Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологические методы диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белецкая, Наталья Ивановна, Тюмень

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ЭНТОМОЛОГИИ И АРАХНОЛОГИИ

На правах рукописи

БЕЛЕЦКАЯ НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ГИПОДЕРМАТОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.19 - Паразитология, гельминтология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Г.С.Сивков Научный консультант: доктор медицинских наук Т.Ф.Степанова

Тюмень - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ ................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................7

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................23

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................23

2. ИЗУЧЕНИЕ ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ ПО

ГИПОДЕРМАТОЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА..................... 26

3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ

И КАЧЕСТВА АНТИГЕНОВ......................................................31

3.1. Получение соматических антигенов............................................31

3.2. Приготовление функционального антигена...................................36

3.3. Оценка качества антигенов.......................................................38

3.4. Получение гамма-глобулиновых фракций

гипериммунных сывороток.......................................................45

4. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИИДИОТИПИ-ЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ АНТИГЕНА ИЗ ЛИЧИНОК HYPODERMA BOVIS ............................................................48

5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ГИПО ДЕРМАТОЗ А КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ....................58

5.1. Диагностическая эффективность и специфичность

реакции кольцепреципитации ..................................................58

5.2. Диагностическая эффективность и специфичность

реакции латекс-агглютинации ................................................63

5.3. Диагностическая эффективность и специфичность

реакции двойной диффузии в агаровом геле ...............................67

5.4. Диагностическая эффективность и специфичность

реакции непрямой гемагглютинации..........................................70

5.5. Иммуноферментный метод ранней диагностики

гиподерматоза крупного рогатого скота.....................................77

6. ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ГИПОДЕРМАТОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

НА ОСНОВЕ РИД..................................................................80

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................82

ВЫВОДЫ...............................................................................88

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.............................................90

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................91

ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................Л 10

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В связи со структурными изменениями в экономике сельскохозяйственного производства - созданием, наряду с промышленными, индивидуальных животноводческих предприятий - важное значение приобретает своевременная диагностика паразитарных болезней животных с целью предотвращения распространения инвазий.

Основные сведения об экологии, фенологии, распространению гиподерматоза (подкожнооводовой инвазии крупного рогатого скота) и мерам борьбы с ним отражены в работах Е.Н.Павловского (1928, 1935), К.Я.Грунина (1953), В.И.Потемкина (1954), К.А.Бреева (1961), В.Н.Дядечко (1961), В.З.Ямова (1965, 1982), Г.А.Таланова (1965, 1966), А.А.Непоклонова (1965-1974), М.Н.Евстафьева (1970, 1977, 1980), Ю.М.Растегаева (1973), Н.Г.Калининой (1975, 1977), Метелица Г.И. (1995); А.М.Окунева (1989) и других авторов. Благодаря внедрению в практику разработок ученых значительно снизилась пораженность животных оводами и причиняемый инвазией экономический ущерб. Однако, в условиях низкой пораженности, ежегодно большое количество животных, свободных от инвазии, нерационально подвергается обработкам инсектицидами, которые длительное время сохраняются в органах и тканях животных, обладают канцерогенным действием и отрицательно влияют на иммунную систему человека и животных (Фридман, 1967; Даугалиева с соавт., 1989). В то же время, попытка исключить осенние обработки животных и перейти к уничтожению возбудителей в период клинического проявления болезни приводит к резкому увеличению численности паразитов. Выходом из создавшегося положения, по мнению ряда исследователей, является осенняя обработка только пораженных животных, выявление которых возможно лишь с помощью иммунобиологических тестов (Бартнинкас, 1964; Калинина, 1975; Калинина, Сивков, 1977 и др.).

Кроме того, в настоящее время все большее внимание исследователи уделяют изучению взаимоотношений в системе "паразит-хозяин" (Степанковская, 1972; Сивков, 1980, 1995; Краковецкая, 1985; Аязбаев, 1990; Алпаев, 1992; Сивков, 1995; Толоконников, 1995; Степанова, 1998; Марченко, 1998 и др.). Считается, что необходимость изучения процессов, развивающихся вследствие паразитирования одного организма на другом, является центральной задачей паразитологии. В этой связи, успешному решению последней во многом способствует использование иммунобиологических методов исследований.

Цель исследований. Разработка и совершенствование серологических методов диагностики гиподерматоза. Для реализации указанной цели были определены следующие задачи:

1. Провести ретроспективный анализ пораженности крупного рогатого скота в Зауралье

2. Разработать новые и совершенствовать известные методы получения антигенов из личинок оводов.

3. Изучить возможность получения антиидиотипических антител, несущих "внутренний образ" антигена из личинок Н.Ьоу1з.

4. Дать сравнительную оценку эффективности серологических методов диагностики гиподерматоза.

5. Создать тест-систему для серологической диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота.

Научная новизна. Отработаны режимы получения соматических и секреторно-экскреторного антигенов. На экспериментальной модели показана возможность получения антиидиотипических антител и использование их в качестве антигена. Апробирован непрямой вариант ИФА гиподерматоза крупного рогатого скота. Проведен сравнительный анализ диагностической чувствительности и специфичности различных методов серологической диагностики подкожнооводовой инвазии.

Практическая значимость работы. Материалы исследований вошли в "Методические рекомендации по серологической диагностике энтомозов животных". Ветеринарной практике предложена тест-система диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе РИД.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на координационных совещаниях по заданию 06 общесоюзной и 0.СХ.66 отраслевой научно-технической программы по ветеринарной энтомологии (Тюмень, 1987; 1988), объединенных секциях Центрального совета ВОГ и секции "Инвазионные болезни сельскохозяйственных животных" отделения ветеринарной медицины ВАСХНИЛ и РАСХН (Москва, 1995; 1996), второй научной конференции Новосибирского отделения Паразитологического общества РАН (Новосибирск, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /4? стр. машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследовании, выводов; иллюстрирована /У таблицами, рисунками. Список литературы включает 191 наименование, в том числе 61 зарубежный источник.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гиподерматоз - хроническое заболевание, вызываемое личинками подкожных оводов Hypoderma bovis de Geer (обыкновенный подкожник или строка) и Hypoderma lineatum de Villers (южный подкожник или пищеводник), паразитирующими в организме крупного рогатого скота, характеризуется поражением кожи, подкожной клетчатки, поверхностных фасций и мышц спины. Основные сведения об экологии, фенологии, распространению инвазии и мерам борьбы отражены в работах E.H. Павловского (1928, 1935), К.А. Бреева (1961, 1965, 1969), В.И. Потемкина (1954), К .Я. Грунина (1953, 1962), В.Н.Дядечко (1961 - 1969), Г.А. Таланова (1965 - 1966), A.A. Непоклонова (1965 - 1974), М.Н.Евстафьева (1970, 1977, 1980), Ю.М. Растегаева (1973), Н.Г.Калининой (1975, 1977), В.З.Ямова (1975, 1976, 1982), А.М.Окунева (1989, 1991) и других авторов. Благодаря внедрению в практику разработок ученых значительно снизилась пораженность животных оводами и причиняемый инвазией экономический ущерб. Однако, в условиях низкой пораженности, ежегодно большое количество животных, свободных от инвазии, нерационально подвергается обработкам инсектицидами, которые длительное время сохраняются в органах и тканях животных, обладают канцерогенным действием и отрицательно влияют на иммунную систему человека и животных (Фридман, 1967; Даугалиева с соавт., 1989). В то же время, попытка исключить осенние обработки животных и перейти к уничтожению возбудителей в период клинического проявления болезни в весенний период приводит к резкому увеличению численности паразитов. Выходом из создавшегося положения, но мнению ряда исследователей, является осенняя обработка только пораженных животных, выявление которых возможно лишь с помощью иммунобиологических реакций (Бартнинкас, 1964; Калинина, 1975; Калинина, Сивков, 1977 и др.).

Кроме того, в настоящее время все большее внимание исследователи уделяют изучению взаимоотношений в системе "паразит-хозяин" (Краковецкая, 1985; Аязбаев, 1990; Алпаев, 1992; Сивков, 1995; Толоконников, 1996 и др.). Считается, что необходимость изучения процессов, развивающихся вследствие паразитирования одного организма на другом, является центральной задачей паразитологии. В этой связи, успешному решению последней во многом способствует использование иммунобиологических методов исследований.

Для того, чтобы точнее разобраться в сущности иммунобиологических методов исследований необходимо определиться с такими понятиями, как иммунитет, антигены, антитела. Понятием "иммунитет" определяют способ защиты организма от живых тел и веществ, несущих на себе признаки генетической чужеродности. Способность развивать иммунный ответ не есть некое обще свойство всего организма. Иммунологическую функцию выполняет специализированная система клеток, тканей и органов, которая имеет три особенности: она генерализована по всему телу, ее клетки постоянно рециркулируют по всему телу через кровоток, она обладает уникальной способностью вырабатывать сугубо специфические молекулы антител, различные по своей специфике в отношении каждого антигена (Петров, 1983).

Центральной фигурой иммунной системы является лимфоцит. Иммунная система - совокупность всех лимфоидных органов и скоплений лимфоидных клеток тела. Лимфоидная система представляет собой морфологический синоним иммунной системы. Совокупность лимфоидных органов и тканей организма (вилочковая железа, селезенка, лимфоузлы, пеиеровы бляшки, другие лимфондные скопления, лимфоциты костного мозга и периферической крови) составляет единый орган иммунитета.

Понятие "иммунный ответ" - наиболее распространенный синоним понятия "иммуногенетическая реактивность". В настоящее время в имунологии известны шесть форм специфических реакций, из которых складывается собственно иммунологическая реактивность (Петров, 1983): 1) выработка антител, 2) гиперчувствительность немедленного типа, 3) гиперчувствительность замедленного типа, иммунологическая память, 5) имунологическая толерантность, 6) идиотип-антиидиотипическое взаимодействие.

Все вещества, которые несут признаки генетической чужеродности и при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций называются антигенами. В практической иммунологии и лабораторной практике термин "антиген" употребляется в двояком смысле: во-первых для обозначения определенного химически очерченного и очищенного от примесей молекулярно гомогенного вещества (кристаллический сывороточный альбумин, яичный альбумин и т.п.), во-вторых для обозначения сложных препаратов целых клеток или тканей, содержащих большое количество отдельных антигенных веществ. Существует четыре понятия, характеризующих вещество как антиген -чужеродность, антигенность (способность вызывать образование антител), иммуногенность (способность создавать иммунитет), специфичность (те антигенные особенности, благодаря которым антигены отличаются друг от друга). Попадая в организм, антигены вызывают выработку антител. Антитела - белки, относящиеся к тому или иному классу иммуноглобулинов, синтез которых стимулируется при поступлении в организм антигена. Антитела обладают способностью специфически

/т% " 1 ЛЛ 1 \ /~ч

взаимодействовать с данным антигеном ^гоит, iyyi). Существует пять классов антител (иммуноглобулинов) - IgA, IgG, IgM, IgE, IgD, свойства которых подробно описаны (Пол, 1987).

В развитии иммунного ответа, кроме гуморальных факторов, принимают участие клетки иммунной системы. Клеточный иммунитет предполагает прямую реакцию иммунных клеток (макрофагов, Т- и В-лимфоцитов) на чужеродные антигены, в отличие от гуморального иммунитета, основное свойство которого - продуцирование иммуноглобулинов, циркулирующих в крови, в ответ на вторжение инородного агента (Йегер, 1990).

Иммунитет при паразитарных болезнях имеет ряд специфических особенностей по сравнению с иммунитетом при бактериальных и вирусных инфекциях, зависящих от особенностей строения и характера функционирования паразитов. В отличие от бактерий и вирусов, паразиты, за рядом исключений не размножаются в организме хозяина. Однако, проходя сложный цикл развития от яйца до взрослого состояния, они нередко меняют свой антигенный состав. Кроме того, в частности гельминты, обладают большими размерами (по сравнению с бактериями и вирусами), а нематоды также и прочной кутикулой, что вероятно требует определенную форму воздействия со стороны хозяина для поражения гельминта (Леутская, 1990). Степень напряженности иммунитета к паразитам определяется рядом факторов. Естественно, что интенсивность инвазии в значительной степени определяет течение иммунологических процессов в организме. Однако рядом работ показано, что не всегда наблюдается такая линейная зависимость между дозой заражения с одной стороны и состоянием организма и его выживанием - с другой (Шульц, Даугалиева, 1967). Существенную роль играет и иммунореактивность самого организма, определяемая его иммунологической подготовленностью и общим состоянием организма.

Многочисленными работами как зарубежных, так и отечественных исследователей показано, что как соматические, так и функциональные

(секреты и экскреты) антигены паразитов стимулируют продукцию антител (Thorson, 1969; Coombs, 1965; Edwards et al., 1971).

По мнению Торзона (Thorson, 1969) и ряда других авторов (Edwards, 1971) антитела парализуют деятельность тех или иных ферментов паразита. Антитела являются первым этапом воздействия организма хозяина на паразита, после чего вступают дополнительные факторы воздействия. Кроме того, антитела типа IgM или IgG способствуют вступлению в реакцию комплемента. Паразиты способны моделировать иммунный ответ хозяина. Факт, что пролиферативная активность клеток различных популяций лимфоидной системы может изменяться в выгодную для паразита сторону и обеспечивать его выживание, не вызывая при этом быстрой гибели хозяина, по-видимому является результатом естественного отбора в процессе эволюции взаимоотношений "паразит-хозяин" (Сох et al.,1984). Иммунодепрессия при инвазиях была отмечена в ряде работ. Так, Е.С. Лейкина (1976) высказывает предположение, что помимо выделения иммунодепрессантов, универсально подавляющих реакцию хозяина на любой патоген, гельминты могут угнетать формирование защитных реакций, направленных против них самих. Не исключено, что иммунодепрессивное свойство паразитов может отражать открытый сравнительно недавно феномен конкуренции антигенов. Конкуренция антигенов проявляется в том, что введение некоторых антигенов подавляет ответ животного на введение одновременно или позже другого антигена.

Многочисленные наблюдения показали, что наиболее активная продукция антител происходит обычно при паразитировании тканевых и кишечных мигрирующих гельминтов, особенно в период прохождения личинок по внутренним органам и их линьки. Это иммуноглобулины классов G и А (Miller, 1987). Высокими антигенными свойствами обладает особая "вылупляющая" жидкость, выделяемая личинками, провоцирующая усиленный синтез антител.

Для всех инвазий характерна эозинофилия - от незначительной до очень высокой. Эозинофилы являются основными клетками-эффекторами, действие которых имеет антипаразитарную направленность. Н.Д. Беклемишев (1969) высказывает мнение, что при паразитарных заболеваниях включение эозинофильного механизма происходит в том случае, если паразит имеет размеры, при которых невозможен фагоцитоз. Эозинофилы скапливаются вокруг внедрившихся в организм паразитов благодаря хемотаксическим факторам, которыми могут быть лейкотриены, гетерогенные лимфокины, продуцируемые Т-клетками селезенки, различные активные вещества, осво�