Получение биопродуктов из коры ивы Salix acutifolia

Коптина, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение биопродуктов из коры ивы Salix acutifolia
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение биопродуктов из коры ивы Salix acutifolia"

КОПТИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ БИОПРОДУКТОВ ИЗ КОРЫ ИВЫ SALIXACUT1FOLIA

03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щёлково, 2010

- 3 ИЮН 2010

004603254

КОПТИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ БИОПРОДУКТОВ ИЗ КОРЫ ИВЫ SALIXACUT1FOUA

03.01.06 -Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щёлково, 2010

Работа выполнена на кафедре лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии ГОУ ВПО «Марийский государственный технический университет», г. Йошкар-Ола.

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Канарский Альберт Владимирович

Официальные оппоненты: доктор технических наук

Гуславский Александр Игнатьевич

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский)

федеральный университет»

Защита диссертации состоится 28 мая 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; E-mail: vnitibp@mail.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ВНИТИБП РАСХН.

Автореферат разослан 27 апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Носов Александр Михайлович

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы в развитых странах наблюдается тенденция к увеличению применения лекарственных растений и экстрактов из них взамен синтетических лекарственных препаратов. Важное место среди источников природных лекарственных веществ занимают растения ивы (род Salix, семейство Salicaceaé). Экстракт коры ивы обладает противовоспалительными, обезболивающими, жаропонижающими свойствами (Marz, 2002, Кортиков, 2005), применяется при ревматических воспалениях и суставной боли (Chrubasik, 2001, Chrubasik, 2001, Chrubasik, 2000), ингибирует тромбин (Jedinak, 2006), обладает противоопухолевыми свойствами (El-Shemy, 2003, El-Shemy, 2007).

Однако ресурсы имеющихся в России диких популяций ивы по содержания сапицилатов не оценивались, а технологии переработки ивы как лекарственного растения имеют серьезные недостатки. Шроты после экстракции находят применение только как топливо. Что не допустимо, так как в них остаются биологически активные вещества. В целом это снижает экономическую и экологическую эффективность использования ивы как растительного ресурса.

Известно также, что многие высшие растения содержат метаболиты, обладающие противомикробными свойствами (El-Shemy, 2007), однако совершенно не изучено влияние веществ коры ивы на физиологию микроорганизмов, синтезирующих патогенные для человека и животных экотоксины. Микотоксины накапливаются в сельхозпродуктах, являются причиной потери урожая и гибели животных. Они передаются по трофической цепи к человеку и способны вызывать сильную интоксикацию.

В связи с этим актуально проведение исследований, направленных на изучение возможности комплексной переработки коры ивы с получением биопродуктов.

Цель и задачи исследований. Цель исследования - обоснование целесообразности применения и разработка технологии салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia Willd.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило:

- оценка сырьевых источников салицилатов;

- совершенствований способа выделения салицилатов;

- определение возможности использования коры и шротов ивы в качестве адсорбентов экотоксинов;

- исследование влияния летучих веществ коры и шрота ивы на рост, спороношение и синтез афлатоксинов грибами Aspergillus parasiticus.

- разработка технологического решения производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.

Научная новизна работы. Установлено содержание салицилатов в коре взрослых деревьев S. acutifolia - 8,3-11,3 %, в листьях и коре молодых побегов 3,2-7,5 % и 4,0-9,9 % соответственно. Выявлено положительное влияние ферментного комплекса целлюлазы и Р-глюканазы на степень извлечения салицилатов из растительного сырья.'Показана эффективность адсорбции коры и шротов ивы Т-2 микотоксина в условиях in vitro и in vivo. Установлено влияние летучих ¿еществ коры и шрота Salix acutifolia, представленных альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединении и др., на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus.

Практическая значимость работы. Рекомендовано использование коры популяций Salix acutifolia в бассейне Средней Волги как наиболее эффективный источник для получения салицилатов. Предложен оптимальный способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и Р-глюканазы из коры Salix acutifolia. Рекомендовано применение коры и шротов ивы в качестве фитосорбентов микотоксинов, которые могут быть использованы в составе кормов для их детоксикации. Летучие вещества коры и шротов Salix acutifolia могут применяться как ингибиторы синтеза афлатоксинов. Разработано технологическое решение производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.

Результаты диссертационной работы использованы в научной и образовательной деятельности ГОУ ВПО «Марийский государственный технический университет» при разработке учебно-методических комплексов дисциплин «Биотехнология», «Основы биохимии и ее применение в генетике» и «Основы биотехнологии». Результаты внедрялись при выполнении НИР и ОКР по темам: Выполнение работ по развитию центра коллективного пользования научным оборудованием «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей (ЦКП ЭБЭЭ)» (07.03.2007-31.03.2008); Обеспечение центром коллективного пользования научным оборудованием комплексных исследований в области рационального лесопользования,' разработки технологий

переработки и получения топлива и энергии из органического сырья (01.04.2008-31.03.2009).

Положения, выносимые на защиту:

1. Оценка сырьевых источников для получения салицилатов.

2. Усовершенствованные способы экстракции салицилатов.

3. Установленные адсорбционные свойства коры и шротов ивы в отношении микотоксинов.

4. Установленное влияние летучих веществ коры Salix acutifolia на рост, неполовое спороношение и синтез. афлатоксинов Aspergillus parasiticus.

5. Технологическое решение по производству биопродуктов из коры Salix acutifolia: экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов, результаты опытных работ и испытания энтеросорбента в условиях in vivo.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на международных и всероссийских конференциях и конгрессах: 2-ая Российско-корейская конференция «Современные проблемы химии природных соединений и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), «Фитофарм 2008» (Санкт-Петербург, 2008), «Биология клеток растений /« vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), «VIII Международный салон инноваций и инвестиций» (Москва, 2008), «2-я Биотехнологическая- выставка-ярмарка "РосБиоТех-2008"» (Москва, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), «Национальные проекты России как фактор её безопасности и устойчивого развития в глобальном мире» (Йошкар-Ола, 2008), «Пути рационального воспроизводства, использования и охраны лесных экосистем в зоне хвойно-широколиственных лесов» (Чебоксары, 2008), «Плодоводстйо, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2007), «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2007) и др. Работа поддержана персональным грантом (стипендией) Президента Российской Федерации для стажировки за рубежом (Приказ Федерального агентства по образованию (Рособразование) №350 от 18.04.2008) и грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К»; награждена большой золотой медалью и дипломом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008» (за разработку способа получения экстракта из растений семейства Salicaceae); дипломами VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (за разработку способа получения салицина)

и биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (за достижения в области биотехнологии и возобновляемой энергетики).

Личный вклад автора заключается в формировании целей и задач работы, проведении исследования, обработке и анализе экспериментальных данных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 заявка на изобретение (положительное решение о выдаче от 11. 02. 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, 5 приложений, содержит 21 таблицу и 22 рисунка. Список использованной литературы включает 212 наименований (в т.ч. 154 зарубежных авторов).

Благодарность. Приношу искреннюю признательность за помощь в Проведении исследований научному руководителю - док. техн. наук, проф. A.B. Канарскому, а также канд. с.-х. наук, доценту А.И Шургину, док. биол. наук, проф. Ю.П. Демакову.

1 СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА

В первой главе проанализированы результаты исследований отечественных и зарубежных авторов по биологической особенности и распространению ивы (Ruuhola, 2001, Афонин, 2006, Булыгин, 2001, Кулагин, 1998, Пчелин, 2007, Фалин, 2005), биохимическому составу коры ивы (Ruuhola, 2001, Афонин, 2006, Булыгин, 2001, Кулагин, 1998, Пчелин, 2007, Акао, 2002, Baker, 1987, Brenna, 2004, Buchanan, 2002, Bukowiecki, 1968, Elwood, 2001, Fiebich, 2004, Julkunen-Tiitto, 1992, 2001, 1992, Julkunen-Tiitto, 1988, Ruuhola, 2003, Ruuhola, 2003, Запрометов, 1993, Кретович, 1980, Плешков, 1980), области применения ивы (Ruuhola, 2001, Пчелин, 2007, Фалин, 2005, Lafont, 2007, Pohjamo, 2003, Smiley, 1985, Steinegger, 1972, 1972) и способах экстракции натуральных биологически активных веществ (Marz, 2002, Bukowiecki, 1968, Fiebich, 2004, Julkunen-Tiitto, 2001, 1992, Du, 2005, Duskova, 2005, Ishikawa, 2004, Kammerer, 2005, Li, 2001, Luo, 1998). Сведения о возможности использования адсорбентов на основе коры ивы и о влиянии летучих компонентов коры на рост грибов в литературе отсутствуют.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования выбраны естественные популяции растений Salix acutifolia Willd, произрастающие на песчаных пойменных почвах берегов рек - притоков Средней Волги.

Образцы коры однолетних побегов или взрослых деревьев отбирались с не менее десяти деревьев естественных популяций Salix acutifolia. Кору усредненного образца высушивали до воздушно-сухого состояния. Высушенные образцы коры измельчали в гомогенизаторе до частиц размером не более 2 мм и подвергали химическому анализу.

Оценка сырьевых ресурсов проводилась выделением экстрактивных веществ из коры ивы методом, предложенным Вагнером (Wagner, 2001). Затем были проанализированы различные способы экстракции с использованием в качестве экстрагента воды, ацетона, спирта и их растворов в разных концентрациях, при различных температурах и продолжительности процесса. В результате разработан рациональный способ экстракции салицилагов с использованием ферментного препарата целлюлазы и Р-глюканазы. Концентрация общего салицина определялась методом ВЭЖХ на хроматографе PerkinElmer Series 200 с бинарным насосом и спектрофотометрическим детектором.

Адсорбционную активность фитосорбента на основе коры ивы определяли методом, описанной Крюковым с соавт. (Крюков, 1992).

В ходе изучения влияния коры и шрота ивы на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus анализ летучих компонентов проводилось методом ГХ-МС, определение афлатоксинов Bl, В2, Gl, G2 и норсолориновой кислоты - ТСХ. Рост грибов оценивался по диаметру колонии на твердой питательной среде с минимальным содержанием глюкозы. Для изучения их эффекта использовался штамм Aspergillus parasiticus В62 (АТСС 24690) (niaD nor-1 br-1), который имеет мутацию в пог-1 гене и в связи. с этим накашивает первое стабильное промежуточное вещество в биохимическом пути синтеза афлатоксинов - норсолориновую кислоту. Накопление данного ярко оранжевого пигмента A. parasiticus В62 может быть обнаружено невооруженным взглядом на нижней поверхности колонии, выращиваемой на твердой питательной среде, с минимальным содержанием глюкозы. Конидиоспоры A. parasiticus В62 (3 х 103 спор на чашку Петри) были инокулированы в центр питательной среды. Маленькие чашки Петри с инокулированной питательной средой были помещены внутрь больших (150 х 150 мм)

чашки Петри. Для исследования эффекта растительного материала на рост, неполовое спорообразование и синтез афлатоксинов, 10 г коры Salix acutifolia было помещено в большие чашки Петри. Такая система позволяет летучим компонентам коры проникать к колониям. Спорообразование измерялось подсчетом спор с помощью гемацитометра (Roze, 2004). Выделение РНК и анализ экспрессии генов.(brlA, ß-tubulin, veA, aflR, veA, ver-1, omtA, hdaA, rpdA, gcn5, MYST 1, MYST 2, MYST3) осуществлялся согласно методике, описанной Розе (Roze, 2007).

Обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием пакетов стандартных программ Excel и Statistica 6.0, Origin 7.О,,позволивших провести корреляционный, дисперсионный и регрессионный анализ общепринятыми методами (Лакин, 1990). Все расчеты выполнены для доверительной вероятности 95 %.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Оценка биоресурсов салицилатов

Проведен сравнительный анализ различных видов ивы (Salix triandra, S. pentandra, S. viminalis, S. dasyclados, S. myrsinifolia, S. cinerea, S. alba, S. caprea, S. acutifolia) по содержанию салицилатов в однолетних побегах, наибольшая концентрация установлена у S. acutifolia, которая была выбрана объектом дальнейшего исследования.

Приведены результаты исследований коры естественных популяций S. acutifolia в бассейне Средней Волги по содержанию доли коры в однолетних побегах и салицилатов.

Максимальная доля коры в однолетних побегах наблюдается в популяциях S. acutifolia на реке Ока, г. Муром - 59,76±4,1 %, Вятка, г. Вятские Поляны - 57,6±3,9 %, Ветлуга, г. Шарья - 57,62±3,4 %, минимальное - в популяции на р. Сура, г. Сурск и Б. Кокшага, д. Кокшамары 51,7±3,8 % и 49,0±2,3 % соответственно. Доля коры в побегах уменьшается с их ростом и описывается следующим уравнением: CKOpa.=86,l-8,9'exp(D/4,2). Коэффициент детерминации модели составляет 0,85.

Наибольшая концентрация салицилатов отмечена в коре взрослых деревьев S. acutifolia - 8,3-11,3 %, в листьях и коре молодых побегов концентрация салицилатов составляет 3,2-7,5 % и 4,0-9,9 % соответственно. Если учесть, что содержание коры в однолетних побегах ^ acutifolia составляет до 60,5 % в свежесобранных побегах и 50 %,- в воздушно сухих, и что ива образуем большое количество

побегов, то однолетние побеги S. acutifolia могут использоваться в фармацевтической промышленности для производства натуральных лекарственных веществ. По требованиям Европейской Фармакопеи минимальное содержание салицилатов в растительном сырье должно составлять 1,5 % (European Pharmacopoeia 6.1, 2007). Таким образом, ива S. acutifolia является эффективным, воспроизводимым биологическим ресурсом салицилатов.

3.2 Усовершенствование способов экстракции салицилатов

Существующие способы экстракции салицилатов не позволяют извлекать максимально возможное количество биологически активных веществ из коры ивы. Были рассмотрены различные способы экстракции салицилатов:

1) Твердофазная экстракция органическими растворителями (10-, 50-, 80 % ацетон, 10-, 50-, 70 % этанол, вода). Все используемые экстрагенты, за исключением 80% ацетона, показали одинаково высокую степень извлечения салицилатов.

2) Ускоренная экстракция растворителями из твердых образцов (метод ASE) при разных условиях процесса (рис. 1):

1 - экстракция водой (160 °С, 3x20 мин.);

2 - двухступенчатая экстракция: 1) экстракция водой (160 °С, 3x5 мин.), 2) водой (100 °С; 3x20 мин.)

3 - многоступенчатая экстракция: 1) экстракция гексаном, (90 °С, 3x5 мин.), 2) смесью ацетон - вода (95:5), (100 °С, 3x5 мин.), 3) водой (100 °С, 3x5 мин), 4) водой (160 °С, 3x20 мин.).

3) Сверхкритическая флюидная экстракция углекислым газом, которая показала значительно меньший выход экстрактивных веществ (менее 1 %).

4) С целью сохранения биологической ценности экстракта и интенсификации процесса экстракции был разработан принципиально новый способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и Р-глюканазы (Laminex BG, с активностью 82105 GCU/g) для гидролиза компонентов клеточной стенки. Ферментативный гидролиз при расходе ферментного препарата 0,1 % от массы коры, при гидромодуле 1:50 и рН 5,5, в режиме гермостатирования (35°С) и перемешивания в течение 9 часов.

На рис. 1 приведены данные выхода чистого салицина и салицилатов в зависимости от способа экстракции.

Способ ЭКС1Р«КЦИИ

1,2,3 - одно-, двух- и многоступенчатая экстракция в экстракторе ASE 300 (Dionex) соответственно; 4 - экстракция водой, 5 - экстракция с использованием ферментного комплекса Laminex BG

Рисунок 1 - Выход чистого салицина и салицилатов в зависимости от способа экстракции.

Экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и р-глюканазы позволяет увеличить выход салицилатов на 4-45 %, при этом содержание салицина, главного действующего вещества экстракта, увеличивается минимум на 37 %. Это связано с высоким содержанием в клеточных стенках растений целлюлозы и гемицеллюлозы и необходимостью их гидролиза для более полного выделения биологически активных веществ. Обработанная таким образом кора ивы может в дальнейшем использоваться в качестве адсорбента микотоксинов.

Модели зависимости экстракции с использованием ферментного комплекса целлюлазы и Р-глюканазы от времени и температуры экстракции, а также количества фермента описываются уравнениями 1-3 соответственно:

Ссал.-7,1 +(23,6/x)-exp(-ln(0,1 -х))2,44 (1)R2=0,87;

Ссал.=7,3+40-е=ф(-0,1-х) (2) R2=0,72;

Ссал=8,1+1/(1+(0,16-х)" (3) R2=0,59.

Таким образом, целесообразным способом экстракции салицилатов является экстракция с использованием ферментного комплекса целлюлазы и р-глюканазы, т.к. увеличивается выход веществ, сохраняется биологическая ценность экстракга и понижается температурный режим, что позволяет экономить энергоресурсы.

3.3 Определение адсорбционных свойств коры и шротов ивы Salix acutifolia по отношению к Т-2 микотоксину

Показано, что кора ивы Salix acutifolia и шроты, полученные после экстракции салицина, его производных, потенциально способны адсорбировать Т-2 микотоксин и выводить его из организма животных. Адсорбционные свойства волокнистых фракций и корки, выделенных из шротов коры ивы, зависят от способа экстракции, результаты приведены в табл. 1. Однако при всех способах обработки коры ивы адсорбционные свойства ее компонентов по отношению к Т: 2 микотоксину не снижаются, а в большинстве случаев превосходят адсорбционные свойства исходной коры. При всех способах обработки коры ивы волокнистые фракции имеют более высокую истинную адсорбцию по отношению к Т-2 микотоксину в сравнении с коркой. Высокая адсорбционная способность наблюдается у волокнистой фракции коры ивы, обработанной ферментным комплексом целлюлазы и ß-глюканазы, которые способствуют разрушению клетчатки и увеличению количества адсорбционных центров на ее поверхности, обуславливающих взаимодействии с Т-2 микотоксином. С поверхности этой волокнистой фракции наблюдается и минимальная десорбция Т-2 микотоксина.

Таблица 1 - Адсорбционные свойства коры ивы, компонентов коры ивы и шротов

Способ обработки коры Наименование компонента в коре Эффективность адсорбции Т-2 микотоксина, % Десорбция Т-2 микотоксина, % Истинная адсорбцияf

pH 7 pH 2 pH 8

Кора ивы, механически измельченная смесь ВФ и К 54,4 57,2 12,7 44,5

ВФ 56,0 66,0 11,4 54,6

К 59,0 66,1 7,9 58,2

Экстракция этанолом ВФ 62,0 70,0 10,7 59,3

К 70,0 76,0 7,9 68,1

Экстракция с использованием ферментного комплекса ВФ 66,0 80,0 7,5 72,5

К 56,0 70,0 7,1 V-... 62 ,9 ..

Экстракция водой ВФ 59,2 64 7,8 53,2

К 59,2 61,6 8,1 53,5

Экстракция 80% ацетоном ВФ 69,0 76,0 7,9 68,1

К 56,0 62,0 12,1 > 49,9

Экстракция 0,01 М фосфатным буфером При ВФ 71,2 76,0 11,8 64,2

К иечание: ВФ - вол 64,0 окнистая 71,2 фракция к 9,4 оры, К~ корка. 61,8

3.4 Влияние летучих веществ Salix acutifolua на физиологию Aspergillus

parasiticus

Методом ГХ-МС определен химический состав летучих веществ, выделяемых корой и шротом ивы S. acutifolia, который в различных концентрациях для коры и шрота представлен альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединений и др. Установлено, что летучие вещества коры и шрота S. acutifolia влияют на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов A. parasiticus.

При выращивании A. parasiticus ВЫ под влиянием летучих веществ коры S. acutifolia синтез норсолориновой кислоты не происходит, что наблюдалось визуально по отсутствию оранжевого ободка по краю колоний и подтверждалось данными ТСХ. Также с помощью ТСХ доказано, что под воздействием летучих веществ коры грибы перестают синтезирововать афлатоксины Bl, В2, Gl, G2. При инкубировании A. parasiticus В62 со шротом синтез норсолориновой кислоты и афлатоксинов также ингибируется, но не полностью.

Кроме того, было отмечено, что под влиянием летучих компонентов коры и шротов Salix acutifolia увеличивался рост А. parasiticus В62 на 18 % и спорообразование на 32 % и 99 % соответственно. Данные приведены в табл. 2.

Таблица 2 - Средний диаметр колонии и спорообразование Aspergillus parasiticus

Вариант опыта Средний диаметр колонии, мм Среднее количество спор, х10"7

Контроль 38,39±0,36 1,9б±0,18

Инкубация с корой ивы 45,30±0,5б 2,59t0,29

Инкубация с корой ивы после экстракции БАВ 45,20±0,20 3,91±0,39

Для изучения механизма воздействия летучих компонентов коры Salix acutifolia на рост, неполовое спороношение и ситнез афлатоксинов A. parasiticus проводился анализ уровня экспрессии генов, участвующих в процессах развития (brlA, P-tubulin) и синтеза афлатоксинов (aflR, veA, ver-1, omtA, hdaA, rpdA, gcn5, MYST 1, MYST 2, MYST 3). Выделенная и очищенная РНК из колоний А. parasiticus была проанализирована методом РТ-ПЦР. Последовательности используемых праймеров сконструированы на основе генома Aspergillus flavus - близкого родственника A. parasiticus fwww.aspergillusflavus.org/genomics/) (Roze et al., 2007; Chanda et al., 2009). Результаты представлены на рис. 2-4.

Накопление транскрнпта в контроле и под воздействием коры ивы соответственно 1,2 — hdaA, 3,4 -rpdA, 5,6- gcn5,7, 8 -MYST 1,9, 10MYST 2, 11, 12-MYST3, 15,16 aflR,

14 - накопление транскрипта omtA в геномной ДНК (для проверки праймеров). Рисунок 4 - Накопление транскрипта гистондеацетилаз и гистонтрансацегилаз, а также aflR Aspergillus parasiticus под воздействием летучих веществ коры ивы

1 - ДНК-маркер; накопление транскрипта при использовании 1 мкл и 5 мкл РНК для транскрипции соответственно 2,3 —ver-1 в контроле, 4, 5 - ver-1 под воздействие коры ивы, 6, 7 - P-tubulin в контроле, 8,9 - p-tubulin под воздействие коры ивы; 10 -накопление чранскрипта P-tubulin в геномной ДНК.

Рисунок 2 - Накопление транскрипта ver-1 и p-tubulin Aspergillus parasiticus под воздействием летучих веществ коры ивы

Накопление транскрипта в контроле и под воздействием коры ивы соответственно 1,2- опйА; 3, 4 - уеА; 5,6 - Ьг1А.

Рисунок 3 - Накопление транскрипта veA, brlA, aflR и omtA Aspergillus parasiticus под воздействием летучих веществ коры ивы

I mm mi

При анализе уровня экспрессии генов A. parasiticus под влиянием летучих веществ коры S. acutifolia, установлена корреляция с отмеченными явлениями при изучении внешних физиологических пареметров (рост, конидиобразование, выделение норсолориновой кислоты и афлатоксинов).

Так, накопление транскрипта P-tubulin (ген участвует в образовании микротрубочек) увеличено на 26 % под влиянием веществ коры ивы; Bristle (brlA) (ген участвует в конидиообразовании) -увеличено на 92 %; veA (определяет реакцию на свет, развитие грибов и вторичный метаболизм) - снижено на 19 %; ver-1 ('средний'ген афлатоксинового кластера) - снижено на 40%. Экспрессия omtA ('поздний' ген афлатоксинового кластера) не наблюдается в 72 ч выращивания.

Накопление транскрипта aflR (положительный регулятор афлатоксинового кластера) под воздействием коры ивы практически не меняется.

Гистон ацетилтрансферазы (gcn5, MYST1, MYST2 и MYST3) и гистондеацетилазы (hdaA и rpdA ) - важные ферменты в транскрипционной регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках. Транскрипция hdaA ингибирована на 30 %, тогда как транскрипции rpdA не наблюдалась. gcn5 и MYST2 показали увеличение накопления транскриптов на 84% и 17% соответственно. Тогда как в MYST1 и MYST3 накопление транскриптов уменьшилось приблизительно на 40% и 30% соответственно. Исходя из данных можно сделать вывод, что две HAT, MYST1 и MYST3, накопление которых было ингибировано летучими веществами ивы могут участвовать в общем снижении гистонацетилирования в афлатоксиновом кластере таким образом вызывая наблюдаемое ингибирование биосинтеза афлатоксинов. gcn5 и MYST2, накопление транскриптов «которых было повышено летучими веществами, вероятно не вовлечены в гистонацетилирование в афлатоксиновом кластере. 4 V

4 разработка технологического решения на опытное Производство биопродуктов из коры

SALIX ACUTIFOLIA

На основании проведенных исследований разработан технологический регламент на опытное производство экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia. Технологическая схема получения экстракта и энтеросорбента

микотоксинов из коры Salix acutifolia представляет собой многостадийный процесс и приведена на рис. 5.

Энтсросорбент |'

1, 5- барабанно-ножевая дробилка; 2, 6, 16- транспортер; 3- инфракрасная сушилка; 4 -склад; 7-бункер; 8, 11,13- дозирующее устройство; 9 - биореактор; 10, 12, 22- ёмкость;

14 - центрифуга; 15 - сушилка с кипящим слоем; 17, 19, 23- насос; 18-хроматографическая колонна; 20 - вакуумный испарительный аппарат; 21 -теплообменник; 24 - распылительная сушилка.

Рисунок 5 - Технологическая схема получения экстракта салидилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia

Свежесобранная кора ивы с содержанием салицилатов в пересчете на салицин не менее 1,5 % предварительно измельчается в барабанно-ножевой дробилке 1 до диаметра менее 2 см, которые затем высушиваются в инфракрасной сушилке 2 и отправляются на склад 3. Перед началом ферментатирования растительное сырье дополнительно измельчается в барабанно-ножевой дробилке i до диметра менее 2 мм и транспортером б подается в бункер 7, а затем дозирующим устройством 8 в биореактор 9 с режимом перемешивания и термостатирования (35°С). Для проведения процесса ферментатирования из емкости 10 с помощью дозирующих устройства П в биореактор при гидромодуле 1:50 подается буферный раствор фосфорного калия (с pH 5,5) и одновременно из емкости 12 с помощью дозирующих устройства 13 вводят раствор ферментного препарата

Laminex™ BG, содержащий целлюлазу и ß-глюканазу, в количестве 0,1% от массы сырья. Ферментатирование проводят периодически при постоянном перемешивании в течение 9 ч и температуре 35 "С, что приводит к дезинтеграции растительных клеток и высокоэффективной экстракции салицилатов из растительных тканей в жидкую фазу. Затем ферментолизат и твердый остаток поступают в центрифугу 14, где при температуре 4 °С происходит разделение твердой фракции (шрота) и водонерастворимых или трудно растворимых веществ (например, таннинов). Шрот высушивается при температуре ЮО±5°С в сушилке с кипящим слоем 15 и упаковывается (16). Супернатант с помощью насоса 17 поступает в хроматографическую колонну 18, заполненную адсорбентом AmberIiteHP20® или HAAS XAD7YH® для отделения посторонних веществ от салицилатов. В качестве элюента используются водно-спиртовые растворы (С1-СЗ спирты, предпочтительно этанол с 10 % содержанием воды (масс.)). Затем очищенный раствор салицилатов насосом 19 поступает в вакуумный испарительный аппарат 20. Пары растворителя конденсируются в теплообменнике 21, собираются в емкости 22 и используются вторично для элюирования. Сконцентрированный раствор салицилатов насосом 23 подается в распылительную сушилку 24, и на выходе получаем готовый экстракт салицилатов. Качество сухого экстракта и концентрацию общего салицина определяют с помощью ВЭЖХ.

Выбранные параметры процесса и оборудование для его проведения позволяют изготовить из коры S. acutifolia сухой препарат салицилатов и энтеросорбент микотоксинов. В условиях ООО «Бонитет» получена опытная партия экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов со следующими показателями: для экстракта салицилатов - содержание действующего вещества в пересчете на салицин (C^HigO-,; М,м. 286,3) -¿5,3 %, внешний вид -желтовато-коричневый аморфный порошок; для энтреросорбента микотоксинов - содержание салицилатов менее 1 %, насыпная плотность - 0,9 г/см3, влажность - 7 %, адсорбция Т-2 токсина - 70 %.

В условиях in vivo на белых нелинейных крысах проверена эффективность адсорбирующей способности компонентов коры ивы и шротов по отношению к Т-2 микотоксину. На основе клинических, гематологических, биохимических исследований установлена целесообразность применения этих продуктов как адсорбентов для . профилактики при подостром Т-2 микотоксикозе животных.

Выводы

1. Показано, что кора растений Salix acutifolia в бассейне Средней Волги является эффективным биологическим ресурсом для получения экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов.

2. Среднее содержание салицилатов в коре Salix acutifolia Willd незначительно различается в зависимости от популяции. Концентрация салицилатов в коре однолетних побегов составляет от 4,0 до 9,9 % в зависимости от генотипа и способа экстракции. Коэффициенты вариации содержания салицилатов в коре S. acutifolia внутри разных популяций значительные и колеблются от 21 до 50%, что свидетельствует о возможности для отбора наиболее «продуктивных» особей по изучаемому признаку внутри популяций.

3. Разработан способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и Р-глюканазы (Laminex BG, с активностью 82-105 GCU/g) для гидролиза компонентов клеточной сгенки. Ферментативный гидролиз при расходе ферментного препарата 0,1 % от массы коры, при гидромодуле 1:50 и рН 5,5, в режиме термостатирования (35°С) и перемешивания в течение 9 часов позволил увеличить выход салицилатов на 4-45 %, при этом содержание салицина, главного действующего вещества экстракта, увеличивается минимум на 37 %.

4. Установлено, что кора и шроты ивы обладают способностью адсорбировать микотоксины. Адсорбционные свойства шротов в отношении Т-2 микотоксина зависят от способа предобработки коры при экстракции салицилатов. Высокая адсорбционная способность 72,5 % наблюдается у волокнистой фракции коры ивы, обработанной ферментным комплексом целлюлазы и р-глюканазы. Эффективность энтеросорбента доказана в условиях in vivo на белых нелинейных крысах.

5. Установлен химический состав летучих веществ коры и шрота

5. acutifolia. Летучие вещества представлены альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединений и др. Состав летучих веществ и их концентрация в коре и шроте различны, что и объясняет разную степень их воздействия на физиологию грибов Aspergillus parasiticus.

parasiticus, участвующих в процессах развития (brlA, P-tubulin, veA), синтеза афлатоксинов (aflR, veA, ver-1, omtA) и деацетилирования (hdaA, rpdA) и трансацетилирования (gcn5, MYST 1, MYST 2, MYST 3) гистонов.

7. Разработан технологический регламент на опытное производство экстракта салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры S. acutifolia. Технология основана на ферментативном гидролизе растительного сырья с последующим разделением и сушкой экстракта и шрота.

Практические приложения

1. В технологическом процессе выделения салицилатов целесообразно использовать экстракцию с гидролизом компонентов клеточной стенки коры ферментным комплексом целлюлазы и р-глюканазы.

2. Шрот после экстракции рекомендуется использовать в качестве энтеросорбента для профилактики Т-2 токсикоза в животноводстве и птицеводстве.

3. Летучие вещества коры и шрота S. acutifolia могут использоваться в качестве ингибитора синтеза афлатоксинов Aspergillus parasiticus.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Заявка 053599 Российская Федерация МПК C12Q1/25 (2006.01).

Способ получения экстракта из растений рода Salix / Коптина А.В., Канарский А.В. и др.; заявитель и патентообладатель Марийский гос. техн. унив-т. - 2008141342/13; заявл. 17. 10. 2008; приоритет 17. 10. 2008. - 5 с. (положительное решение о выдаче от 11.02.2010).

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации:

1 1 Коптина, А.В. Межпопуяяционная изменчивость ивы остролистной по продуктивности биомассы и содержанию фенольных компонентов / А.В. Коптина, А.И. Шургин, А.В. Канарский // ИВУЗ. Лесной журнал. - 2008. - № 4. - С. 106-112.

2 Изучение влияния протеолиза дрожжей Saccharomyces cerevisiae на адсорбционные свойства клеточной стенки и качество дрожжевого экстракта. / Р.А. Ахмадышин, А.В. Канарский и др. // Катализ в промышленности. - 2008. - № 4. - С. 41-46.

3 Адсорбция 7-2 микотоксина некрахмалистыми полисахаридами / З.А. Канарская, A.B. Канарский и др. // Хранение и переработка, сельхозсырья. - 2009. - № 4. - С. 58-60.

4 Эффективность адсорбции Т-2 микотоксина корой ивы Salix acutifolia / A.B. Коптина, А.И. Шургин и др. // ИВУЗ «Лесной журнал». -2009.-№6.-С. 146-151.

5 Коптина, A.B. Использование коры Salix acutifolia (Salicaceae) для получения салицилатов / A.B. Коптина, А.И. Шургин, A.B. Канарский // Растительные ресурсы. - 2010. - Вып. 1. - С. 67-71.

Публикации в иных изданиях:

6 Коптина, A.B. Перспективы воспроизводства и комплексного использования ивовых плантаций с повышенным содержанием биологически активных веществ /A.B. Коптина, A.B. Канарский, А.И. Шургин, II Пути рационального воспроизводства, использования и охраны лесных экосистем в зоне хвойно-широколиственных лесов. Сборник научных чтений, посвященный 70-летию Заслуженного лесовода России, доктора с.-х. наук профессора Аглиуллина Ф. В. -Чебоксары, 2005. - С. 233.

7 Разработка рациональных способов экстракции углеводородов из почв при оценке эффективности биоремедиации / A.B. Коптина, E.H. Семенова и др. II Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы Третьего Московского международного конгресса. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д. И. Менделеева,,2005. -Ч.2.-С.31.

8 Коптина, A.B. Перспектива воспроизводства растений ивы с повышенным содержанием салицилатов / A.B. Коптина, А.И. Шургин // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы научно-практической конференции в рамках международной научно-образовательной школы-конференции по биоинженерии и приложениям. - М.: Инноватика, 2007. - С. 40-41

9 Коптина, А.В, Межпопуляционная изменчивость ивы остролистной (Salix acutifolia) в бассейне Средней Волги / A.B. Коптина, А.И. Шургин, Е.А. Лобанова // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: Материалы X Международной научной конференции. - Красноярск: СибГТУ, 2007. - С. 36 - 39. ' '

10 Коптина, A.B. Рациональная технология воспроизводства ресурсов ивы остролистной с повышенной продуктивностью салицилатов / A.B. Коптина, Р.В. Сергеев, А.И. Шургин // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». - Звенигород, 2008. - С. 194.

11 Willow bark as a raw material for phytotherapy / A. Koptina et al. // Proceeding of the 12th International Congress 'Phytopharm 2008'. - Saint-Petersburg, 2008. - P. 67.

12 Содержание салицина в экстрактах коры ивы Salix acutifolia / A.B. Коптина и др. // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов V Всероссийской научной конференции. -Сыктывкар-Уфа, 2008. - С. 160.

13 Разработка технологии микроклонального размножения растений рода Salix для получения биологически активных веществ / A.B. Коптина, Р.В. Сергеев, А.И. Шургин // Материалы докладов X Международного симпозиума «Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование». -Сыктывкар, 2008. - С. 93-94.

14 Sergeev, R.V. Propagation in vitro of willow for salicylates production // R.V. Sergeev, A.V. Koptina, A.I. Shurgin // Proceeding of the 12th International Congress 'Phytopharm 2008'. - Saint-Petersburg, 2008. -P. 117.

15 Коптина, A.B. Современное состояние проблемы получения салицина в мировой практике / A.B. Коптина // XI Вавииовские чтения. Национальные проекты России как фактор её безопасности и устойчивого развития в глобальном мире: Материалы постоянно действующей Всероссийской междисциплинарной научной конференции с международным участием. - Йошкар-Ола, 2008. - С. 267-268.

16 Рациональная технология использования растительного сырья ивы с целью получения биологически активных веществ / A.B. Коптина, A.B. Канарский, А.И. Шургин // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов Международной научной студенческой конференции по естественным и научным дисциплинам: в 3 частях. -Ч. 3. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2008. - С. 142-143.

17 Размножение in vitro высокопродуктивных генотипов Salix для создания плантаций на салицин / A.B. Коптина, Е.А. Лобанова и др. // Материалы конгресса "Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»". - Москва, 2009. -Т. 1 - С. 197-198.

18 Разработка технологии получения экстракта из растений семейства Salicaceae / A.B. Коптина, Н.С. Масленникова и др. // Научному прогрессу - творчество молодых: сборник материалов Международной научной студенческой конференции по естественным и научным

дисциплинам: в 3 частях. - Ч. 3. - Йошкар-Ола: Марийский государственный технический университет, 2009. - С. 63.

19 Сергеев, Р.В. Микроклональное размножение Salix для плантационного выращивания на салицин / Р.В. Сергеев, А.В. Коптина, А.И. Шургин // Матер1али I М1жнародноТ науково'1 конференцш студентов, acnupamiB та молодих учених. - Донсцьк, 2009.-Т.2.-389-390.

20 Сорбционная активность энтеросорбентов на основе коры ивы при подостром Т-2 микотоксикозе / Е.Ю. Тарасова, М.Я. Тремасов и др. /7 Материалы Международной научно-практической конференции "Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения". - Ульяновск: ГСХА, 2009. - Т.З. - С. 118121.

21 Koptina, A.V. The new method of salycilates extraction / A.V. Koptina, A.I. Shurgin, A.V. Kanarskiy // Proceedings of the 2nd Annual Russian-Korean Conference "Current issues of natural products chemistry and biotechnology". - Novosibirsk, 2010. -P.87.

Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; тел/факс: (495) 526-43-74; E-mail: vnitibp@mail.ru

ООО "Мещера", ИНН 5050006864, М.О., г. Щелково, ул. Свирская, д.8а. Тираж 100. Заказ № 173. 2010г.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Коптина, Анна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1 СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА.

1.1 Биологические и экологические особенности, распространение и применение ивы Salix acutifolia Willd.

1.2 Кора деревьев и области ее применения.

1.3 Биохимический состав коры и листьев ивы.

1.4 Фармацевтические свойства биологически активных веществ из коры ивы.

1.5 Влияние условий выращивания и сушки ивы на состав и количественное содержание салицилатов.

1.6 Способы выделения биологически активных веществ из коры ивы

1.7 Области применения вторичных ресурсов при переработке коры ивы.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.3 Методы исследования.

2.3.1 Методика определения общего салицина методом ВЭЖХ.

2.3.2 Способ экстракции салицилатов сверхкритической флюидной экстракцией углекислым газом.

2.3.3 Способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и р-глюканазы.

2.3.4 Методика определения адсорбционной активности коры и шрота ивы по отношению к Т-2 микотоксину.

2.3.5 Методика определения Т-2 токсина методом ТСХ.

2.3.6 Методика испытания энтеросорбента на основе коры ивы при подостром Т-2 микотоксикозе на белых нелинейных крысах.

2.3.7 Методика определения влияния летучих веществ коры и шрота Salix acutifolia на физиологию Aspergillus parasiticus.

2.3.8 Методика анализа норсолориновой кислоты и афлатоксинов В1, В2, Gl, G2 тонкослойной хроматографией.

2.3.9 Методика анализа летучих веществ коры и шрота ивы методом ГХ-МС.

2.3.10 Методика выделения РНК мицелиальных грибов.

2.3.11 Методика определения уровня транскрипции.

2.3.12 Статистический анализ.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Оценка биоресурсов салицилатов.

3.1.1 Сравнительный анализ содержания салицилатов в различных видах ивы.

3.1.2 Анализ изменчивости Salix acutifolia по доле коры в побегах.

3.1.3 Анализ изменчивости Salix acutifolia по содержанию салицилатов.

3.2 Усовершенствование способов экстракции салицилатов.

3.3 Определение адсорбционных свойств коры и шротов ивы Salix acutifolia по отношению к Т-2 микотоксину.

3.4 Влияние летучих веществ коры и шротов ивы Salix acutifolia на физиологию Aspergillus parasiticus.

4 РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО РЕШЕНИЯ НА ОПЫТНОЕ ПРОИЗВОДСТВО БИОПРОДУКТОВ ИЗ КОРЫ SALIX ACUTIFOLIA.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение биопродуктов из коры ивы Salix acutifolia"

Актуальность темы. В последние годы в развитых странах наблюдается тенденция к увеличению применения лекарственных растений и экстрактов из них взамен синтетических лекарственных препаратов. Важное место среди источников природных БАВ занимают растения ивы (род Salix, семейство Salicaceae). Экстракт коры ивы обладает противовоспалительными, обезболивающими, жаропонижающими свойствами [1-3], применяется при ревматических воспалениях и суставной боли [4-6], ингибирует тромбин [7], обладает противоопухолевыми свойствами [8, 9].

Однако ресурсы имеющихся в России диких популяций ивы по содержанию салицилатов не оценивались, а технологии переработки ивы как лекарственного растения имеют серьезные недостатки. Шроты после экстракции находят применение только как топливо, что не допустимо, так как в них остаются БАВ. В целом это снижает экономическую и экологическую эффективность использования ивы как растительного ресурса.

Известно также, что многие высшие растения содержат метаболиты, обладающие противомикробными свойствами [9], однако совершенно не изучено влияние веществ коры ивы на физиологию микроорганизмов, синтезирующих патогенные для человека и животных токсины. Микотоксины накапливаются в сельхозпродуктах, являются причиной потери урожая и гибели животных. Они передаются по трофической цепи к человеку и способны вызывать сильную интоксикацию.

В связи с этим актуально проведение исследований, направленных на изучение возможности использования биопродуктов растительного происхождения для решения проблем детоксикации.

В соответствии с поставленной целью в задачи исследований входило:

S оценка сырьевых источников салицилатов;

S совершенствование способа выделения салицилатов; определение возможности использования коры и шротов ивы в качестве адсорбентов экотоксинов; исследование влияния летучих веществ коры и шрота ивы на рост, спороношение и синтез афлатоксинов грибами Aspergillus parasiticus.

S разработка технологического решения производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.

Научная новизна работы. Установлено содержание салицилатов в коре взрослых деревьев S. acutifolia - 8,3-11,3 %, в листьях и коре молодых побегов 3,2-7,5 % и 4,0-9,9 % соответственно. Выявлено положительное влияние ферментного комплекса целлюлазы и (3-глюканазы на степень извлечения салицилатов из растительного сырья. Показана эффективность адсорбции корой и шротом ивы Т-2 микотоксина в условиях in vitro и in vivo. Установлено влияние летучих веществ коры и шрота Salix acutifolia, представленных альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединений и др., на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus.

Практическая значимость работы. Рекомендовано использование коры популяций Salix acutifolia в бассейне Средней Волги для получения салицилатов. Предложен эффективный способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и (З-глюканазы из коры Salix acutifolia. Рекомендовано применение коры и шротов ивы в качестве фитосорбентов микотоксинов, которые могут быть использованы в составе кормов для их детоксикации. Летучие вещества коры и шротов Salix acutifolia могут применяться как ингибиторы синтеза афлатоксинов. 7

Разработано технологическое решение производства салицилатов и энтеросорбента микотоксинов из коры Salix acutifolia.

Обоснованность и достоверность результатов работы. Обеспечивается достаточным объемом экспериментального материала, применением современных методов математической статистики, оценкой критериев достоверности средних данных и различий.

Положения, выдвигаемые для защиты:

1. Оценка сырьевых источников для получения салицилатов.

2. Усовершенствованные способы экстракции салицилатов.

3. Установленные адсорбционные свойства коры и шротов ивы в отношении микотоксинов.

4. Установленное влияние летучих веществ коры Salix acutifolia на рост, неполовое спороношение и синтез афлатоксинов Aspergillus parasiticus.

Внедрение результатов работ. Результаты диссертационной работы использованы в научной и образовательной деятельности ГОУ ВПО «Марийский государственный технический университет» при разработке учебно-методических комплексов дисциплин «Биотехнология», «Основы биохимии и ее применение в генетике» и «Основы биотехнологии». Результаты внедрялись при выполнении НИР и ОКР по темам: Выполнение работ по развитию центра коллективного пользования научным оборудованием «Экология, биотехнологии и процессы получения экологически чистых энергоносителей (ЦКП ЭБЭЭ)» (07.03.200731.03.2008); Обеспечение центром коллективного пользования научным оборудованием комплексных исследований в области рационального лесопользования, разработки технологий переработки и получения топлива и энергии из органического сырья (01.04.2008 - 31.03.2009) (приложение 4).

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на международных и всероссийских конференциях и конгрессах: 2-ая Российско-корейская конференция «Современные проблемы химии природных соединений и биотехнологии» (Новосибирск, 2010), «Фитофарм 2008» (Санкт-Петербург, 2008), «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), «VIII Международный салон инноваций и инвестиций» (Москва, 2008), «2-я Биотехнологическая выставка-ярмарка "РосБиоТех-2008"» (Москва, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), «Национальные проекты России как фактор её безопасности и устойчивого развития в глобальном мире» (Йошкар-Ола, 2008), «Пути рационального воспроизводства, использования и охраны лесных экосистем в зоне хвойно-широколиственных лесов» (Чебоксары, 2008), «Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений» (Красноярск, 2007), «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2007) и др. Работа поддержана персональным грантом (стипендией) Президента Российской Федерации для стажировки за рубежом (Приказ Федерального агентства по образованию (Рособразование) №350 от 18.04.2008) и грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К»; награждена большой золотой медалью и дипломом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008» (за разработку способа получения экстракта из растений семейства Salicaceae); дипломами VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (за разработку способа получения салицина) и биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (за достижения в области биотехнологии и возобновляемой энергетики) (приложение 5). 9

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, 5 приложений, содержит 21 таблицу и 22 рисунка. Список использованной литературы включает 212 наименований (в т.ч. 154 зарубежных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Коптина, Анна Владимировна

выводы

По результатам проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы:

2. Среднее содержание салицилатов в коре Salix acutifolia Willd. незначительно различается в зависимости от популяции. Концентрация салицилатов в коре однолетних побегов составляет от 4,0 до 9,9 % в зависимости от генотипа и способа экстракции. Коэффициенты вариации содержания салицилатов в коре S. acutifolia внутри разных популяций значительные и колеблются от 21 до 50%, что свидетельствует о возможности для отбора наиболее «продуктивных» особей по изучаемому признаку внутри популяций.

3. Разработан способ экстракции салицилатов с использованием ферментного комплекса целлюлазы и (3-глюканазы (Laminex BG, с активностью 82-105 GCU/g) для гидролиза компонентов клеточной стенки. Ферментативный гидролиз при расходе ферментного препарата 0,1 % от массы коры, при гидромодуле 1:50 и рН 5,5, в режиме термостатирования (35°С) и перемешивания в течение 9 часов позволил увеличить выход салицилатов на 4-45 %, при этом содержание салицина, главного действующего вещества экстракта, увеличивается минимум на 37 %.

4. Установлено, что кора и шроты ивы обладают способностью адсорбировать микотоксины. Адсорбционные свойства шротов в отношении Т-2 микотоксина зависят от способа предобработки коры при экстракции салицилатов. Высокая адсорбционная способность (72,5 %) наблюдается у волокнистой фракции коры ивы, обработанной ферментным комплексом целлюлазы и р-глюканазы. Эффективность энтеросорбента доказана в условиях in vivo на белых нелинейных крысах.

5. Установлен химический состав летучих веществ коры и шрота S. acutifolia. Летучие вещества представлены альдегидами, кетонами, производными фурана, фенольных соединений и др. Состав летучих веществ и их концентрация в коре и шроте различны, что и объясняет разную степень их воздействия на физиологию грибов Aspergillus parasiticus.

6. Установлено, что под влиянием летучих компонентов коры и шрота S. acutifolia увеличивается рост A. parasiticus В62 на 18 % и спорообразование на 32 % и 99 % соответственно, ингибируется синтез норсолориновой кислоты и афлатоксинов Bl, В2, Gl, G2. Летучие вещества коры ивы S. acutifolia адсорбируются мицелием A. parasiticus В62 и влияют на накопление транскриптов генов A. parasiticus, участвующих в процессах развития (brlA, P-tubulin, veA), синтеза афлатоксинов (aflR, veA, ver-1, omtA) и деацетилирования (hdaA, rpdA) и трансацетилирования (gcn5, MYST 1, MYST 2, MYST 3) гистонов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Коптина, Анна Владимировна, Щёлково

1. Marz, R.W. Willow bark extract-effects and effectiveness. Status of current knowledge regarding pharmacology, toxicology and clinical aspects / R.W. Marz, F. Kemper // Wien Med Wochenschr, 2002. - V. 152. - P. 354-359.

2. Кортиков, B.H. Справочник лекарственных растений / B.H. Кортиков, А.В. Кортиков. Ростов /нД: "Издательский Дом "Проф-Пресс", 2005. -800 с.

3. Юрьев, К.Л. Новый противовоспалительный фитопрепарат Ассаликс: «назад в будущее» / К.Л. Юрьев // Украшський медичний часопис, 2005. -№. 4(48).-С. 113-131.

4. Treatment of low back pain with a herbal or synthetic anti-rheumatic: a randomized controlled study. Willow bark extract for low back pain / S. Chrubasik, O. Kunzel et al. // Rheumatology (Oxford), 2001. - V. 40. -P. 1388-1393.

5. Potential economic impact of using a proprietary willow bark extract in outpatient treatment of low back pain: an open non-randomized study / S. Chrubasik, O. Kunzel et al. // Phytomedicine, 2001. - V. 8. - P. 241-251.

6. Treatment of low back pain exacerbations with willow bark extract: a randomized double-blind study / S. Chrubasik, E. Eisenberg et al. // Am J Med, -2000.-V. 109.-P. 9-14.

7. Inhibition activities of natural products on serine proteases / A. Jedinak, T. Maliar et al. // Phytother Res, 2006. - V. 20. - P. 214-217.

8. The effect of willow leaf extracts on human leukemic cells in vitro / H.A. El-Shemy, A.M. Aboul-Enein et al. // J Biochem Mol Biol, 2003. - V. 36. -P. 387-389.

9. Афонин А.А. Ивы (Salix, Willows, Weiden) систематика, экология, генетика и селекция, изменчивость ив в природе, культуры ивы. URL: http://afonin-59-salix.narod.ru/ (дата обращения: 19.11.2009).

10. Ива. Willow. Род Salix // Дерево.ЬШ, 2006. - №. 4. - С. 28-32.

11. Булыгин, Н.Е. Дендрология / Н.Е. Булыгин, В.Т. Ярмишко. М.:МГУЛ, 2001.-528 с.

12. Кулагин, А.Ю. Ивы: техногенез и проблемы оптимизации нарушенных ландшафтов / А.Ю. Кулагин. Уфа: Гилем, 1998. - 193 с.

13. Полубояринов, О.И. Качество древесины ивы и возможности ее использования / О.И. Полубояринов // Лесное хозяйство, 1999. - №. 4. -С. 29-30.

14. Васильев, С.Н. Фенольные экстрактивные вещества видов рода Picea А. Dietr. / С.Н. Васильев, В.И. Рощин, Н.А. Артемкина // Растительные ресурсы, 1999. - №. 35(2). - С. 15-31.

15. Житков, А.В. Утилизация древесной коры / А.В. Житков. М.: Лесная промышленность, 1985.- 136с.19Балакин, А.Г. Использование отходов древесины и отработанных щелоков / А.Г. Балакин, А.И. Карнозов. М.: ЦНИИТЭИМС, 1991. - 24 с.

16. Wood and Cellulose Chemistry / Edited by D. N.-S.Hon, N. Shkiraishi, M. Dekker. New York and Basel, 1991. - 1020 c.

17. Кислицын, A.H. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства и применение / А.Н. Кислицын // Химия древесины, 1994. -№.3.-С. 3-28.

18. Демченко, Е.А. Осиновая кора и возможности ее использования / Е.А. Демченко, В.Б. Некрасова // Лесохимия и подсочка. Экспресс-информация, 1978.-№. 9.-С. 20.

19. Фаустова, Н.М. Химический состав коры и древесины осины Populus tremula L.: автореферат, канд. хим. наук 05.21.03 / Фаустова Наталья Михайловна. Санкт-Петербург, 2005. - 20 с.

20. Pharmaceutical aspects of the use of willows in herbal remedies / B. Meier, O. Sticher et al. // Planta Med, 1988. - V. 54. - P. 559-560.

21. Efficacy and safety of willow bark extract in the treatment of osteoarthritis and rheumatoid arthritis: results of 2 randomized double-blind controlled trials / C. Biegert, I. Wagner et al. //J Rheumatol, 2004. - V. 31. - P. 2121-2130.

22. Григорюк, Г.П. Кора хвойных потенциальный источник продукции для народного хозяйства / Г.П. Григорюк, И.И. Сластников // Современные проблемы лесохимии. Сборник трудов ЦНИИЛХИ. Н.Новгород., - 1992. -С. 73-81.

23. Дейнеко, И.П. Окислительный аммонолиз древесной коры / И.П. Дейнеко, И.В. Дейнеко, Л.И. Корнилова // ЖПХ, 2002. - №. 75(3). -С. 302-305.

24. Скриган, А.И. Исследование фенольных гликозидов и флаваноидов ивовой коры / А.И. Скриган, И.И. Винокуров // Исследование природных и синтетических полимерных материалов и их использование, 1970. - С. 3745.

25. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: Учеб. пособие / Под. ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. СПб.: СпецЛит, 2004. - 765 с.

26. Биологически активные вещества растительного происхождения. В 3 т., Т. 1: А-К / М.: Наука, 2001. - 350 с.

27. Julkunen-Tiitto, R. The effect of the sample preparation method of extractable phenolics of salicaceae species / R. Julkunen-Tiitto, J. Tahavanainen // Planta Med, 1989. - V. 55. - P. 55-58.

28. HPLC-MS/MS analysis of willow bark extracts contained in pharmaceutical preparations / B. Kammerer, R. Kahlich et al. // Phytochem Anal, 2005. -V. 16.-P. 470-478.

29. Phenolic compounds of Salix acutifolia bark / G.G. Zapesochnaya, V.A. Kurkin, et al. // Chemistry of Natural Compounds, 2002. - V. 38(4). - P. 314318.

30. Phenolic extractives in Salix caprea wood and knots / S.P. Pohjamo et al. // Phytochemistry, 2003. - V. 63. - P. 165-169.

31. Словарь ботанических терминов / Под общ. ред. И.А. Дудки. Киев: Наук, думка, 1984. - 308 с.36Zenk, М.Н. Pathways of salycyl alcohols and salicin formation in Salix purpurea L. / M.H. Zenk // Phytochemistry, 1967. - V. 6. - P. 245-252.

32. Arbutin, salicin: the possibilities of their biotechnological production / J. Duskova, J. Dusek et al. // Ceska Slov Farm, 2005. - V. 54. - P. 78-81.

33. Ruuhola, T.M. Salicylates of intact Salix myrsinifolia plantlets do not undergo rapid metabolic turnover / T. Ruuhola, R. Julkunen-Tiitto // Plant Physiol, 2000. - V. 122. - P. 895-905.

34. The biosynthesis of hydroxybenzoic acids in higher plants / S. El-Basyouni, D. Chen et al. // Phytochemistry, 1964. - V. 3. - P. 485-492.

35. Ellis, B.E. The "NM-shift" during aromatic ortho-hydroxylation in higher plants / B.E. Ellis, N. Amrhein // Phytochemistry, 1971. - V. 10. - P. 30693072.

36. Pinto, S.S. Calorimetric studies on the phenolic glycoside D(-)-salicin / S.S. Pinto, H.P.Diogo // J Pharm Sci, 2008. - V. 97. - P. 5354-5362.

37. Phenolic compounds of willow bark as deterrence against feeding by mountain hare / J. Tahvanaine, E. Helle et al. // Oecologia, 1985. - V. 65. -P. 319-323.

38. Clausen, T.P. A simple method for the isolation of salicortin, tremulacin, and tremuloiden from quaking aspen (Populus tremuloides) / T.P. Clausen,

39. T.P.Evans, P.B. Reichardt // Journal Natural Products, 1989. - V. 52(1). -P. 207-209.

40. Ecological effects of salicin at three trophic levels: new problems from old adaptations / J.T. Smiley, J.M. Horn et al. // Science, 1985. - V. 229. - P. 649651.

41. Ruuhola, T. Trade-off between synthesis of salicylates and growth of micropropagated Salix pentandra / T. Ruuhola, R. Julkunen-Tiitto // J Chem Ecol, 2003. - V. 29. - P. 1565-1588.

42. Tiitto etal.pdf (дата обращения: 12.12.2009).

43. Herms, D.A. The dilemma of plants: To grow or defend / D.A. Herms, WJ. Mattson // Q. Rev. Biol., 1992. - V. 67. - P. 283-335.

44. Ruuhola, T. Dynamics of salicylates in willows and its relation to herbivory: PhD Dissertations in Biology / T. Ruuhola. University of Joensuu, 2001. -138 p.

45. Coley, P.D. Resource availability and plant antiherbivore defense / P.D. Coley, J.P. Bryant, F.S. Chapin // Science, 1985. - V. 230. - P. 895-899.

46. Hwang, S.-Y. Clonal variation in foliar chemistry of aspen: Effects on gypsy moths and forest tent caterpillars / S.-Y. Hwang, R.L. Lindroth // Oecologia, -1997.-V. 111.-P. 99-108.

47. Hakulinen, J. Nitrogen-induced reduction in leaf phenolic level is not accompanied by increased rust frequency in a compatible willow {Salixmyrsinifolid)-Melampsora rust infection / J. Hakulinen // Plant Physiol., 1998. -V. 102.-P. 101-110.

48. Hakulinen, J. Does nitrogen fertilization have an impact on the trade-off between willow growth and defensive secondary metabolism? / J. Hakulinen, R. Julkunen-Tiitto, J. Tahvanainen // Trees, 1995. - V. 9. - P. 235-240.

49. Haukioja, E. Biosynthetic origin of carbon-based secondary compounds: Cause of variable responses of woody plants to fertilization? / E. Haukioja, V. Osslpov // Chemoecology, 1998. - V. 8. - P. 133-139.

50. Delayed inducible resistance in mountain birch in response to fertilization and shade / K. Ruohomaki, F.S. Chapin et al. // Ecology, 1996. - V. 27. -P. 2302-2311.

51. The cost of antiherbivore defense: An evaluation of some ecological and physiological factors / I. Skogsmyr, T. Fagerstrom et al. // Oikos, 1992. -V. 64.-P. 451-457.

52. Jones, C.G. A protein competition model of phenolic allocation / C.G. Jones, S.E. Hartley // Oilws, 1999. - V. 86. - P. 27-44.

53. Физиология растений: Учебник для студ. вузов / Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко и др.; Под ред. И.П. Ермакова. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 640 с.

54. Зузук Б.М., Куцик Р.В. и др. Ива белая Salix alba L. (Аналитический обзор) // Провизор, 2005. - №. 16. URL: http://www.provisor.com.ua/archive/2005/Nl 6/art27.php (дата обращения: 13.10.2009).

55. Elwood, Р.С. Aspirin: past, present and future / P.C. Elwood // Clin Med, -2001.-V. l.-P. 132-137.

56. Fleming, L.W. A medical bouquet. Poppies, cinchona and willow / L.W. Fleming // Scott Med J, 1999. - V. 44. - P. 176-179.

57. Lafont, O. From the willow to aspirin / O. Lafont // Rev Hist Pharm (Paris), -2007.-V. 55.-P. 209-216.

58. Levesque, H. Aspirin throughout the ages: a historical review / H. Levesque, O. Lafont // Rev Med Interne, 2000. - V. 21 Suppl 1. - P. 8s-17s.

59. The historical analysis of aspirin discovery, its relation to the willow tree and antiproliferative and anticancer potential / J.G. Mahdi, A.J. Mahdi et al. // Cell Prolif, 2006. - V. 39. - P. 147-155.

60. ESCOP monographs on the medicinal uses of plant drugs / Fascicule 4, 1997.

61. Willow bark extract and aspirin — their potential for gastric injury in mice and other toxicity aspects. / E.I. Dabrowska-Zamojcin, A. Glinko et al. // Focus Altera. Complement. Ther., 2002. - V. 7(91).

62. Fotsch, G. The biotransformation of leiocarposide and salicin phenol glycosides—examples for special consideration of the absorption and metabolism of glycosidic compounds / G. Fotsch, S. Pfeifer // Pharmazie, 1989. - V. 44. -P. 710-712.

63. Biotransformation of phenolglycosides leiocarposide and salicin / G. Fotsch, S. Pfeifer et al. // Pharmazie, 1989. - V. 44. - P. 555-558.

64. Does excretion of secondary metabolites always involve a measurable metabolic cost? Fate of plant antifeedant salicin in common brushtail possum, Trichosurus vulpecula / S. McLean, G.J. Pass et al. // J Chem Ecol, 2001. -V. 27.-P. 1077-1089.

65. Pharmacokinetics of salicin after oral administration of a standardised willow bark extract / B. Schmid, I. Kotter et al. // Eur J Clin Pharmacol, 2001. - V. 57. -P. 387-391.

66. Hostettmann, K. The search for new drugs from higher plants / K. Hostettmann, A. Marston // Chimia, 2007. - V. 61(6). - P. 322-326.

67. Evaluation of salicin as an antipyretic prodrug that does not cause gastric injury / Т. Akao, T. Yoshino et al. // Planta Med, 2002. - V. 68. - P. 714-718.

68. Fiebich, B.L. Effects of an ethanolic salix extract on the release of selected inflammatory mediators in vitro / B.L. Fiebich, S. Chrubasik // Phytomedicine, -2004.-V. 11.-P. 135-138.

69. McCurdy, C.R. Analgesic substances derived from natural products (natureceuticals) / C.R. McCurdy, S.S. Scully // Life Sci, 2005. - V. 78. -P. 476-484.

70. The antagonism by anti-inflammatory analgesics of prostaglandin f 2 alpha-induced contractions of human and rabbit myometrium in vitro / I.D. Smith,

71. D.M. Temple et al. // Prostaglandins, 1975. - V. 10. - P. 41-57.

72. Stewart, W.K. Perthshire pioneer of anti-inflammatory agents (Thomas John Maclagan) / W.K. Stewart, L.W. Fleming // Scott Med J, 1987. - V. 32. -P. 141-146.

73. Phenolic glycosides from Alangium salviifolium leaves with inhibitory activity on LPS-induced NO, PGE(2), and TNF-alpha production / M.H. Tran, H.D. Nguyen et al. // Bioorg Med Chem Lett, 2009. - V. 19. - P. 4389-4393.

74. Effect of salicis cortex extract on human platelet aggregation / N. Krivoy,

75. E. Pavlotzky et al. // Planta Med, 2001. - V. 67. - P. 209-212.

76. Enzymatic synthesis and anti-coagulant effect of salicin analogs by using the Leuconostoc mesenteroides glucansucrase acceptor reaction / E.S. Seo, J.H. Lee et al. // J Biotechnol, 2005. - V. 117. - P. 31-38.

77. Alternative medicine. Willow bark for low back pain / Alternative medicine. Willow bark for low back pain // Harv Health Lett, 2000. - V. 26. - P. 3.

78. Chrubasik, S. Pain management with herbal antirheumatic drugs / S. Chrubasik, S. Pollak

79. Wien Med Wochenschr, 2002. - V. 152. - P. 198-203.

80. Herbal medicine for low back pain / J.J. Gagnier, M. van Tulder et al. // Cochrane Database Syst Rev, 2006. - P. CD004504.

81. Kaiser, H. From the plant to chemistry—the early history of "rheumatic medication" / H. Kaiser // Z Rheumatol, 2008. - V. 67. - P. 252-262.

82. Efficacy and tolerability of a standardized willow bark extract in patients with osteoarthritis: randomized placebo-controlled, double blind clinical trial / B. Schmid, R. Ludtke et al. // Phytother Res, 2001. - V. 15. - P. 344-350.

83. Effectiveness and tolerance of standardized willow bark extract in arthrosis patients. Randomized, placebo controlled double-blind study / B. Schmid, R. Ludtke et al. // Z Rheumatol, 2000. - V. 59. - P. 314-320.

84. Snead, M.W. T.J. Maclagan and the treatment of rheumatic fever with salicin / M.W. Snead, J.K. Aikawa // AMA Arch Intern Med, 1958. - V. 101. - P. 9971004.

85. A systematic review on the effectiveness of willow bark for musculoskeletal pain / J.E. Vlachojannis, M. Cameron et al. // Phytother Res, 2009. - V. 23. -P. 897-900.

86. Wagner, I. Salicin and treatment of rheumatic diseases /1. Wagner, L. Heide // J Rheumatol, 2003. - V. 30. - P. 1125.

87. Validated HPTLC methods for the determination of salicin in Salix sp. and of harpagoside in Harpagophytum corrected. procumbens / S. Wagner, A. Urena et al. // J Pharm Biomed Anal, 2008. - V. 48. - P. 587-591.

88. Constabel, C.P. A survey of herbivore-inducible defense proteins and phytochemicals / C.P. Constabel // Induced Plant Defenses against Pathogens and Herbivores. Biochemistry, Ecology and Agriculture., 1999. - P. 137-166.

89. Willow bark extract (BN01455) and its fractions suppress growth and induce apoptosis in human colon and lung cancer cells / K. Hostanska, G. Jurgenliemk et al. // Cancer Detect Prev, 2007. - V. 31. - P. 129-139.

90. Influence of willow bark extract on cyclooxygenase activity and on tumor necrosis factor alpha or interleukin 1 beta release in vitro and ex vivo / I. Wagner, C. Greim et al. // Clin Pharmacol Ther, 2003. - V. 73. - P. 272-274.

91. Marz, R.W. Willow bark extract—effects and effectiveness. Status of current knowledge regarding pharmacology, toxicology and clinical aspects / R.W. Marz, F. Kemper // Wien Med Wochenschr, 2002. - V. 152. - P. 354359.

92. Isolation of salicin derivatives from Homalium cochinchinensis and their antiviral activities / T. Ishikawa, K. Nishigaya et al. // J Nat Prod, 2004. -V. 67.-P. 659-663.

93. Allergy-preventive phenolic glycosides from Populus sieboldii / Y. Ogawa, H. Oku et al. // J Nat Prod, 2006. - V. 69. - P. 1215-1217.

94. Willow bark extract: the contribution of polyphenols to the overall effect / A. Nahrstedt, M. Schmidt et al. // Wien Med Wochenschr, 2007. - V. 157. -P. 348-351.

95. Riddle, J.M. History as a tool in identifying «new» old drugs / J.M. Riddle // Adv. Exp. Med. Biol., 2002. - V. 505. - P. 89-94.

96. Чекман, I.C. Юпшчна фгготерашя / I.С. Чекман. A.C.K., Кш'в, 2003. -552 с.

97. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Н.Н. Третьяков, Е.И. Кошкин, Н.М. Макрушин и др.; Под ред. Н.Н. Третьякова. М.: КолосС, 2005. - 656 с.

98. Mechanisms involved in the anti-inflammatory effect of a standardized willow bark extract / M.T. Khayyal, M.A. El-Ghazaly et al. // Arzneimittelforschung, 2005.vV. 55. - P. 677-687.

99. Nyman, T. Chemical variation within and among six northern willow species / T. Nyman, R. Julkunen-Tiitto // Phytochemistry, 2005. - V. 66. -P. 2836-2843.

100. The tissue variation of self-defensive phenolics in three willow (salicaceae) species / R. Julkunen-Tiitto, J. Tahavanainen et al. // Planta.Med, -1988.-V. 54.-P. 569-570.

101. The effect of genotype and cultivation method on the total salicylate yield of dark-leaved willows (Salix myrsinifolia) / S. Heiska, M. Rousi et al. // Planta Med, 2005. - V. 71. - P.l 134-1139.

102. Long-term experimental warming, shading and nutrient addition affect the concentration of phenolic compounds in arctic-alpine deciduous and evergreen dwarf shrubs / A.H. Hansen, S. Jonasson et al. // Oecologia, 2006. - V. 147. -P. 1-11.

103. Ronnberg-Wastlund, A.C. Genetics of breeding characters with possible effects on biomass production in Salix viminalis (L.) / A.C. Ronnberg-Wastlund, U. Gullberg // Theoretical and Applied Genetics, 1999. - V. 98. - P. 531-540.

104. Stace, C.A. Plant taxonomy and biosystematics / C.A. Stace. London: Edward Arnold Ltd, 1980.

105. Julkunen-Tiitto, R. Testing the effects of drying methods on willow flavonoids, tannins, and salicylates / R. Julkunen-Tiitto, S. Sorsa // J Chem Ecol,- 2001. V. 27.-P. 779-789.

106. Lindroth, R.L. Preservation of Salicaceae leaves for phytochemical analyses; further assessment / R.L. Lindroth, P.A. Koss // Journal of Chemical Ecology, 1996. - V. 22. - P. 765-771.

107. Markham, K.R. Techniques of Flavonoid Identification / London: Academic Press. 1982. - 16 p.

108. Keinanen, M. Effect of sample preparation method on birch (Betula pendula Roth) leaf phenolics / M. Keinanen, R. Julkunen-Tiitto // J. Agric. Food Chem., 1996. - V. 44. - P. 2724-2727.

109. Thieme, H. Die Phenolglycoside der Salicaceen / H. Thieme // Pharmazie,- 1965.-V. 20.-P. 570-574.

110. Julkunen-Tiitto, R. The enzymatic decomposition of salicin and its derivatives obtained from Salicaceae species / R. Julkunen-Tiitto, B. Meier // J. Nat Prod, 1992. - V. 55. - P. 1204-1212.

111. Julkunen-Tiitto, R. Phenolic constituents in the leaves of northern willows: Methods for the analysis of certain phenolics / R. Julkunen-Tiitto // J. Agric. Food. Chem, 1985. - V. 33. - P. 213-217.

112. Orians, C.M. Preserving leaves for tannin and phenolic glycoside analyses: A comparison of methods using three willow taxa / C.M. Orians // J. Chem. Ecol, 1995. - V. 21. - P. 1235-1243.

113. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / М.: Медицина, 1989. - 400 с.

114. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения / М.Н. Запрометов. М.: Наука, 1993.-271 с.

115. Determination of salicin in extract of willow bark by high performance liquid chromatography / L.S. Li, W.D. Huang et al // Se Pu, 2001. - V. 19. -P. 446-448.

116. Steinegger, E. Analytical and biological studies of salicacean drugs, especially salicin. I. Identification, isolation and analysis methods / E. Steinegger, H. Hovel // Pharm Acta Helv, 1972. - V. 47. - P. 133-141.

117. Муравьев, И.А. Технология лекарственных средств / И.А. Муравьев. М.: Медицина, 1980. - 234 с.

118. Sticher, О. Natural product isolation / О. Sticher // Nat Prod Rep, 2008. -V. 25.-P. 517-554.

119. Chromatographic analysis of salicylic compounds in different species of the genus Salix / L. Poblocka-Olech, A.M. van Nederkassel et al. // J Sep Sci, -2007.-V. 30.-P. 2958-2966.

120. Optimization and comparison of five methods for extraction of coniferyl ferulate from Angelica sinensis / J.J. Xie, J. Lu et al. // Molecules, 2009. -V. 14.-P. 555-565.

121. Extraction of oil from wheat germ by supercritical C02 / A. Piras, A. Rosa et al. // Molecules, 2009. - V. 14. - P. 2573-2581.

122. Pat. WO 2007/006384 Al, A61K 36/76, A61P 19/02 (2006.01). Salix extract, its use and formulations containing it / INDENA S.P.A. IT/IT.; Viale Ortles, 12,1-20132 Milano (IT). 14.07.2005; 14.06.2006. - 11 c.

123. Semi-industrial isolation of salicin and amygdalin from plant extracts using slow rotary counter-current chromatography / Q. Du, G. Jerz et al. // J Chromatogr A, 2005. - V. 1074. - P. 43-46.

124. Винокуров, И.И. Исследование гликозидов и углеводного состава некоторых видов ивы / И.И. Винокуров, А.И. Скриган // Органический катализ, 1970. - С. 3-14.

125. Эрнст, JI.K. Кормовые продукты из отходов леса / JI.K. Эрнст.- М.: Лесная промышленность, 1982. 153 с.

126. Пат. 2329098 Российская Федерация МПК5 B01J20/24, C02F1/28

127. Пат. 2253511 Российская Федерация МПК 7 B01J20/24, B01J20/30.

128. Кельцов, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцов. М.: Химия, 1984. - 19 с.

129. Пат. 2031849 Российская Федерация МКИ6 C02F1/28, B01J20/20.

130. Способ извлечения нефти и нефтепродуктов из воды / Гафаров И.Г., Садыков А.Н. и др.; заявители Гафаров И.Г., Садыков А.Н. и др.; патентообладатель Гафаров И.Г. №2031849; заяв. 18.12.91.; опубл. 27.03.95, - 2 с.

131. Пат. 2355187 Российская Федерация МПК5 А23К1/14, А23К1/16.

132. Кормовая добавка для сельскохозяйственной птицы и животных / Полянский М. М.; заявитель и патентообладатель Полянский М. М. -№2355187; заявл. 28.09.07; опубл. 20.05.09, 5 с.

133. Andersen, M.R. Current status of systems biology in Aspergilli / M.R. Andersen, J. Nielsen // Fungal Genet Biol, 2009. - V. 46 Suppl 1. - P. SI80-190.

134. Molecular genetic analysis and regulation of aflatoxin biosynthesis / D. Bhatnagar, K.C. Ehrlich, Т.Е. Cleveland // Appl Microbiol Biotechnol, 2003. -V. 61.-P. 83-93.

135. Simultaneous determination of deoxynivalenol, zearalenone, and their major masked metabolites in cereal-based food by LC-MS-MS / O. Vendl, F. Berthiller et al. // Anal Bioanal Chem, 2009. - V. 395. - P. 1347-1354.

136. Pestka, J.J. Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis / J.J. Pestka // Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 2008. - Y. 25. - P. 1128-1140.

137. Induction of suppressors of cytokine signaling by the trichothecene deoxynivalenol in the mouse / C.J. Amuzie, J. Shinozuka, J.J. Pestka // Toxicol Sci, 2009. - V. 111. - P. 277-287.

138. Влияние микотоксинов на продуктивность птицы / Б. Бессарабов, И. Мельникова, С. Садчиков // Животноводство Росии, 2009. - Р. 23-24.

139. A survey of Т-2 toxin, ochratoxin, and aflatoxin for their effects on the coagulation of blood in young broiler chickens / J. A. Doerr, W.E. Huff et al. // Poult Sci, 1974. - V. 53. - P. 1728-1734.

140. The anemia caused by aflatoxin / H.T. Tung, F.W. Cook et al. // Poult Sci, 1975.-V. 54.-P. 1962-1969.

141. The micotoxin blue book / Edited by D.E. Diaz. Nottingham: Nottingham University Press, 2005. - 349 p.

142. Ахмадышин, P.А. Получение селективного адсорбента микотоксинов из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae: автореферат, канд. техн. наук 03.00.23 / Равиль Айратович Ахмадышин. 2007. - 19 с.

143. Effects of volatile aldehydes from Aspergillus-resistant varieties of corn on Aspergillus parasiticus growth and aflatoxin biosynthesis / M.S. Wright, D.M. Greene-McDowelle et al. // Toxicon, 2000. - V. 38. - P. 1215-1223.

144. Zeringue, H.J., Bhatnagar, D. Effects of Neem Leaf Volatiles on Submerged Cultures of Aflatoxigenic Aspergillus parasiticus / H.J. Zeringue, D. Bhatnagar // Appl Environ Microbiol, 1994. - V. 60. - P. 3543-3547.115

145. Zeringue, H.J. Aflatoxin production in cultures of Aspergillus flavus incubated in atmospheres containing selected cotton leaf-derived volatiles / HJ. Zeringue, S.P. Jr. McCormick // Toxicon, 1990. - V. 28. - P. 445-448.

146. Effect of soybean volatile compounds on Aspergillus flavus growth and aflatoxin production / Т.Е. Cleveland, C.H. Carter-Wientjes et al. // J Food Sci, -2009. V. 74. - P. H83-87.

147. The effects of selected cotton-leaf volatiles on growth, development and aflatoxin production of Aspergillus parasiticus / D.M.Greene-McDowelle, B. Ingber et al. // Toxicon, 1999. - V. 37. - P. 883-893.

148. Wagner, H. Plant drug analysis. A thin layer chromatography atlas / H. Wagner, S. Bladt. New York: Springer, 2001.-384 p.

149. In vitro degradation of willow salicylates / T. Ruuhola, R. Julkunen-Tiitto et al. // J Chem Ecol, 2003. - V. 29. - P. 1083-1097.

150. Differences in host use efficiency of larvae of a generalist moth, Operophtera brumata on three chemically divergent Salix species / T. Ruuhola, O.P. Tikkanen et al. // J Chem Ecol, 2001. - V. 27. - P. 1595-1615.

151. Крюков, B.C. Применение клиноптилолита для профилактики микотоксикозов / B.C. Крюков., В.В. Крупин., А.Н. Котик // Ветеринария, -1992.-№. 9-12.-С. 28-29.

152. Structural and functional analysis of the nor-1 gene involved in the biosynthesis of aflatoxins by Aspergillus parasiticus / F. Trail, P.K. Chang et al. // Appl. Environ. Microbiol., 1994. - V. 60. - P. 4078-4085.

153. Aspergillus volatiles regulate aflatoxin synthesis and asexual sporulation in Aspergillus parasiticus / L.V.Roze, R.M. Beaudry et al. // Appl Environ Microbiol, 2007. - V. 73. - P. 7268-7276.116

154. Buchanan, R.L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: effect of glucose on activities of various glycolytic enzymes / R.L. Buchanan, D.F. Lewis // Appl Environ Microbiol, 1984. - V. 48. - P. 306-310.

155. Regulation of aflatoxin synthesis by FadA/cAMP/protein kinase A signaling in Aspergillus parasiticus / L.V. Roze, R.M. Beaudry et al. // Mycopathologia, 2004. - V. 158. - P. 219-232.

156. Effect of hexanal vapor on the growth of postharvest pathogens and fruit decay / J. Song, P.D. Hildebrand et al. // J Food Sci, 2007. - V. 72. - P. Ml 08112.

157. The initiation and pattern of spread of histone H4 acetylation parallel the order of transcriptional activation of genes in the aflatoxin cluster / L.V. Roze, A.E. Arthur et al. // Mol Microbiol, 2007. - V. 66. - P. 713-726.

158. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

159. Котов, М.М. Применение биометрических методов в лесной селекции: Учеб. пособие / М.М. Котов, Э.П. Лебедева. Горький, 1977. -120 с.

160. Julkunen-Tiitto, R. A chemotaxonomic survey of phenolics in leaves of northern Salicaceae species / R. Julkunen-Tiitto // Phytochemistry, 1986. -V. 25.-P. 663-667.

161. Pearl, I.A. Phenolic, extractives of Salix purpurea bark / I.A. Pearl, S.F. Darling // Phytochemistry, 1970. - V. 9. - P. 1277-1281.

162. European Pharmacopoeia 6.1 / Council of Europe European (СОЕ) -European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM). BDC, 2007. -310 p.

163. Зайцев, Г.Н. Математический анализ биологических данных. / Г.Н. Зайцев. М.: "Наука", 1991. - 184 с.117

164. Саловарова, В.П. Эколого-биотехнологические основы конверсии растительных субстратов: Учеб. пособие / В.П. Саловарова, Ю.П. Козлов. -Москва: Изд-во РУДН, 2001.-331 с.

165. Т-2 toxin: incidence and toxicity in poultry / M. Sokolovic, V. Garaj-Vrhovac, B. Simpraga // Arh Hig Rada Toksikol, 2008. - V. 59. - P. 43-52.

166. Адсорбция Т-2 микотоксина некрахмалистыми полисахаридами / З.А.Канарская и др. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2009. - №. 1. -С. 15-19.

167. Volatile compounds inhibiting Aspergillus flavus / R.C. Gueldner, D.M. Wilson, A.R. Heidt // J Agric Food Chem, 1985. - V. 33. - P. 411-413.

168. In vitro efficacy of plant volatiles for inhibiting the growth of fruit and vegetable decay microorganisms / I.M.S. Utama, R.B.H. Wills et al. // J Agric Food Chem, 2002. - V. 50. - P. 6371-6377.

169. Interaction with and effects on the profile of proteins of Botrytis cinerea by C6 aldehydes / K. Myung,T.R. Hamilton-Kemp, D.D. Archbold // J Agric Food Chem, 2007. - V. 55. - P. 2182-2188.

170. Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis / J. Yu, P.-K. Chang et al. // Applied and Environmental Microbiology, 2004. - V. - P. 1253-1262.

171. Effects of different organic farming methods on the concentration of phenolic compounds in sea buckthorn leaves / M. Heinaaho, J. Pusenius et al. // J Agric Food Chem, 2006. - V. 54. - P. 7678-7685.

172. Stadelbacher, G.J. Postharvest decay control of apple by acetaldehyde vapor / GJ. Stadelbacher, Y. Prasad // J Amer Soc Hort Sci, 1974. - V. 99. -P. 364-368.

173. Avissar, I. The control of postharvest decay in table grape using acetaldehyde vapors / I. Avissar, E. Pesis // Ann Appl Biol, 1991. - V. 118. -P. 229-237.

174. The use of vinegar vapor to reduce post harvest decay / P.L. Sholberg, P. Haag et al. // HortScience, 2000. - V. 35. - P. 898-903.

175. Wang, C.Y. Maintaining quality of fresh-cut kiwi fruit with volatile compounds / C.Y. Wang, J.G. Buta // Postharv Biol Technol, 2003. - V. 28. -P. 181-186.

176. Evidence implicating the lipoxygenase pathway in providing resistance to soybeans against Aspergillus flavus / D.C. Doehlert, D.T. Wicklow, H.W. Gardner//Phytopathology, 1993. - V. 83. - P. 1473-1477.

177. Inhibitory effect of aflastatin A on melanin biosynthesis by Colletotrichum lagenarium / S. Okamoto, M. Sakurada et al. // Microbiology, -2001.-V. 147.-P. 2623-2628.

178. Molecular cloning, expression profiling, and yeast complementation of 19 b-tubulin cDNAs from developing cotton ovules / X.-C. He, Y.-M. Qin et al. // Journal of Experimental Botany, 2008. - V. 59(10). - P. 2687-2695.

179. Systematic mutational analysis of the yeast b-tubulin gene / R.A. Reijo, E.M. Cooper et al. // Molecular Biology of the Cell, 1994. - V. 5. - P. 29-43.

180. Involvement of a particular species of beta-tubulin (beta 3) in conidial development in Aspergillus nidulans / J.A. Weatherbee, G.S. May // J Cell Biol, 1985.-V. 101.-P. 706-711.

181. Prade, R.A. The Aspergillus nidulans brlA regulatory locus consists of overlapping transcription units that are individually required for conidiophore development / R.A. Prade, W.E. Timberlake // Embo J, 1993. - V. 12. -P. 2439-2447.

182. Interactions of three sequentially expressed genes control temporal and spatial specificity in Aspergillus development / P.M. Mirabito, Т.Н. Adams, W.E. Timberlake // Cell, 1989. - V. 57. - P. 859-868.

183. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism / VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism // Science, -2008. V. 320. - P. 1504-1506.i

184. Calvo, A.M. The VeA regulatory system and its role in morphological and chemical development in fungi / A.M. Calvo // Fungal Genet Biol, 2008. -V. 45.-P. 1053-1061.

185. Yager, L.N.' Early developmental events during asexual and sexual sporulation in Aspergillus nidulans / L.N. Yager // Biotechnology, 1992. -V. 23.-P. 19-41.

186. Molecular biology of aflatoxin biosynthesis / F. Trail, N. Mahanti, J. Linz // Microbiology, 1995. - V.l 41 (Pt 4). - P. 755-765.

187. Genes encoding cytochrome P450 and monooxygenase enzymes define one end of the aflatoxin pathway gene cluster in Aspergillus parasiticus / J. Yu, P.K. Chang et al. // Appl Microbiol Biotechnol, 2000. - V. 53. - P. 583-590.

188. Regulated expression of the nor-1 and ver-1 genes associated with aflatoxin biosynthesis / C.D. Skory, P.K. Chang, J.E. Linz // Appl Environ Microbiol, 1993. - Y. 59. - P. 1642-1646.

189. Fungal secondary metabolism from biochemistry to genomics / Fungal secondary metabolism - from biochemistry to genomics // Nat Rev Microbiol, -2005. - V. 3. - P. 937-947.

190. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis / C.P. Woloshuk, K.R. Foutz et al. // Appl Environ Microbiol, -1994.-V. 60.-P. 2408-2414.

191. Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis / J. Yu, P.K. Chang et al. // Appl Environ Microbiol, 2004. - V. 70. - P. 1253-1262.

192. Ehrlich, K.C. Evolution of the aflatoxin gene cluster / Evolution of the aflatoxin gene cluster // Mycotoxin Research, 2006. - V. 22. - P. 9-15.

193. Elucidation of the functional genomics of antioxidant-based inhibition of aflatoxin biosynthesis / Elucidation of the functional genomics of antioxidant-based inhibition of aflatoxin biosynthesis // Int J Food Microbiol, 2008. -V. 122.-P. 49-60.

194. Secondary chemicals protect mould from fungivory / M. Rohlfs, M. Albert et al. // Biol Lett, 2007. - V. 3. - P. 523-525.

195. Molecular and functional characterization of a second copy of the aflatoxin regulatory gene, aflR-2, from Aspergillus parasiticus / J.W. Cary, J.M. Dyer et al. // Biochim Biophys Acta, 2002. - V. 1576. - P. 316-323.

196. Structure and function of fas-lA, a gene encoding a putative fatty acid synthetase directly involved in aflatoxin biosynthesis in Aspergillus parasiticus / N. Mahanti, D. Bhatnagar et al. // Appl Environ Microbiol, 1996. - V. 62. -P. 191-195.

197. A Fluorogenic Histone Deacetylase Assay Well Suited for High-Throughput Activity Screening shown to be a tumor suppressor gene whose mutation / D. Wegener, F. Wirsching et al. // Chemistry & Biology, 2003. -V. 10.-P. 61-68.

198. Gcn5 and SAGA regulate shelterin protein turnover and telomere maintenance / B.S. Atanassov, Y.A. Evrard et al. // Molecular Cell, 2009. -V. 35. - P. 352-364.

199. Коптина, A.B. Использование коры Salix acutifolia (Salicaceae) для получения салицилатов / A.B. Коптина, А.И. Шургин, A.B. Канарский // Растительные ресурсы, 2010. - № 1. - С. 67-71.

Информация о работе

Коптина, Анна Владимировна
кандидата технических наук
Щёлково, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение биопродуктов из коры ивы Salix acutifolia - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы