Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Селекция и технология микроклонального размножения ивы остролистной (Salix Acutifolia Willd)

ВАК РФ 06.03.01, Лесные культуры, селекция, семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Селекция и технология микроклонального размножения ивы остролистной (Salix Acutifolia Willd)"



Сергеев Роман Владимирович

СЕЛЕКЦИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ИВЫ ОСТРОЛИСТНОЙ (SALIXACUTIFOLIA WILLD)

Специальность 06.03.01 «Лесные культуры, селекция, семеноводство»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

1 9 МАЙ 2011

Йошкар-Ола - 2011

4846646

Работа выполнена на кафедре лесных культур и механизации лесохозяйственных работ ГОУ ВПО «Марийский государственный технический университет»

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Романов Евгений Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Калашникова Елена Анатольевна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Карасев Валерий Николаевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Марийский государственный

университет»

Защита состоится «3» июня 2011 года в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.115.03 при Марийском государственном техническом университете по адресу: 424000, г. Йошкар-Ола, пл. Ленина^, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Марийского государственного технического университета.

Автореферат разослан «29» апреля 2011 г.

Отзывы на автореферат просим направлять в двух экземплярах с заверенными печатью подписями по адресу: 424000, г. Йошкар-Ола, пл. Ленина, 3, учёному секретарю диссертационного совета. Факс (8362) 41-08-72; E-mail: MuhortovDI@marstu.net

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук

Мухортов Д.И.

Введение

Актуальность темы. Большинство видов ивы содержат в листьях, коре и почках салицилаты. Салицин (ß-D-глюкопиранозид салицилового спирта) - наиболее распространённый салицилат, который используется в качестве обезболивающего, противовоспалительного и жаропонижающего средства. Интерес к натуральным препаратам из ивы, как альтернативе аспирина, возрастает, так как они не обладают побочными эффектами (раздражение и повреждение желудка) (Chrubasik et al., 2000).

В настоящее время основная масса ивового сырья, доступного для получения лекарственных препаратов, содержит в своём составе менее 1 % активных компонентов, вследствие чего представляют большой интерес исследования, направленные на селекцию и культивирование генотипов Salix acutifolia Willd, с высоким приростом биомассы и содержанием биологически активных веществ (салицилатов) (Julkunen-Tiitto, Meier, 1992). Недостаток качественного растительного сырья существенно ограничивает производство натуральных лекарственных препаратов. В связи с этим возникает необходимость в отборе и размножении высокопродуктивных генотипов растений S.acutifolia Willd для создания промышленных плантаций интенсивного типа с короткой ротацией.

Цели и задачи исследования. Целью работы является разработка критериев для отбора плюсовых деревьев S.acutifolia Willd и дальнейшее их размножение с использованием технологии культуры тканей растений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявление зависимостей от таксационных характеристик деревьев S.acutifolia Willd биомассы коры на отдельном дереве и единице площади.

2. Определение направлений селекции S.acutifolia Willd с целью получения максимального прироста запаса коры на отдельном дереве

3. Разработка методики по отбору плюсовых деревьев S.acutifolia Willd в местах их естественного произрастания.

4. Изучение режима стерилизации и особенностей микроклональ-ного размножения S.acutifolia Willd.

5. Оптимизация условий культивирования in vitro и адаптации S.acutifolia Willd.

Научная новизна. Определены критерии для оценки природных популяций S.acutifolia Willd и предложен методический подход для от-

бора плюсовых деревьев ивы остролистной с высокой продуктивностью биомассы коры. Разработана технология микроклонального размножения растений ивы остролистной и оптимизированы условия культивирования и адаптации полученных in vitro растений-регенерантов S.acutifolia Willd. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro растений S.acutifolia Willd.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Оценка природных популяций ивы остролистной на интенсивность накопления биомассы коры.

2. Методика для отбора плюсовых деревьев S.acutifolia Willd.

3. Технология микроклонального размножения и особенности культивирования in vitro растений S.acutifolia Willd.

Практическая значимость работы. Разработаны нормативные таблицы по оценке товарных запасов коры S.acutifolia Willd в зависимости от таксационных характеристик. Создана коллекция in vitro высокопродуктивных генотипов ив. Оптимизирован процесс получения посадочного материала ивы остролистной с применением культуры in vitro. Разработано обоснование выбора типа сырья, заготовляемого с плантации S.acutifolia Willd. Теоретические и практические результаты работы используются в НИР и учебном процессе МарГТУ.

Обоснование и достоверность научных положений обеспечены достаточным объемом экспериментального материала, собранного с использованием обоснованных методик, а также применением математических методов при обработке полученных результатов, воспроизводимостью результатов научной работы.

Личный вклад автора. Сбор значительной части экспериментального материала и лабораторный анализ образцов выполнены лично автором или при его непосредственном участии. Автором выбран методический подход для решения программных вопросов, проведена камеральная обработка полевых материалов, разработаны уравнения для оценки изменения таксационных показателей деревьев в зависимости от возраста и диаметра, нормативы, сформулированы выводы и предложения.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований доложены на «12th International Congress «Phytopharm 2008» (Saint-Petersburg, 2008), I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Фундаментальные и прикладные достижения в биологии» (Донецк, 2009). Научные разработки экспонировались на 2-й биотехнологической выставке-ярмарке «РосБио-Тех-2008» и отмечены дипломом и серебряной медалью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы из 110 наименований (в том числе 60 на иностранных языках) и приложения. Основной текст изложен на 105 страницах, иллюстрирован 26 рисунками и сопровождён 26 таблицами.

1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

В лесах кроме древесины сосредоточены значительные ресурсы разнообразной продукции. По различным оценкам, стоимость пищевых и лекарственных ресурсов леса в общей стоимости насаждений составляет более 15%. Площадь естественных насаждений ивы в стране составляет 3057 тыс. га. К лесам, где промышленная заготовка сырья не может проводиться, относится 40% этих насаждений. Остальная часть площади насаждений ивы, пригодной для эксплуатации, расположена в труднодоступных и малонаселенных районах (Чумаков, 1991).

Растения в целом, и ивы в частности, являются источниками различных биологически активных соединений (Wetzel, et al., 1990). Кора ивы содержит 2,5-3 % флавоновых гликозидов, 12-14 % дубильных веществ, витамины, минеральные элементы и др. Лекарственные препараты, получаемые из растений Salix, содержат салицин (2-гидроксиметил-фенил-р-0-глюкопиранозид) и его производные: фра-гилин, саликортин, 2'-о-ацетилсаликортин, тремулацин, салирепозид и др. (Wagner, et al., 2001). Содержание общего салицина в коре ивы широко варьируется в зависимости от вида: S.albaL. 0,5-1%, S. cinerea L.~Q,4%, S. daphnoides L. 4,9-8,4%, S.fragilisL. 4-10%, S. purpurea L. 3,4-7.4%, S. pentandra L. 0,9-1,1%, S. viminalis L.~0,2% (Чумаков, 1991). Салицин, содержащийся в коре ивы в значительном количестве, в организме под действием ферментов расщепляется до салициловой кислоты, которая является носителем основных лечебных свойств данного сырья (Зузук, и др., 2005).

Исследования по клональному микроразмножению разных видов ив проводились в основном за рубежом, начиная с 80-х гг. XX века. Научная работа по микроразмножению проводится на различных видах и гибридах ивы (S'. matsudana х alba NZ-1002, S. caprea L., S. pseudolasiogyne и др.). Обширна и география исследований: Новая Зеландия (Bhojwani, 1980), Чехословакия (Chalupa, 1983), Швеция (Bergmas, et al., 1985), Ис-

пания (Amo-Marco, et al., 1996), США (Lyyra, et al., 2006), Германия (Neuner, et al., 1993; Liesebach, 2004), Финляндия (Karkonen, 1999), Бразилия (Santos, 2005), Корея и Индия (Park, 2008) и др.

Анализ литературных данных показал, что комплексной оценки растительных ресурсов S.acutifolia Willd как источника салицилатов не проводилось. В культуре растительной ткани S.acutifolia Willd недостаточно изучена.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследований использовали растительный материал ивы, отобранный с деревьев модельных популяций (Нижегородская обл., Кировская обл., Республика Марий Эл). Район исследования расположен по берегам рек: Вятка, Волга, Ока, Рутка, Ветлуга, Б Кок-шага, М Кокшага, М Кундыш, Илеть, Сура. Работа была направлена на выявление и таксацию естественных насаждений ивы остролистной. В насаждениях ивы остролистной заложено 16 пробных площадей. Отобрано модельных деревьев со сбором коры 143 шт., с определением таксационных характеристик - 196 шт. Для оценки селекционных категорий популяций произведено 1467 измерений, для оценки селекционных категорий деревьев (дополнительно) проанализировано 44 модельных дерева.

Исследования по культивированию в условиях in vitro проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений (Бутенко Р. Г., Хромова JI. М., Седнина Г.А., 1984; Поляков A.B., 2005).

Все эксперименты по культуре ткани проводились в трёхкратной повторности и имели от 4 до 45 вариантов состава питательных сред.

Обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным Кото-вым (Котов, и др., 1977) и Доспеховым (Доспехов, 1979).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Динамика накопления коры в насаждениях ивы остролистной

Для определения имеющихся запасов коры ивы остролистной выявлена динамика изменения таксационных показателей (диаметр, масса коры, высота) модельных деревьев от их возраста. Уравнение, описывающие зависимость диаметра дерева S.acutifolia Willd от возраста, имеет вид d=((-1,0015)-(49,5219))*ЕХР(-(0,011132)*ал(1,02883))+(49,5219),

(а - возраст, лет; с! - средний диаметр, см; пределы действия уравнения 1лт(5-50); коэффициент корреляции с фактическими данными 0,9). С увеличением возраста модельного дерева происходит равномерное увеличение диаметра ствола.

Вторая зависимость описана уравнением у=((4б,1676)+0,5)* *ЕХР(-(42,3581)*В2л(-0,97803))+(0,387254) (у - масса коры, кг; с1 -средний диаметр, см; пределы действия уравнения 1лш(5-50); коэффициент корреляции с фактическими данными 0,84) и характеризует динамику увеличения массы коры с изменением возраста дерева. Необходимо отметить, что масса коры интенсивнее растет в возрасте от 10 до 25 лет.

Третью зависимость, отражающую увеличение высоты модельных деревьев с увеличением их возраста, можно описать уравнением Ь=((-1734,9)-(6087,57))*ЕХР(-(-0,74967)*аА(-0,00089)-1)+(6087,57) (Ь - средняя высота стволов, м; у - масса коры, кг; пределы действия уравнения 1лт(5-50); коэффициент корреляции с фактическими данными 0,66). Максимальная динамика увеличения высоты деревьев отмечена в период 5-15 лет, что обусловлено, вероятно, высокой скоростью метаболических процессов на ранних стадиях онтогенетического развития растительного организма.

-диаметр (г=0,9), см

—— —~ - масса коры (г=0,84), кг

--- (г=0,66), м

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Возраст, лет

Рис. 1. Возрастная динамика таксационных характеристик З.асиИ/оНа ]¥ИШ

Для определения запасов коры ивы остролистной выявлена динамика изменения таксационных показателей (масса коры, возраст, высота, количество стволов) модельных деревьев от диаметра (рис. 2). Зависимость изменения биомассы коры дерева от его диаметра имеет вид

у=((4,74)-(-4,34))*ЕХР(-(-2,35)*с1л((1,42)-1))+(-4,34) и у=((31,91))*ЕХР (-(58,86)*сЗл(-1,45))+(0,82) (<1 - средний диаметр, см; у - масса коры, кг; коэффициент корреляции с фактическими данными 0,96; пределы действия уравнений ¿¡т(2-14) и 1лт(14.1-26) соответственно).

В начале развития растения (2-6 лет) происходит незначительное увеличение биомассы коры, однако после 7 лет рост существенно усиливается. Динамика, характеризующая связи возраста и диаметра, описывается уравнением а=(((27,89)-(54,59))*ехр(-(-0,93)*с1л((0,57)-1))+(54,59)) (сЗ - средний диаметр, см; а - возраст модельных деревьев, лет; коэффициент корреляции с фактическими данными 0,73; пределы действия уравнений 1лт(2-16), а зависимость высоты от диаметра Ь=(((26,28)-(-631,27))*ехр(-(0,04)*<1л((0,77)-1 ))+(-631,27)) (а - средний диаметр, см; И - средняя высота стволов, м; коэффициент корреляции с фактическими данными 0,73; пределы действия уравнений Ыт(2-16).

В течение первых пяти лет рост деревьев ивы остролистной происходит пропорционально увеличению диаметра его ствола, далее рост замедляется и в период достижения растением предельной высоты (1015 м) происходит увеличение биометрических параметров побегов лишь в горизонтальной плоскости, а не вертикальной. Зависимость количества стволов от диаметра п=((-5440,3)-(-5785,0))*ехр(-(-4,77)* *с1Л((0,86)-1))+(-5785) (с! - средний диаметр, см; п - число стволов, шт.; коэффициент корреляции с фактическими данными 0,54; пределы действия уравнений Ыш(2-16).

6 8 10 12 14 Диаметр дерева, см

16

• Возраст, лет

--- Высота, м

-----Масса

"свежей" коры,кг — Масса сухой коры, кг

■ Количество стволов, тыс шт/га

Рис. 2. Зависимость таксационных характеристик модельных деревьев S.acutifolia Willd от диаметра

Наиболее точно описывается зависимость массы коры от диаметра побега (коэффициент 0,96). На основании рассчитанных параметров построена зависимость и составлена нормативная таблица по оценке ресурсов коры ивы остролистной, на основе среднего диаметра побегов (табл. 1).

Таблица 1. Зависимость массы коры от таксационных характеристик и нормативы формирования коры З.асии/оИа \Villd в природных условиях

Диаметр, см Возраст, лет Высота, м Масса "свежей" коры,кг Масса сухой коры, кг Кол-во стволов, 105 шт./га Биологический запас сухой коры, т/га Эксплуатационный запас сухой коры, т/га

2 5 3 0,2 0,1 12,7 0,8 0

4 10 6 0,6 0,3 7.5 1,5 0,3

6 13 8 1,3 0,7 5,5 2,4 0,7

8 15 9 2,6 1,3 4,3 3,6 1,4

10 17 10 4,5 2,3 3,5 5,1 2,5

12 18 10 7,3 3,8 2,9 6,9 4,2

14 19 11 9,8 5,1 2,5 7,9 5,5

16 19 11 12,0 6,3 2,2 8,4 6,7

Из полученных данных следует, что с увеличением значений таксационных характеристик (диаметр, возраст, высота) модельных деревьев количество стволов уменьшается, а масса "свежей" и сухой коры увеличивается.

Выявленная зависимость биологического и эксплуатационного запасов сухой коры от таксационных показателей модельных деревьев позволяет определять запас сухой коры на участке, зная средний диаметр, возраст или высоту деревьев. На обследованных территориях при расчете массы коры принят коэффициент 0,52, полученный экспериментальным путем. Эксплуатационный запас рассчитан как произведение массы сухой коры на коэффициент выборки от 20 % при среднем диаметре 4 см до 80 % при среднем диаметре 16 см.

3.2. Селекционная оценка деревьев ивы остролистной

Для создания рентабельных плантаций S.acutifolia Willd необходимо использовать в качестве посадочного материала генотипы растений, отличающихся наибольшей продуктивностью, в том числе и по приросту биомассы коры. С целью их определения высокопродуктивных генотипов в естественных насаждениях S.acutifolia Willd проведена работа по выявлению селекционных категорий деревьев.

Для выбора категории деревьев, имеющих наибольший прирост коры, провели градацию по категориям отобранных деревьев. Все отобранные модели разделили на 3 категории по влиянию возраста, дна-

метра и высоты на прирост коры. Деревья, имеющие прирост до 80 % от модели, отнесли к категории «угнетенные», с приростом 80,1-120 % - к категории «нормальные», более 120,1 % - «плюсовые». Для оценки достоверности влияния селекционной категории модельных деревьев на прирост коры проведен дисперсионный анализ (табл. 2).

Таблица 2. Результаты дисперсионный анализ селекционных категорий

Возрастной интервал Р факт И табл. Доля влияния фактора, %

0,001 0,01 0,05

Выделенные селекционные категории деревьев по диаметру

8-10 лет 13,4 11 67

11-13 лет 3,4 3,3 20

14-1блет 2,07 3,5 12

17-19 лет 1,3 3,6 5

Выделенные селекционные категории деревьев по высоте

8-10 лег 5,3 3,6 40

11-13 лег 2,27 3,4 И

14-16лет 0,28 3,6

Выделенные селекционные категории деревьев по возрасту

8-10 лет 70 11 91

11-13 лет 19,66 9,1 65

14-16лет 27 10,4 78

17-19 лет 54,6 11,7 89

Закономерность выделения селекционных категорий по высоте не подтверждается, так как только в возрасте 8-10 лет данное влияние достоверно на уровне 5 %. (см. табл. 2). Выделение селекционных категорий по диаметру обосновано в возрасте 8-13 лет, а по возрасту оправдано во всех исследованных возрастных интервалах, даже на 1 % уровне значимости. Наибольший запас коры отмечен у деревьев, имеющих категорию «плюсовые» по отношению к возрасту, а также плюсовые и нормальные по диаметру.

На основании проведенных исследований выделена категория плюсовых деревьев (табл. 3).

Таблица 3. Сравнение средних запасов коры на одном дереве

Возрастной интервал Селекционная категория Средняя масса коры,кг Коэффициент достоверности различия

8-10 лет плюсовые 1,31+0,17 4,35

нормальные 0,51+0,08

11-13 лег плюсовые 2,35+ 0,26 4,80

нормальные 1,00+ 0,11

14-16 лет плюсовые 3,44+ 0,91 1,87

нормальные 1,68+ 0,25

17-19лет плюсовые 5,34+0,84 3,73

нормальные 2,12+0,19

Во всех возрастных интервалах прирост коры плюсовых деревьев превышает по исследуемым параметрам у нормальных деревьев в 2-2,5 раза.

Для сохранения лучших деревьев по накоплению биомассы коры необходима оценка деревьев неразрушающими методами анализа. Выявлена возможность использования в качестве данного критерия массу коры на единице площади. Так, при отборе проб на одном дереве на высоте 130±12 см масса 1 см2 коры практически не различается, но данный показатель различается у разных деревьев (РфаКт 3,27 Ртабл 3,2 при уровне значимости 0,01 доля влияния фактора 34,4 %). Для достижения точности оценки в 2% необходим отбор 10 см2 коры, так как на небольшом расстоянии вдоль ствола 8-12 см их масса практически не варьирует. Толщина коры при наличии на ней выростов и спящих почек не может быть использована в качестве критерия оценки.

Для выявления доли влияния индивидуальных особенностей дерева на общую продуктивность накопления биомассы коры была проанализирована масса 1 см 2 коры аеиН/оНа [УНЫ в «свежем» и воздушно-сухом состояниях (табл. 4).

Таблица 4. Масса 1 см2 коры З.асиИ/оИа \Villd

Возрастной интервал Селекционная категория «Свежее» состояние Воздушно-сухое состояние

средняя массы I см2 коры, г коэффициент достоверности различия средняя массы 1 см2 коры, г коэффициент достоверности различия

8-10 лет плюсовые 0,2017±0,0063 4,80 0,1004±0,0029 7,21

нормальные 0,1679±0,0033 0,0767±0,0017

11-13 лет плюсовые 0,2483±0,0071 3,70 0,1250±0,0038 3,40

нормальные 0,2104±0,0075 0,1063±0,0042

14-16 лет плюсовые 0,2867±0,0013 0,90 0,1813±0,0317 1,34

нормальные 0,2654±0,0238 0,1358±0,0125

17-19 лет плюсовые 0,3475±0,0454 - 0,1871±0,0275

нормальные 0,2058 0,0967±0,0000

Масса 1 см 2 коры, как в свежем, так и воздушно-сухом состоянии, у плюсовых деревьев на 15-25 % больше. Достоверность различия выборок особенно большая в возрасте 8-13 лет. Это подтверждает возможность использования данного критерия для проведения селекционной работы.

Таблица 5. Таксационные характеристики плюсовых деревьев Я.асиН/оИа №НШ

Возрастной интервал Селекционная ^егория Диаметр, см Высота, м Масса коры, кг Масса 1 см 2 коры, г

в "свежем виде" в воздушно-сухом состоянии

8-10 лет плюсовые 5,3+0,2 7,2+0,3 1,3+0,17 0,2017±0,0063 0,1004±0,0029

нормальные 4,3+0,23 6,0+0,4 0,5+0,08 0,1679±0,0033 0,0767+0,0017

11-13 лет плюсовые 7,4+0,41 8,9+0,2 2,3+0,26 0,2483+0,0071 0,1250+0,0038

нормальные 5,6+0,4 7,6+0,3 1,0+0,11 0,2104±0,00751 0,1063+0,0042

14-16 лет плюсовые 8,5+0,9 8,8+0,7 3,4+0,91 0,2867+0,0013 0,1813+0,0317

нормальные 6,3+0,3 8,1+0,5 1,7+0,25 0,2654+0,023? 0,1358+0,0125

17-19 лет плюсовые 10,3+0,7 10,1+1,1 5,3+0,84 0,3475+0,0454 0,1871+0,0275

нормальные 7,1 +0,3 7,7+0,2 2,1+0,19 0,2058+0,0000 0,0967+0,0000

Плюсовые деревья имеют более высокие показатели по всем анализируемым параметрам, что свидетельствует о возможности использования данных признаков для отбора лучших деревьев в качестве материала для селекционной работы (табл. 5).

3.3. Методика отбора особей ивы остролистной

на продуктивность получения биологически активных веществ

Селекцию ивы остролистной целесообразно осуществлять через индивидуальный отбор особей, так как проведенные исследования показали, что влияние межпопуляционной изменчивости (по содержанию биологически активных веществ и интенсивности роста) незначительны по сравнению с индивидуальной изменчивостью генотипов ивы остролистной внутри географически разделенных популяций.

Содержание биологически активных веществ в растениях & асыН/оНа \Yilld характеризуется большой степенью изменчивости и зависит от следующих факторов:

- вид сырья - до 15 раз;

- фенологическая стадия - более 10 %;

- место отбора образца на одном дереве - до 80 %;

-наличие механических или иных повреждений на деревьях, с которых произведён отбор пробы, - около 15 %.

В зависимости от потребностей мирового рынка в сырье, содержащем салицилаты, возможны следующие направления селекционного отбора генотипов 5. асиИ/о11а \Villd в природных популяциях:

1) для заготовки коры - отбор особей по интенсивности накопления биомассы коры;

2) для заготовки прута от 1 до 5 лет:

• отбор генотипов по содержанию биологически активных веществ в коре однолетних побегов;

• отбор особей по доле коры на однолетних побегах;

• отбор особей по содержанию биологически активных веществ в зеленых листьях.

Отбор генотипов на содержание биологически активных веществ целесообразно проводить с однолетних побегов, собранных в период покоя (декабрь-март); отбор листьев на содержание биологически активных веществ целесообразно проводить в июне - июле; отбор образцов коры - в июне.

Ввиду интенсивного разрушения биологически активных веществ при сушке, хранении и переработке первичного сырья необходимо соблюдение следующих условий:

1) высушивание растительного материала необходимо проводить при температуре не выше 60 °С, т.к. при увеличении температуры происходит необратимое разрушение до 10 % биологически активных веществ; сублимационная сушка побегов на 30 % увеличивает сохранение биологически активных веществ;

2) увеличение степени измельчения и гомогенности растительного материала позволяет существенно повысить выход экстрагируемых биологически активных веществ.

3.4. Оптимизация микрокпоналыюгоразмножения S.acutifolia Willd

При преодолении физиологического барьера регенерации важнейшую роль играют следующие факторы: происхождение экспланта, фи-тогормональный состав питательной среды, условия культивирования и другие (Thorpe, Т. А., 1984). Выбор первичного экспланта играет существенную роль при введения в культуру in vitro (Bergman, L., 1985).

В ходе исследования получено 61 % стерильных морфогенных эксплантов при введении в культуру in vitro меристем (табл. 7), что на 5 % больше, чем при использовании почек. Однако формирование побегов из меристем происходило значительно медленнее.

Таблица 7. Морфогенез in vitro ивы остролистной

Эксплант Изучено эксплантов, шт. Получено стерильных, %. Получено мор( Зогенных эксплантов, %.

всего гемогенных ризогенных каллусогенных

Побег с почкой 30 6,7 6,7 6,7 3,3 -

Почка 32 56,3 56,3 56,3 - 3,1

Меристема 31 61,3 61,3 61,3 - -

Высечка листа 30 53,3 - - - -

Если не ставится задача получения безвирусного посадочного материала S.acutifolia Willd, то рациональнее использовать в качестве первичного экспланта почки растений.

Стерилизация необходима для удаления с поверхности сегментов вегетирующих растений инфекции, которая может развиться при дальнейшем культивировании эксплантов in vitro и вызвать поражение и гибель растительного материала. Исследования показали, что максимальное число стерильных морфогенных эксплантов (79 %) при использовании гипохлорита кальция наблюдается при дезинфекции 1,5 % раствором в течение 15 минут. Для гипохлорита натрия (белизна) лучшие результаты (73 % морфогенных эксплантов) при дезинфекции 10 % раствором в течение 15 минут. В результате данного исследования выявлено, что оптимальным стерилизующим агентом является раствор коммерческого препарата Domestos в концентрации 10% с экспозицией 10 минут, при этом число стерильных морфогенных эксплантов составило 94,4 % (табл. 8).

Таблица 8. Стерилизация эксплантов ивы остролистной

Агент Концентрация, % Экспозиция, мин.

5 10 15

0 1,1 2,2 2,2

Гипохлорит Na (Domestos) 5 65,6 78,9 82,2

10 78,9 94,4 85,6

15 75,6 83,3 76,7

20 70,0 67,8 65,6

0 0,0 2,2 1,1

ГипохлоритNa (Белизна) 5 33,3 41,1 54,4

10 43,3 64,4 73,3

15 62,2 56,7 52,2

20 57,8 47,8 38,9

0 3,3 1,1 2,2

0,5 38,9 48,9 58,9

Гипохлорит Са I 54,4 70,0 70,0

1,5 62,2 77,8 78,9

2 41,1 28,9 21,1

На этапе микроразмножения и укоренения in vitro осуществлялся подбор оптимальных концентраций ауксинов и цитокининов с оценкой их влияния на динамику развития регенерантов, коэффициент размножения, каллусогенез, ризогенез. Использовали 25 вариантов питательной среды с различным комбинациями фитогормонов (табл. 9). Полученные экспериментальным путем данные подтвердили наличие поло-

жительного эффекта при совместном использовании 6-БАП и НУК. При добавлении в среду культивирования 6-БАП наблюдали увеличение числа новых побегов. На средах с сочетанием 6-БАП и НУК 1,0 мг/л 6-БАП+0,01 мг/л НУК, 1,0 мг/л 6-БАП+0,05 мг/л НУК, 1,0 мг/л 6-БАП+ + 0,1 мг/л НУК побегообразование происходило интенсивнее. Однако в последнем варианте длина побегов была существенно больше (16,0 мм), чем в двух предыдущих (10,8 мм и 9,0 мм соответственно).

Таблица 9. Влияние 6-БАП и НУК на побегообразование S.acutifolia Willd

Фито гормоны Концентрация 6-БАП, мг/л

0 0,1 0,5 1,0 2,0

Концентрация НУК, мг/л 0 1,0 21,2 мм 1,2 18,8 мм 1,5 14,5 мм 1,33 15,67 мм 1,6 12,0 мм

0,01 1,2 19,6 мм 1,5 19,5 мм 1,4 14,6 мм 1,8 10,8 мм 1,2 13,4 мм

0,05 1,0 12,67 мм 1,25 13,75 мм 1,33 14,67 мм 2,0 9,0 мм 1,2 12,75 мм

0,1 1,33 27,5 мм 1,14 17,86 мм 1,0 13,8 мм 1,8 16,0 мм 1,33 11,67 мм

0,2 1,0 29,6 мм 1,0 11,5 мм 1,0 15,3 мм 1,17 13,3 мм 1,0 11,86 мм

Примечание: в верхней строке каждой ячейки представлено среднее количество побегов на одном экспланте, в нижней - среднее значение длины побега.

Стимулирующий эффект низких концентраций бензиладенина (5*10'7М, 10"6 М) на удлинение побегов из пазушных почек был показан в работе Bergman (Bergman, 1985), однако образования адвентивных почек авторы не наблюдали. Увеличение концентрации НУК в среде стимулировало образование эксплантами корней. Так, при добавлении в среду 0,1 - 0,2 мг/л НУК на эксплантах образовывалось в среднем 3 и более корня, длиной 36,89 и 33,63 мм соответственно. Однако корнеоб-разование происходило не на всех вариантах сред, где присутствовал ауксин, а лишь на тех средах, в которые не был добавлен 6-БАП (кроме варианта НУК 0,0 мг/л + 6-БАП 1,0 мг/л). На всех вариантах сред наблюдалось незначительное каллусирование базальных частей эксплан-гов, за исключением сред: 0,1 мг/л 6-БАП без НУК, 0,1 мг/л 6-БАП + 0,01 мг/л НУК и 0,0 мг/л 6-БАП + 0,2 мг/л НУК.

В ходе эксперимента по изучению влияния минеральных солей на гемогенез in vitro эксплантов ивы остролистной было выявлено, что изученные варианты питательных сред имеют существенное отличие по регенерационной активности на них эксплантов ивы остролистной (Рфакт 4,76 Fri6l 3,8 при уровне значимости 0,05).

Наибольшее число образовавшихся побегов и почек (2,9 и 2,8 шт./экспл.) наблюдали на средах MS и DKW соответственно, в то же время на среде WPM этот показатель составил лишь 2 шт./экспл. Таким образом, формирование новых почек происходило на среде MS на 43 % более эффективно, чем на WPM, а на средах DKW и GD - на 39 % и 19 % соответственно.

Проведённый эксперимент показал, что исследуемые среды существенно отличаются друг от друга по влиянию на рост побегов ивы остролистной в культуре in vitro (F$aicr 8,0 FTa6jI, 7,0 при уровне значимости 0,01). При оценке параметров роста эксплантов лучшие результаты наблюдали на среде MS, длина побегов на этом варианте была больше, чем на среде GD, на 46 %. Среды DKW и WPM по данному показателю практически не отличались (меньше, чем на WPM, на 26,8 % и 24,7 % соответственно). На среде GD происходило формирование укороченных побегов.

На сегодняшний день существует множество различных питательных сред, используемых для культивирования и регенерации растений определённого вида (Driver, J., 1984; Gresshoff, P., 1972; Murashige, Т., 1962). Однако для многих видов растений, вводимых в культуру in vitro, готовые прописи уже имеющихся сред не подходят. Изучение влияния трех фитогормонов цитокининовой природы на морфогенетическую способность эксплантов ивы проводили с использованием питательной среды MS, содержащей 30 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара. Сегменты побегов ивы помещали на питательные среды, содержащие Кин, 6-БАП и 2iP и разлитые в пластиковые контейнеры. На 14-16 сутки культивирования на базальной части эксплантов образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых впоследствии формировались адвентивные почки.

• В ходе исследования было выявлено существенное различие исследуемых вариантов питательных сред по интенсивности формирования новых побегов (FiaKI 164,5 Ртабл 27,0 при уровне значимости 0,001). Наибольший коэффициент размножения (4,2) был зафиксирован на среде с кинетином, побеги были более сформированными, чем на двух других исследуемых средах.

Интенсивность ризогенеза на средах DKW, GD, WPM, MS с добавлением 0,2 мг/л НУК оценивали по числу укоренившихся побегов, числу корней на один эксплант и длине одного корня (см. табл. 10).

На величину среднего значения укоренившихся растений влияние среды начинает сказываться с восьмой недели культивирования. Так, на

2, 3 и 5 неделях культивирования фактическое значение критерия Фишера, рассчитанное методом дисперсионного анализа, варьирует от 0,37 до 2,3 при табличном значении 4,2, что свидетельствует об отсутствии влияния среды на укоренение при 5 % уровне значимости. На восьмой неделе эксперимента влияние среды на процент укоренившихся растений достоверно на 1 % уровне значимости (И факт. = 8,5 при И табл.001 = = 7,85).

Лучший результат укоренения эксплантов ивы остролистной был получен на среде МБ - 96,7 %, несколько меньше укоренившихся растений на среде У/РМ - 92,6 %, в то время как на средах БКУ/ и СО укорененных побегов было получено на 20 % меньше (табл. 10).

Таблица 10. Сравнение параметров ризогенеза

Среда Параметр

укоренившихся растений, % корней/эксплант, шт. длина 1 корня, мм

ОКЛУ 65,3 1,3 12,4

76,7 1,6 12.1

96,7 2,3 17,4

92,6 2,9 18,7

При оценке среднего количества корней на одном экспланте влияние среды начинает сказываться с восьмой недели культивирования. На 2, 3 и 5 неделях культивирования фактическое значение критерия Фишера, рассчитанное методом дисперсионного анализа, варьирует от 0,92 до 2,9 при табличном значении 4,2, что свидетельствует об отсутствии влияния фактора среды на значение среднего числа корней на эксплант при 5 % уровне значимости. Однако на восьмой неделе эксперимента влияние среды достоверно на 1 % уровне значимости (Р факт. = 6,1, Ртабл.0,01 = 7,85). Экспланты на среде ОК\У образовывали корней на 43,5 % меньше, чем на среде МБ (2,3 шт./эксплант - контроль). В то же время на среде СО среднее число корней на один эксгшант составило 1,6, что меньше, чем в контроле, на 30,4%. Лучшие результаты были получены на среде \УРМ - 2,9 шт./эксплант. что больше, чем на среде МБ, - на 26 %.

После трёх недель культивирования средняя длина корней на исследуемых средах не имела достоверного отличия. Через 8 недель культивирования минимальная средняя длина корней наблюдалась на среде СБ (12,1 шт./эксплант), что меньше, чем в контроле, на 30,5 %. Неудовлетворительные результаты были получены на среде

(12,4 шт./эксплант): средняя длина корней была на 28,7 % меньше, чем на MS. Максимальная средняя длина корней в эксперименте составила 18,7 мм на среде WPM, превысив контроль на 7,5 %.

На основании полученных результатов совокупности исследуемых параметров укоренения in vitro эксплантов ивы остролистной было установлено достоверное отличие влияния минеральных солей среды культивирования на процессы ризогенеза, начиная с восьмой недели культивирования. Экспериментально установлено, что результаты, полученные на среде WPM, как правило, на 10-20 % лучше результатов, достигнутых на других исследованных средах.

Критериями интенсивности адаптации растений-регенерантов являлись длина побегов и процент приживаемости растений. Исследованы два способа адаптации растений: в таблетки-микропарники и субстрат-контейнеры. Показания снимали каждые 7 дней. На 44 день культивирования растений S.acutifolia Willd достоверность различия по среднему значению по t критерию Стьюдента составила 2,4. Средняя длина побегов в таблетках больше средней длины побегов в контейнерах на 23,7 %, разница в высотах побегов на уровне значимости 0,99, ошибка вывода составляет 1,64 %. Средняя длина побегов на 44 день культивирования в микропарниках составила 103,0±3,6 мм, в то время как в контейнерах 83,3±7,4 мм. В процессе адаптации растений к условиям окружающей среды в варианте с контейнером процент успешной адаптированных растений составил 94,4 %, в то время как для микропарников эта величина составила 87,5 %.

Для получения новых форм растений в культуре тканей необходимо оптимизировать условия для индукции каллусной ткани и изучить особенности данного процесса. Обычно условия индивидуальны и в значительной степени предопределены генотипом.

В процессе культивирования на средах, дополненных 2 мг/л НУК, ИМК, ИУК, а также в контроле (без ауксинов) не происходило образования каллусной ткани, в то время как на среде с 2,4-Д интенсивное каллусообразование началось на второй неделе. Индекс роста для среды с 2,4-Д через 3 недели культивирования составил 384,1.

Определение оптимального состава солей в среде культивирования каллусной ткани имеет большое значение (рис. 3). На среде MS наблюдали отмирание каллусной ткани в 20-25 % случаев. В контроле каллус-ная ткань характеризовалась бурым оттенком и самым низким показателем интенсивности роста.

160,00 : ................-...........—........................ -.......

; * i4o,oo 4.........................................-.............у

: р | 120,00 j-———-------------------------®

| i I 100'00 ? T T т T............ I ■ i

! i | 80,00 |ГН|........flbL .........................MSa-03-06 I

z ; I 11 [if 11 —

i GD LP MS WPM

среды {

Рис. 3. Интенсивность каплусогенеза S.acutifolia Willd

На средах GD и LP рост каллусной ткани происходил в 87 % случаев. Чаще всего морфогенный желтый каллус образовывался на среде GD. Среда WPM характеризовалась наибольшей интенсивностью кал-лусообразования.

ВЫВОДЫ

1. Для создания плантаций ивы остролистной необходимо проведение селекционной оценки как внутри насаждений отдельных особей, так и на популяционном уровне.

2. Плюсовые деревья S.acutifolia Willd имеют в том же возрасте запас коры в 2-2,5 раза выше, чем нормальные деревья.

3. Для выявления плюсовых деревьев необходима оценка возраста, диаметра, высоты растения, а также отбор не менее 10 проб коры.

4. Биомасса коры на однолетних побегах у 15 изученных популяций отличается на 16 %, что свидетельствует о возможности проведения отбора на межпопуляционном уровне.

5. Селекцию ивы остролистной целесообразно осуществлять через индивидуальный отбор особей.

6. Отбор на содержание биологически активных веществ целесообразно проводить с однолетних побегов, собранных в период покоя (декабрь-март),

7. Оптимальным режимом стерилизации для получения стерильных морфогенных эксплантов ивы остролистной является выдерживание сегментов растений в 10 % растворе Domestos в течение 10 минут.

8. Для интенсивной пролиферации побегов ивы остролистной в культуре in vitro необходимо использовать среду MS, дополненную 1 мг/л Кин и 0,05 мг/л НУК.

9. Экспериментально установлено, что результаты, полученные на среде WPM, как правило, на 10-20 % лучше результатов, достигнутых на других исследованных средах.

10. Эффективность адаптации растений-регенерантов в контейнерах несколько выше, чем в микропарниках, однако с технологической точки зрения рациональнее использовать торфяные таблетки в комплексе с микропарниками.

11. Для индукции морфогенного каллуса необходимо использовать среду WPM, дополненную 2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л Кин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При оценке запасов коры S.acutifolia Willd рекомендуется использовать разработанные таблицы.

2. Селекцию ивы остролистной целесообразно осуществлять через индивидуальный отбор особей, так как влияние межпопуляционной изменчивости (по содержанию биологически активных веществ и интенсивности роста) незначительно по сравнению с индивидуальной изменчивостью отдельных генотипов.

3. Ввиду интенсивного разрушения биологически активных веществ при сушке сырья необходимо соблюдение следующих условий:

а) избегать запаривания образцов;

б) проводить сублимационную сушку, увеличивающую сохранение биологически активных веществ до 30%;

в) высушивание образцов проводить при температуре не выше 60 °С;

г) при размельчении образцов обеспечивать их максимальную гомогенность;

д) срок сбора образцов - июнь.

4. Для создания высокопродуктивных плантаций ивы остролистной рекомендуется использовать качественный посадочный материал, полученный in vitro,

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Сергеев Р.В. Размножение in vitro генотипов ивы с повышенным содержанием биологически активных веществ для плантационного выращивания на салицин / Р.В. Сергеев, А.И. Шургин // Лесной журнал. -2009,- №6.- С. 40-45.

2. Сергеев Р.В. Изучение влияния минерального и гормонального состава среды на размножение in vitro генотипов ивы с повышенным

содержанием биологически активных веществ / Р.В. Сергеев, А.И. Шургин // Вестник МарГТУ. - 2010. - № 2(9).- С. 93-100.

3. Коптина A.B., Сергеев Р.В., Шургин А.И. Разработка технологии микроклонального размножения растений рода Salix для получения биологически активных веществ // Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование: материалы докладов X международного симпозиума. - Сыктывкар, 2008. -С. 93-94.

4. Сергеев Р.В., Шургин А.И., Канарский A.B., Пономарёва Т.А., Коптина A.B., Содержание салицина в экстрактах коры ивы Salix acutifolia L. // Химия и технология растительных веществ: тезисы докладов V Всероссийской научной конференции. - Уфа, 2008. - С. 160.

5. Коптина A.B., Сергеев Р.В., Шургин А.И. Рациональная технология воспроизводства ресурсов ивы остролистной с повышенной продуктивностью салицилатов // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тезисы IX международной конференции. - Звенигород, 2008.-С. 194.

6. Koptina А.V., Sergeyev R.V., Shurgin A.I. Propagation in vitro of willow for salicylates production // Proceeding of the 12th International Congress 'Phytopharm 2008'. - Saint-Petersburg, 2008. - P. 117.

7. Kanarskiy A.V., Koptina A.V., Sergeyev R.V., Shurgin A.I. Willow bark as a raw material for phytotherapy // Proceeding of the 12th International Congress 'Phytopharm 2008'. - Saint-Petersburg, 2008. - P. 67.

8. Коптина A.B., Сергеев P.B., Шургин А.И. Микроклональное размножение Salix для плантационного выращивания на салицин // Фундаментальные и прикладные достижения в биологии: сборник материалов I международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных. - Донецк, 2009. - Том II. - С. 389-390.

9. Коптина A.B., Лобанова Е.А., Масленникова Н.С, Сергеев Р.В., Шевелёва H.H., Шургин А.И. Размножение in vitro высокопродуктивных генотипов Salix для создания плантаций на салицин // БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития: материалы V Московского международного конгресса. - Москва, 2009. - Том 1. - С. 197-198.

Ю.Сергеев Р.В. Микроклональное размножение Salix как способ получения улучшенного посадочного материала для создания плантационных культур // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов международной научной студенческой конференции по естественным и техническим дисциплинам. - Йошкар-Ола, 2009. -Часть 3,-С. 81-82.

11. Сергеев Р.В., Щургин А.И. Разработка протокола размножения in vitro ивы остролистной (Salix acutifolia) для плантационного выращивания // Интродукция растений: теоретические, методические и прикладные проблемы: материалы международной конференции. - Йошкар-Ола, 2009. - С. 223-226.

12.Sergeyev R.V., Sheveleva N.N., Shurgin A.I. BAS Accumulation and in vitro Propagation of Salix High Productive Genotypes // 2nd Annual Russian-Korean Conference "Current issues of natural products chemistry and biotechnology". - Novosibirsk, 2010. - P. 163.

13. Сергеев P.B. Совершенствование технологии доращивания растений полученных в культуре ткани in vitro / P.B. Сергеев, А.Д. Средин, Д.И. Мухортов //Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». - Волгоград, 2010.-С. 264-269.

14. Сергеев Р.В. Разработка протокола размножения in vitro ивы остролистной (Salix acutifolia Willd) для плантационного выращивания / Р.В. Сергеев, А.И. Шургин, Н.Н. Шевелёва, Е.Н. Новикова // Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». - Волгоград, 2010. - С. 304-308.

15.Kanarskiy A.V., Koptina A.V., Sergeyev R.V., Shurgin A.I. screening and reproduction of Salix acutifolia plant resources for phytotherapy // Proceeding of the 14th International Congress 'Phytopharm 2010'. - Saint-Petersburg, 2010.-P. 63.

Подписано в печать 28.04.2011. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 4601. Тираж 100 экз.

Редакционно-издательский центр Марийского государственного технического университета 424006 Йошкар-Ола, ул. Панфилова, 17

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Сергеев, Роман Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биология Ивы остролистной

1.2. Экология Ивы остролистной

1.3. Хозяйственное значение ивы

1.3.1. Биологически активные вещества, применение в медицине

1.3.2. Хозяйственное значение ив

1.4. Методы культивирования

1.4.1. Традиционные методы выращивания ив

1.4.2. Размножение растений Salix в культуре in vitro

1.5. Влияние генотипа на синтез вторичных метаболитов ' 26 Выводы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМА И

МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристика района исследования

2.2. Методика отбора растительного материала

2.3. Методы оценки запасов коры ив

2.4. Отбор образцов S.acutifolia Willd для определения продуктивности

2.5. Растительный материал S.acutifolia Willd для введения в культуру in vitro

2.6. Схема исследований

2.7. Методики лабораторных исследований

2.8. Культура ивы остролистной in vitro

2.8.1 Выбор первичного экспланта

2.8.2. Стерилизация исходного экспланта Salix acutifolia Willd

2.8.3. Влияние 6-БАП и НУК на морфогенез S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.4. Оценка влияния минерального состава среды на процессы побегообразование S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.5. Влияние типа цитокинина на процесс морфогенеза S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.6. Влияние минерального состава среды на ризогенез S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.7. Укоренение и адаптация регенерантов S. acutifolia Willd

2.8.8. Влияние ауксинов на каллусогенез S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.9. Влияние минерального состава среды на каллусогенез S. acutifolia Willd в культуре in vitro

2.8.10 Создание коллекции in vitro S. acutifolia Willd

2.8.11 Математическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Динамика накопления коры в насаждениях ивы остролистной

3.1.1. Динамика изменения таксационных показателей модельных деревьев ивы остролистной от возраста

3.1.2. Зависимость таксационных показателей модельных деревьев S. acutifolia Willd в зависимости от диаметра

3.1.3. Динамика накопления коры модельными деревьями ивы остролистной

Выводы

3.2. Селекционная оценка деревьев ивы остролистной

3.3. Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов ивы

3.3.1. Обоснование выбора первичного экспланта

3.3.2. Стерилизация эксплантов ивы для введения в культуру in vitro

3.3.3. Изучение влияния сочетание фитогормонов на морфогенез in vitro

3.3.4 Влияние минерального состава среды на гемогенез S. acutifolia Willd в культуре in vitro

3.3.5 Влияние цитокининов на интенсивность морфогенеза S. acutifolia Willd в культуре in vitro

3.3.6 Влияние минерального состава среды на интенсивность образования корней эксплантами ивы остролистной

3.3.7 Адаптация полученных in vitro регенерантов к условиям внешней среды

3.3.8 Подбор ауксина в питательной среде для получения морфогенной каллусной ткани

3.3.9 Изучение влияния минерального состава среды культивирования на процесс каллусогенеза эксплантами ивы 84 остролистной

3.4. Экономическая эффективность

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Селекция и технология микроклонального размножения ивы остролистной (Salix Acutifolia Willd)"

На сегодняшний день плантационный способ выращивания древесных пород является общепринятой мировой практикой повышения эффективности лесного хозяйства. Для повышения продуктивности и рентабельности плантационного способа ведения лесного хозяйства необходимо использовать высококачественный посадочный материал, произведенный на основе отобранных по продуктивности форм древесных пород.

В 70-80-е годы XX века наша страна была одной из ведущих биотехнологических держав. Сейчас доля РФ в мировом объеме биотехнологической продукции не превышает 0,2 % (четверть века назад — 5 %), США - 42 %, Евросоюз - 22 %, Китай - 10 %, Индия - 2 %, а по уровню развития биоиндустрии, занимает 70-е место в Мире. Большинство видов жизненно важной биотехнологической продукции Россия импортирует [14].

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов прошлого столетия. В последующих работах 40-х годов было проведены исследования по способности различных тканей Ulmus foliacea Gilib. к образованию адвентивных почек. К середине 60-х годов Матесу (Бутенко, 1964) удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры.

Большинство видов ивы {Salix, Salicaceae) содержат в листьях, коре или почках салицилаты (производные салицилового спирта). Салицин (ß-D-глюкопиранозид салицилового спирта), наиболее распространённый салицилат, был первым фенольным глюкозидом, обнаруженным, как в иве, так и в природе. Интерес к натуральным препаратам из ивы как альтернативе аспирина, возрастает, так как салицилаты ивы не обладают побочными эффектами (раздражение и повреждение желудка) [63]. Большинство из источников ивы, в настоящее время доступных для получения лекарственных препаратов, содержат менее 1 % активных компонентов. Поэтому, представляет большой интерес исследования, селекция и культивирование видов и форм ивы, с повышенным содержанием салицилатов [75].

В связи с этим, возникает необходимость их разведения путем создания промышленных плантаций интенсивного типа с короткой ротацией, а в качестве посадочного материала использовать высокопродуктивные (по выходу салицилатов) сорта-клоны, обладающие устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям.

Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований явилось разработка критериев для отбора плюсовых деревьев S.acutifolia Willd и дальнейшее их размножение с использованием технологии культуры тканей растений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявление зависимостей от таксационных характеристик деревьев S.acutifolia Willd биомассы коры на отдельном дереве и единице площади.

2. Определение направлений селекции S.acutifolia Willd с целью получения максимального прироста запаса коры на отдельном дереве

3. Разработка методики по отбору плюсовых деревьев S.acutifolia Willd в местах их естественного произрастания.

4. Изучение режима стерилизации и особенностей микроклонального размножения S.acutifolia Willd.

5. Оптимизация условий культивирования in vitro и адаптации S.acutifolia Willd.

Объект исследований — методы оценки популяций и культур in vitro древесных растений.

Предмет исследований - популяции, отдельные особи, части растений ивы остролистной, каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения-регенеранты.

Научная новизна работы.

Определены критерии для оценки природных популяций S.acutifolia Willd и предложен методический подход для отбора плюсовых деревьев ивы остролистной с высокой продуктивностью биомассы коры. Разработана технология микроклонального размножения растений ивы остролистной и оптимизированы условия культивирования и адаптации полученных in vitro растений-регенерантов S.acutifolia Willd. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro растений S.acutifolia Willd.

Практическая ценность. Разработаны нормативные таблицы по оценке товарных запасов коры S.acutifolia Willd в зависимости от таксационных характеристик. Создана коллекция in vitro высокопродуктивных генотипов ив. Оптимизирован процесс получения посадочного материала ивы остролистной с применением культуры in vitro. Разработано обоснование выбора типа сырья, заготовляемого с плантации S.acutifolia Willd. Теоретические и практические результаты работы используются в НИР и учебном процессе МарГТУ.

Обоснование и достоверность научных положений обеспечены достаточным объемом экспериментального материала, собранного с использованием обоснованных методик, а также применением математических методов при обработке полученных результатов, воспроизводимостью результатов научной работы.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на X Международном симпозиуме «Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование» (Сыктывкар 2008), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа 2008), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород 2008), 12th International Congress «Phytopharm 2008» (Saint-Petersburg 2008), Международной научной студенческой конференции по естественным и техническим дисциплинам

Научному прогрессу - творчество молодых» (Йошкар-Ола 2008), I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Фундаментальные и прикладные достижения в биологии» (Донецк 2009). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе на 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008», где были отмечены дипломом и серебряной медалью, были отмечены дипломом третьей степени в VI ярмарке бизнес-ангелов и инноваторов «Российским инновациям — Российский капитал», кроме того проект по теме диссертации победил в программе «Участник Молодёжного Научно-Инновационного Конкурса» («УМНИК») и был удостоен диплома и медали конкурса молодых учёных на лучшую научно-исследовательскую работу на Пятом Московском Международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Оценка природных популяций ивы остролистной на интенсивность накопления биомассы коры.

2. Методика для отбора плюсовых деревьев S.acutifolia Willd.

3. Технология микроклонального размножения и особенности культивирования in vitro растений S.acutifolia Willd.

Публикации результатов исследований

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования на практике, списка использованной литературы, содержащего 110 наименований, в том числе 60 иностранных авторов и приложений.

Заключение Диссертация по теме "Лесные культуры, селекция, семеноводство", Сергеев, Роман Владимирович

Выводы

Для создания плантаций ивы остролистной необходимо проведение селекционной оценки как внутри насаждений, так и на популяционном уровне.

2. Плюсовые деревья Salix acutifolia Willd имеют в том же возрасте запас коры в 2-2,5 раза выше, чем у нормальных деревьев.

3. Для выявления плюсовых деревьев необходима оценка возраста, диаметра и высоты растения, а так же отбор не более 10 проб массы 1 см коры.

4. Доля коры на однолетних побегах у 15 изученных популяций отличается на 16%, Что свидетельствует о возможности проведения отбора на межпопуляционном уровне.

5. Селекцию ивы остролистной целесообразно осуществлять через индивидуальный отбор особей.

6. Отбор на содержание биологически активных веществ целесообразно проводить с однолетних побегов собранных в период покоя (декабрь-март) с последующим их проращиванием в лабораторных условиях.

7. Оптимальным режимом стерилизации для получения стерильных морфогенных эксплантов ивы остролистной является выдерживание сегментов растений в 10 % растворе Domestos в течение 10 минут.

8. Для интенсивной пролиферации побегов ивы остролистной в культуре in vitro необходимо использовать среду MS дополненную 1 мг/л Кин и 0,05 мг/л НУК.

9. Экспериментально установлено, что результаты, полученные на среде WPM как правило, на 10-20 % лучше результатов, достигнутых на других исследованных средах.

10. Эффективность адаптации растений-регенерантов в контейнерах несколько выше, чем в микропарниках, однако с технологической точки зрения рациональнее использовать торфяные таблетки в комплексе с микропарниками.

11. Для индукции морфогенного каллуса необходимо использовать среду \¥РМ дополненную 2 мг/л 2,4-Д и 0,2 мг/л Кин. I

Предложения для использования в селекционной практике

1. При оценке запасов коры ивы остролистной рекомендуется использование разработанных в данном исследовании нормативных таблиц.

2. Методика отбора особей ивы остролистной на продуктивность коры и содержание биологически активных веществ.

Селекцию ивы остролистной целесообразно осуществлять через индивидуальный отбор особей, так как влияние межпопуляционной изменчивости (по содержанию биологически активных веществ и интенсивности роста) незначительны по сравнению с индивидуальной изменчивостью генотипов ивы остролистной. Отбор на содержание биологически активных веществ целесообразно проводить с однолетних побегов собранных в период покоя (декабрь-март) с последующим их проращиванием в лабораторных условиях.

3. Отбор листьев на содержание биологически активных веществ июнь — июль.

Отбор образцов коры - июнь.

В виду интенсивного разрушения биологически активных веществ при сушке сырья необходимо соблюдение следующих условий: а) избегание запаривания образцов, которое ведёт к снижению содержания биологически активных веществ до трех раз; б) сублимационная сушка для побегов увеличивает сохранение биологически активных веществ до 30%; в) высушивание образцов должно проводиться при температуре не выше 60 °С, при увеличении температуры происходит разрушение до 10 % биологически активных веществ; г) при размельчении образцов необходимо обеспечивать их максимальную гомогенность.

4. Для создания высокопродуктивных плантаций ивы остролистной рекомендуется использовать качественный посадочный материал полученный отбором и последующим микроклональным размножением лучших генотипов.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Сергеев, Роман Владимирович, Йошкар-Ола

1. Анциферов, Г. И. Отбор каповых форм тополя черного и ивы белой / Г. И. Анциферов // Лесное хозяйство. — 1966. № 5. — С. 33 - 34.

2. Анциферов, Г. И. Ива / Г. И. Анциферов. — М.: Лесная промышленность, 1984.-101 с.

3. Афонин, А. А. Методологические принципы создания устойчивых высокопродуктивных насаждений ив (на примере автохтонных видов Salix Брянского лесного массива). — Брянск: БГУ, 2005. — 146 с.

4. Афонин, А. А. Изменчивость ив Брянского лесного массива и перспективы их селекции на устойчивость и продуктивность: атореф. дис. докт. сельско-хозяйственных наук / A.A. Афонин. — Брянск, 2006. С. 47.

5. Афонин, А. А. Ивы Брянского лесного массива / А. А. Афонин. Брянск: БГУ, 2003.-237 с.

6. Беляева, И. В. Низкорослые декоративные формы ивы в культуре на Среднем Урале / И. В.Беляева, В. И. Шабуров, А. А. Дьяченко // Экология и акклиматизация растений: сб. ст. Ботан. сад УрО РАН. — Екатеринбург. — 1998.-С. 105-113.

7. Берике, В. Гомеопатическое лекарствоведение / В. Берике. СПб. - 2002. — 688 С.

8. Будниченко, Н. И. Опыт посадки ив для биотехнических целей / Н. И. Будниченко // Заповед.Белоруссии. 1985. - № 10. - С. 437 - 451.

9. Бутенко, Р. Г. Клеточная селекция картофеля / Р. Г.Бутенко, Л. М.Хромова, Г. А.Седнина// Сельскохозяйственная биология. 1983. — № 11. — С. 347 — 352.

10. Бутенко, Р. Г. Культура изолтрованных тканей и физиология морфогенеза / Р. Г.Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272 с.

11. Бутенко, Р. Г. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля / Р. Г.Бутенко, Л. М. Хромова, Г. В. Седнина. М.: ВАСХНИЛ, 1984. - 28 с.

12. Валягина-Малютина, Е. Т. Ива европейской части России. Иллюстрированное пособие для работников лесного хозяйства / Е. Т.Валягина-Малютина. М.: КМК, 2004. - 217 стр.

13. Василов, Р.Г. И накормит, и вылечит Проект "Концепция стратегии развития биотехнологической отрасли промышленности на 2008 2020 гг." / Р.Г. Василов // Российская Газета. - 2008. — 25 янв.

14. Глухов, М. М. Ивовый взяток / М. М. Глухов // Пчеловодство. 1963. — № 3. - С. 20-24.

15. Горобец, А. И. Биологическая продуктивность и хозяйственное значение некоторых видов ив в ЦЧР: автореф. дис. канд. сельско-хозяйственных наук / А. И. Горобец. Воронеж, 1992. - 202 с.

16. Горобец, А. И. Особенности роста ивовых плантаций в зависимости от условий выращивания и свойств культивара / А. И. Горобец // Развитие научного наследия акад. Н.И. Вавилова: тез. Междунар. науч. конф. — Саратов, 1997.-Т. 2.-С. 131-133.

17. Горобец, А. И. Результаты плантационного выращивания ивы в Краснодарском крае / А. И. Горобец, А. П. Максименко // Лесной журнал. -2007.-№6.-С. 36-41.

18. Дервиз — Соколова, Т. Г. Жизненные формы ив северо-востока СССР / Т. Г. Дервиз Соколова // Ботанический журнал. — 1982. — № 7, Т. 67. — С. 975 -982.

19. Дончев, Г. Используването на дървесните кори / Г.Дончев, Н. Иосифов // Гор. Стоп., Гор. пром-ст. 1986. - № 3, Т. 42. - С. 22-25.

20. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта (с основами стат. обработки результатов исследований) / Б. А. Доспехов. — М.: Колос, 1979. — 416 с.

21. Дундаров, С. Фармация (Болг.) / С. Дупдаров, П. Антонов, М. Бояджиева. — 1973. -№3.- С. 54-60.

22. Зузук, Б. М. Ива белая. Salix alba L. / Б. М. Зузук, Р. В. Куцик, А. Т. Недоступ // Провизор. 2005. — № 17.

23. Керн, Э. Э. Деревья и кустарники; их лесоводственные особенности, использование и технические применения / Э. Э. Керн. — М.: Государственное изд-во, 1925. 80 с.

24. Косиченко, Н. Е. Различия в строении древесины и содержании целлюлозы в древесине однолетних побегов и стволов древовидных ив и тополей / Н. Е. Косиченко // Лесохозяйственная информация. 1975. - № 14. - С. 16 — 17.

25. Котов, М. М. Применение биометрических методов в лесной селекции / М. М. Котов, Э. П.Лебедева. — Горький: Марийская республиканская типография, 1977. 121 с.

26. Курнаев, С. Ф. Лесорастительное районирование СССР / С. Ф.Курнаев. — М.: Наука, 1973.

27. Кущенская, С. Ю. Рекомендации по созданию ивовых прутяных плантаций в условиях Ивантеевского питомника / С. Ю. Кущенская // Науч. тр. Моск. гос. ун-т леса. 2000. - № 303. - С. 182 - 185.

28. Максименко, А. П. Плантационное выращивание лозовых ив : учеб. пособие / А. П. Максименко, А. И. Горобец. Краснодар: КубГАУ, 2006. — 118 с.

29. Малыченко, Е. В. Анатомия коры Chosenia nakai и сравнение ее со структурой коры других представителей семейства Salicaceae / Е. В. Малыченко // Науч. докл. высш. шк. Биол.наук. — 1988. № 7. - С. 71 — 76.

30. Малютина, Е. Т. О гермафродитизме у ив секции Vetrix / Е. Т. Малютина // Изв. вузов Лесн. жури. 1973. - № 1. - С. 5 — 8.

31. Морозов, И. Р. Определитель ив СССР и их культура / И. Р. Морозов. — М.: Лесн. промышленность, 1966. 254 с.

32. Насудари, А. А. Материалы к исследованию некоторых видов ивы из флоры Азербайджана: автореф. дис. канд. фармацевт, наук. / А. А. Насудари. Баку, 1966. —19 с.

33. Парфенов, В. И. Ивы (Salix L.) Белоруссии: Таксономия, фитоценология, ресурсы / В. И. Парфенов, И. Ф.Мазин. — Минск: Наука и техника, 1986. — 167 с.

34. Поляков, А. Рекультивация техногенных песков Норильского промышленного района / А. Поляков // Науч. техн. бюл. СО ВАСХНИЛ. — 1987.-№5.-С. 53-59.

35. Правдин, Л. Ф. Ива, ее культура и использование / Л. Ф. Правдин. — М.: Изд-во АН СССР, 1952.

36. Ростовцев, С. А. Содержание целлюлозы и длина волокна в древесине ив / С. А. Ростовцев // Лесн. хоз-во. 1964. - № 1. - С. 22.

37. Саутин, В. И. Выращивание и комплексное использование ивы. Практическое пособие / В. И. Саутин, П. Н. Райко, В. Н. Воробьев. — Минск: Ураджай, 1986. 54 с.

38. Сидоров, А. И. Таннидные ивы / А. И. Сидоров. М.: Лесная промышленность, 1978. -120 с.

39. Скворцов, А. К. Ивы СССР: Систематический и географический обзор / А. К. Скворцов. М.: Наука, 1968. -262 с.

40. Сукачев, В. Н. Из работ по селекции ивы / В. Н. Сукачев // Селекция и интродукция быстрорастущих древесных пород. — Л.: Гослестехиздат, 1934. -№ 1.-С. 51-85.

41. Сукачев, В. Н. Работы по селекции ивы / В. Н. Сукачев // Лесное хозяйство. 1939. - № 3. - С. 24-34.

42. Томилова, Н. К. Статистическая обработка данных: Методическое указание к выполнению расчетно-графического задания для студентов II и III курсов всех специальностей / Н. К. Томилова. — Йошкар-Ола : МарПИ, 1984.-28 с.

43. Чумаков, В. В. Рекомендации по ассортименту и технологии создания плантаций высокотаннидных ив в Европейской части РСФСР / В. В. Чумаков. М.: Мин. лесн. хоз-ва РСФСР, 1989. -55 с.

44. Чумаков, В. В. Создание плантаций высокотанидных ив: Обзорн. информ / В. В. Чумаков. М.: ВНИЦлесресурс Госкомлеса СССР, 1991. - 36 с.

45. Шабуров, В. И. Устойчивость и особенности роста ив на природно-техногенных песках / В. И. Шабуров, И. И. Шилова // Структура популяций и устойчивость растений на Урале. Свердловск, 1978. — С. 135-144.

46. Шашко, Д. Н. Агроклиматическое районирование СССР / Д. Н. Шашко. — М.: Колос, 1967.-335 с.

47. Шлыков, Г. Н. Дубильные растения СССР / Г. Н. Шлыков. М.: Сельхозгиз, 1932. - 192 с.

48. Agrawal, D.C. Rapid micropropagation of hybrid willow (Salix) established by ovary culture/ D.C. Agrawal, K. Gebhardt // Plant Physiology. 1994.- Vol. 143.-P. 763-765.

49. Ahuja, M.R. Somatic cell differentiation and rapid clonal propagation of aspen / M.R. Ahuja// Silvae Genetica. 1983. - Vol. 32. - P. 131 - 135.

50. Amo-Marco, J. В. In vitro propagation of Salix tarraconensis Pau ex Font Quer, an endemic and threatened plant / J. B. Amo-Marco, M. D. Lledo // In vitro Cellular and Development Biology. 1996. - Vol. 32. - P. 42-46.

51. Aravanopoulos, F. A. Heterozygosity and biomass production in Salix eriocephala / F. A. Aravanopoulos, L. Zsuffa // Heredity. 1998. - № 81. - P. 396-403.

52. Aronsson, P. Willow vegetation filters for wastewater treatment and soil remediation combined with biomass production / P. Aronsson, K. Perttu, // Forestry Chronicle. 2001. - Vol. 77, № 2. - P. 293 - 299.

53. Bergman, L. Effects of N6-benzyladenine on shoots of five willow clones (Salix ssp.) cultured in vitro / L. Bergman, S. von Arnold, T. Eriksson // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1985. - Vol. 4. - P. 135 - 144.

54. Bhojwani Sant S. Micropropagation method for a hybrid willow (Salix matsudana x alba NZ-1002) / Sant S. Bhojwani // New Zealand Journal of Botany. 1980. - Vol. 18. - P. 209 - 214.

55. Chalupa, V. In vitro propagation of willows (Salix s P.), European mountain — ahs (Sorbus aucuparia L.) and black locust (Robinia pseudoacacia L.) / V. Chalupa // Biologia Plantarum. 1983. - № 4. - Vol. 25. - P. 305 - 307.

56. Cherkasov, A. Ph. Classification of non-timber resourcer in the USSR: Pap.Finn.-Sov. Symp.Non- Timber Forest Resours / A. Ph. Cherkasov // Acta bot. Fenn. Juvaskyla, 1988.-Vol. 136.-P. 3-5.

57. Chrubasik, S. Treatment of low back pain exacerbations with willow bark extract: a randomized douple-blind study / S. Chrubasik, E. Eisenberg, E. Balan // American Journal of Medicine. 2000. - Vol. 109. - P. 9 - 14.

58. De Vries, M. G. Conservation of natural ecosystems of poplar and willow / M.

59. G. De Vries // Forestry Chronicle. 2001. - Vol. 77, № 2. - P. 255 - 257.

60. Douglas, D. A. Growth of Salix setchellioina on a Kluane River Point Bar,Ykon Territory, Canada / D. A. Douglas // Arct. and Apl. ReS. 1987. - № 1. Vol. 19.-P. 35-44.

61. Driver, J. A. In vitro propagation of paradox walnut rootstock / J. A. Driver, A.

62. H. Kuniyuki // Hortscience. 1984. - Vol. 19. - P. 507 - 509.

63. Dytkowska, O. Heavy metals content of selected galenic preparations / O. Dytkowska, B. Kami-Nski // Acta poloniae pharmaceutica. 1964. - Vol. 21. — P. 493 - 496.

64. Ebbs, S. Transport and metabolism of free cyanide and iron cyanide complexes by willow / S. Ebbs, J. Bushey, S. Poston, Kosma // Plant, Cell & Environment 2003. - Vol. 26. - P. 1467 - 1478.

65. El-Shemy, H. A. The effect of willow leaf extracts on human leukemic cells in vitro / H. A. El-Shemy, A.M. Aboul-Enein, M.I. Aboul-Enein // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2003. - № 4. Vol. 36. - P. 387 - 389.

66. Forster, N. Seasonality of salicin and phenolic glycoside contents in the bark of three Salix species / N. Forster, C. Ulrichs, M. Zander // First Symposium on Horticulture in Europe, Book of abstracts. — Vienna, 2008. — P. 40-41.

67. Granel, T. Cadmium accumulation by willow clones used for soil conservation, stock fodder, and phytoremediation / T. Granel, B. Robinson, T. Mills // Australian Journal of Soil Research. 2002. - Vol. 40, № 8. - P. 1331 - 1337.

68. Gresshoff, P. M. Development and differentiation of haploid Lycopercicon esculentum (tomato) / P. M. Gresshoff, C. H. Doy // Planta. 1972. - Vol. 107. -P. 161-170.

69. Jain, S. Somatic Embryogenesis in Woody Plants / S. Jain, P. Gupta, R. Newton // Kluwer Academic Publishers. 1995. - Vol. 2. - P. 219 - 234.

70. Jicinska, D. Compatibility and hybridization in wtland Salix species / D.Jicinska, M. N. Koncalova // Preslia. 1986. - № 4. Vol. 58. - P. 369 - 371.

71. Julkunen-Tiitto, R. Variation in growth and secondary phenolics among field cultivated clones of Salix myrsinifolia / R. Julkunen-Tiitto, B. Meier // Planta Medica. 1992. - Vol. 258. - P. 77 - 80.

72. Karkonen, A. Micropropagation of several Japanes woody plants for horticultural purposes / A. Karkonen // Societas Biologica Fennica. 1999. — Vol. 36.-P. 21-31.

73. Kefelil, V. I. Phenolic cycle in plants and environment / V. I. Kefelil, M. V. Kalevitch, B. Borsari // Journal of Cell and Molecular Biology. 2003. - № 2. -P. 13-18.

74. Klang-Westin, E. Potential of Salix as phytoextractor for Cd on moderately contaminated soils/ E. Klang-Westin, J. Eriksson // Plant & Soil. 2003. — Vol. 249.-P 127-137.

75. Kopp, R. F. Willow biomass trials in central New York State / R. F. Kopp, E. H. White, L. P. Abrahamson // Biomass and Bioenergy. 1993. - Vol. 5, № 2. — P. 179-187.

76. Kuzovkina, Y. A. Willows beyond wetlands: uses of Salix L. species for environmental projects / Y. A. Kuzovkina, M. F. Quigley // Water, Air, and Soil Pollution. 2005. - Vol. - 162. - P. 183 - 204.

77. Landberg, T. Differences in oxidative stress in heavy metal resistant and sensitive clones of Salix viminalis / T. Landberg, M. Greger // Journal of Plant Physiology. 2002. - Vol. 159. - P. 69 - 75.

78. Landsberg, J. J. A generalized model of forest productivity using simplified concepts of radiation-use efficiency, carbon balance and partitioning / J. J. Landsberg, R H. Waring // Forest Ecology and Management. 1997. - № 95. — P. 209-228.

79. Larsson, G. The Salix viminalis group useful plants then and now / Larsson G. and Bremer B. // Svensk Botanisk Tidskrift - 1991. - Vol. 85 (3). - P. 185 -200.

80. Ledin, S. Handbook on how to grow short rotation forest / S. Ledin, A. Alriksson. Uppsala: Swedish Univ. Agric. Sei., Section of Short Rotation Forestry, 1992.

81. Liesebach, M. Approaches on vegetative propagation of difficult-to-root Salix caprea / M. Liesebach, G. Naujoks // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. — 2004. № 79. - P. 239 - 247.

82. Lloyd, G. Commercially feasible micropropagtion of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot tip culture / G. Lloyd, B. H. McCown // Proceeded International Plant Propagators Society 1980. - Vol. 30. - P. 421 - 427.

83. Lyyra, S. In vitro regeneration of Salix nigra via adventitious shoots / S. Lyyra, A. Lima, S. A. Merkle // Tree Physiology. 2006. - Vol. 26. - P. 969 - 975.

84. Makela, A. Process-based models for forest ecosystem management: current state of the art and challenges for practical implementation / A. Makela, J. Landberg, A. R. Ek // Tree Physiology. 2000. - №. - 20. - P. 289 - 298.

85. Mohren, G.M.J. Contrasts between biologically-based process models and management-oriented growth and yield models / G.M.J. Mohren, II.E. Burkhart // Forest Ecology and Management. 1994. - № 69. - P. 1-5.

86. Mosiej, J. Closing the nutrient loop between urban and rural area wastewater and sludge utilization in Ner River Valley / J.Mosiej, A. Karezmarezyk // Ecohydrology and hydrobiology. - 2006. - Vol. 6, № 1-4. - P. 197 - 203.

87. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T.Murashige, F.Skoog // Physiologia Plantarum. 1962. - Vol. 15.-P. 473-497.

88. Neumann, A. Die mitteleuropäischen Salix-Arten / A.Neumann. Wien: Mitt Forstlichen Bundes-versuchsanstalt, 1981. —P. 152.

89. Neuner, H. In vitro propagation of Salix caprea L. by single node explants / H. Neuner, R. Beiderbeck // Silvae Genetica. 1993. - № 6. Vol. 42. - P. 308 -310.

90. Newton, R. J. Somatic Embryogenesis in Woody Plants / R. J. Newton, P. K. Gupta Pramod, S. M. Jain Shri Mohan. 1995. - Vol. 2. - P. 532.

91. Park, S. Y. Micropropagation of Salix pseudolasiogynefrom nodal explants / S. Y. Park // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2008. - № 3. Vol. 93. - P. 341 -346.

92. Patent FR2622800 France, Process for preparing a product for combatting viral complaints, especially cutaneomucosal viral complaints, pharmaceutical compositions and medicaments obtained using this process / Hauser D. — FR2622800; 05.12.1989.

93. Pulford, I. D. Heavy metal uptake by willow clones fro sewage sludge-treated soil: The potential for phytoremediation / I. D. Pulford, D. Riddell-Black, C. Stewart // International Journal of Phytoremediation. — 2002. — Vol. 4, № 1. — P. 59 72.

94. Sands, P. J. Application of process-based models to forest management: experience with PROMOD, a simple plantation productivity model / P. J. Sands, M. Battaglia, D. Mummery // Tree Physiology. 2000. - № 20. - P. 383 - 392.

95. Santos, B. R. Induction of friable callus in leaf explants of Salix (Salyx humboldtiana Willd) / B. R. Santos, R. Paiva, C. Martinotto // Ciencia Rural. — 2005. -№3. Vol. 35.-P. 510-514.

96. Sarwat, S. Salix caprea inhibits skin carcinogenesis in murine skin: inhibition of oxidative stress, ornithine decarboxylase activity and DNA synthesis / S. Sarwat, S. Mohammad // Journal of Ethnopharmacology. 2004. - Vols. 91 (2-3).-P. 267-276.

97. Schenk, R. U. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures / R. U. Schenk, A. C. Hildebrandt // Canadian Journal Botanica. 1972. - Vol. 50. - P. 199 - 204.

98. Thill, A. Culture et utilisation de l'osier / A. Thill // Bull. Cent. Populicult. Haunaut. 1984. - Vol. 1. - P. 23 - 28.

99. Thorpe, T. A. Clonal Propagation: Advertitious buds / T. A. Thorpe, K. R. Patel // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants / book auth. Vasil I. K. — New York: Academic Press, 1984. — Vol. 1.

100. Van Auken, O. W. Dynamics of establishment , growth and development of black willow and cottonwood in the san Antonio river forest / O. W. Van Auken, K. J. Bush // Texas Journal of Science . 1988. - № 3 : Vol. 40. - P. 269-277.

101. Vervaeke, P. Phytoremediation prospects of willow stand on contaminated sediment: a field trial / P. Vervaeke, S. Luyssaert, J. Mertens // Environmental Pollution. 2003. - Vol. 126. - P. 275 - 282.

102. Wagner, H. Plant drug analysis / H.Wagner, S.Bladt. New York: Springer, 2001.-Vol. XVI.-P. 384.

103. Waring, R.H. A process model analysis of environmental limitations on the growth of Sitka spruce plantations in Great Britain / R.H. Waring // Forestry. — 2000.-№73.-P. 65-79.

104. Watson, C. Development of a hydroponic screening technique to assess heavy metal resistance in willow (Salix) / C. Watson, I. D. Pulford, D. Riddell-Black // International Journal of Phytoremediation. 2003. - Vol. 5, № 4. - P. 333 — 349.

105. Weber, E. Monographie der Salix alba L. Spec. Plant Unter Berusceichtigund genetischer und Zuchterischer Aspecte / E. Weber // Forstwis-sentschaftliches. — 1974.-Vol. 5.-P. 233-247.

106. МАРИЙ ЭЛ РЕСПУБЛИКЫН ЧОДЫРА ОЗАНЛЫК МИНИСТЕРСТВЫЖЕ

107. МИНИСТЕРСТВО ЛЕСНОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ МАРИЙ ЭЛ

108. Ленин проспект, 24 б, Йошкар-Ола, Марий Эл Республик, 424000

109. Ленинский проспект, д.24 б, г. Йошкар-Ола, Республика Марий Эл, 424000

110. Председатель комиссии: Члены комиссии: