среде Чапека, не содержащей антпгенно-активных веществ.

Для серологических испытаний использовался тот же, но предварительно отфильтрованный антиген.

Сама культуральная жидкость непригодна для этих целей, так как она антигенными свойствами не обладает.

3. В наших опытах при внутривенных инъекциях антигенов, суспензированных в физиологическом растворе, применение адъюванта (альгината натрия) одновременно с инъекциями антигенов не вызвало повышения титра антифузарийных сывороток.

4. Динамика накопления антител в сенсибилизированном организме во время иммунизации и после нее выражается кривой. В наших опытах максимальное количество антител накапливалось в крови подопытных кроликов через неделю после

10-й (последней) инъекции.

5. Из изучавшихся нами различных модификаций метода иммунодиффузин в агаровом геле для выяснения серологически родственных отношений между видами Fusarium пригодны:

а) линейная угловая двойная диффузия;

б) компаративная диффузия по Оухтерлони;

в) многомерная диффузия.

Наиболее подходящим и основным методом мы считаем многомерную диффузию, где попеременно уменьшается количество реагирующих антител при поочередном насыщении агара одним из антигенов.

6. Сравнивая полученные нами серологические данные о соотношениях между изучаемыми видами с их морфологическими и культуральными признаками, на которых основаны существующие таксономические системы, можно сделать следующие обобщения:

а) F. oxysporum и F. moniliforme, которые по классификации Д. И. Билай (1955) включаются в одну секцию (Elegans), являются и серологически наиболее родственными.

б) Виды F. avenaceum, F. culmorum, F. heterosporum и F. sambucinum, объединенные в классификации Snyder и Hansen в один вид F. roseum, и по нашим данным серологически ближе по сравнению с другими исследованными видами.

в) Вместе с тем в составе этой группы видов обнаруживается еще более близкое попарное родство между F. grami-nearum и F. culmorutn, а в'другой паре — между F. heterospo-rum и F. sambucinum (при наличии большой близости к антигенам F.avenaceum). ...

Эти серологические соотношения подтверждают правомерность части классификаций'Волленвебера и Рейнкинга (1935), Билай (1955) и Booth (1971); объединяющих названные четыре вида в рамках одной секции Discolor.

г) Кроме того,, серологически обнаруживается близость F. avenaceum, F. heterosporum и F. sambucinum, не предусматриваемая упомянутыми классификациям; и представителей рода Fusan'um. * ;

д) F. solani, относящийся к секции Martiella по всем упомянутым классификациям (кроме Snyder и Hansen), имеет общие, главным образом родоспецифические эпитеты с антигенами других видов и в то же время характеризуется значительной видовой обособленностью от других исследованных видов. .

Эти соотношения можно характеризовать следующей схемой группировки исследованых нами видов-в сопоставлении с существующими классификациями в пределах рода Fusarium.

7. Таким образом, литературные и полученные нами экспериментальные данные показывают, что сравнительное изучение антигенных свойств подопытных видов фузариума открывает дополнительные ценные возможности для обоснования и уточнения классификации этих видов.

Объем 1 п. л.

ЗаказЭ82

Тираж 150.-

Типография Московской с.-х. академии им.. К. А. Тимирязева-125008,-Москва А-8,-Тимирязевская-ул., 44-

! Та5л:Ш

lpyiHqxniba iicoievioiiiKiiic iíiihh! в conocTaMem с cдocядaпи клacca?тцвют '.';';/•{ :;.;•: у;/;......;' 'В!1peдвлaх'poдa;£a5Ё£лЛ-':--:Хлл:'.4''' -'/. ' 'У\хУ::'.

no клaccя----л • лфюсэциян /-iloUM»-.' <•», w«b*r- Beinking .:;.'БИЙИ;; <v •'.'. Booth " >% ».".• Sayd»-." no вaaш. • •. , cepoлoг*» . .-' чесвя';'.\; '<"'явяп

• F;aveMc«m.,~......'.-. y.heteroaporua..... - F.Mabnclmz*,,:,,,,,. : F.graainaam....... - F*CU1AOTTO....... — F*oxjrepoxuA...,.,.„, y.nonillforB»...... ?.eol«ni........,...„ ....."'.'. .•'•':С в К Ц В В •';• -'•••;';'/-> ........ - 3 ; '•'.,':'• ВНДУ-: ••>•'•

oieooior" ...Ммйе... „JJertlaU». .'.ЯвИЩ..;.-.. aiJieeier"' "liegJlEu.V" ..ИвгИеЦв... 'fiUcbibr':;......... .MArtWl».:...... F.reMu»; _ ;.'..'„...'...;.... ^•«ox^rJoxm - -* .FjB»Ultex*e ....;..\Z...........