Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сенсорные электроды на основе наночастиц диоксида марганца
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации по теме "Сенсорные электроды на основе наночастиц диоксида марганца"
На правах рукописи
/
Донцова Екатерина Александровна
Сенсорные электроды на основе наночастиц диоксида марганца
специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2011
005009118
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического
факультета
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный руководитель'. доктор химических наук, профессор
Курочкин Илья Николаевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Гольдберг Владимир Михайлович Институт биохимической физики имени Н.М. Эммануэля РАН
доктор химических наук, профессор Евдокимов Юрий Михайлович Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН
Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН
Защита состоится « » декабря 2011 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
Автореферат разослан «...» ноября 2011 года
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук
Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Диоксид марганца используется в качестве окислителя, катализатора, адсорбента и как электродный материал источников энергии. В технологиях био- и химических сенсоров применяют модификацию поверхности электродов Мп02 для формирования медиаторного слоя, который способен к многократному циклическому окислению-востановлению на электроде, и осуществляет транспорт электрона от аналита к поверхности электрода, тем самым существенно повышая чувствительность определения аналита.
Традиционно используемой процедурой формирования медиаторного слоя на поверхности электрода является электрохимическое осаждение. В нашей лаборатории была разработана методика изготовления пероксид-чувствительных и холиноксидазных электрохимических сенсоров на основе электрохимически осажденного Мп02, которые позволяли определять пероксид водорода с чувствительностью 1,2 А/(М • см2) и пределом обнаружения 30 нМ и холин с пределом обнаружения 800 нМ и чувствительностью 50 мА/(М • см2). Вместе с тем, при переходе к массовому производству сенсоров, необходима разработка более удобных в технологическом отношении подходов. Таковыми являются методы струйно-капельного нанесения. Современные технологии позволяют дозировать с высокой точностью микро- и нанолитровые объемы растворов, содержащих необходимые компоненты. При этом существуют автоматизированные системы дозирования, позволяющие сделать процесс изготовления аналитических элементов высокопроизводительным и воспроизводимым. Для такого нанесения необходимо заранее подготовить препарат, содержащий медиатор: раствор или стабильный золь наночастиц.
Описано использование Мп02 в качестве медиатора для анализа пероксида водорода, а также аскорбиновой и мочевой кислот, на его основе были разработаны высокочувствительные системы определения глюкозы и холина, в которых осуществлено сопряжение медиатора с ферментом класса оксидаз. Данное соединение привлекательно с технологической точки зрения т.к. его легко получить в виде различных кристаллических модификаций. Однако, существует проблема его стабилизации в виде золя для нанесения на поверхность сенсоров струйно-капельными методами.
Также следует заметить, что в литературе не описано возможности использования диоксида марганца в качестве медиатора для анализа тиолов, в то время как имеются данные о способности Мп02 окислять тиолы.
Таким образом, исследование различных способов получения и стабилизации золей наночастиц диоксида марганца, возможности нанесения их на поверхность электрохимических сенсоров капельным методом и создания на основе полученного медиаторного слоя систем определения Н202 и тиолов, а
также создания на их основе более сложных ферментативных биосенсоров, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование возможности применения наночастиц диоксида марганца для изготовления электрохимических систем анализа тиолов, пероксида водорода и холина, позволяющих определять активности холинэстераз и проводить анализ их ингибиторов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
- Получение и исследование стабильности различных препаратов наночастиц диоксида марганца, в том числе различных кристаллических модификаций.
- Исследование возможности применения наночастиц Мп02 для электрохимического анализа пероксида водорода и тиолов, в частности тиохолина.
- Разработка системы сопряжения наночастиц Мп02 с ферментами класса оксидаз, в частности холиноксидазы, для электрохимического анализа холина.
- Исследование возможности определения активности ферментов холинэстераз и анализа их ингибиторов с использованием разработанных на основе наночастиц Мп02 систем анализа холина и тиохолина.
Научная новизна. Разработана методика получения наночастиц МпО? в обращенных мицеллах. Показана возможность использования таких наночастиц для создания пероксид-чувствительного слоя.
Исследованы медиаторные свойства наночастиц Мп02 различных кристаллических модификаций в реакции электрохимического окисления тиохолина и пероксида водорода, показано, что у-модификация Мп02 обладает более высокой медиаторной активностью по сравнению с аморфным и (3-Мп02.
Впервые показана возможность электрохимического определения тиолов, в частности тиохолина, с использованием диоксида марганца в качестве медиатора.
Разработана и оптимизирована методика получения стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02, исследовано влияние различных катионов и анионов на стабильность гидрозоля. Наночастицы Мп02 в гидрозоле охарактеризованы при помощи электронной микроскопии, светорассеяния и т.д.
Разработана методика формирования медиаторных слоев на основе полученных наночастиц у-Мп02 и последующей иммобилизации ферментов для создания сенсоров, определяющих Н202 и холин. Разработан холиноксидазный биосенсор на основе стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02.
Разработанные сенсоры использованы для анализа активности БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности.
Практическая значимость работы.
Разработаны пероксид-чувствительные электроды на основе наночастиц Мп02, полученных в обращенных мицеллах. Аналитические характеристики электродов: линейный диапазон определения Н202 1 ■ 10'7 - 1 • 10"4, предел обнаружения Н202 8 • 10"8, чувствительность 922 мА/(М • см2).
Разработаны электрохимические сенсоры для высокочувствительного анализа пероксида водорода и тиолов, а также ферментативные биосенсоры для анализа холина на основе стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02. Методики получения стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02, формирования медиаторного слоя на поверхности электрода, а также иммобилизации фермента холиноксидазы для создания холин-чувствительных биосенсоров, были защищены патентом РФ. Все описанные сенсорные элементы могут быть использованы как непосредственно для анализа соответствующих аналитов, так и в качестве базовых элементов при создании более сложных биосенсорных систем.
Основные аналитические характеристики сенсоров: линейный диапазон определяемых концентраций Н202 составил 2-Ю"8 М - 1-Ю"4 М, предел обнаружения и чувствительность - 210"8 М и 515 мА/(М-см2), соответственно. Линейный диапазон определяемых концентраций тиохолина, цистеина и глутатиона составил 5-Ю"7 М - МО"4 М, 5-10"7 М - 1 -10"3 М и 5 -10"7 М - МО'5 М соответственно. Предел обнаружения и чувствительность для тиохолина, цистеина и глутатиона составили - 610"8 М и 345 мА/(М-см2), 9 • 10"8 М и 183 мА/(М-см ) и 2-Ю"7 М и 178 мА/(М-см Соответственно. Предел обнаружения тиохолина снижен в 8 раз по сравнению с электрохимическими сенсорами для анализа тиохолина на основе других медиаторов и в 200 раз по сравнению со спектрофотометрическим методом Эллмана.
Медиаторный слой на основе наночастиц Мп02 может быть использован для анализа концентрации пероксида водорода, которая является важным параметром при изучении различных биохимических процессов, в частности связанным с работой ферментов класса оксидоредуктаз: оксидаз, супероксиддисмутаз и пероксидаз. Данный медиаторный слой может служить базовой конструкцией для создания биосенсоров на основе этих ферментов или измерения их активности.
Разработан и оптимизирован холиноксидазный биосенсор на основе гидрозолей наночастиц у-Мп02. Линейный диапазон определяемых концентраций холина составил 1,3-10"7 М - 1-Ю"4 М Предел обнаружения холина и чувствительность - 1,3-10"7 нМ и 103 мА/(М-см2), соответственно. Такое значение передела обнаружения по холину является минимальным
значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
Возможность анализа тиолов при помощи сенсора на основе наночастиц Мп02 также может быть использована для анализа биологически активных молекул, таких как глутатион и цистеин.
Показано, что разработанные тиохолин-чувствительные сенсоры и холиноксидазные биосенсоры могут быть использованы для анализа активности эстераз в биологических жидкостях, а также определения содержания ингибиторов холинэстеразной активности в экологических образцах.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 2-я Международная школа 'Наноматериалы и нанотехнолигии в живых системах. Безопасность и наномедицина', 19-24 сентября 2011, Московская область; IV-й Московский Международный Конгресс 'Биотехнология - состояние и перспективы развития', 21-25 марта 2011, Москва; ICYS-ICMR Summer School on Nanomaterials, July 22-28 2006, Tsukuba, Japan.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в международных и отечественных журналах, 1 глава в книге, тезисы на 3-х научных конференциях и 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 170 стр. и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения в 4-х главах, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 186 ссылок. Работа содержит 74 рисунка, 22 таблицы.
Список сокращений
ХЭ - холинэстераза(ы),
АХЭ - ацетилхолинэстераза,
БХЭ - бутирилхолинэстераза,
АОТ - (ди(этил-2-гексил)сульфосукцинат натрия,
ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия,
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия,
NTA - Nanoparticles Tracking Analysis
ПАСН - полианетолсульфонат натрия,
ПДДА - полидиметилдиаллиаммонийхлорид,
ХО - холиноксидаза,
ПНП - послойное нанесение полиэлектролитов,
БХ-бутирилхолин
ПТХ - пропионилтиохолин
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы
В литературном обзоре рассматривается структура, функции и роль в организме млекопитающих ферментов группы холинэстераз (АХЭ и БХЭ), приводятся сведения об их ингибиторах и систематизируются методы анализа ингибиторов холинэстеразной активности. Подробно рассматриваются два подхода к анализу ингибиторов - определение скорости гидролиза природных субстратов ХЭ с образованием холина и их синтетических тиоаналогов с образованием тиохолина. Систематизируются сведения о методах определения холина и тиохолина, подробно освещаются конструкции предназначенных для этого электрохимических сенсорных систем. Классифицируются методы получения и стабилизации наночастиц медиаторов, используемых в качестве обязательного компонента в таких системах. Анализируются данные о структуре, способах получения и стабилизации наночастиц диоксида марганца, а также описываются существующие электрохимические сенсорные системы на его основе.
Экспериментальная часть Получение наночастиц МпО?. Наночастицы диоксида марганца получали с использованием реакции сопропорционирования ионов Мп2+ и Мп04". Для получения Мп02 в обращенных мицеллах 0.221 г АОТ растворяли в 5 мл гексана, раствор разделяли на две части, к одной части добавляли водный раствор ацетета марганца (II), ко второй - водный раствор КМп04 в равных объемах (4,5-31,5 мкл). Смеси интенсивно встряхивали для получения однородных прозрачных растворов, полученные растворы немедленно смешивали и встряхивали на шейкере. Препарат аморфного Мп02 готовили из водных растворов КМп04 и MnS04 в тефлоновом вкладыше автоклава. Для получения препаратов ß-модификации проводили последующую гидротермальную обработку полученной суспензии в стальном автоклаве при температуре 160°С. Водные золи аморфного и ß-MnCb получали суспензированием в ацетатном буфере (0,125 мМ АсК/0,25 мМ АсН) при помощи ультразвука. Золи наночастиц у-MnO? получали смешением разбавленных водных растворов КМп04 и ацетата марганца (II). Растворы реагентов смешивали и встряхивали.
Физико-химическая характеристика наночастиц МпО^. Кристаллическую структуру полученных препаратов Мп02 определяли методом рентгеновской дифракции с использованием автоматического порошкового дифрактометра STOE STADI-P. Электронные микрофотографии наночастиц Мп02 били получены при помощи ПЭИ LE0912 AB OMEGA и СЭМ Carl Zeiss Supra 40 (Германия). Измерение концентрации и распределения
наночастиц в по размерам проводили с использованием прибора Nanosight LM10-HS (Великобритания), основанного на методе Анализа траекторий Броуновского движения наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA). Спектры водных золей диоксида марганца были получены на спектрофотометре Сагу 100 (Varían, США). Изучение квазиупругого динамического светорассеяния золей у - Мп02 проводили в цилиндрических кюветах, на приборе ALV DLS/SLS-SP 5022F. Определение дзетта-потенциала наночастиц Мп02 в гидрозоле проводили на зета-сайзере Nano-ZS фирмы 'Malvern instruments' (Великобритания).
Изготовление электродов на основе наночастиц MnO?. Для изготовления сенсорных элементов на основе наночастиц Мп02 использовались: шлифованные графитовые стержни и планарные электроды, напечатанные на подложке из поливинилхлорида с использованием аппарата для полуавтоматической печати Winon модели WSC160B, трафаретной сетки (Mesh count = 200 нитей/см), и проводящих графитовых чернил (Coates Screen, Германия). Модификацию графитовых стержней наночастицами Мп02, синтезированными в обращенных мицеллах осуществляли следующим образом: за один цикл нанесения на рабочую поверхностью электрода, наносили одну каплю мицеллярного раствора диоксида марганца в гексане с АОТ объемом 3.4 мкл. Электрод высушивали в течение 1 минуты на воздухе при комнатной температуре, за это время гексан полностью испарялся. Цикл нанесения повторяли необходимое количество раз, затем промывали электрод смесью метанола с ацетоном для удаления АОТ и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для модификации планарных графитовых электродов водными золями наночастиц МпО? на поверхность электрода наносили каплю гидрозоля объемом 10 мкл, электрод высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем промывали бидистилпированной водой, излишки воды удаляли и прогревали электроды 1 час при 60°С в термостате. Для изготовления холиноксидазных электродов конструкции ПДДА/ХО на рабочую поверхность электрода наносили каплю водного раствора ПДДА объемом 5 мкл, выдерживали 10 минут, не допуская высыхания капли, затем электрод промывали бидистиллированной водой для удаления неспецифически адсорбировавшихся молекул, стряхивали излишки воды и высушивали электрод на воздухе при комнатной температуре. После этого наносили каплю раствора ХО объемом 5 мкл, снова выдерживали 10 минут, затем промывали водой и высушивали. Аналогичную процедуру использовали для изготовления электродов других конструкции (ПДЦА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)п на планарных графитовых электродах.
Электрохимические измерения активности электродов проводились в амперометрическом режиме в 50 мМ буфере НереБ, 30 мМ КС1, рН 7.5 при помощи потенциостата 1РС-2000 (Кронас, Россия).
Результаты и обсуждение
Исследование электрохимических свойств наночастиц диоксида марганца, синтезированных в обращенных мицеллах. Синтез в обращенных мицеллах является одним из методов, широко использующимся для получения различных типов наночастиц. Нами было проведено исследование возможности синтеза наночастиц Мп02 в системе гексан-АОТ-вода и изготовления на их основе пероксид-чувствительного покрытия.
В целях оптимизации условий синтеза наночастиц для последующего изготовления пероксид-чувствительных электродов была проведена серия экспериментов, в которых варьировался параметр степень гидратации ^0=[Н2О]/[АОТ]) и концентрации Ас2Мп и КМп04 и перманганата калия в исходных водных растворах. Было показано, что электрохимический сигнал возрастает при увеличении параметра \у0, однако, при \у0 выше 5 наблюдается разрушение мицелл выпадение Мп02 в осадок, что сопровождается резким снижением электрохимического отклика изготовляемых электродов. Для различных степеней гидратации при определенных концентрациях диоксида марганца в мицеллярном растворе величина аналитического сигнала выходит приблизительно на один и тот же уровень. Дальнейшая работа велась с наночастицами, полученными в мицеллярных растворах, \у0 в которых составляла 5 и исходные концентрации водных растворов ацетата марганца (II) и перманганата калия - 0.025 М и 0.037 М соответственно.
Исследования полученных наночастиц методом ПЭМ показали, что препараты состоят из нитевидных объектов толщиной около 1 нм и длиной 2030 нм, объединенных в аморфные скопления (рис. 1).
Рис. 1. ПЭМ-изображения наночастиц МпС>2, полученных в обращенных
мицеллах.
Кроме того, иногда на образцах встречаются шарообразные кристаллические образования диаметром около 30 нм. Спектры потерь энергии электронов для обоих типов структур имеют максимумы, соответствующие марганцу в районе 645 и 655 еВ,
В целях оптимизации процедуры изготовления медиаторного слоя было изучены влияние числа циклов нанесения наночастиц и операционная стабильность электрода. Было показано, что отклик на стандатрную концентрацию Н202 увеличивается с одного до 4-х циклов нанесения, после чего практически не меняется (рис. 2). В дальнейшей работе электроды готовили, повторяя цикл нанесения 8 раз Операционная стабильность таких электродов характеризовалась постепенным падением (данные приведены на рисунке 3, а). Декремент падения составляет от 0.5 до 2% за одно измерение Увеличение операционной стабильности сенсоров было достигнуто за счет формирования на их поверхности тонкого слоя из ацетата целлюлозы (рис. 3, б). Операционная стабильность такого сенсора характеризуется вариационным коэффициентом 4.9±0.1%, декремент падения составляет не более ±0.2% за измерение.
Рис. 2. Зависимость аналитического Рис. 3. Операционная стабильность сигнала от числа циклов нанесения электродов, а) не покрытых, б)
мицеллярного раствора диоксида покрытых ацетатцеллюлозной
марганца. мембраной.
Долговременная стабильность определялась для электродов, стабилизированных и нестабшшзированных ацетатцеллюлозной мембраной. В обоих случаях электроды демонстрировали стабильный аналитический сигнал при хранении в течение месяца.
В целях оптимизации условий анализа Н?0? было изучено влияние рабочего потенциала, ионной силы и рН измерительного буфера на величину аналитического отклика электрода. При потенциале от 350 до 500 мВ наблюдаются максимальные отклики на Н202. (рис. 4) При дальнейшем
повышении потенциала величина откликов падает, а шум базовой линии увеличивается, что затрудняет проведение точных измерений для низких концентраций.
0,0
200 300 400 500 600 700 Е, мВ
5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 рН
Рис. 4. Зависимость величины аналитического откликов на 10 мкМ Н202 от потенциала измерения против Ag/AgCl-элeкmpoдa
Рис. 5 Зависимость величины аналитического отклика на ЮмкМ Н202 от рН
Измерения, проведенные при различной ионной силе буфера, показали рост аналитического отклика от 0 до 30 мМ КС1, при дальнейшем увеличении ионной силы изменения величины аналитического сигнала не происходит. В интервале рН буферного раствора от 6.5 до 8.5 наблюдается наибольшая величина отклика (рис. 5). Для более низких значений рН величина наблюдаемого аналитического сигнала меньше. Как показало исследование операционной стабильности электродов при различных рН, в кислой среде величина наблюдаемого аналитического сигнала уменьшается от измерения к измерению. Такая картина свидетельствует о том, что в кислой среде происходит разрушение пероксид-чувствительного слоя за счет растворения Мп02.
Таким образом, в качестве оптимальных условий измерения Н202 были выбраны: рабочий потенциал 480 мВ, состав буферного раствора: 50 мМ Нереэ, 30 мМ КС1, рН 7.5. В этих условиях были получены градуировочные зависимости и определены аналитические характеристики электродов: время развития 90% тока от максимального составляет 5 сек, предел обнаружения Н202, рассчитанный по уравнению у=0.001+0.06455 х при уровне шума 2нА составил 7.8'10"8 М (Зо), линейный диапазон 7.810 8-1.0Ю4 М, чувствительность электродов составила 922±2мА/(М-см2).
Исследование медиаторных свойств гидрозолей диоксида марганца для анализа пероксида водорода и тиохолина. При апробации технологии формирования медиаторного слоя наночастиц Мп02, полученных в обратных
мицеллах, были использованы графитовые стержни. В настоящее время для изготовления электрохимических сенсорных элементов используют планарные электроды, изготовленные при помощи трафаретной печати. Причиной этого является простота, низкая стоимость и одновременно универсальность данной технологии, позволяющей изготавливать планарные электроды различной конфигурации, в том числе миниатюризированные варианты сенсоров, что особенно важно при разработке портативных аналитических систем для АМЛ, 'анализа по месту лечения' ('ронЦ-оГ-саге'). Проведенные исследования показали, что использование технологии создания медиаторного слоя на основе наночастиц Мп02, полученных в обращенных мицеллах, не приводит к формированию активных и стабильно работающих конструкций при нанесении ферментов. Поэтому следующим шагом было получение гидрозолей наночастиц Мп02 и исследование их медиаторных свойств по отношению к процессам окисления перо-ксида водорода и тиолов на поверхности планарных графитовых электродов. Диоксид марганца нерастворим в воде, однако наночастицы этого материала могут быть получены или ресуспендированы в воде с образованием гидрозолей При взаимодействии КМп04 с МпС12 в водном растворе образующийся диоксид марганца быстро выпадает в осадок. Известно, что некоторые ионы, способные достраивать кристаллическую решетку или адсорбироваться на поверхности кристаллической фазы, препятствуют агрегации частиц, что позволяет получить стабильный золь. Поэтому для получения стабильного золя Мп02 было исследовано влияние различных ионов. Для этого реакция сопропорционирования проводилась в присутствие натриевых солей анионов, взятых в
320 -, 270 -220 -170 -
620
640 660
Потери энергии, эВ
Рис. 6. Фотографии и ПЭМ-изображения золей диоксида марганца, через 2 часа после
проведения реакции 2.5-10'4 М перманганата калия а) с хлоридом марганца (II) (3.751О'4 М) б) с ацетатом марганца (II) (3.751 С!4 М). Спектр потерь энергии электронов (в).
полуторократном избытке по отношению к хлорид-иону. Было показано, что ряд анионов, а именно: ацетат, гидрокарбонат, гидрофосфат и дигидрофосфат, способствуют образованию стабильного гидрозоля Мп02, в то время как в случае сульфата, фторида, карбоната и додецилсульфата происходит агрегация частиц и выпадение осадка (рис. 6, а).
По данным ПЭМ (рис. 6, б) частицы стабильного гидрозоля, полученного с использованием Ас2Мп, имеют форму складчатых плоскостей толщиной 0,30,6 нм и размерами 50-100 нм. Спектр потерь энергии электронов, полученный методом ПЭМ приведен на рисунке 6 (в). Интенсивные максимумы в районах 645 и 655 эВ подтверждают, что основным элементом частиц является марганец. Оптический спектр поглощения золя имеет максимум в районе 366 нм, что, в соответствие с литературными данными, подтверждает наличие Мп02.
Дополнительное изучение стабильности гидрозоля проводили методом NTA (Nanoparticles Tracking Analysis). На рисунке 7 приведены данные по изменению концентрации частиц в гидрозоле (а) и их размеров (б), полученные методом NTA в течение 8-ми часов. Было показано, что изменения концентрации и размеров частиц за это время не происходит. Средний размер частиц согласно данным NTA составляет около 107 нм, значения диаметров, ниже которых лежат размеры 90 и 10 % частиц составляет соответственно 164 и 50 нм.
вГ с
а °
г *
и
5 о
о л
Si з-
1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 -0,6 0,4 -0,2 0,0
*' \ а
5 х
i s I-
о га з-Q. Ф 2 п га о_
0,0
2,0 4,0 6,0 Время, ч
8,0
200 160 " 120 80 -40 0
DM = 164 nm
А А
D ■ 107 nm
D£10f> ==© ft«®
4 D-(0» 50
0,0
2.0 4,0 6.0 Время, ч
Рис. 7. Зависимость а) концентрации частиц в гидрозоле б) размера частиц от времени.
По данным квазиупругого динамического светорассеянья гидродинамический радиус частиц составил 64 нм. Определение ^-потенциала методом измерения электрофоретической подвижности частиц в капилляре показало, что частицы золя заряжены отрицательно (величина ^-потенциала -30 мВ). Данный факт был также косвенно подтвержден тем, что золь коагулирует под действием катионов. Определены пороговые концентрации различных
катионов, данные находятся в соответствие с поведением классических коллоидных систем.
Кристаллическая структура диоксида марганца была определена методом рентгеновской дифракции. Показано, что частицы имеют поликристаллическую природу, размер кристаллитов составляет около 2 нм. Характер дифрактограммы свидетельствует о наличии орторомбической симметрии и соответствует y-Mn02 (ICDD -JCPDS Card No. 72-1983).
Известно, что тип кристаллической структуры Мп02 влияет на его электрохимические свойства. В связи с этим возникает необходимость проведения сравнительного анализа наночастиц Мп02 различных кристаллических модификаций в отношении их медиаторной способности обеспечивать окисление Н202 и тиолов. Препараты аморфного и Р-Мп02, синтезированные в гидротермальных условиях, были любезно предоставлены сотрудниками лаб. катализа и газовой электрохимии хим. факультета МГУ. Наночастицы Мп02 различных кристаллических модификаций были охарактеризованы методами рентгеновской дифракции, СЭМ (рис. 8) и NTA. Для получения гидрозолей препараты диспергировали при помощи ультразвука в ацетатном буфере.
Рис. 8. СЭМ-изображения препаратов Мп02, (а) - аморфная модификация, (б, в) ^-модификация (г) - у-модификация,
Исследования электрохимических свойств проводили, нанося полученные гидрозоли наночастиц Мп02 на поверхность планарных графитовых электродов и измеряя величину аналитического сигнала электродов на стандартные концентрации Н202 и тиохолина.
Табл. 1. Сравнение медиаторной активности Мп(?2
Наибольший отклик в обоих случаях наблюдается для у-Мп02 (табл. 1) Таким образом, у-Мп02
является наиболее эффективным медиатором окисления тиолов и Н202.
В целях оптимизации условий формирования медиаторного слоя у-Мп02 была изучена зависимость величины аналитического отклика на 1 мкМ Н202 от концентрации Мп02 в гидрозоле. Данные приведены на рис. 9, в качестве характеристики концентрации используется оптическая плотность гидрозоля при 370 нм.
Тип Мп02 Отклик электрода на 8 мкМ тиохолина, нА Отклик электрода на 10 мкМ Н202, нА
аморфный 28 ±13 100+23
(3-Мп02 15 + 6 175+33
Р-Мп02 11+3 115+40
у-Мп02 129 + 28 233+37
3 "
< 15
* I ^
щ
Рис. 9. Зависимость аналитического сигнала пероксид-чувствительного сенсора от Азуо гидрозоля у-Мп02
Рис. 10. СЭМ-изображение поверхности планарных графитовых электродов, модифицированных наночастицами у-Мп02.
На начальном участке зависимости с ростом концентрации Мп02, растет аналитический отклик, при определенных концентрациях достигается область насыщения, в которой дальнейшее увеличение концентрации Мп02 не приводит к существенному изменению величины аналитического сигнала. Для дальнейшей работы были выбраны исходные концентрации ацетата марганца
3.75 -10 М
перманганата калия
2.5 10"4М.
Расчетная концентрация
образующегося в этих условиях диоксида марганца составляет 30 мкг/мл, А370 = 1,6, что соответствует области плато на графике 9. Методом СЭМ было показано, что при такой модификации часть поверхности электрода покрыта наночастицами Мп02, представляющими собой объекты в характерной форме 'сморщенных листов' (рис. 10).
Из данных вольтаммограмм, полученных в отсутствие и присутствие Н202 и и тиохолина (рис. 11, 12) была определена область рабочих потенциалов против Ag/AgCl электрода, при которых можно проводить анализ Н202 и тиолов. Вольтаммограмма, полученная в присутствие Ю^М пероксида водорода на модифицированном электроде, характеризуется увеличением токов по сравнению в вольтамперограммой, полученной в отсутствие Н202. Максимальная разница токов между двумя кривыми достигается при 600 мВ. Однако, при потенциалах выше 500 мВ в режиме стационарного потенциала наблюдается резкое увеличение базового тока и шумов. Поэтому, для оптимального проведения измерений Н202 была выбрана область потенциалов от 250 до 500 мВ. В присутствие тиохолина. начиная с потенциала +300 мВ относительно электрода сравнения (Ag/AgCl) наблюдается увеличение анодного тока, разница между анодными токами в присутствии и отсутствие тиохолина достигает максимума при потенциале +410 мВ и существенно не меняется при дальнейшем увеличении потенциала. Для дальнейших измерений тиохолина был выбран потенциал +450 мВ.
Е, мВ
Рис. 12. Циклические волыпаммограмы электродов, модифицированных у-Мп02, в отсутствие (I) и присутствии (II 0,4 мМ тиохолина При помощи оптимизированной конструкции были получены градуировочные зависимости для Н202 и ряда органических тиолов (тиохолина,
Рис. 11. Линейные вольтамперограммы электродов, модифицированных у-МпО^ в отсутствие (I) и присутствии 0,1 мМ Н202 (II).
цистеина и глутатиона), из которых рассчитаны аналитические характеристики электродов. Данные приведены в таблице 2.
Табл. 2. Аналитические характеристики электродов, модифицированных
у-Мп02.
Аналит Е, мВ Время выхода аналитического сигнала, с Предел обнаруже ния, М Линейный диапазон, М Чувствительность, мА/(М см2)
Н202 250 6 4.5Т0'8 4.5-10'8-1.0-10"4 377
Н202 480 6 2.2-10"8 2.2-10"8-1.0-10"4 515
тиохолин 450 15 610"8 5Т0'7-110'4 345
цистеин 450 8 9-Ю"8 5Т0'7-110"3 183
глутатион 450 10 2-Ю"7 510"7-110'5 178
Таким образом, электроды на основе у-Мп02 позволяют измерять в 5 раз меньшую концентрацию Н202, чем было описано в ранее опубликованных работах по пероксид-чувствительным сенсорам на основе диоксида марганца, и в 8 и более раз меньшую концентрацию тиохолина, чем описанные электроды на основе других электрохимических медиаторов.
Операционная стабильность электродов при анализе Н202 характеризуется разбросом значений в 5.5±1.7% при 250 мВ и 5.0±3.0% при 480 мВ по результатам 20-ти последовательных измерений Операционная стабильность при анализе тиохолина характеризуется разбросом значений в 4,0±0.2% по результатам 10 последовательных измерений. Данное исследование подтверждает важную особенность нового медиатора -способность к многократному использованию электродов на его основе для анализа тиолов без отравления катализатора.
Для изучения долговременной стабильности электроды хранили на воздухе при комнатной температуре и проводили измерения аналитического отклика на 10~5 М Н202 каждую неделю в течение двух месяцев с момента изготовления. По результатам исследований изменения активности электродов в течение двух месяцев хранения не наблюдалось.
Холиноксидазные электроды на основе гидрозоля наночастиц у-МпОэ Для
изготовления ХО биосенсора использовали технологию послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП), позволяющую формировать на поверхности послойные конструкции заряженных объектов, в том числе белковой природы.
Изоэлектрическая точка для холиноксидазы составляет 4.1, это означает, что в оптимальном диапазоне значений рН (7.08.5), молекулы фермента заряжены отрицательно. Для иммобилизации фермента была применена предварительная модификация поверхности пероксид-чувствительного слоя поликатионом (ПДДА) путем адсорбции из водного раствора (рис. 13). Далее на подготовленную таким образом поверхность адсорбировали фермент. В целях оптимизации процедуры изготовления холиноксидазного электрода и измерений холина были изучены активность электрода (аналитический отклик на стандартную концентрацию холина) и операционная стабильность (изменение активности Рис. 13. Схема изготовления электрода в ряду последовательных холиноксидазного электрода на измерений) в зависимости от разных основе у-Мп02 конструкции параметров. Варьируемые параметры: ПДЦА/ХО по технологии ПНП концентрация фермента в растворе, влияние подслоев поликатион/полианион, влияние числа слоев поликатион/ХО, потенциал измерений и рН рабочего буферного раствора.
Табл. 3. Влияние концентрации ХО Зависимость величины аналитического отв растворе для адсорбции на клика на Ю^М холина от концентрации величину аналитического отклика холиноксидазы в растворе, из которого и воспроизводимость методики происходила адсорбция фермента была изготовления биосенсоров исследована в диапазоне 0.05-4.00 мг/мл.
(табл. 3). С увеличением концентрации ХО наблюдается рост величины аналитического отклика на холин т.к. на поверхность электрода адсорбируется большее количество фермента. Однако, одновременн о увеличива-ется 11.8.0. В качестве оптимальной была выбрана концентрация 0,5 мг/мл, для которой наблюдаются достаточно высокие значения величины активности, а значение величины стандартного отклонения (Я-Б-О.), вычисленное для 10 электродов, не превышает 15 %.
планарный графитовый электрод
О
гидрозоль 7-Мп02, высушивание
щ,о оо? оо оооо.
ПДДА, адсорбция
ХО, адсорбция
Концентрация холиноксидазы, мг/мл Д1ср, нА КБЛ}., %
0.05 58 16
0.10 98 13
0.50 239 13
1.00 276 24
2.00 318 29
4.00 331 37
Для изучения операционной стабильности холиноксидазных биосенсоров были получены зависимости аналитического сигнала на 10"4М холина по результатам 10 последовательных измерений. Для каждой определены декремент падения (процент снижения аналитического сигнала в пересчете на одно измерение,-вычислялся как тангенс угла наклона прямой) и вариационный коэффициент (Я.Б.О., среднеквадратичное отклонение).
Операционная стабильность сенсоров, конструкции Мп02/ПДДА/Х0, исследованная при рабочем потенциале 480 мВ и рН рабочего буферного раствора 7.5 показала декремент падения аналитического сигнала 2.1±0.1% за одно измерение и вариационный коэффициент за 10 измерений 7.0±0.3%. Полученные величины свидетельствуют о недостаточной операционной стабильности. Причины этого могут заключаться либо в недостаточной стабильности пероксид-чувствительного слоя, разрушение которого ведет к потере стабильности всей конструкции в целом, либо в недостаточной стабильности слоя ПДДА/ХО. Ранее была продемонстрирована хорошая операционная стабильность медиаторного слоя в анализе пероксида водорода и тиохолина. Однако, остается возможность, что его разрушение все-таки происходит, но настолько медленно, что его нельзя отследить, измеряя ответы на стандартную концентрацию Н202 или тиохолина. Т.к. выбранная концентрация Мп02 в гидрозоле лежит в области насыщения на зависимости отклика на Н202 от концентрации (рис. 9), то даже существенное уменьшение количества медиатора на поверхности электрода практически не влияет на величину аналитического сигнала на пероксид водорода. В случае холиноксидазного электрода, нестабильность медиаторного слоя может приводить к тому, что фермент будет десорбироваться с поверхности электрода и аналитический сигнал на холин будет уменьшаться.
Для исследования этого вопроса концентрация диоксида марганца при изготовлении пероксид-чувствительного слоя холиноксидазных сенсоров уменьшалась в 10 раз, с 30 мкг/мл (А370 = 1,60) до 3 мкг/мл (Аз7О=0,16), и измерения проводились в области, где изменение количества медиатора на электроде приводит к значительному изменению аналитического сигнала на пероксид водорода. Результаты исследований говорят о том, что пероксид-чувствительный слой в этих условиях стабилен (декремент падения составил 0.2±0.4%, коэффициент вариации за 10 измерений 2.0±0.1%). Поэтому был сделан вывод о необходимости дополнительной стабилизации холиноксидазного слоя. Для этого провели предварительную модификацию поверхности пероксид-чувствительного слоя двумя дополнительными подслоями ПДДА/ПАСН с целью ее выравнивания. В результате такой модификации удалось снизить декремент падения аналитического сигнала на
холин. Для электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДДА/ХО он составил 0.6±0.2% за измерение, вариационный коэффициент за 10 измерений 1.9±0.4%.
Было также исследовано влияние условий амперометрической детекции холина на операционную стабильность холиноксидазных электродов. При минимальном стационарном потенциале который позволяет регистрировать пероксид водорода - 250 мВ - декремент падения аналитического отклика на холин электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДДА/ХО составил 2.1±0.4, вариационный коэффициент за 10 измерений 9.6±3.0%. Изучение операционной стабильности пероксид-чувствительного слоя показало, что при низких измерительных потенциалах, происходит уменьшение количества Мп02 на поверхности электрода, за счет перехода в растворимую форму Мл II и III. Это в свою очередь приводит к разрушению холиноксидазного слоя. При потенциале 480 мВ разрушения слоя Мп02 не происходит, что определяет операционную стабильность холиноксидазных электродов при этих условиях. Таким образом, оптимальным потенциалом для измерения холина является 480 мВ.
Изучение зависимости величины аналитического сигнала на холин от рН рабочего буферного раствора показало, что с ростом рН увеличивается величина аналитического сигнала на холин. Эти результаты находятся в соответствии с известным из литературы рН-оптимумом работы фермента холиноксидазы, который лежит вблизи значения 8.0. Однако, операционная стабильность холиноксидазных биосенсоров при рН измерительного буфера 8.2 ниже, чем при 7.5, декремент падения составляет 3.2±0.0% за измерение, значение Я.Б.О. за 10 измерений 11.1±0.4%. Таким образом, оптимальным значением рН рабочего буферного раствора для холиноксидазных электродов является 7.5.
Следующим этапом работы было увеличение чувствительности холиноксидазных электродов. Чтобы повысить чувствительность электродов, необходимо увеличить количество фермента в поверхностном слое. Как было показано выше, увеличение количества фермента на поверхности электрода путем повышения его концентрации в растворе при адсорбции ограничено т.к. при высоких концентрациях ухудшается воспроизводимость методики (табл. 3). Однако, метод ПНП позволяет наносить несколько слоев фермента, путем чередования их со слоями поликатиона. В таблице 4 приведены результаты измерений аналитического отклика холиноксидазных электродов конструкции (ПДДА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)„ от числа слоев ПДДА/ХО. Конструкции (ПДЦА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)2 и (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)з имеют большую активность, чем конструкция (ПДДА/ПАСК)2/ПДДА/ХО, однако дальнейшее увеличение количества слоев ПДДА/ХО не влияет на активность сенсоров. Было также замечено, что при увеличении число слоев ХО с 1-го до 3-х
улучшается воспроизводимость от электрода к электроду. Вероятно, при увеличении числа слоев происходит более равномерное заполнение поверхности электрода молекулами фермента.
Табл. 4. Влияние числа слоев ПДДА/ХО на величину аналитического сигнала на Ш4Мхолина холиноксидазных электродов конструкции (ПЩА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)п
п Отношение величины аналитического отклика на 10"4 М холина для конструкции с п слоями ХО к аналитическому отклику для 1-го слоя ХО, Д1п/11 ИЗО, %
1 1 19
2 1,29 14
3 1,52 7
4 1,53 9
5 1,25 11
6 1,40 12
8 1,48 6
10 1,37 4
Анализ градуировочных зависимостей аналитического сигнала от концентрации холина позволил вычислить следующие аналитические характеристики сенсоров:
Конструкция ГПДДА/ПАСЮ,/ПДДА/ХО
-предел обнаружения по холину, рассчитанный по уравнению у=2.9-х+3.5 при уровне шума О.ЗнА составил 3.0-10'7М (Зо), -линейный диапазон 5.0-10 М.О-Ю"4 М, -чувствительность составила 59 ± ЗмА/СМ-см2). Конструкция ШДДА/ПАСКУШДДА/ХОЬ
-предел обнаружения по холину, рассчитанный по уравнению у=5,146 х при уровне шума О.ЗнА составил 1.3.0-10'7М (Зо), -линейный диапазон 5.010"7-1.0-10"4 М, -чувствительность составила 103 ± ЗмАУ(Мсм2).
Для получения статистических данных по воспроизводимости холиноксидазных электродов, содержащих 3 слоя холиноксидазы, было изготовлено 5 серий по 5 электродов и проведены измерения аналитического отклика этих электродов на стандартную концентрацию холина.
-среднее значение отклика для 25-ти электродов составило: 559±53 нА, -1*51) для 5-ти электродов внутри одной серии составило: 9±2 % -1*80 средних значений откликов между сериями составило: 9%
Значения пределов обнаружения близки (по пероксиду водорода) или ниже (по холину) по сравнению с ранее разработанными в лаб Посгеномной химии сенсорами с использованием технологии электрохимического осаждения Мп02.
Для изучения операционной стабильности было изготовлено 5 электродов конструкции (ПДДА/ПАСК)2/(ПДДА/ХО)з> для каждого было сделано 10 последовательных измерений на Ю^М холина в 50 мМ буфере НереБ с 30 мМ КС1, рН 7.5 при рабочем потенциале 480 мВ. Среднее значение декримента падения (с11/с11о, % за одно измерение) составило -0,65±0,43 %, значение ЯББ составило 2,6±1,4%
Долговременная стабильность изучалась для электродов, конструкции (ПДДА/ПАСН)2/ПДЦА/ХО, которые хранили при +4°С, в герметичной упаковке с осушителем. Об активности электродов судили, измеряя раз в неделю значения аналитического отклика на тестовую концентрацию (10"4 М) холина на трех электродах при 480 мВ. Было показано, что остаточная активность электродов на 21-й день хранения составила 74.5% от начальной активности.
Анализ активности БХЭ и ингибиторов холинэстераз при помощи электродов, модифицированных наночастицами у-МпО?
Основной областью применения разработанных электрохимических сенсоров является анализ активности холинэстераз и определение содержания их ингибиторов в образцах.
Возможность анализа активности холинэстераз при помощи разработанных электродов была исследована на примере БХЭ. В основу анализа легли два подхода:
1) Измерение холина, образующегося в реакции гидролиза природного субстрата БХЭ бутирилхолина (БХ), при помощи холиноксидазного электрода согласно схеме:
2) Измерение тиохолина, образующегося в реакции гидролиза
синтетического субстрата пропионилтиохолина (ПТХ), при
помощи электрода, модифицированного медиаторным слоем Мп02 согласно схеме:
2е
С
Мп02
2 Тиохолин
Mn (II, III) ^ Дитиобисхолин + 2 Н+
Определение ингибиторов холинэстеразной активности проводили, инкубируя БХЭ с ингибитором, и измеряя активность БХЭ до и после инкубации
Измерение активности БХЭ проводили в двух режимах:
1) режим измерения накопленного продукта при перемешивании: фермент инкубировали в течение фиксированного времени с ПТХ или БХ, после чего измеряли концентрацию наработанного (тио)холина в ячейке с перемешиванием. Аналитическим сигналом в этом случае являлся отклик электрода на (тио)холин (рис. 14)
2) кинетический режим: хроноамперометрические кривые накопления (тио)холина получали, проводя гидролиз субстрата в электрохимической ячейке с перемешиванием при включенном потенциале. После добавления ПТХ (БХ) в электрохимическую ячейку, определяли тангенс угла наклона его спонтанного гидролиза, а затем, добавляя в ячейку БХЭ, наблюдали суммарный гидролиз субстрата. Скорость ферментативного гидролиза определяли по разнице скоростей суммарного и спонтанного гидролиза субстрата (рис. 15).
300-,
< х
200
100
1000
< х
500
БХЭ бутирил-холин
600
200
350
250 300 Время, с
Рис. 14. Типичный вид аналитического отклика холиноксидазного биосенсора на добавление в электрохимическую ячейку холина
В таблице 5 приведены аналитические характеристики разработанных методов определения активности БХЭ. Таким образом, было показано, что разработанные холиноксидазные и тиохолин-чувствительные электроды могут применяться для определения активностей ферментов холинэстераз с высокой чувствительностью. Для сравнения, спектрофотометрический метод Эллмана позволяет определять БХЭ в концентрации 1 • Ю'10 М.
200 400
Время, с
Рис. 15. Типичный вид аналитического отклика на последовательное добавление в электрохимическую ячейку БХ и БХЭ
Табл. 5. Аналитические характеристики различных режимов определения
активности БХЭ.
Субстрат/электрод Режим измерения Предел обнаружения БХЭ, М Чувствительность
БХ/холиноксидазный накопления продукта 1 ■ 10 й 101 нА/нМ
БХУхолиноксидазный кинетический 5 • Ю-2 5,02 нА/(нМ • с)
ПТХ/тиохолин-чувсвтвительный накопления продукта 2 • 10"12 630 нА/нМ
ПТХ/тиохолин-чувсвтвительный кинетический 1 • ю-'2 8,16 нА/(нМ ■ с)
Анализ ингибиторов холинэстеразной активности при помощи холиноксидазных электродов проводили в кинетическом режиме. В таблице 6 приведены диапазоны определяемых концентрация ряда ингибиторов.
Таким образом, показана возможность использования разработанных холиноксидазных электродов для высокочувствительного определения ингибиторов холинэстеразной активности. Применение разработанного метода ингибиторного анализа было опробовано на примере определения нейро-токсичности препаратов сине-зеленых водорослей из оз. Сестрорецкий Разлив. Работа проводилась на базе с Санкт-Петербургского Научного Центра Экологической Безопасности РАН. Отбор проб и верификация данных была проведена сотрудниками центра Зигель В.В. и Пилип А. Г. С использванием холин-чувствительных электродов были зарегистрированы сезонные колебания нейротоксиов в препаратах сине-зеленых водорослей, отобранных в летний период 2008-2010 гг. Данные были верифицированы методом масс-спектрометрии.
Анализ ингибиторов на примере диазинона при помощи тиохолин-чувствительных электродов проводили в трех режимах: кинетическом и режимах измерения накопленного продукта при перемешивании и без перемешивания (табл. 7). В последнем слечае использовались комбинированные плпнарные электроды, состоящие из рабочего графитового электрода, модифицированного наночастицами у-Мп02 и А§/А§С1 электрода сравнения.
Табл. 6. Диапазоны определяемых концентраций различных ингибиторов при измерении относительной активности БХЭ
Ингибитор Диапазон определяемых концентраций, нМ
Хлорпирифос 0,04-0,46
Диазинон 0,9-10,9
Диизипропилфторфосфат 12-138
Карбофуран 160-1900
Табл. 7. Диапазоны определяемых концентраций диазинона при измерении относительной активности БХЭ при помощи тиохолин-чувствительного
электрода.
Режим измерения Определяемый диапазон, нМ
Кинетический 0,7-8,0
Измерения накопленного продукта при перемешивании 0,9-10,3
Измерение накопленного продукта без перемешивания 1,3-14,8
Таким образом, была продемонстрирована возможность использования разработанных тиохолин-чувствительных электродов для анализа ингибиторов холинэстеразной активности в различных режимах проведения измерений, в том числе в режиме, не требующем перемешивания и удобном для проведения анализов в 'полевых условиях', с высокой чувствительностью.
ВЫВОДЫ
1) С использованием обращенных мицелл синтезированы наночастицы Мп02, представляющие собой нитевидные образования диаметром 1 нм и длиной 20-30 нм. Исследованы медиаторные свойства этих наночастиц в реакции окисления пероксида водорода, получены аналитические характеристики (предел обнаружения 7,8 • 10"8 M, чувствительность 922 мА/(М • см2).
2) Разработана методика получения стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02, имеющих гидродинамический радиус 60 нм по данным светорассеяния. Показано, что частицы у-Мп02 обладают более высокоактивными медиаторными свойствами по сравнению с аморфной и р-модификациями. На основе полученного гидрозоля созданы высокочувствительные медиаторные слои, позволяющие определять пероксид водорода с чувствительностью 515 мА/(М ■ см2) и пределом обнаружения 2,2-10"8 М.
3) Показано, что гидрозоль наночастиц у-Мп02 позволяет формировать медиаторные слои более технологичным способом по сравнению с традиционно используемым электрохимическим осаждением, при этом не уступающие им по аналитическим характеристикам.
4) Разработан электрохимический формат определения тиолов с использованием наночастиц у-Мп02 в качестве медиатора со следующими аналитическими характеристиками по тиохолину: чувствительностью 345 мА/(М • см2) и пределом обнаружения 6 ■ 10"8М. Полученное значение в 200 раз ниже предела обнаружения спектрофотометрических методов и в 8 раз ниже описанных электрохимических сенсоров на основе других медиаторов.
5) Разработан электрохимический холин-чувствительный биосенсор на основе наночастиц у-Мп02. Оптимизирована конструкция биосенсора. Показано, что конструкция (ПДДА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)з обладает улучшенной стабильностью, активностью и воспроизводимостью. Чувствительность определения холина при помощи разработанного биосенсора составляет 103 мА/(М ■ см2), предел обнаружения 1,3 • 10'7 М, что является лучшим значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
6) Разработанные тиохолин- и холин-чувствительных сенсоры были использованы для высокочувствительного анализа БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности. Апробация сенсоров была проведена на базе Санкт-Петербургского Научного Центра Экологической Безопасности РАН в условиях мониторинга нейротоксичности водоемов в период вредоносного цветения водорослей.
Список работ по теме диссертации
1. Dontsova Е.А., Zeifman Y.S., Budashov I.A., Eremenko A.V., Kalnov S.L., Kurochkin I. N. Screen-printed carbon electrode for choline based on Mn02 nanoparticles and choline oxidase/polyelectrolyte layers // Sensors and Actuators B: Chemical, V 159, No 1,2011, pp. 261-270.
2. Донцова E.A., Будашов И.А., Еременко A.B., Кальнов СЛ., Курочкин И.Н., Трудил Д. Гидрозоль для формирования покрытий электрохимических пероксид-чувствительных сенсоров и биосенсоров, способ его получения, электрохимический сенсор и биосенсор, способы их получения и применение // Патент РФ № 2419785 (27 мая 2011)
3. Еременко A.B., Курочкин И.Н, Варфоломеев С.Д., Осипова М.С.,. Сиголаева Л.В, Донцова Е.А., Донченко К.В., Жаковская З.А., Зигель В.В., Пилип А.Г. Биосенсорные системы как средства ранней диагностики экологической безопасности // Научно-информационный бюллетень 'Экологическая безопасность' № 1-2 (21-22). 2009. Санкт-Петербург. стр 16-24.
4. Донцова Е.А., Будашов И.А., Еременко A.B., Курочкин И.Н. Пероксид-чувствительный амперометрический сенсор на основе наночастиц диоксида марганца // Российские нанотехнологии Т 3 № 7-8, 2008, стр. 133-143.
5. Курочкин И.Н., Еременко A.B., Сиголаева Л.В., Громова М.С., Донцова Е.А., Торгонская A.A., Крайнова H.A., Дубачева Г.В., Порус М.С., Махаева Г.Ф., Рудакова E.H., Пергушов Д.В., Будашов И.А., Евтушенко Е.Г., Зезин А.Б., Варфоломеев С.Д. Фермент-полимерные нанокомпозиты как основа диагностической платформы для медико-биологических
исследований. С. 219-296. В книге Посгеномные исследования и технологии (под ред. Варфоломеева С. Д.), Москва. 2011.
6. Евтушенко Е.Г., Донцова Е.А., Курочкин И.Н. Практические примеры использования метода NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) для изучения нанобиообъектов, процессов агрегации белков, а также общей характеристики наночастиц // 2-ой Международной Школы 'Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина', 19-24 сентября 2011, Московская обл. С. 28.
7. Донцова Е.А., Сиголаева Л.В., Пилип А.Г., Еременко А.В., Курочкин И.Н., Планарные амперометрические сенсоры на основе наночастиц диоксида марганца и холиноксидазы для анализа холинэстераз и их ингибиторов // VI -го Московского Международного Конгресса 'Биотехнология: состояние и перспективы развития', 21-25 марта 2011, Москва. С. 268.
8. Dontsova Е.А. Investigation of including Mn02 nanoparticles and antibodies into polymer multilayered thin films // ICYS-ICMR Summer School on Nanomaterials, July 22-28 2006, Tsukuba, Japan. P. 41.
Формат 60x90/16. Заказ 1487. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,4. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Донцова, Екатерина Александровна
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура, свойства и роль холинэстераз в организме
1.2. Ингибиторы холинэстераз
1.3. Методы анализа ингибиторов холинэстераз
1.4. Амперометрические системы регистрации тиохолина
1.5. Амперометрические системы регистрации пероксида водорода и холина
1.5.1. Фермент холиноксидаза, структура и свойства
1.5.2. Холиноксидазные электрохимические сенсоры
1.5.2.1. Электрохимическая регистрация пероксида водорода
1.5.2.2. Иммобилизация холиноксидазы и анализ холина
1.6. Методы получения и стабилизации наночастиц для формирования медиаторных покрытий
1.6.1. Методы получения наночастиц.
1.6.2. Стабилизация золей наночастиц
1.7. Диоксид марганца как медиатор для электрохимического анализа
1.7.1. Структура и свойства диоксида марганца
1.7.2. Синтез и стабилизация наночастиц диоксида марганца.
1.7.3. Электрохимические сенсоры на основе диоксида марганца
2. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Получение наночастиц МпОг для формирования медиаторных покрытий
2.2.1.1. Получение наночастиц диоксида марганца в обращенных мицеллах
2.2.1.2. Получение наночастиц МпОг в гидротермальных условиях.
2.2.1.3. Получение у - диоксида марганца
2.2.1.4. Получение водных золей аморфного и (З-МпОг
2.2.2. Физико-химические методы характеристики наночастиц МпОг
2.2.2.1. Рентгеновская дифракция
2.2.2.2. Просвечивающая электронная микроскопия
2.2.2.3. Сканирующая электронная микроскопия
2.2.2.4. Измерение концентрации и распределения частиц гидрозолей аморфного, (3- и у-Мп02 по размерам
2.2.2.5. Спектрофотометрические исследования водных золей Мп
2.2.2.6. Квазиупругое динамическое светорассеяние
2.2.2.7. Определение дзетта-потенциала наночастиц у - Мп
2.2.3. Изготовление электродов на основе наночастиц Мп
2.2.3.1. Модификация графитовых стержней наночастицами
Мп02. синтезированными в обратных мицеллах.
2.2.3.2. Модификация планарных графитовых электродов водными золями наночастиц Мп
2.2.3.3. Сканирующая электронная микроскопия поверхности электродов
2.2.3.4. Изготовление холиноксидазных биосенсоров методом послойного нанесения полиэлектролитов
2.2.3.5. Изготовление холиноксидазных электродов методом иммобилизации фермента в пленке с поли(4-винилпирилином)
2.2.4. Электрохимические характеристики электродов
2.2.4.1. Вольтамперометрия
2.2.4.2. Анализ пероксида водорода, холина и тиохолина
2.2.5. Анализ холинэстеразной активности и ингибиторов холинэстераз
2.2.5.1. Электрохимическое определение активности бутерилхолинэстеразы с использованием холиноксидазных электродов '
2.2.5.2. Электрохимический анализ активности БХЭ с использованием серосодержащих субстратов
2.2.5.3. Электрохимический анализ ингибиторов холинэстеразной активности с использованием холиноксидазных электродов
2.2.5.4. Определение нейротоксичности проб сине-зеленых водорослей £ ^
2.2.5.5. Электрохимический анализ ингибиторов холинэстеразной активности с использованием серосодержащих субстратов
2.2.5.6. Анализ тиохолина и диазинона без перемешивания 82 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование электрохимических свойств наночастиц диоксида марганца,
-синтезированных в обращенных мицеллах
3.1.1. Синтез наночастиц МпОг в обращенных мицеллах и их характеристика
3.1.2. Изготовление и характеристика пероксид-чувствительных электродов на основе наночастиц М11О2. полученных в обращенных мицеллах
3.1.2.1. Оптимизация процедуры нанесения медиатора
3.1.2.2. Вольтамперометрические характеристики электродов
3.1.2.3. Операционная и долговременная стабильнбость электродов
3.1.3. Анализ пероксида водророда при помощи электродов на основе наночастиц МпОг полученными в обращенных мицеллах
3.1.3.1. Влияние рабочего потенциала
3.1.3.2. Влияние ионной силы рабочего буфера.
3.1.3.3. Интерферирующее влияние различных веществ на электрохимический анализ пероксида водорода
3.1.3.4. Градуировочная зависимость по Н2О2 и аналитические характеристики электродов
3.1.4. Холиноксидазные электроды на основе наночастиц диоксида марганца, полученных в обращенных мицеллах
3.2. Исследование медиаторных свойств гидрозолей диоксида марганца для анализа пероксида водорода и тиохолина
3.2.1. Получение и физико-химические характеристики гидрозолей наночастиц диоксида марганца
3.2.1.1. Гидрозоль наночастиц у-МпОг
3.2.1.2. Гидрозоли аморфного и Р-М1Ю
3.2.2. Исследование электрохимических свойств наночастиц М11О2 в реакции электроокисления тиохолина
3.2.3. Исследование электрохимических свойств наночастиц МпОг в реакции электроокисления пероксида водорода
3.2.4. Оптимизация и характеристика электродов на основе наночастиц у-МпОг
3.2.4.1. Анализ пероксида водорода
3.2.4.2. Анализ тиолов
3.3. Холиноксидазные электроды на основе гидрозоля наночастиц у-МпОг
3.3.1. Оптимизация методики изготовления холиноксидазных электродов и анализа хо лина ^
3.3.1.1. Оптимизация концентрации фермента при адсорбции
3.3.1.2. Операционная стабильность холиноксидазных электродов
3.3.1.3. Исследование влияния числа слоев холиноксидазы на аналитические характеристики электродов ]
3.3.2. Определение кинетических параметров иммобилизованной холиноксидазы
3.3.3. Аналитические характеристики холиноксидазных электродов
3.3.4. Влияние интерферирующих компонентов биологических жидкостей и экологических образцов на анализ холина !
3.4. Анализ активности БХЭ и ингибиторов холинэстераз при помощи электродов, модифицированных наночастицами у-Мп02 но
3.4.1. Анализ активности БХЭ при помощи холиноксидазных электродов
3.4.2. Анализ активности БХЭ с использованием серосодержащих субстратов
3.4.2.1. Оптимизация времени проведения реакции ферментативного гидролиза ПТХ и концентрации субстрата
3.4.2.2. Измерение активности БХЭ в режиме накопления продукта и в кинетическом режиме
3.4.3. Анализ ингибиторов холинэстераз при помощи холиноксидазных электродов
3.4.3.1. Анализ хлорпирифоса, диазинона, диизопропилфторфосфата и карбофурана в кинетическом режиме
3.4.3.2. Анализ нейротоксичности проб сине-зелёных водорослей
3.4.4. Анализ ингибиторов холинэстераз с использованием серосодержащих субстратов
3.4.4.1. Анализ диазинона в режиме измерения накопленного продукта и кинетическом режиме
3.4.4.2. Анализ тиохолина и диазинона без перемешивания 152 ЗАКЛЮЧЕНИЕ выводы ]
Введение Диссертация по биологии, на тему "Сенсорные электроды на основе наночастиц диоксида марганца"
Холинэстеразы выполняют важнейшие функции в организме человека и других млекопитающих. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) участвует в процессе передачи нервного импульса, её роль заключается в гидролизе нейромедиатора ацетилхолина. Бутирилхолинэстераза (БХЭ) участвует в процессах метаболизма широкого спектра эндогенных и экзогенных субстратов и биотрансформации ксенобиотиков. Изменение уровня активности холинэстераз сопровождает такие нейродегенеративные заболевания, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Ингибиторы холинэстераз, к которым относятся фосфорорганические соединения и карбаматы, применяются в качестве пестицидов. Наиболее токсичные ингибиторы, например зарин, зоман, УХ, являются боевыми отравляющими веществами нейропаралитического действия и могут быть использованы в качестве химического оружия. Отравление ингибиторами холинэстераз может привести к тяжёлым последствиям для организма и даже к летальному исходу. В связи с этим актуальной является задача разработки экспрессных и высокочувствительных методов анализа ингибиторов холинэстеразной активности.
Экспресс-методы анализа ингибиторов холинэстераз основаны на измерении активности ферментов АХЭ и БХЭ до и после контакта с пробой, потенциально содержащей ингибитор. Показателем активности данных ферментов является скорость гидролиза их природных и синтетических субстратов. Природными субстратами холинэстераз являются холиновые эфиры, их гидролиз приводит к образованию холина. В качестве синтетических аналогов используют серосодержащие эфиры, гидролиз которых приводит к образованию тиохолина.
Классическим методом анализа тиохолина является спектрофотомерия, которая позволяет анализировать данное соединение с пределом обнаружения 10 мкМ. Более высокой чувствительностью обладают электрохимические методы анализа, среди которых выделяют электрохимические сенсоры с использованием медиаторов, веществ, способных к циклическому окислению-восстановлению на поверхности электрода, которые позволяют существенно снизить предел обнаружения тиохолина.
Среди наиболее перспективных методов анализа холина также можно выделить использование электрохимических сенсоров. Холин-чувствительные сенсоры содержат в своём составе фермент холиноксидазу, который катализирует окисление холина с образованием пероксида водорода в качестве копродукта. Образующийся пероксид водорода регистрируют электрохимически, при этом использование медиаторов также позволяет существенно повысить чувствительность такого анализа.
Таким образом, использование электрохимических медиаторов является перспективным универсальным подходом для создания тиохолин- и холин-чувствительных сенсоров, позволяющих определять активность холинэстераз и осуществлять анализ их ингибиторов. Среди описанных соединений, обладающих медиаторной активностью, можно перечислить гексацианоферраты кобальта и железа, оксиды меди, марганца, ванадия, а также ряд органических и металлорганических соединений. При этом наилучшей чувствительностью обладают электрохимические системы, в которых медиатор присутствует в виде слоя сформированного на рабочей поверхности электрода. Как правило, медиаторный слой на поверхности электрода формируют в процессе электрохимического осаждения, либо синтезируют медиатор на поверхности электрода, либо наносят и высушивают каплю препарата, содержащего медиатор.
В ряде работ, посвященных созданию пероксид-чувствительных и холин-чувствительных сенсоров, было показано, что способ получения медиатора и формирования медиаторного слоя оказывает влияние на чувствительность сенсора. Так, использование наночастиц медиаторов дает существенное преимущество по сравнению с применением обычных микроразмерных порошков [1]. Также было показано, что электрохимическая активность зависит от кристаллической структуры медиатора [2]. Упомянутые исследования касались различных модификаций и способов получения диоксида марганца.
В работах по определению тиохолина описано использование гексацианоферрата кобальта, Берлинской лазури и некоторых органических медиаторов, однако исследований по использованию диоксида марганца для анализа тиолов к настоящему времени не проводилось.
Таким образом, важно исследовать различные способы получения медиатора МпОг и сравнить их электрохимические свойства в реакциях окисления пероксида водорода и тиохолина. С технологической точки зрения, для изготовления электрохимических сенсоров, удобно использовать золи и эмульсии, содержащие наночастицы медиатора, и наносить их на поверхность электродов методами раскапывания. При этом важнейшую роль для разработки воспроизводимой технологии наряду с электрохимической активностью играет стабильность такого препарата.
Таким образом, целью данной работы было исследование возможности применения наночастиц медиатора диоксида марганца, полученных и стабилизированных различными способами, для изготовления электрохимических систем анализа тиохолина, пероксида водорода и холина с целью определения активности ферментов холинэстераз и анализа их ингибиторов.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Донцова, Екатерина Александровна
4. ВЫВОДЫ
1) С использованием обращенных мицелл синтезированы наночастицы Мп02, представляющие собой нитевидные образования диаметром 1 нм и длиной 20-30 нм. Исследованы медиаторные свойства этих наночастиц в реакции окисления пероксида водорода, получены аналитические характеристики (предел обнаружения 7,8 • 10"8 M , у чувствительность 922 мА/(М • см ).
2) Разработана методика получения стабильного гидрозоля наночастиц у-Мп02, имеющих гидродинамический радиус 60 нм по данным светорассеяния. Показано, что частицы у-Мп02 обладают более высокоактивными медиаторными свойствами по сравнению с аморфной и (3-модификациями. На основе полученного гидрозоля созданы высокочувствительные медиаторные слои, позволяющие определять пероксид водорода с чувствительностью 515 мА/(М • см2) и пределом обнаружения 2,2-10"8 М.
3) Показано, что гидрозоль наночастиц у-Мп02 позволяет формировать медиаторные слои более технологичным способом по сравнению с традиционно используемым электрохимическим осаждением, при этом не уступающие им по аналитическим характеристикам.
4) Разработан электрохимический формат определения тиолов с использованием наночастиц у-Мп02 в качестве медиатора со следующими аналитическими характеристиками по тиохолину: чувствительностью 345 мА/(М • см ) и пределом обнаружения 6 • 10"8М. Полученное значение в 200 раз ниже предела обнаружения спектрофотометрических методов и в 8 раз ниже описанных электрохимических сенсоров на основе других медиаторов.
5) Разработан электрохимический холин-чувствительный биосенсор на основе наночастиц у-Мп02 оптимизирована конструкция биосенсора. Показано, что конструкция (ПДЦА/ПАСН)2/(ПДДА/ХО)з обладает улучшенной стабильностью, активностью и воспроизводимостью. Чувствительность определения холина при помощи разработанного биосенсора составляет 103 мА/(М • см ), предел обнаружения 1,3 • 10"7 М, что является лучшим значением для электрохимических холиноксидазных биосенсоров, описанных на сегодняшний день в литературе.
6) Разработанные тиохолин- и холин-чувствительных сенсоры были использованы для высокочувствительного анализа БХЭ и ингибиторов холинэстеразной активности. Апробация сенсоров была проведена на базе Санкт-Петербургского Научного Центра Экологической Безопасности РАН в условиях мониторинга нейротоксичности водоемов в период вредоносного цветения водорослей.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Донцова, Екатерина Александровна, Москва
1. Bai Y.H., Zhang H., Xu J.J., Chen H.Y. Relationship between Nanostructure and Electrochemical/Biosensing Properties of Mn02 Nanomaterials for НгОг/СЬоИпе. // J. Phys. Chem. С., 2008. V. 112. P. 18984-18990.
2. Ruiz-Espejo, F., Cabezas-Herrera, J., Illana, J., Campoy F.G., Vidal C.J. Cholinesterase activity and acetylcholinesterase glycosylation are altered in human breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat., 2002.V. 72. P. 11-22.
3. Gawin, F. H., Ellinwood, E. H. Cocaine and other stimulants. Actions, abuse and treatment. //N.Engl. J. Med., 1988. V. 318. P. 1173-1182.
4. Бресткин А.П., Кузнецова А.П. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток. Высшая школа. 1997. С. 15.
5. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.J., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharm., 1961. V. 7. P. 88-95.
6. Krezel A., Lesniak W., Jezowska-Bojczuk M., Mlynarz P., Brasun J., Kozlowski, H., Bal W. Coordination of heavy metals by dithiothreitol, a commonly used thiol group protectant. // J. Inorg. Biochem., 2001. V. 84. P. 77-88.
7. Majid S., El Rhazi M., Amine A., Brett C.M.A. An amperometric method for the determination of trace mercury (II) by formation of complexes with 1-tyrosine. Anal. Chim. Acta., 2002. V. 464. P. 123-133.
8. Wilkins E., Carter M., Voss J., Ivnitski D. A quantitative determination of organophosphate pesticides in organic solvents. // Electrochem. Commun., 2000. V. 2. P. 786-790.
9. Campanella L., De Luca S., Sammartino M.P., Tomassetti M. A new organic phase enzyme electrode for the analysis of organophosphorus pesticides and carbamates. // Anal. Chim. Acta., 1999. V. 385. P. 59-71.
10. Arduini F., Ricci F., Bourais I., Amine A., Moscone D., Palleschi G. Extraction and Detection of Pesticides by Cholinesterase Inhibition in a Two Phase System: a Strategy to Avoid Heavy Metal Interference. // Anal. Lett., 2005. V. 38. P. 1703-1719.
11. Liu G., Lin Y. Biosensor based on self-assembling acetylcholinesterase on carbon nanotubes for flow injection/amperometric detection of organophosphate pesticides and nerve agents. // Anal. Chem., 2006., V. 78. P. 835-43.
12. Pritchard. J., Law K., Vakurov A., Millner P., Higson S.P.J. Sonochemocally fabricated enzyme microelectrode arrays for the environmental monitoring of pesticides. // Biosens. Bioelectron., 2004. V. 20. P. 765-772.
13. Somerset V.S, Klink M.J, Baker P.G, Iwuoha E.I. Acetylcholinesterase-polyaniline biosensor investigation of organophosphate pesticides in selected organic solvents. J. Environ. Sci. Health B„ 2007. V. 42. P. 297-304.
14. Du D., Wang M., Cai J., Qin Y., Zhang A. One-step synthesis of multiwalled carbon nanotubes-gold nanocomposites for fabricating amperometric acetylcholinesterase biosensor. // Sens. Actuat. B: Chem., 2010. V. 143. P. 524-529.
15. Doretti L., Ferrara D., Lora S., Palma G. Amperometric biosensor involving covalent immobilization of choline oxidase and butyrylcholinesterase on a methacrylate-vinylene carbonate co-polymer. // Biotechnol. Appl. Biochem., 1999. V. 29. P. 67-72.
16. Ivanov A.N., Evtugyn G.A., Gyurcsanyi R.E., Toth K., Budnikov H.C. Comparative investigation of electrochemical cholinesterase biosensors for pesticide determination. // Analyt. Chim. Acta, 2000. V. 404. P. 55-65.
17. Kharitonov A.B., Zayats M., Lichtenstein A., Katz E., Willner I. Enzyme monolayer-functionalized field-effect transistor for biosensor applications. // Sens. Actuat. B: Chem., 2000. V. 70. P. 222-231.
18. Neufeld T., Eshkenazi I., Cohen E., Rishpon J. A micro flow injection electrochemical biosensor for organophosphorus pesticides // Biosens. Bioelectron., 2000. V. 15. P. 323-329.
19. Imato T., Ishibashi N., Potentiometric butyrylcholine sensor for organophosphate pesticides. Biosens. Bioelectron., 1995. V. 10. P. 435^41.
20. Palchetti M., Cagnini A., Del Carlo M., Coppi C., Mascini M., Turner A.P.F. Determination of anticholinesterase pesticides in real samples using a disposable biosensor. // Analyt. Chim. Acta, 1997. V. 337. P. 315-321.
21. Kok F., Hasirci V. Determination of binary pesticide mixtures by an acethylcholinesterase-choline oxidase biosensor. // Biosens. Bioelectron., 2004. V. 19. P. 661665.
22. Gulla K.C., Gouda M.D., Thakur M.S., Karanth N.G. Reactivation of immobilized cholinesterase in an amperometric biosensor for organophosphorus pesticide. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1597. P. 133-139.
23. Collier W.A., Clear M., Hart A.L. Convenient and rapid detection of pesticides in extracts of sheep wool. // Biosens. Bioelectron., 2002. V. 17. P. 815-819.
24. Ghindilis, A.L., Morzunova, T.G., Barmin, A.V., Kurochkin, I.N. Potentiometric biosensors for cholinesterase inhibitor analysis based on mediatorless bioelectrocatalysis. // Biosens. Bioelectron., 1996. V. 11. P. 873-880.
25. Ciucu A., Negulescu C., Baldwin R. Detection of pesticides using an amperometric biosensor based on ferophthalocyanine chemically modified carbon paste electrode and immobilized bienzymatic system. // Biosens. Bioelectron., 2003. V. 18. P. 303-310.
26. Dyk J.S.V., Pletschke B. Review on the use of enzymes for the detection of organochlorine, organophosphate and carbamate pesticides in the environment. // Chemosphere., 2011. V. 82. P 291-307.
27. Donarski W.J., Dumas D.P., Heitmeyer D.P., Lewis V.E., Raushel F.M. Structure -activity relationships in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. // Biochemistry, 1989. V. 28. P. 4650-4655.
28. Neufeld T., Eshkenazi I., Cohen E., Rishpon J. A micro flow injection electrochemical biosensor for organophosphorus pesticides. // Biosens. Bioelectron., 2000. V. 15. P. 323-329.
29. Lea Y., Mulchandani P., Chen W., Wang J., Mulchandani A. Whole cell enzyme hybrid amperometric biosensor for direct determination of organophosphorous nerve agents with p-nitrophenyl substituent. // Biotechnol. Bioeng., 2004. V. 7. P. 706-713.
30. Gaberlein S., Knoll M., Spener F., Zaborosch C. Disposable potentiometric enzyme sensor for direct determination of organophosphorus insecticides. // Analyst, 2000. V. 125. P. 2274-2279.
31. La Rosa C., Pariente F., Hernandez L., Lorenzo E. Amperometric flow-through biosensor for the determination of pesticides // Anal. Chim. Acta, 1995. V. 308. P. 129-136.
32. Jeanty G., Marty J. L. Detection of paraoxon by continuous flow system-based enzyme sensors. //Biosens. Bioelectron., 1998. V.13. P. 213-233.
33. Hernandez S., Palchetti I., Mascini M. Determination of acetylcholinesterase activity for pesticides monitoring using a thiocholine sensor. // Intern. J. Environ. Anal. Chem., 2000. V. 78. P. 263-278.
34. Cortina M., del Valle M., Marty J. L. Electronic tongue using an enzyme inhibition biosensor array for the resolution of pesticide mixtures. // Electroanalysis, 2008. V. 20. P. 5460.
35. Collier W. A., Clear M., Hart A. L. Convenient and rapid detection of pesticides in extracts of sheep wool. // Biosens. Bioelectron., 2002. V. 17. P. 815-819.
36. Hart J. P., Hartley I.C. Voltammetric and amperometric studies of thiocholine at a screen-printed carbon electrode chemically modified with cobalt phthalocyanine: studies towards a pesticide sensor. //Analyst, 1994. V. 119. P. 259-263.
37. Hart A. L., Collier W. A., Janssen D. The response of screen-printed enzyme electrodes containing cholinesterases to organo-phosphates in solution and from commercial formulations. //Biosens. Bioelectron., 1997. Y. 12. P. 645-654.
38. Riccia F., Arduinia F., Amineb A., Moscone D., Palleschi G. Characterisation of Prussian blue modified screen-printed electrodes for thiol detection. // J. Electroanal. Chem., 2004. V. 563. P. 229-237.
39. Arduini F., Cassisi A., Amine A., Ricci F., Moscone D., Palleschi G. Electrocatalytic oxidaton of thiocholine at chemically modified cobalt hexacyanoferrate screen-printed electrodes. // J. Electroanal. Chem., 2009. V. 626. P. 66-74.
40. Arduini F., Amine A., Moscone D., Ricci F., Palleschi G. Fast, sensitive and cost-effective detection of nerve agents in the gas phase using a portable instrument and an electrochemical biosensor. // Anal. Bioanal. Chem., 2007. V. 388. P. 1049-1057.
41. Sun X., Wang X., Acetylcholinesterase biosensor based on prussian blue-modified electrode for detecting organophosphorous pesticides. // Biosens. Bioelectron., 2010. V. 25. P. 2611-2614.
42. Herszage J., dos Santos Afonso M., Luther GW 3rd. Oxidation of cysteine and glutathione by soluble polymeric Mn02. // Environ Sci Technol., 2003. V. 37. P. 3332-3338.
43. Ikuta, S., Imamura, S., Misaki, H., Hariuti, Y. Purification and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. II J. Biochem. 1977. V. 82. P. 1741-1749.
44. Ohta-Fukuyama, M., Miyake, Y., Emi, S., Yamano, T. Identification and properties of the prosthetic group of choline oxidase from Alcaligenes sp. //J. Biochem. 1983. V. 88. P. 197203.
45. Ohishi, N., Yagi, K. Covalently bound flavin and prosthetic group of choline oxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 86. P. 1084-1088.
46. Yamada, H., Mori, N., Tani, Y. Properties of choline oxidase of cylindrocarpon didymium M-l. //Agric. Biol. Chem. 1979. V. 43. P. 2173- 2177.
47. Hatefi, Y., Stiggall, D.L. Metal-containing flavoprotein dehydrogenases, The Enzymes, 3rd Ed. (Boyer,P.D., ed)., 1975. P. 175-297.
48. Fan F., Gadda G. On the catalytic mechanism of choline oxidase. // J.Chem.Amer.Soc., 2005. V. 127. P. 2067-2074.
49. Tang J., Wang B., Wu Z., Han X., Dong Sh., Wang E. Lipid membrane immobilized horseradish peroxidase biosensor for amperometric determination of hydrogen peroxide. // Biosens. Bioelectron., 2003. V.18. P. 867-872.
50. Ledru S., Ruill'e N., Boujtita M. One-step screen-printed electrode modified in its bulk with HRP based on direct electron transfer for hydrogen peroxide detection in flow injection mode. // Biosens. Bioelectron., 2006. V. 21. P. 1591-1598.
51. Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor N., Leon J.C., Csoregi E., Sakharov I.Y. Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide monitoring. // Biosens. Bioelectron., 2005. V. 21. P. 742-748.
52. Ferri T., Poscia A., Santucci. R. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide. // Bioelectrochem. Bioenerg., 1998. V.45. P. 221-226.
53. Lyon J.L., Stevenson K.J. Picomolar peroxide detection using a chemically activated redox mediator and square wave voltammetry. // Anal. Chem., 2006. V.78. P. 8518-8525.
54. Morrin A., Moutloali R.M., Killard A.J., Smyth M.R., Darkwa J., Iwuoha E.I. Electrocatalytic sensor devices: (I) cyclopentadienylnickel(II) thiolato Schiff base monolayer self-assembled on gold. // Talanta. 2004. Y.64. P. 30-38.
55. Tripathi V.S., Kandimalla V.B, Ju H. Amperometric biosensor for hydrogen peroxide based on ferrocene-bovine serum albumin and multiwall carbon nanotube modified ormosil composite. // Biosens. Bioelectron. 2006. V.21. P. 1529-1535.
56. Gaspar S., Popescu I. C., Gazaryan I.G., Bautista A.G., Sakharov I. Y., Mattiasson B., Csoregi E. Biosensors based on novel plant peroxidases: a comparative study. // Electrochim. Acta, 2000. V. 46. P. 255-264.
57. Yao H., Li N., Xu Sh., Xu J.Z., Zhu J.J., Chen H.Yu. Electrochemical study of a new methylene blue/silicon oxide nanocomposition mediator and its application for stable biosensor of hydrogen peroxide. // Biosens. Bioelectron., 2005. V.21. P. 372-377.
58. Ren Ch., Song Yo., Li Z., Zhu G. Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on a silver nanoparticles /cysteamine/gold electrode. // Anal. Bioanal. Chem., 2005. V. 381. P. 1179-1185.
59. Mashazi Ph.N., Ozoemenab K.I., Nyokong T. Tetracarboxylic acid cobalt phthalocyanine SAM on gold: potential applications as amperometric sensor for H2O2 and fabrication of glucose biosensor // Electrochim. Acta. 2006. V.52. P. 177-186.
60. Mannino S., Cosio M. S., Ratti S. Cobalt(II, III)-oxide chemically modified electrode as amperometric detector in flow injection systems. // Electroanalysis, 1993. V.5. P. 145-148.
61. Salimi A., Hallaj R., Soltanian S., Mamkhezri H. Nanomolar detection of hydrogen peroxide on glassy carbon electrode modified with electrodeposited cobalt oxide nanoparticles. // Anal. Chim. Acta., 2007. V. 594. P.24-31.
62. Cox J. A., Jaworski R.K., Voltammetric reduction and determination of hydrogen peroxide at an electrode modified with a film containing palladium and iridium. // Anal. Chem. 1989. V. 61. P. 2176-2178.
63. Domenech A., Alarcon J. Determination of hydrogen peroxide using glassy carbon and graphite/polyester composite electrodes modified by vanadium-doped zirconias. // Anal. Chim. Acta., 2002. V. 452. P. 11-22.
64. Yang M., Jiang J., Yang Yu., Chen X., Shen G., Yu R. Carbon nanotube/cobalt hexacyanoferrate nanoparticle-biopolymer system for the fabrication of biosensors. // Biosens. Bioelectron., 2006. V. 21. P. 1791-1797.
65. Eftekhari A. Electrocatalysis and amperometric detection of hydrogen peroxide at an aluminum microelectrode modified with cobalt hexacyanoferrate film. // Mikrochim. Acta. 2003. V.141.P.15-21.
66. Razmi H., Heidari H. Amperometric determination of hydrogen peroxide on surface of a novel PbPCNF-modified carbon-ceramic electrode in acidic medium. // J. Electroanal. Chem, 2009. V. 625. P. 101-108.
67. Karyakin A.A., Puganova E.A., Budashov I.A., Kurochkin I.N., Karyakina E.E., Levchenko V.A., Matveyenko V.N., Varfolomeyev S.D. Prussian blue based nanoelectrode arrays for H202 detection. // Anal. Chem., 2004. V.76. P. 474-478.
68. Karyakin A. A., Karyakina E.E. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors. // Sens. Actuat. B: Chem., 1999. V. 57. P. 268-273.
69. Ricci F., Palleschi G. Sensor and biosensor preparation, optimisation and applications of Prussian Blue modified electrodes. // Biosens. Bioelectron., 2005. V. 21. P. 389-407.
70. Taha Z., Wang J. Electrocatalysis and flow detection at a glassy carbon electrode modified with a thin film of oxymanganese species. // Electroanalysis, 1991. V. 3. P. 215219.
71. Schachl K., Alemu H., Kalcher K., Jeozkova J., Svancara I., Vytoras K. Amperometric determination of hydrogen peroxide with a manganese dioxide-modified carbon paste electrode using flow injection analysis. // Analyst., 1997. V.122. P. 985-989.
72. Schachl K., Alemu H., Kalcher K., Moderegger H., Svancara I., Vytras K. Amperometric determination of hydrogen peroxide with a manganese dioxide film-modified screen printed electrode. // Fresenius J. Anal. Chem., 1998. V. 362. P. 194-200.
73. Doretti L., Ferrara D., Gattolin P., Lora S. Covalentl immobilized enzymes on biocompatible polymers for amperometric sensor applications. // Biosens. Bioelectron., 1996. V. 11. P. 365-373. .
74. Shimomura T., Itoh T., Sumiya T., Mizukami F., Ono M. Amperometric determination of choline with enzyme immobilized in a hybrid mesoporous membrane. // Talanta, 2009. V. 78. P. 217-220.
75. Bai Y. H., Du Y., Xu J. J., Chen H. Y. Choline biosensors based on a bi-electrocatalytic property of MnC>2 nanoparticles modified electrodes to H2O2 // Electrochem. Commun., 2007. V. 9. P. 2611-2616.
76. Sen S., Gulce A., Gulce H. Polyvinylferrocenium modified Pt electrode for the design of amperometric choline and acetylcholine enzyme electrodes. // Biosens. Bioelectron., 2004. V. 19. P. 1261-1268.
77. Langer J. J., Filipiak M., Kecinska J., Jasnowska J., Wlodarczak J., Buladowski B. Polyaniline biosensor for choline determination. // Surface Science, 2004.V. 573. P. 140-145.
78. Yang M., Yang Y., Yang Yu., Shen G., Yu R. Microbiosensor for acetylcholine and choline based on electropolymerization/sol-gel derived composite membrane. // Anal. Chim. Acta, 2005. V. 530. P. 205-211.
79. Mitchell K. M. Acetylcholine and choline amperometric enzyme sensors characterized in vitro and in vivo. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 1098-1106.
80. Rahman M. A., Park D. S., Shim Y. B. A performance comparison of choline biosensors: anodic or cathodic detections of H2O2 generated by enzyme immobilized on a conducting polymer. // Biosens. Bioelectron., 2004. V. 19. P. 1565-1571.
81. Razola S. S., Pochet S., Grosfils K., Kauffmann J.M. Amperometric determination of choline released from rat submandibular gland acinar cells using a choline oxidase biosensor. // Biosens. Bioelectron., 2003. V. 18. P. 185 191.
82. Yang M., Yang Y., Yang Yu., Shen G., Yu R. Bienzymatic amperometric biosensor for choline based on mediator thionine in situ electropolymerized within a carbon paste electrode. // Anal. Biochem., 2004. V. 334 P. 127-134.
83. Moscone D., D'Ottavi D., Compagnone D., Palleschi G. Construction and analytical characterization of prussian blue-based carbon paste electrodes and their assembly as oxidase enzyme sensors. // Anal. Chem., 2001. V. 73. P. 2529-2535.
84. Ricci F., Amine A., Palleschi G., Moscone D. Prussian Blue based screen printed biosensors with improved characteristics of long-term lifetime and pH stability. // Biosens. Bioelectron., 2003. V. 18. P. 165 174.
85. Shi H., Yang Yu, Huang J., Zhao Z., Xu X., Anzai J., Osa Т., Chen Q. Amperometric choline biosensors prepared by layer-by-layer deposition of choline oxidase on the Prussian blue-modified platinum electrode. // Talanta, 2006. V. 70. P. 852-858.
86. Порус M.B., Дубачева Г.В., Сиголаева Jl.B., Еременко А.В., Курочкин И.Н. Определение активностей холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродной сенсорной системы. // Сенсорные Системы, 2008. Т. 22. С. 88-95.
87. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. 2-е изд. Москва. Химия. 1975. 512 с.
88. Фридрихсберг Д. А. Курс коллоидной химии. 2-е изд. Ленинград. Химия. 1984. 368 с.
89. Sugimoto Т. Fine particles: synthesis, characterization, and mechanisms of growth. 1st Ed. 2000. 824 c.
90. Eastoe J., Hollamby M. J., Hudson L. Recent advances in nanoparticle synthesis with reversed micelles. // Advances in Colloid and Interface Sci., 2006. V. 128-130. P. 5-15.
91. Li L., Wu Q. Sh., Ding Ya P., Wang P. M. Control synthesis of semiconductor ZnSe quasi-nanospheres by reverse micelles soft template. // Mater. Lett., 2005. V. 59. P. 16231626.
92. Cason J. P., Miller M. E., Thompson J. В., Roberts С. B. Solvent Effects on Copper Nanoparticle Growth Behavior in AOT Reverse Micelle Systems. // J. Phys. Chem. B, 2001. V 105. P. 2297-2302.
93. Bagwe R. P., Khilar К. C. Effects of the intermicellar exchange rate and cations on the size of silver chloride nanoparticles formed in reverse micelles of AOT. // Langmuir, 1997. V.13.P. 6432-6438.
94. Ahmad Т., Chopra R., Ramanujachary К. V., Lofland S. E., Ganguli A. K. Canted antiferromagnetism in copper oxide nanoparticles synthesized by the reverse-micellar route. // Solid State Sci., 2005. V. 7. P. :891-895.
95. Pileni M. P. The role of soft colloidal templates in controlling the size and shape of inorganic nanocrystals. //Nature Mater., 2003. V. 2. P. 145-150.
96. Petit C, Lixon P, Pileni M-P. Structural study of divalent metal bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate aggregates. // Langmuir, 1991. V. 7. P. 2620-2625.
97. Lopez-Quintela M. A., Tojo C., Blanco M. C., Garcia R. L., Leis J. R. Microemulsion dynamics and reactions in microemulsions. // Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 2004. V. 9. P. 264-278.
98. Uskokovic V., Drofenik M. Synthesis of materials within reverse micelles. // Surf. Rev. Lett., 2005. V. 12. P. 239-277.
99. Maillard M., Giorgio S., Pileni M. P. Tuning the size of silver nanodisks with similar aspect ratios: synthesis and optical properties. // J. Phys. Chem. B, 2003. V. 107. P. 24662470.
100. Lisiecki I., Pileni M. P. Synthesis of well-defined and low size distribution cobalt nanocrystals: the limited influence of reverse micelles. // Langmuir, 2003. V. 19. P. 94869489.
101. Pileni M. P. Nanocrystals: Fabrication, organization and collective properties. // Comptes Rendus Chimie, 2003. V. 6. P. 965-978.
102. Cao M., Wu X., He X., Hu C. Shape-controlled synthesis of Prussian blue analogue Co3Co(CN)6.2 nanocrystals. // Chem. Commun, 2005. P. 2241- 2243.
103. Pileni M. P., Ninham B.W., Gulik-Krzywicki T., Tanori J., Lisiecki I., Filankembo A. Direct Relationship Between Shape and Size of Template and Synthesis of Copper Metal Particles. //Adv. Mater., 1999. V.ll. P. 1358-1362.
104. Ganguly P. B., Dhar N. R. Coagulation of manganese dioxide sol by different electrolytes. // J. Phys. Chem., 1922. V. 26. P. 701-714.
105. Jin Y., Wang P., Yin D., Liu J., Qiu H., Yu N. Gold nanoparticles stabilized in a novel periodic mesoporous organosilica of SBA-15 for styrene epoxidation. // Microporous Mesoporous Mater., 2008. V. 111. P. 569-576.
106. Zhy Sh., Zhou H., Hibino M., Honma I., Ichihara M. Synthesys of Mn02 nanoparticles confined in odered mesoporous carbon using a sonochemical method. // Adv. Funct. Matter.,2005. V. 15. P. 381-386.
107. Dong X., Shen W., Gu J., Xiong L., Zhu Y„ Li H., Shi J. Mn02-embedded-in-mesoporous-carbon-wall structure for use as electrochemical capacitors. // J. Phys. Chem. B,2006. V. 110. P. 6015-6019.
108. Dong X., Shen W. , Gu J., Xiong L., Zhu Y., Li H., Shi J. A structure of Mn02 embedded in CMK-3 framework developed by a redox method. // Microporous Mesoporous Mater., 2006. V. 91, P. 120-127.
109. Liu J., Lee J. B., Kim D. H., Kim Y. Preparation of high concentration of silver colloidal nanoparticles in layered laponite sol. // Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects,2007. V. 302. P. 276-279.
110. Yao Sh., Yuan Sh., Xu Yu., Wang Yi., Luo J., Hu Sh. A hydrogen peroxide sensor based on colloidal Mn02/Na-montmorillonite. // Applied Clay Sci., 2006. V. 33. P. 35^12.
111. Tiraferri A., Chen K. L., Sethi R., Elimelech M. Reduced aggregation and sedimentation of zero-valent iron nanoparticles in the presence of guar gum. // J. Colloid Interface Sci., 2008. V. 324. P. 71-79.
112. Shin Y., Blackwood J. M., Bae I. T., Arey B. W., Exarhos G. J. Synthesis and stabilization of selenium nanoparticles on cellulose nanocrystal. // Mater. Lett., 2007. V. 61. P. 4297-4300.
113. Hang J., Shi L., Feng X., Xiao L. Electrostatic and electrosteric stabilization of aqueous suspensions of barite nanoparticles. // Powder Technol., 2009. V. 192. P. 166-170.
114. Nichick M. N., Voitekhovich S. V., Shavel A., Lesnikovich A. I., Ivashkevich O. A. 1-Substituted 5-thiotetrazoles as novel capping agents for stabilization of gold nanoparticles. // Polyhedron, 2009. V. 28. P. 3138-3142.
115. Misra T. K., Liu C. Y. Synthesis of 28-membered macrocyclic polyammonium cations functionalized gold nanoparticles and their potential for sensing nucleotides. // J. Colloid Interface Sci., 2008. V. 326. P. 411^119.
116. Pillai Z. S., Kamat P. V. What Factors Control the Size and Shape of Silver Nanoparticles in the Citrate Ion Reduction Method? // J. Phys. Chem. B, 2004. V. 108. P. 945-951.
117. Pradeep T., Anshup. Noble metal nanoparticles for water purification: A critical review. // Thin Solid Films, 2009. V. 517. P. 6441-6478.
118. Maity D., Agrawal D. C. Synthesis of iron oxide nanoparticles under oxidizing environment and their stabilization in aqueous and non-aqueous media. // J. Magnetism Magnetic Mater., 2007. V. 308. P. 46-55.
119. Du B., Zhao B., Tao P., Yin K., Lei P., Wang Q. Amphiphilic multiblock copolymer stabilized Au nanoparticles. // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 2008. V. 317. P. 194-205.
120. Aqil F., Serwas H., Delplancke J.L., Jerome R., Jerome C., Canet L. Preparation of stable suspensions of gold nanoparticles in water by sonoelectrochemistry. // Ultrasonics Sonochem., 2008. V.15. P. 1055-1061.
121. Yuan J.J., Armes S.P., Takabayashi Y., Prassides K., Leite C.A.P., Galembeck F., Lewis A.L. Synthesis of biocompatible poly2-(metacryloyloxy)ethyl phosphorylcholine.-coated magnetite nanoparticles. // Langmuir, 2006. V. 22. P. 10989-10993.
122. Ge J., Hu Y., Biasini M., Dong C., Guo J., Beyermann W.P., Yin Y. One-step synthesis of highly water-soluble magnetite colloidal nanocrystals. // Chem. Eur. J., 2007. V.13. P. 7153-7161.
123. Hornok V., Dekany I. Synthesis and stabilization of Prussian blue nanoparticles and application for sensors. // J. Colloid Interface Sci., 2007. V. 309. P. 176-182.
124. Du G.H., Liu Z.L., Xia X., Chu Q., Zhang S.M. Characterization and application of Fe304/Si02 nanocomposites. //J. Sol-Gel Sci. Techn., 2006. V. 39. P. 285-291.
125. Weichold O., Tigges B., Bertmer M., Moller M. A comparative study on the dispersion stability of aminofunctionalised silica nanoparticles made from sodium silicate. // J. Colloid Interface Sci., 2008. V. 324. P. 105-109.
126. Cheng F., Zhao J., Song W., Li C., Ma H., Chen J., Shen P. Facile controlled synthesis of Mn02 nanostructures of novel shapes and their application in batteries. // Inorg. Chem., 2006. V. 45. P. 2038-2044.
127. Euler K.J. Battery manganese dioxide a survey of its history and etymology. // J. Power Sourses, 1982. V. 8. P. 133-141.
128. Kanungo S.B., Parida K.M., Sant B.R. Studies on Mn02—II. Relationship between physicochemical properties and electrochemical activity of some synthetic Mn02 of different crystallographic forms. // Electrochim. Acta, 1981. V. 26. P. 1147-1156.
129. Cotti P., Macchia F. Unprecedented oxidative degradation of arylethanols and arylacetic acids by means of active gamma-manganese dioxide. // J. Org. Chem., 1983. V. 48. P. 13501352.
130. Pratt E., Suskind S. P. Oxidation by solids. II. The preparation of either tetraarylethanes or diarylketones by the oxidation of diarylmethanes with manganese dioxide. // J. Org. Chem., 1963. V. 28. P. 633-638.
131. Pratt E.F., McGovern T.P. Oxidation by solids. III. Benzalanilines from N-benzylanilines and related oxidations by manganese dioxide. // J. Org. Chem., 1964. V. 29. P. 1540-1543.
132. Chen J., Lin J. C., Purohit V., Cutlip M. B., Suib S. L. Photoassisted catalytic oxidation of alcohols and halogenated hydrocarbons with amorphous manganese oxides. // Catal. Today, 1997. V. 33. P. 205-214.
133. Qi G, Yang R. T. Low-temperature selective catalytic reduction of NO with NH3 over iron and manganese oxides supported on titania. // Applied Catal. B: Environ., 2003. V. 44. P. 217-225.
134. Chen X., Shen Y. F., Suib S. L., O'Young C. L. Catalytic decomposition of 2-propanol over different metal-cation-doped OMS-2 materials. // Anal. Sci., 2007. V. 23. P. 165-170.
135. Xia G. G., Yin Y. G„ Willis W. S, Wang J. Y., Suib S. L. Efficient stable catalysts for low temperature carbon monoxide oxidation. // J. Catal., 1999. V. 185. P. 91-105.
136. Cheng F., Zhao J., Song W., Li C., Ma H., Chen J., Shen P. Facile controlled synthesis of Mn02 nanostructures of novel shapes and their application in batteries. // Inorg. Chem., 2006. V. 45. P. 2038-2044.
137. Li Q., Wang Y., Luo G. pH-Response of nanosized MnO prepared with solid state reaction route 2 at room temperature. // Sens. Actuat. B: Chem., 1999. V. 59. P. 42-47.
138. Luo X. L., Xu J. J., Zhao W., Chen H. Y. Ascorbic acid sensor based on ion-sensitive field-effect transistor modified with Mn02 nanoparticles. // Anal. Chim. Acta, 2004. V. 512. P. 57-61.
139. Luo X. L., Xu J. J., Zhao W., Chen H. Y. A novel glucose ENFET based on the special reactivity of Mn02 nanoparticles. // Biosens. Bioelectron., 2004. V 19. P. 1295-1300.
140. Xu J. J., Zhao W., Luo X. L., Chen H. Y. A sensitive biosensor for lactate based on layer-by-layer assembling Mn02 nanoparticles and lactate oxidase on ion-sensitive field-effect transistors. // Chem. Commun., 2005, V. 41. P. 792-794.
141. Okitsu K., Ashokkumar M., Grieser F. Sonochemical Synthesis of Gold Nanoparticles: Effects of Ultrasound Frequency. // J. Phys. Chem. B, 2005. V. 109. P. 20673-20675.
142. Mizukoshi Y., Okitsu K., Maeda Y., Yamamoto T. A., Oshima R. , Nagata Y. Sonochemical preparation of bimetallic nanoparticles of gold/palladium in aqueous solution. // J. Phys. Chem. B, 1997. V. 101. P. 7033-7037.
143. Fujimoto T., Mizukoshi Y., Nagata Y., Maeda Y., Oshima R. Sonolytical preparation of various types of metal nanoparticles in aqueous solution. // Scripta mater., 2001. V. 44. P. 2183-2186.
144. Luo Y. Preparation of Mn02 nanoparticles by directly mixing potassium permanganate and polyelectrolyte aqueous solutions. // Mater. Lett., 2007. V. 61. P. 1893-1895.
145. Omomo Y., Sasaki T., Wang L., Watanabe M. Redoxable nanosheet crystallites of Mn02 derived via delamination of a layered manganese oxide. // J. Am. Chem. Soc., 2003. V. 125. P. 3568-3575.
146. Kadoma Y., Uchimoto Y., Wakihara M. Synthesis and structural study on Mn02 nanosheet material by X-ray absorption spectroscopic technique. // J. Phys. Chem. B, 2006. V. 110. P. 174-177.
147. Subramanian V., Zhu H., Vajtai R., Ajayan P. M., Wei B. Hydrothermal synthesis and pseudocapacitance properties of Mn02 nanostructures. // J. Phys. Chem. B, 2005. V. 109. P. 20207-20214.
148. Wang X. and Yadong Li. Rational synthesis of a-Mn02 single-crystal nanorods. // Chem. Commun., 2002. P. 764-765.
149. Zheng D., Sun S., Fan W., Yu H., Fan C., Cao G., Yin Z., Song X. One-Step Preparation of Single-Crystalline p-Mn02 Nanotubes. // J. Phys. Chem. B, 2005. V. 109. P. 16439-16443.
150. Das D., Ganguly S., Sen P. K., Das K. Spectral and electrochemical behavior of manganese dioxide nanodispersions prepared in reverse micelle. // J. Electroanal. Chem., 2008. V. 622. P. 59-63.
151. Liu Y., Zhang M., Zhang J., Qian Y. A simple method of fabricating large-area a-Mn02 nanowires and nanorods. // J. Solid State Chem., 2006. V. 179. P. 1757-1761.
152. Tang B., Wang G., Zhuo L. H., Ge J. Novel dandelion-like beta-manganese dioxide microstructures and their magnetic properties. // Nanotech., 2006. V. 17. P. 947-951.
153. Escax V., Imperor-Cler M., Bazin D., Davidson A. Nanocasting, templated syntheses and structural studies of manganese oxide nanoparticles nucleated in the pores of ordered mesoporous silicas (SBA-15). // C. R. Chimie, 2005. V. 8. P. 663-677.
154. Dong X., Shen W., Gu J., Xiong L., Zhu Y.,Li H., Shi J. Mn02-embedded-in-mesoporous-carbon-wall structure for use as electrochemical capacitors. // J. Phys. Chem. B, 2006. V. 110. P. 6015-6019.
155. Dong X., Shen W., Gu J., Xiong L., Zhu Y., Li H., Shi J. A structure of Mn02 embedded in CMK-3 framework developed by a redox method. // Micropor. Mesopor. Mater., 2006. V. 91. P. 120-127.
156. Zhy S., Zhou H., Hibino M., Honma I., Ichihara M. Synthesis of Mn02 nanoparticles confined in odered mesoporous carbon using a sonochemical method. // Adv. Funct. Matter., 2005. V. 15. P. 381-386.
157. Yao S., Xu J., Wang Y., Chen X., Xu Y., Hu S. A highly sensitive hydrogen peroxide amperometric sensor based on Mn02 nanoparticles and dihexadecyl hydrogen phosphate composite film. // Anal. Chim. Acta, 2006. V. 557. P. 78-84.
158. Wang Y., Zhitomirsky I. Electrophoretic deposition of manganese dioxide-multiwalled carbon nanotube composites for electrochemical supercapacitors. // Langmuir, 2009. V. 25. P. 9684-9689.
159. Langley C. E., Sljukic B., Banks C. E., Compton R. G. Manganese dioxide graphite composite electrodes: application to the electroanalysis of hydrogen peroxide, ascorbic acid and nitrite. // Anal. Sci., 2007. V. 23. P. 165-170.
160. Turkusic E., Milicevic V., Tahmiscija H. Vehabovic M., Basic S., Amidzic V. Amperometric sensor for L-ascorbic acid determination based on Mn02 bulk modified screen printed electrode. // Fresenius J. Anal. Chem., 2000. V. 368. P. 466-470.
161. Quinn D.M., Balasubramanian A.S., Doctor B.P., Taylor P. Enzymes of cholinesterase family. New York and London: Plenum Press. 1995. 521 p.
162. Wring S.A., Hart J. P. Chemically modified, screen-printed carbon electrodes. // Analyst,1992. V. 117. P. 1281-1286.
163. Yamada H., Mori N., Tani Y. Properties of choline oxidase of cylindrocarpon didymum M-l. //Agric. Biol. Chem., 1979. V43. P.2173-2177.
164. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Москва: Мир.1993. Т.2. 416 с.
165. Carmichael W., Drapeau D., М. Anderson D.M. Harvesting of Aphanizomenon flosaquae Ralfs ex Born. & Flah. var. flosaquae (Cyanobacteria) from Klamath Lake for human dietary use // Journal of Applied Phycology., 2000. P. 585-595.
166. Mahmood, N. А. и W. W. Carmichael. Acetylcholinesterase and Anatoxin-(s) from cyanobacteria Anabaena fios-aquae NRC-525-17. // Toxicon, 1987. V. 25. P. 1221-1227.
167. Devic, Dunhai Li, Peter Henriksen, Geoffrey A. Codd. Detection of Anatoxin-a(s) in Environmental Samples of Cyanobacteria by Using a Biosensor with Engineered Acetylcholinesterases. // Appl. Environ. Microbiol., 2002., V. 68. P. 4102-4106.
168. Matsunaga, S., Moore, R.E., Niemszura, W.P. Anatoxin-a(S), a potent anticholinesterase from Anabeana flos-aquae. // J. Am. Chem. Soc., 1989. V. 111 P. 8021-8023.
-
Донцова, Екатерина Александровна
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.06
- Влияние наночастиц переходной группы металлов на антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов
- Электрохимический анализ кардиомаркеров в плазме крови
- Локальная очистка от ионов марганца производственных сточных вод горно-обогатительного комбината
- Получение островковых плёнок золота для высокочувствительного иммуноанализа
- Физико-химические условия формирования океанских железо-марганцевых конкреций и корок
