Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция и физиолого-биохимическая характеристика штаммов Pseudomonas putida, продуцирующих метионин

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Селекция и физиолого-биохимическая характеристика штаммов Pseudomonas putida, продуцирующих метионин"

министерство ывдицинсюй кташзмссти ссср

всесоюзный шч/ю-ясащяоваъ&ъсюй! институт гене тики и селекции гс-юйшленных микроорглпйздов

На правах рукописи

П О Л О Д И Е Н К О Ольг 1 Борисовна

СЕЛЕКЦИЯ И ФьЗШОГО-ВКОШКЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

штдмшв гштоомж^з ритход. , яродзд^ЖчИХ *

гетюшн -

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ - 03 . СО . 15.

' АВТОРЕФЕРАТ

чиссер.йгош на соискание ученой степени канцицата биологических наук

ЮСШ ■ 1991 '

Работа Е:шо.а?*на в Одесском госу-Т-раменксм университете М!.ил;.Мечвзш®а на .хандре ганетекк и >»олекулярнс & баодогьа • 2 в лабораторгк гаг.ехгаса иелшогтю^двс иактори'] ШЗЗХекетака

Научные руководители: доктор бЕолсгичесмк каук, нрофе сор Владаек Ь;:кодаеют Тонкий,

доглор бко.сотЕЧвсккх наук 5СркЛ #«д?риевзп 1£гганков

.С&тпвалькые о^по.чгиты: доктор баолэютеохпх шу» Ыетоусов Л.!'., ■ доктор ОйдаогЕяесках каук Про-сухе^л В.А.

Двдучое уч^реддвнге - йьег-ктуг бнападз к '¿жзеологик ь«чкроорга-низ;,"® Уп ССОР (Ду:гаю-1;р-0:се)

Запта ^ссерташк состоится " у " «».-'//-Г 1£-Э / г. б _££__ 1 на зассдашн снесаа^зкровайного созета по присуждение-степени хавдадата наук Л.С93."1£.1Я при Всесоазном наз^ко-йсследоваа-едь-с.:о:.'. ш-.огЕ.тэт-е генегшк к селсюда • сромаакенркх иккрооргакиаггоь 1Г3545г г.Носкьа, ДорожккД проезд, д. I.

О диссертацией мсето озк&/.<тл>ся б библиотеке института.

Автореферат разос-ла" " " гА48,% 1951 г,

Уцеей сехрага; ъ спешалкзировелкого совэта тдощз? бкологачсоэзс каух

к ,.„. - В.П.Щербгкош

■л: ь i

OiiilAH ШХШЖУ1к«А TKsCf2*

mi

т., ¿л

-zUi^i тотальность тетоотн : Яриорк?ет в области лроизвэдстьа ами-

коклилov лрккадлегат гжкгоо'кологлчеоко:,'.;; cwneiy, которж прокз-згчвлся болео 6Q& эбтгего объела еялвкиалот. Дуд ряда зг.жполпс-ЛОГ (л«|2£а, Тр80ШК>&, ГХ1У"Л1;.'.::ГОБО:1 SCOJIOIU) ю:фобкодог«ческпй сппт&.> является эишоодес акокомячгаа!. Одкако производство меско-гипа - одной кз гезаиадииос агяшокхсяо?, крайк кеосхэдоу.ой ддя кошаяадой .тазредеятальпостп - в иастоятяез зрскя осуществляется только дорогостоящи зохгчесхя.'. путем б -оргле рапелкгчесхои с;ле~ ci-i. В то ко ярегш потребность в метпо'.ж'е постоянно уволкчхшаот-ся а сзязл с сто использованием в качество' добавки в корм сель-схозсозямствешолЗ швотпкм, в качестве лекярстаогиоге препарата, a ошсю прк проведекп гаушсс ксследоаажй. !.;етком:ь-у, шк и другим негашиггда! аглвошдоокш, отеодется большая роль в реяэ-диг проблем! сеихоеяя байкового д&7ет£та за счет ебогааеняя. пи~

Кэзеогик г/ккробкологлчесяаэ саоссбк получения мзчлолика, оо\готашп?.('. :т способяоскг адахрсоргагкзков к бчолоютеской тршмз-Ере.Фаестворсаа canseза иетшдаа - го?лоакстеЕпа» Одга-ко шшбодеэ эко&огттадо язляб"ся бшскктаз ;гетиок: .па кз npocwec псгавтов углерода и аз osa, ьскычакпий аспатьзоаишо дорогосто-aiEx арздоостзешшков. В тстожюс зреия известен прп«адаю:газче к раг.пл:-жл ро^аи j.aiKp0apr£(H«a.70B ют и (Sseudomonas вр.,Со*>-3iet>üct0Tiu;i glutaalctit» ASCO 21 SOS, Bacillna ae^aterium 371» $ae-udoaonas 7В2Ы я:е{Ьап1са12),СПОСОбкае к ИЗБЫТОЧНОМУ

тетяокаял. Kazáosoe продулпшю'К из жх является с.grata« • laiouai Д.ТСС 21803, акскрегкрутьЯ 3,4 меялоняла. Недостат-

ком дацяого ШсЦ'с-ia является aro суксоаро.^ссть ко треошву,' .тро-флощпя экзогамного вяосешуг трзо/iKHii срзду ^'ъяпвирозаиля. Кроме того, уровень избит одного сяятеоа иотвдшя у c.^dutáel-. он ATOO 21§09 сладком кал дал прадшаввхого производства. По-oí'oJjj* в Матаядое время зозрасч«йт сктуздьность яселодозаняЛ, нанрэвлёйКИЕ ка гонок яяямиав с рэнтабв-ино:: дог-ЪшсробнологА-4SCKPÍS ярл^дглозглотз! протрт/гкшостьа яог/юнжа. Ё последкс •. -годи уедался кн-герес к кпкроорг&ки&лаи рода Peeu-iofconao дзк • эбгоаавк оолзетконеой работы, yvor-ry' слоеаЗствоьглэ гакоилкнко

. результатов многодетна: кссдедоваай! по : аучен&о контроля биосинтеза р;..ца - мзшокисдот, а тахте успешное разваздю методологи? геккой шашерш примокателько к г*шсрооргашшгд8 данного рода.

Исходи из гыпьсказакного, представляется актуальным подучите к изучение генездаческк стабкят нкх мутантов Saeudomoius putidQ , ceocoúelu к избыточному синтезу кетиошга.

Настоящая работа осуществлялась в *хшках хоздоговорных Еаучно-исследэЕательскнх работ кафедры гепетякк и молекулярной бяолопз: Одесского грсушгзерсатета им.й.К.Г.ечкккэва х:о теме "Paopaciosasb метод седекта: сродзптенуов серссодержащих аминокислот по годвадаоитк юасрэортакизиоЕ из родов Poeudoaonao j» Bacillus". Тека в-ьоякялась по заказу ЕВйЗекэтака, государственники регке-грагиокша': & 0104004303.

Цель и зада-г исследований: Цель настоящей работа состояла-■ в получении & .гэучеквд ^кететески стабидьнах мутантов «.putida способных к избыточному сипеэу кетиокша я прсстбзгшицнх сер-споктквнш£ штер^ал. .цля дальнейшей сех^юги .хозяйстз'енпо-пекннх - продуцентов данной аминокислоты. 1л освосе изучения сТл-зкологи-чео:г>: a бкохньигеских свойств полученных яута.чтов предстояло уточнять cyr^c-rBywaKö представления о аркроде сверхсангеза ме-тиокииа у ?. putida Для доотияешя поставленной цель решались

- разработать селекционные приемы вдя, отбора мутантов P.putida, сшсойдах к избыточному <штег7 кетиояша;

- цровесга сравнительную опенку эффективности, методов -езлектш 'в грэдгзнта кокяенграшш ангимет&болнта к ступенчатого отбора;

- с поиоесьо многоступенчато:! селехяхЕ и в градкен'.з концентрации аятаыатлболкта подучить мутанты P.putida , обладающие кзбы-

;.ючяым синтезом кетйоаша;

- изучить роэдл^сго активности некоторых саесцфяоскмис и обикх iJepKCiitOB биосинтеза кетионша у ¿оходйохо .вйаюза ? .futida CIS к ого мутантов; , • ,

' изучить вшсякЕе некоторых .органических добавок и витаминов на -йзс&точш! сйа'сеа'кетконгна у полученных мутантов.

Научвая кзвизна. С использованкэк 'гепетвко-селетвоннш. подходов получены зшшиа г-putlda , способные к избыточному синтез у метеанмиа :< каучеш их культу салъкш к фезиолох'о-бяохкля-чс сказ сьолсиа. р-^ерзыо пеглззыо налети© SOS -ответа у í.putids

о

— —

прд оЬучеаш }'льтрач«а!£в*гок доза;; 13,5 vjlx/i? z ' фектиЕНость обработки jtoü лозоИ дад подучеиял акалэгорезистен-тгага грантов Р.риЫДл . у акадогэрезистсн'шк ктаг.глов P.putida, а отдгяие от неходкого ¡гсгам/а CI5, o£i:apy::<SHa поваленная котив-' носгь ппстаташик- ß -льазн (тастатхэнян- Ь-гопкстеиа-лиаза, дса- . мкЕиррклчя, Е.С,4,4,1.0.), конститутивная экспрессия гена meto и незначительная репрессия-гена raetA з присутствии ме' ионика (5 ;,''.!). Показано влияний пекоторнх шкамщюв п дрожшого экстра» та ла азбиггочннй синтез иетяоняка. Путем ал®ы£якап23 rei;a Уах-Х с штлощыо' рвйом0КЕаят1*о£ сдазоддр рЗСТХ исслодогапо влияние поваленного уровня акгаъаостх ферментов асиартатшпазы (AM:- I -аспар'гат$осул)01ран<у»еразы, S.C .2,7.2.4.) я гомосерпндотадрогейа- . зы ( X -гомоеврик: IMDi L-окспдорэдуктазы, E.G.I.I.I.3.) па бис.-5нктвз мошоивяа у J.puUdr. , Получай итанк, способной аакап-jr;namb з среде кул'ьтпвярованпя до 3,5 нетиокляг и .метко- •

ящхсульТюксвдд.

Практическое,, знамение уг ~?отн определяется язучеккем эффективности ыодаТдпироватюй кетодмкк селекгак атдогорезкетоптдше мутантов в градиента кондептрапга антагметаболагь, созданном в агаве, Зит метод дает возможность ирэодоДеть дштелънооть и труцозшсость многоступенчатого отбора л позволяет в один этап . получать мутанты, устойчивые к высоким концентрациям негэтабо- . визируемого аналога а характеризующиеся избыточно;} рропукнней целевой. аиинокаслотн. Вчявяепо ст?ьулирушее авшнге биотина, 1шрвдо1'сальфос(Тата, тшакокобаламяиа к дрожтввого экстракта на избч'-очнкн биосинтез мотнонаиа у мутанта P.putida 6. Полушм ■ ычамли P»puti4a , сг.особше к избыточному синтезу котионпна.кй-" торио могут бить аспольэовави так яерспактиБпий материал для ' дальнейшей седекшш. ■ • . .

Стоудтута и объем работа;. Диссертация состоит из введения, обзора литература, описания м-зто.цов исследований, изяожеьля результатов,, зкенержен'тож-ш:; исследований и пх обсудешш, затс- • лшепия, шзодов, списка исподьзозашой литературы. .-Работа из- _ лохеиа па 150 страницах машинописного техссга, содер-.жт 21 таблицу И 17 рисунков. .

л'лсс^-тч'я габотн: ;Латетааж дассортахшм дмо:»снн ьа У съезда генетиков к седзгаконоров Украинк (Глев,. 1935), на У съезда Бессоюзного общества 1епетикотз и селэкйионсров лм'Л'.К.Заз.ттова

Шэюза, IS5?), на коя&зрсжаиях молодых ученых Одесского гос-уну.версит„та ^п.ийЛ!.Г.ачкигсога (Одесса, 1937; 1988), ка кокуорен-цш "Проблещи инкробногс синтеза вктакзшэв я их производишь" (Таякект, IS90;.

.. Птбликаттик: По теме дгссеруаша:' опубликовано сеть работ.

Вгепоег.ке; 1ltsj.ii.: , скособжй к нзбиточког/у СЕпезу меодипша, P.putida 25 переда; и используется в гаучно-асследоватсльской работе лаборатории геиетьга меги/'.отро^ЕКХ шкрооргаиЕзмов (ЗШ'Тенетака). Ка шжмм i.putida »£55 яодака заявка га изобретение, ка косого падучеь иолоилельш-'й ответ.

Исходит.! длл селекционной рабосн был итак-: P.puUäa CI5 кз адзейнок Кчмигезша: гаузедрн г.:ш\робкэлогш J37. Остальное ятаи-ш, разастсьгкю к рагда?"з.к а**алогаы мегаонкнг, сс-лектаокгрота* ш а процессе кастождей работы. Б начезтсе тест-культуры б аук-C0H0rpaJs:4ecK0M тесте использовали E.coli EIS?£ wet, lie (тип - leaiy ),thrA442, tto, sue , шяученмШ аз ЗЕЖГепешса. Штажл В.coli S17-* (nic.hsdH, hßdMt Smr,iEpr KP4-2 :sln7)),

n0JJV4öbr3äß от Simor е.,кспользован в качестве донора Ю'я переноса кокьигает.вкки путем сконструнрэьанноЗ шазмздц pBGTI в штаммы i. put Ida . Б работе попользовал? ляазлшда рРЕ24 к p'.iESI (несущие сооздетсгзгшо 1вх4 ген л фрагмент геол. rfenä), любезно иредоставлеышь Sedgv.-ilc З.С. Плазкгца рЗСТ4 п р21 получены от , ' авторор, сконструировавши и Еспользовавьглх их а научных кссле-•довасиях /Эягёль к до., 1925; Хургес к др., 1йй/. 3 качестве полноценных пкт&телыш: сред использовали жадий или атаркзован* . ¿¡кГ; бульок Хоттингера, среду LB. Б качестве микаюльной среды -среду М9. Соста- ферментаниоЕШх срод (г-л""1): среда A KGI - 2 ClTH4)pSO}~IO; Ш2Р04 - I;iigS04 •'гЛг20*0,04; дрожеЕОй экстракт-I*; пептон - 1; глзкоза - 100; мал. - 25; среда В - see то ае самое, sa искжшекиом лрохуеаого экстракта и понтона. 1

' Лея мутаген£э£ обработки клеток использоБали ультрафиолет VJQ) и И -aevus-S -нитро-И -натрозогуаавдш-: (РГ). • • Отбор акалогорезисте'-ини :.г/та;;тов r.putida волн каг с couausbo мкогесхупенчатой сьдекцш, так к в гродиепте конгеш-ра-стла la-r^scn Золей.. ХоллчестЕвивую опенку способности мутантов

про,дотировать кетгс.лхн прзвчдалк нослз .fejweKiaronx. Услолпя <fep-кэптатли': Z мл 'Тертгсктатшоы'о! среда после засева культуры инкубировали г,£ хачалгса (200-220 об/мк) при 28->J °С в тсчспяе 72-CS ч. Содорудпие кеи-:о:шна я культурглшко': гэдкости определяли штодом хроматографкп га бушге.

,Опрод0лс1;ив содержания глзкози в среде провод; т 0-толуи-доювик методом.

Транс.7.ор>.;апк:и клевок г.ри-lläa и E.coli S17-1 осуществляли по стандартной методике с использование;* хлористого хяльикя /какиаткс Т. к др., IS34/.

Определение скорости позреблехлтя кислорода бактеряедышш' клетка?:,к проводили иа долярзгра^е LP -7е, используя закрытий электрод Кларка.

Изучение активности Лермонтов проводила после разрушения-бактериальной Люмассн уль-граазу&о;* при Бослсдуздам "чделовш обломков клеток путам геитрп-ругировакия. Ахадвпость ß -падартат-ккказц (АК) оцределялп по кегоду ЗЯаск 7ISG2/ с лехоторжк дзфшаркямп. Уделы'ую акываэгаь фермента вы^-алат количеством пколей обр&зовгвшэгося в результате peascreiz аспартглтадроксама-та в :.'.яп яа иг беш-л феркеататпвнагэ препарата. Активность г.о-ьюсередегадроголазз (ГЛ.) определяла в реанши, йдущр'! в направлено: гокоссрик+КАДЙ|'=полу?льдехад аспарагпковой нпслотьч-НА '¿21. Удзаьнэя -аятяЕлооть .фермента взразека кап ьзмекезно экстшпжи (при даило золш 540 ем), обусловлепюо восстановлением 11АДЗ в гаш iE. кг белка. Активность гдетатиоппк- з-лпазы и го:<оссри'п-8кгптк?,траро-|.-еразв определяли ;a:t указано з работах Guggenheim" /1971/2 KasefKalcüyar;ta /197]'/. Удельную активность ферментов . шракалк количеством п.шей SH-rpynn, соответственно гомопкете-лпа алк коарэимз А, образугдахся в реакгаг аа nsh к а мт "белка . ферментативного препарата. Определение белка в фермент содержащее ■ экстрактах проведали по.«eiоду Ъвту <?t ai /ХЭ5Ч Статистическую обработку эксперк!«еиталышх матерл-ялов, по- • лученных в работе, проводила методой Стьюдента.

.езштатн шадомга» V. к: азезда-а?

ОсиокзоЗ задачей при создания ттшдаов-продуиентов яэ»:я&тся

- е -

изменение г.:етабол;:цг.;а бактерий таккгл обрело:.", чтобы обеспечить . -' СБврхсПнте? аечевог аишокЕсдотн. ыугеотошшд кетод, укаверсаль-* кость которого очевадна, бил к в блавсаЗше года останется, ко-ввдамоку, с, j-uiK кэ ; сковшас для кзаекения леходкых свойств ияк-рооргаксакою» :.'.к предаилоккщ, что ii/тои воздействия на бактериальную культуру в дозе, Евдупаруздей SOS -ответ, ко;шо расширить спектр мутал-лшх изменений к увелкяить в вофляим ко- • дстествэ мутаитных клеток, когутз-х послулкть персивптаьккм ка-•териалом для сглексг:::-: икоков, chocoói-~ix: к избыточно»:? iîhïgv . метаоняка. С уч^та;, сказакгого, сровбден« исследованы с цель» определить налыччь ses-ответа ц еозг.окность его кндукпиз у

put ida . . Ранее вал:лие sós -огрета било установлено у ряда :ле-кроорга>шзь:ов. Однако о проложена;-» sos -о.вста У г. put id a дан- ; кые отсутствовав, Ктагеряя»/и наличия шхакматдов sos -ответа у. кикроопганыг ;ор служат: интенсивность синтеза Real белья, а&ек-' -гсвпостъ репарация ¿KK к мутагенеза, подавление плеточного даха- . ■ ш, Еядукикя прошагал .

. . Кндуккия ультрафиолетом so¿ -отиета у p.putide.

■ Установлена, что подавление" (на tb%) 'скорости потребления кчеюрода кяеткайж p.putida происходит при облучении Vit в до-'зо 13,5 xZji/if. Однако при шеледушей аэробной нккубатал облу-чен"о£ культурц в сродо МЭ скорость йстреблзнзя кислорода через ч- с восстававТЕвалась „о 'доходной (табл.I).

Браненное подавление дахашш у облученной УФ (13,5 к&ж/м") бактериально» культур«, а raie© каблэдаекая задеркга клеточного делена в течении 2,5 ч, следствием чего явилась ,£оамэнтаиия . . улеток, убедительно свидетельствует о каытаид sos -лодойннх

" реакций у P. put ida ,

Справедливость данного вывода подтвердил." сь в ошгах со атакам" бактерий с гаруаешши а есА-зависиквдг функциями. Таю«) пташк получага путем введения в зтамм P.pu-tida плаз;дд ,р?Е24 и p.3¿23 (несуашс соответственно lexá ген а Лралаент язсА гека). Облучение íy> (12,5' клеток, содержащих длаамвд$

íípüp.0/5-10 к полному подавлении дакания, которое не восстакавли- • вадось в течег.го* 2 ч (табл.!). Sto мокет бкть'объяснено тек, ^ что остаточная уровень НесА белка у клеток, оодерааших гшазгж-

ду, ¡to достаточным для поддвленил тдаакяя, но яе.дос.таточппм для протео>штэтоского расиспльлпя LoxA. белит, а тате для SCS-репарапии Д-:К. В результата этого оонсбкоя масса клпог. погибала и восстапеалеинл дахаипя 1-е наблюдалось.

Тййякга X

Блеяло ультрафиолетового облучения па скорость пот, ебления ккслорода зизсгкагд; ,ита::моа P.putida

'¿тамь; :Ялазмзда Доза 0бдучекия:3реул после:Скорость клвточ-(гчДкДг) : облечется :ного дакания : (гаи) : С'.)

10 100

Р.putida 4,5 70 IU0

. 9,0 10 100

70ч ■100

10 , 35 ■

13,5 100

10 0

?. put ida 70 . 0

130 >0

10 0

?»putj<la pPS24 .13,5 . 70 0

130 0

Предположение о снижении уровня Вее& '■¡елка, следствием _ оторого может являться отсутствие филамектагац и зовытание увствЕтельности к JQ у трансформактом, согласуется с ли^ератур^-ЫШ дашнмк /Емпегаоп et al , 1336; SedgwiK, Goorxía .1965/. агам образом,- стзоз<уиность полученных данных дозволяет гоео- • ить о наличии 502 -подобного ответа у р.putida , аналогично-о по свои/. ирояалекщям SOS --ответу у в.coli • Кндунпрузогззя 0S—ответ доза У& (13,5 дальнеЛ.шм использовалась'

ля мутагенной обработка кл<зток г. put ida ' с пелью шлучкякя утешив, способных к изйи'рчному симезу штгогана.

Сслекгахя апалсгос-бзцстсптЕих кутагггов putida Cío

Пэолв предаарьтел1«э2 обработав баксериальнюс клеток УФ Задалось с/сбУГ}КТЛуОвагь эгаокияргзастекмше С £thr ) кутанты P.putldc , кз которых 20-£5 £ обладав кзбнточшм синтезом ма-тионаш(от 0,1 до 0,2 в ю время как исходный ш'амм

Ьputida CI5 не ооладал зтой способностью.

Ладьнгйпая сзяекшг sthT ¿^тактов ка среде с более высокой ¡сонц&ятражей откгшза (6 ) позволила oTcJpatí» i> мутанта, спосооаих выделять в срзду 'Лгскектатгеи до 0,4 ке-гьонипа. Необходимость от'еккк больших выборок микроорганизмов .ч& способности, к зг.слредг.11 ашлокасло? ítoii ctj пекчатой селэк-. nüii предопределяет длительность п трудоемкость этого процесса. Еоэхэау бил апрАбьроаак кзтод евшешк в i-рашеяте конаектраэтзд аредуюхеший Saybelski Я. /1953/ и модафштрованний i-'poynoii I:. ддя отбора а^адогорезистепниу мутантов. Суть «го заключается з тог.-, что культура .достигала участка среда с максимальной хсоя-"теитрадпе^ аналога по мере своего роста. Для зтого клетки хсудь-TE^Epyi.1 ка атапа, который залат в дждз двух коскх сдоев. Верхний не содршет добавки аналога, ьтай слой содержит аналог' ■ evamoiaíCAOM. Культуру P. put ida , облучекгую УЗ, засевали у на.. чала верхнего агара. Сначала цроисходот быстрый рост бак.те риал ной г^'ЛьтурЕ и макрооргалязкн распространяются в сторону шх-

кошевграпао антиметайолрта, затег/, кизнедеятельмость боль-' яей часта микрооргалкаоз подавляется под влиянием ток«ическо-■' то действия аитаметабадкта. Ь условиях ужесточающегося действш отбора разжигаются к достигают высокой-кокцектр-тж актшетабс :'лита хшзь глотки, способные к избыточному синтезу аминокяслоты, '.-Устав садено, что -jD^ .Ethr мутантов, отобранных с помощью'се-лекптх к градиенте ковдентрашш зтиоаина, способны синтезировать 0,2-0.,5 г-л"^. мотаонгаа. laicas образом, в отличие от сту-пЗях£,л)2 еслекшл!, ,с помощью которой удалось отсалехтирозать ■¡mm¡i якощ&гпруктъ 0,4 г.л"* ивтиошша лага, поело двух этапов' седакции (за'¡-12 даей), путь- селекции а. градиенте конпентрг . пил. araoi.Hhf- TñiCKo мудавяг получади ухе ш иесяце суки. Итак, owtcjM.'iia в градиенте кмяюлтраиш актжетабои;та шеет сэд^пэ-. ¡цао вропкулгэства иерэд етулевиатой. "селекцией: внборка.из иопу-

ляплц идете*, внросасг* г.а агаре, со.^ор-тащег' ыхсжлалънуэ коп-аентралил аналога, дает достаточно внроьвсншй но своой прохук-тквности материал; действие селег.тируппего га культуру,

по к.эре ее роста в условия* градиента, кенттерггаы аналога позволяет ДО премировать клэ-гкк по ус?э''1чгс:-оссн к ьвцг в соответствии о,н:с местоположение" на поверхности агара; ц-ллэи трудоемкость процесса отбора, что позволяет в о.щт этап получать мутанты устойчивее к бксоеяи котгертраипям аналога и характеризуй-, пщеся избыточной продумтае:! пелево." аьжокаслогн.

Х'альгемтая работа била направлена на погашение продуктивности лучшего в отношении биосинтеза кеткокнна (0,5 г.л"1')-птак-гла Р.ри1-1с1а 2. Селекгая в грздезнте гонпентрапта атнсяшга клеток шгшма 2, предварительно лодассгнутих иутпгеажиу действии З'Ф, позволите поме' п.таи дней кульк&хро.таля отобрать ¡^гаш, резистентные 'к 15 зтиолп-а. В среде хулъгавпрорчнлл 20'

лучок« из прсанализарованявну мутантов здевгсьвэдюв&зг от 1,2 до 1,4 г*л~~ меткоявка и его окисленной $орик - кеткониксульфо-ксвда. У наиболее продуктивного иваама г.рцИйа 28(2) накопление в' среде культивирования мотнонина и мтаотпжсульфокспда 'достигало соответственно "1,0 г-л-" п 0,5 г.л-"'". Таи*"! образе:;., в -результате проведенной селеталхи удалось отобрать мутактп, у ко'-'' торых уровень избыточного синтеза кетконина возрос по сразнениь со атгилом Р.р-лИйа 2 в 1,6 и С,0 раза. ' д

Заззсилость продуктивности В.ра1;1<1а 28(2) от згсловг.£ „ культивирования

Установлено, что ври кульишкров&нин ытамма 28(2) в пробирках (2x20) с объенол фешентамюннОл среда 2 ь«* продукция ■■ г/.етиоямна достигает 1,49 г.л"*. Ухудшение условий аэратда, в ' частности увеличение рабочего объема среда до 0-10 мл, ведет к снЕжека'э^продуташ йетиошна (ка 42 и 45$ соответственно). Яри ' - этом уменьшается скорость отшелевая кетаою:::а в метдонинсульфо-кепд. Б ходе опытов определено, что для избыточного синтеза ме-,_ тподоша предпочтительной является ионненграгия глглсозы з среде, рашая 10%. Прд содауяанви в срег"1 -фэрментапид более низких кон--пентрашш глюкозн. продукция кетионнла -клетигия пташ.-а 28(25-снижается.

Голуекпе к характеристика штаммов P.putida 25, G и I

!1нд!шд:гуальшл дяалкз клоиоэ, отобранных поело иысега лгаи-кг P.putida £1'(2!,покацал, что ьутант P.putida. 25 обладает более шоош>: уровне:« бкоеж-яеег. штьончшх. В среде ферментации 2,TOiS4& 25 ЕД&КТК^ШКфОЕйЯЙ 1,2 Г-Л-^ КеТКОНИЯЕ. к 0,8 г.л~х ке-тиогащсудъ-к.ксада. Однахо, коске 72 ч культивирования дтка 25 отвечай« псчезисаенае часта &котретэтуш:эго иекаотша. Дщ полу-чзихк у аилаа '-5 кутьаов с в0з;.:0/Л)£У.п иарушенашма путск д&гра-дапш: мети о: вша дрогоаг штрозо.уанЕдоваоэки мутагенез и из 200 зроаыушзцроз&врых xwoiiob отооралк два к?гаита - 1 п С. lira» I' ..ье рос ;ia среде, оодериая&Д ичщоянн в качестве источника углерода, мтсим 6 тос на среде с мотеокяеок, но значительно кедлезг нее, .чем асхеднкй итаж P.yttd^ 25. По уровни, продатввоста етатАл; I но отличался от родительского 5"?аад/д 25. У иутанта б нгчоплекие ¡«ткокпна к меиюшагсульЗоксэда в среде культивирования ".оставило соответственно 1,7 и 0,7 г «л"1.

Изучение природа сверхсдотеза метионина у мутантов 2, 25 и 6

^згестко, что способность бактерий к избыточному а-пт-зу акдаокделот обусловлена генети .веками' яаруоешяки механизмов саигеза ферментов шш утратой чувств^рельносаэд регудяторннх у.йрг-опттз к рбтрояягйбкровяшяо /Гусятклер, 1979;.Шевченко в др., Shito .Hakaawrl . , 1У70/. Поэтому у трех ранее' полученных мутаэтоз (2, й!5 к 6), различающихся по уровню продукции'ыетсо-¿ssc,- была изучена активность и особенности регулягая некоторых ферментов (а чшртаттщзп, гомоейриндегвдрогекгш к пкета-'тпонин-в-лиазн}, учаотвуквдх в биосинтезе ыетконика. Уровень удельной активности асяартаиыяазы (AEJ у мутантов практически не отучался о? уровня активности у исходного ажайла B.puti-da CIS (табл.2). _ - *

Алцарзатлявайпач антивкость гигантов такие как l родительского 'штакма Clij;ивгябарок лась • треовивок {на 66-68%) и «¿дколь-. ко' ciadee -дквкком (па 54-60$) (табд.З).'

в.

и - -

•и - ? ►tí и .го

en tс.

<3

ta

И ш -S N' Я о

feg g- Q ■

i

ó ta-e 3=1

И CD

й о о ь<

к , w Ь

о ю Я

Ф о

и .<о is

о g."

"'я

о. о » о м г^

-■ и . • а; а

-В ü -

g р:

и А ■

о Й ¡0

ÍS о s

,р я. (В

о . ь

Я ъг о ►3

in . й s

¿3 о cri

« о

<t ь

о И о. о

H H

к О f

о

» С ■

- / ¿0

Й >а

с у . -

о

S о m .

я rt

Q t? ß> -

■• S ci

о о О

о vi .

Уя ■■ - О

Й'

К H rt.i'S H

со W Ч « о "ci

К о с* и Ч ®

а о о м м о

0 к к й с а д а к .■ рв

1 ' +

g

ÍS fe

4 +

fa S

h со

со и?

" в .

о К

сл .ь м л-сл го .р. го

м I-i íj м о w 1+ 1+ •+ 1+ ¡R- H

•¿3 В Ы 03 Ü1 tJ

01 M с H M <n

СЛ C.3 ip. li*. H Ip.

о a w и о о

То W -"jJ w о M 1+ !+ 1+ !+ 1+ 1+

го « и » сн со

w Те* ы ~c ai

•a. C-5 о i. H О!

-¡-ч го <3 СП О M

Ol -<J N СП О СЛ 1+ J+ 1+ 1+ )+ 1+

6) ¿o ^ ta. о о?

M M 0J W H

'S¡ Ы M w о со '.О M С! to о M

Л Ю ffi о to 1+ 1+ 1+ .+ 1+ 1+ ;о м оз :о „• ад

О О. H СЛ ^ H

О >б b

S О'О

is а О к

* S g

о с

Л Ш s

S ^ Р

го сл

о

.о ы ел сг. го oí

Л» СО О) to

о- г о го со 14- 1+ 1+ 1+ О О О С

И M С to

>-3

!» О.

IS со

О .Tí о: <J 1+ 1+ 1+ 1+

° -С' Р Р

t_1 СО rf^ M

ЕЭ

1-5

1

ß

>

о

Й

i 'Ь

в

ц р . J

сх ' s

э О К

Í4 И

ОЗ га

¡и ш H

3

13

2

й

с

о о

>-з

fe t> С о1

ПГ" Q

• M О -

о

ri

О S

о • > ÍD

«V CT гт:

M И --3

О Í.- о

№ ■Ъ «

о

ч

га

Р

сз

Ш

<< о о

а >-з

■э о'

tí _

F; >'<

fí to sa

»ö p —» *

ß 4 ü 0

ft tt p.

В

¡3

Ca ÍB

1-3 p

p>

4

~ H

f-a о

с г:

M с

ГО

oí fe

к - >-¡

--i

O jj

ю а.

S ro

АК у кекоторщг представителе í¡ рода Jsoudomoaaa . Зишде на" Al', рэдьтольскэго м мутаитшх. ктакков смесей ■треонип+метдотш и'-котаоамн+дизш бшю аракткчасаш таим ае, как и дейотшь одного треонина или лизаш. Уставо„пено, что гоиоезриндегкдрохяпа-за (Гд) ьоох иседе?чуе;-лнх штатов заметно ингнбируется при од;ю-'вродоЕИом дооашеппи в реавдяоннув смесь изолейпкна и тоэоиша (по 5 :.;.! кяздого) или :>рЗ внесении их в отдельности, но в йолоо . шсоко£ KOMvüiiTpiMjjüi (25 .л.0 (таол.4).

Таблица 4

üoanuia агш'окаслот аспарагкяоного семейства на активность т«осортлц^гадрогоказк шташа üputida Cío и его акантов 2, 25 и 6

Ь'-аиияокислота,: Актавноста гопосэт г.нкдепщоог! знази, f-

добаьлэпкан в :

^еакииолкуп : CI5 : 2 : • 25 : 6

Смесь, 5 : : : :

Треснки 77 0±т з 70, СР2,S 71,0*2,9 80,0*2,1 .

Mex'UOHviíi ьо HI,0-4,4 63,0*1,7 53,3*1,6

КзаяеНшш 9S ,8-3,0 ti - Л+о 1 Ü-Í , ü-o, 4 70,0*2,6 £5,1*4,2

Нетионш+1:золешз1щ75 ,4*?. ,4 r,c c+o o O'-J , Cí— и t o 77,0*2,3 63,6*1,4

Мотйовш-глваиа 60 ,4*1,4 6П,0*2,6 64,0*3,0 63,7*0,7

Треоншм-изтконан 46 48,1*1,0 42,9*1,6 37,3*0,7

Тпеонды-лазин 54. 44,5*2,6 01,9*1,2 42,1*1,4 .

Треошш+пзолй ¿¡ он: 43 ,№0,8 47,0*1,3 35,2*0,9 48,4-1,4

Повазаго, что активность Тд как родительского гатажа, так и кутантон, юаютел&ио ингкбнруется (на 5?-&Ъ%) треокгвом, до-б&ааевййы вместе с ыетиоЕШЖ, в треонин«« каэоте с лпзиком (на 45~S8;*s). Таким образом, характер регуляти АК и ГД у му-тактоа в данном случае остается таким лее, как у родительского 2:rai.;.iciS.pu-tida CIS. Вероятно, клопах исследуемых штаммов содержат цухшчш, затрагивающие свойства ферментов, учасгсуедг: неиоерздгл'веглю в биосинтезе кеткошша. Ото предтло.тше под-

тверядаетон ресульта'.саьи пзуч'экг.я активности гдсгЕТ^оггкд-й -лгазк. Установлена, что уровень актавкосгя отого #вр<е:гг& у мутантов в ¿-3 раза прошлаот уроьи'-ь ого пкткзносш у "/.сходного шаш, и что в отльчкз от последнего у иутаптоз отсутствует репрессии ;.остоеш.эм (5 к'Л) гена aetc (табл.5).

Тао'ллпа 5.

Удельная активность-отст&теож'-з -лхаэи у »¿тала. J.putidii.

CIS и мутантов 2, 25, 6

Ста.лл: Удельная активность етстатпошт-в -лшои,

; •-Щ2Ш:-- ккз-кг oa,v.:a

: Добавлено и&шчша в opajsy культ u^poBaiiz.^:, 5

: 0 : 5 ■

CI5 0,3^05-0,0750 0,03469^0,0G50

с, ю 0,82S5±0,II35 G,B0820-0,C'.OiO '

■ 25 0,8825-0,0355 0,90000iC,G330

С о,эзз:±о,оз75 O.S38i.OiO,ICOO

Виолче вероятно, чтоюнскгтутзвкостз зксг.рессзш гора -¿а 1С в присутствия иоялонака (3 ь/м) к вогаскшякя актавноегь гг?.тагл;о-ниь:-в-.тгзазн, язхлется одной кз причин избыточного сж'Л'зь ::е-таопиаа, обседачЕвахвдхэ усзбйчпвоси» соотзете-гтувдих фактов

к акаллу.

■йпонологичоекке и генетические подходи увеличения" лро^утстнвлост* мекгонпна у мутанта p.pittiia £

a) Влияние рааюиякх шшепораций яоигопа, дрогогевото экстракта,, а таю/.я ряда витаминов на уровень избыточного ешмоза мотионана игоакмои €•

. Установлено, что у штампа 6 (яучиэго S3 отсеяекзкрованкпе на предадудах этапах работ таймов) санте- /медяэнгде (па СЗ-^ • ■ ,33$) стшф';шровкла добавка дрозоктого экстракта (230-500и-г-л~1). ; В *ех so условиях внесекив раашгагсх мяттрмий пс-птзна крак--

■пиески не ■ оказывало вжяпля на синтез кетмокика. Биотип, пк-рвдо^-сальОосййт (I мкс>1.и~х), а такке гашол>балашш (0,са«кг»мГ^ стимулировали лзбктсчмый с:::: тез иетиошша у штаг. г& 6 согтвэтст-венио ма-2£,16 и 22^. Сй&улЕруэтий эйфект влташныв в условия: капах опытов кол;от бнть связан о их котермениюй Сушащей / ЬагАЪ о! ¿1, 1934; За.1п!;-;а.го.1С ей с.1, 1933 /, Однако нельзя иекличигь и воекомюоть некосперкеитгЕх влияний исследуемых вита-М1Д50Б, что, одшно, куудеется в экспериментальной проверка.

б) Селегагая мутамсл г.ри-мДаб, резистентных к

¡10рле!шшу

По-зло оомл дней культивирования штамма Р.ри-Шщ 6 на среде с градеитта копиентрации корлейцы-а (Еог ) была отобраки Тог37 мутап-ты. Однако среда 200 вЯгх,Иогг проавализировгвных' .лут&нтив не было обнаружено штат,ков, у которых уровень избыточно-. го синтеза мотиопипа проЕжгал би таково!: у штампа 6. Отобранные -*огг мутанта экскретаровалм в среду культивирования лзбыточное количество валика. Наиболее продуктивииш во ззадияу были вгаак-\зг 33 (2,6 г •л""1) и 136 (3,4 г-л-1). Известно, что иорлейщш •' является аналогал как кеткоаша, так и лейяша. Поскольку начальна© этапы биоелктеза лейцина и валила совпадает, вполне возможно, что устойчивость кутантов к иорлийщпу обусловлена мутатшями на уровне синтеза обарсс'продав'шешягков. Тек не'менее, причина избыточного синтеза именно вгшша остается неясной.

в) Тшко-ингенеркзй подход ' ..

Необходимы.:.;',! уолозкяил сверхоянтеза ажпокислот является уве,ютекие активности ферментов за счет более высокого уровня експрессии с.ответствуя-да. генов или их аиплкфикатщи, а такжо устранение элементов негативного контроля /Дебабов, Едакова, 1982; 1Тй^ауааа , 1980/. Ъ настоящей -работ» предпринята поштал увеличить уровень синтеза иадааояша путем амшификагяш геаа биосинтеза гомосерина продаестзештака метионина. На основе вектора широкого круга хозяев рЕСТ4 и плазшда р21, содержащей ге-

rai треокипового ояерога о точечной путанной в гене thr Ь, с'ила с<сонструмров8на_гпфядгая. pLCX'I (рко.1).

I iv-

Рис.Т. СЬсека конструирования гзбрютоЕ плагиидо рБСП

¿обияЕватая хкбрвдюС пзазмдог р&С'Л аз coli SI7-I з итащгн s.puttda ооуще-твяЕлась глаамздоЯ R? 4 (1«Р1 группы пе-сошес гтлостн), локалкзогг,Ено2 в клетках донора, Частота «обк-льзатли плазиг^да pBCTI в иксами P.putida £5, 6 к I составляла . i, что соответствует частоте иобшжзалйл з мегг^одовых

.скрещивания.: ряда векторных плазызд, скопструирозангаг-. на оско-bj R3P 1010 Аистосердов, Цчгакков, 1984/.

Уровень экспрессии гена -thr А ( E.coll ) з клетках i.puti-Са 6 (pSCTl) измеряли," определяя у рвы ^гш активности АК я ГЛ. , Увеличение »пи&юсти гена th* А в клетках i.pivtida G после введения гибридной ллазмида привело по сравнения со ттакыо:.; • г. put Ida о к значительному повышению (г 3,2 раза) уровня экспрессии Ait и Г.Д..

■ Активность АК штакма ,6(pBCTi) на 67,2/5 кнгкбкрогаласн трсо-ншои<. Ос.аточвыг уровень активности фермента находился на уро-

вне удальло? акшгсосгг «ста;«.» 6. В отличие от неходкого -ьТак-ма ñutida 6 у тракс>эи^фо:еаккого штамла. 6(рЬ0Т1) лиьлк лиаь-... незначительно (na II,7¡J) шаъбгруея í кткваость АК. По-ввдзсому, этот ¿(акт иогет бить объяснен извзагтагал: дашпадп о яеч>дствите-■.•лькостп AIü, колируемой ЪлтА f'J.coli) , к лизину / Sain--Girona, ' Parsát 5, al, ЮЗС/. ГА тегаш; 6(рВСТ1) ингабирозалась трео-„ ' »в»ом (-а €7,3?») к смесью трсо?к:нсшзЕк (ка 78,*$) до уровня ... ., удвльиоЛ акткзпсстп штата G. Троошк+глетиопш и "•реокаи+а. э-леЙ!уш лодсш.-ггли актив:;ость 7ер,\:е^та ьа 52 : ■ •' , дальне:; míe исследэзекш: показал«:, что трааскоаыагаяты • ; /23(pLCTZ), О(рБОИ), I {pBGTI)/' способны к пзчточному синтезу ■ • гомосеряпа (до 0,2 г.л-1). Однако синтез ¡лотиоппка увеличился ссзкачитсльно. асян'О предположить, что в ¡оютках трапскоккеган-,тов агтквЕость ^ор^екта го^осерхк- ^-агетилтрамсХараБЫ, катали-' ■1знрукщего дер&уэ реакмлэ бноскитсаа непосредственно кетЕОнпва, недостаточна до» того чтобы весь сжтезкруешй ro.v.ocep;u: (иле ";по краИне". uepe его больауэ часть) клетка когла использовать '."•• дак скнтеза уеташшна. Мз »того 'следует,'что №. обеспечения

высокого урошя избыточного сглтоза мэтпояаиа у P,putida • : . ьедостаточго ai;j4?.№ju-.uipoBaTb только часть гепор, ответственных /за биоспптоз предлостБеипжов otoi" -»мхзокполоты. Зо-влдкыому, ' необходимо тогах уводшять догу генов, ответственных кепосред- , •• етвенвэ зг бкэсплтез иаигосика. Яодатаса клолирозать геин биосвн-. теза кетпонпла у P.putida солряг.е^а с определенными трудностями, постольку mm, кодарусше .'Оеруонти пути биосинтеза шзтго-•• пина у ссов.йо«о:'ац, ix op. шгсзовапы в оперов / Holloway , IS75; • Tíorgaxi, Dean , IS85/. ' ,

r) Се^чкгтпя путагтов P.putida , резистентных к ' .. г-етионкнсульДопу

Селезню пегЕстек-гпдх к кетиомщсуль^ону (й'£0) мутантов ■ вели на среде с градиентом его иэттектратапх среда бактериального катерпсгл, предварительно подвергнутого обработке УФ. Из 200 ■ произвольно взятих íivKT "jio:iob отобрала лучиий по уровню избг-точного спктзза ыетамшиа итагс, М355 (2,0 г~«л-- ыетпоыша я 1,5 г-д~х лотко^цнсультоксида), У остальных прозерепигх муъан- _ тчв pai.oiijioj'^e s среде феркштаивк кетаонпна к лвтиокиксулаЛд-

- IT -

ксида достигало соотлетствевно Iг-л--1- п I 3 г*л~А.

У мутанта ."..1355, в отлсчио от исходного пк&акэ CI5, обнаружена повышенная активность илстаткоюш- а -ллазы, показано ко.1:— стптутквность экспрессии гена ие';С к незначительная (па 12,%) репрессия гвна -et.i, в иркоутстагг. !,:еглОК7л;а (5 ь'.'.). Несмотря ка указанные бдохидаюсляе особенности мутанта , активность его ферментов и рогудяториоо влияние та госс эхзогенно добавлен-шх аминокислот не .¡Зыскжось по с раз копию с родитольскх: л гак-ком 6. Сказанное дозволяет прэдполо1а?ь, wo nomnoimo зебытбч-г.ого синтеза котконика у мутанта ¿1355, но сравнению со жсжои 6 обусловлено ¡"утащ;яг.;и в генных локусах других. "ермектов биосинтеза . мотношша я (дяк) з регуляторнок гепз cetl .

5АЖЛ1Е1ПЗ '

Представители p.putlda могут слуяят?> дохода*.". штеркало»' .для отбора мутантов, способных к кзбнтсяг.оуу синтезу г.:ет:юшц'а. У бактерий г.щШа вкяплеп so* -подобии!! эффект на дейетако Зш>тра.;жодета в дозе ,13,5 кЛ'х/1^. Разработан реет: облучения УЗ и применения акткмотоболитов с целью получения ••.утанткнх £>орм P.putiCa . спнтескруялЕХ избыточное количество мотлекш-а.

Показана высокая с-Сфектиапость отбора аналогорезкетентнкх мутантов модоГ-ЕГйровазккм метод ст.: седеют! в граддепм хокиепт-paumj антнм5тг.бо.щ;та, который дозволит езкраглть многоэтондость и трудоемкость ступенчатого 'отбора.

Путем объединения в од-.ог. хепо;,:е иуташ?., вызквахзлш. избыточный синтез метпоккна, и г/уташж', целутох к нарушению деградации целевой аминокислота:, получеп ятоик р.рцШаб. накаплм-ьащпй в среде феркептации 1,75 г »л"* гэгаонада п 0,75 метиокзпсульфоксэда.. Указанный шташ но уровню избыточного синтеза ¡¿етиоиина превосходит друтке итаммк рода гзсайоиоаав , в частности Psa'-domonas i*B 24-4 (0,8 г-л""^) л Psedoaoiias -р. (0,4 дз агаашда P.putida G отобракн резистентные к метко-

шпеульфону мутанты, лучший из которых (К55) накапливал е среде ферментации 2,0г-"л~^ метионлда и 1,5 г-л"^ ызтионпнсульТюк-екда. Даншй мутант до продуктивности мэтгошша приближается к лучыэвд- в мировой практика шамглу о glutanicum Р'ХО 21608, и имеет перед ним грелмуаество, т.к. по является луксог-ро^ом по

троогаяу.

Установлено, что аналог орезистонтние мутанти, способ-ше к избыточное/ синтезу кетиошша, характеризуются повышенной активностью цистаTKoiiiiH- и -ляазд, констктутивиостьа экспрессии гена ce-to и ко значительной (на 13% i депрессией гона шяЦ в присутствии иотионига (5 kLI).

Показано повнкише избыточного синтеза ыетиочина ш ашом P.putida при дсбамюшт в среду культивирования дрояиевого эгс-тракта mt бяотяка, пирадоксаяьфоаЗата и вдшюкобалашша.

К со^акенко.акгшификапия гена tlirA ( E.coli) о помо -Н(ь:о реко.у.бшантно& плазкида рЕСП нэ привела к дальнейшему, позшаошш избыточного синтеза моткопикау P.putida

Полученные в донной работе мутанты могут служить перспек-тчвннм гатерналсм .для изучения генетической детерминации и пу-той биосинтеза метионкна у P.putida , а также для дальнейшей селекшк итаймов-сверхдродуиентов этой аминокислоты.

зьсвощ

1. Ультрафиолетовое облучение клеток P.putida дозой 13,Бцйд/м2 плгкбдрует дыхание и деление клеток с последующей их фила-ментациой, что свидетельствует о наличии у P.putida 'механизмов 30£LpempauEU. Указанная доза облучения характеризуется высокой, путагенкой активностью np"t довольно высокой жизнеспособности облученннх клеток и может быть рекомендована для получения мутантных йори P.putida в целях дальнейшей Селек-

РИЕ.

2. Покаааяа внеокая оЖоктивносгь модифицированной методики селенная онэлогорезистрнтных мутантов в градиенте конпентрашш антшэтабадшта, созданном в агара. При этом установлено, что:

а) тпульдая клеток, выросшая на агаре, содержащем максимальную кслшзнтра'що аналога, содер-шг достаточно выровненный по своей продуктивности материал пригодшш для дальнейшей сс чек-ям ; *

б) действие иыусстЕсннс-го отбора на бактериальную культуру по маре ео роста в условиях градиента. концентрация аналога позволяет дачйарзвгаровать клетки, по устойчивости к послед» чеку э соответствии с их иестзпо&аггсшием па поверхности ага-

1 'pa;

б) могод позволяет вести эЛ^ектавш;!! от4ор акологорознстент-нкх ioioïok к дает йолыаоя шкгрпз вс зр:л.'.епи прк ссяекжишо2 рабсто.

3. bJsauwa ?.pufclda, сзосо&ие к иэбктоткоху екптззу глетпонина, характеризуется:

а) щигсеияой гистивностю гастатиокга:- я-стазы;

б) коксайгутпвиостыэ эксщюсетк rosa aets и ¡юзначптолькой репоессиоЗ гепаnetA• з присутствия мемюняса (о ai,'.);

в) отсутствие:.: заметных азменекий антлш;ост.к аст.артатпжа»и и гомосоркндогадрогешзи.

4. Введена в ï.putlda poKOMteaiïTEOii гаазчидк pBCTI, соде"- •

; здей ген ïhxX ( E.coii ) , Бгдот л 1пб1)точио?г/ синтезу гоко-серина (до 0,2 г.л~*), ко не влияет кз синтез моткоттла у трапсхоньлггитоз.

0. Беотлн, пишдо»:сшя>Т)ос5а1 (Г" щажл""-"-), rnmiom6u.v.?szi& (0.05

а тгике дроккавоИ о?.стракт (250 и 500 мг«л ) вовнжж' пзшточш" синтез ¡/.етконпге у мутанта .г.pa-iida G. 6. оредн солэктаровэщшх шташоЕ ?.puutda, сласобгы;. к избыток-' г ому синтезу метнокнна, наиболее перслеттквкки для дальнейшей сол .юти яваяотся атдод L1C55, в срздо его кулътстдпрова-ння сря/аркое накопление г/.етаонипа и ■ кэтач.дяпсул&Зоксях'* сос-тагллет 3,5

сш:сок fa'jot, спгпшваша .по raœ десогртаож'

1. Полодяенко 0.5., Броув II.II., Глаголев АЛ:.," Топкий 3.3.-Ия-дук'тдя системы зоз-ответа у P.patida // ?/' съезд г^пеожков . и селекционеров Учраинн: Тез докл. июнь, I08G, - Киев, IS8S.-4.4. - а.6£.-?0. _

2. Броун И.И., Глаголев А.Н., Наракке С.т., Пслодиевко 0.3., ■ Топкий В.::. Селакпия кутаптшос штампов бактерий, основанная, на их подзшности// Там яе. - 0.56.

3. Полодаезко 0.5. Изучение активности ч-пхстатповазк у апу.о-Горз.зкстовтного мутанта ÎaeuOoaoaas putiàa // йаагер.научн. /онФ.мол.ученых Одес.ун-та, 21-ÏZ октября 1587 г.- Одесса, 1967, -0.63. "

4. Полоднекко O.S., Зкейкмап luA. Ингибировапке дыхания у je.pu-iiia под ьмштаем ультра фиолетового облучения как проявление У съезд Всесоюзного общества генетгков к сэаакцйогюров им. Н.К.Вашлога: Тез .докл., 24-28 но-бря, I9S7. - Mocusa, I0C7. - С.70.

r, Каракас С.Г., Полодкенко О,В. Сравнительной характеристика ar.TKBwOC'Ki оеклепта з-гоютатпонази у этиошшрезьстектккх Myjwmm ?.patiüa2 к 3 sutiilie ЬЭ// "атер.науч.1.он.п.кол. ученых Одес.ул-'га, Одасс ., 22-D3 сентября, 1988 Сер.Бнол/ Одзс.уп-Т - Ода с 1230. - C.I76-ISI. Д^.УкрШЩ'ГК/ 27.10. 39, К 2396 - У:ч82.

6. Броун У.Л:., '.'iEpo4t;EK ОЛО., Пололдеико О.Б., Точшй В.К., ФтОтОЯ И.А. £0$-В0Д00Ш0 peüicmi у 2aeudot»»i»o putiöa // Бкодомю&егк© щуки. - I9S0. - & 3. - C.I24-I2S.

7. ТоцкаИ В.'Н.» Пододкенхо 0.5. Оптгтазкмирш блосапчеза цэткони-на у акта i.putiaa с Еспзхьззвгшек «>доравтворишх витамином// УесдубжгтаЯская копф. "Яр6йдв>а шмробкого синтеза т«шж» 'л их дроцзлодкшс: Тез'.до*:., 12-14 коля IS90. - . Тагжаит, 1Э50. - 0.52-84.

8 Подоуиемко О.Е.,Чкотосерцое A.D., Тс^дай В.Н., Цчганков Ю.Д^ Влияние ахшюкислст вспырагииового семейстеа ь:а активность, аспартаггинаэы к гокосеринчвгипрогеназы чткотдараэистэнтнтс мутантое p.patida // й'.кроЗко логический журкал. - 1997. -№ I ,53,- С £3-6?.

По.л. К почат?,' 23.iK.9l г. Форм«* 1ЛС. Об'см f\.ßv4.<tj5.ff. 1,23п.л, Здюи »« J$S3. JCKbsa,

Гортцяогрд! Ля Одесского «"¡лэдччгр.-фи uarai,u®)№3» Ленине 49.