Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Селекционное и генетическое изучение устойчивости белокачанной капусты к сосудистому бактериозу

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Селекционное и генетическое изучение устойчивости белокачанной капусты к сосудистому бактериозу"

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи ИГНАТОВ Александр Николаевич

УДК 635.34 : 632.938 : 631.52

СЕЛЕКЦИОННОЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ К СОСУДИСТОМУ БАКТЕРИОЗУ

06.01.05 — селекция и семеноводство, 06.01.11 — защита растений от вредителей и болезней

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1992

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ '

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ

Капуста - одна из главных овощных культур России. К'1985 г. она занимала 302 площадей (Матвеева, 1984), что составляет около 60 тыс.га. в Нечерноземье эта доля доходит до 55-60% от общей площади посевов овощных (Федорова, 1981).

Бее виды капусты в течение вегетационного периода поражаются болезнями и.вредителями, в рездльтате чего потери дрожал • могут достигать более 70У. (Антонов, .1973; Дорожкин, Куневич, 1980: Тивари, 1989). К основным вредоносным болезням напусти относится сосудистый.бактериоз. заболеваемость которым усилилась в последние годы из-за концентрации площадей под этой культурой. С момента описания болезни в 1891 году не било предложено ни одного радикального метода борьбы с сосудистым бактериозом, за йсклвчением гидротермической обработки семян и санитарных Я0р, (йи55е1. 1897: ИНИаав, 1980: 5ЬекЬауа1 е1 а!,, 1982). Поэтому особое значение приобретает селекция капуста на устойчивость? и поиск методов борьба, максимально йс-пользуащих генетический патенциал растений.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИИ

Целью нашей работы было изучить особенности реакции устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу, учитывая характер наследования этого признака у селекционных линий и гибридов и возможность иммунизации растений против заболевания.

Для достижения поставленной цели предполагалось ревить еледующие задачи:

-выявить особенности внутривидовой дифференциации возбудителя сосудистого бактериоза капусты:

- разработать метод оценки устойчивости белокочанной капусты к сосудистому бактериозу, позволяющий проводить индивядуальнув оценку растения к ряду «таммов с последувщнм его использованием в селекционном процессе:

■ '' ■ - 4 - . ■

-изучить наследование признака устойчивости к патогену в селекционных линиях и гибридах белокочанной напусти; -разработать способы получения иммунизирувцих втаммов для индуцирования устойчивости капуст« к сосудистому бактериозу; -показать возмокность иммунизации белокочанной напусти против сосудистого бактериоза.

НАУЧНАЯ новизна ИССЛЕДОВАНИЙ

Выявлено разнообразие популяции возбудителя сосудистого бактериоза по патогенности, вирулентности, биохимическим признакам, активности зкзоферментов, белковому и плазмидному профиле.

Предложен подход к расовой дифференциации возбудителя на основе использования линий и гибридов белокочанной капусти.

Выявлен диапазон условий, обеспечиваввий проявление наи-больвих различий по устойчивости растений к патогену. .

Предло*ен метод отбора устойчивых к сосудистому бактерио- . зу селекционных образцов на основе,использования для оценки нескольких различавяихся втаммов ХапШвопаэ саире?1г1$ ру. саарейШз.

Показано сущёствование, как минимум, двух рецессивных и аддитивных генов устойчивости к сосудистому бактериозу у линии. И436606.. / •

Предложены методы получения непатогенных штаммов возбудителя сосудистого бактериоза./ способных иммунизировать растения капусты против этого заболевания.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ ; . : ; :

Отобраны сильнопатогенные штаммы X, саюрез1Н5 ру. савре51г15, обеспечивавшие наиболее : дифференцированную оценку устойчивости капусты к сосудистому бактериозу.

Разработан метод оценки капусты на устойчивость к сосудистому бактериозу по листовым высечкам, позволяющий проводить> в расчеплявцемся гибридном потомстве оценку на устойчивость^ к нескольким атаммам патогена одновременно без потери растений ; для дальнейшей репродукции.

Получены 1? непатогенных «таймов X. campestrls pv. caipestrls, йригодных для иммунизации белокочанной капусты.

Выявлены селекционные образца устойчивые к сосудистому бактериозу, и проведен анализ спектра их устойчивости и воз-момного происхомдения и взаимодействия генов.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Основные материалы работы были доломены на конференции молодых ученых "Экологические проблемы защиты растений" (21-24 ноября 1990г.) в Ленинграде: на республиканской конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60- лети» образования Казахского СХИ, в Алма-Ате, 1990 г.; на вколе-семинаре мо-лодх ученых "Генетика, физиология и биохимия микроорганизмов* ' в Алувте, ноябрь 1990 г.; на конференции молодых уччннх ТСХА . Москва. 1991 г.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликованы 3 работы.

ОБЪЕМ И СТРИКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Работа излоаена на 134 страницах машинописного текста, вклвчает 29 таблиц. 16 рисунков и состоит из введения, обзора литературы и.экспериментальной части, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы из 180 наименований, в том числе 95 зарубеяных, лрилояений, справки о внедрении. ■■

: МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

Работа была выполнена в 1989-1992 гг. на базе отдела иммунитета и запиты растений Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур, в лаборатории иммунитета растений Института обвей генетики им. Н.И.Вавилова и во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Сбор инфекционного материала для выделения изолятов X.caipestris pv. caapestrls осуществляли в периоды, наиболее благоприятные для развития заболеваний в Московской, Ленинградской областях и Белоруссии. Выделение проводили по общепринятым в микробиологии и фитопатологии методам (Бельтшкова, Ма-

- б -

тавевскаа, 1368; Кирай и др.. 1974: Чумаков. 1974; Сэги/ 1983: Герхард,1983; Джалилов, J909; Чумаевская, Матвеева, 1989).

Изучение биохимических и морфологических свойств изодятов проводили стандартными методами (Герхард. 1983; Сэги, 1983; Матвеева. Чумаевская,1986). оценка патогенности - в лзборатор^ пых и тепличных условиях, с предварительной проверкой по.реакции сверхчувствительности на растениях-гиндикаторах Pelargonla zonale (К1е>епЪ.1968) и Plectranthus australIs (Самохвалов и др., 1989; Рогачев, 1986). :

Селекционные образцы и гибриды F1 и F2. в том числе с линией PI 436606. предоставленные лабораторией селекции и семеноводства капусты ВНИИССОК, выращивались в течении круглого года в климатических камерах, в течении вегетационного сезона - на опытном поле лаборатории селекции и семеноводства капусты, ;.:•.-■'. v- [• .. '6/

Оценку развития . сосудистого бактериоза проводили сначала по 5 балльной вкале Студенцова с модификациями (Никитина, Сту-денцов, 1971; Сухорукова,1986), а затем по разработанной нами '?-и балльной шкале.

Математическую обработку результатов.опытов проводили мет тодаыи дисперсионного, регрессионного и' кластерного анализа при помощи пакетов- статистических программ для- PC IBM. (IT STATSRfiF 3.0 и SURFER 3.0.,

Погодные условия (среднемесячная температура,: влавность' воздуха и сумма осадков) полевых сезонов 1990-91гг. были типичным по сравнении с многолетними, условия 1992 г. - экстрег мальными по дефициту влаги и высоким средним температурам.

Аля введения систематических поправок на неоднородность опытного участка и инфекционного фона был использован -метод построения; изолиний по точкам контрольных делянок с помоцьв пакета программ SURFER. Результаты каядого'года испытаний суммировались.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ • .СОСТАВ ПОПУЛЯЦИИ Xanthoaonas caapestris pw.caapestrls.

Популяцив Хап1Ьовопаз савре51г15 pv.caBpest.rls оценивали по патогенности. биохимически» признака* и активности энзофер-ментов, часть «танков была такае оценена по спектру общих водорастворимых белков и плазмидному профили.

Мн проводили комплекснув оценку патогенности собранной коллекции X. савре51г1з ру. самрезЬг1з по продоляительности латентного периода, степени развития болезни и способности вызывать сверхчувствительность на растениях-индикаторах.

Общее распределение частот непатогенных С слабопатогенных), патогенных и сильнопатогенных итаммов представлено на рисСоотношение фенотипов близко к распределению 3:7:4 (достоверность по анализу Хи-квадрат 78%), что соответствует результатам предыдущих исследователей (Тивари, 1989). и показывает более высокув приспособленность патогена к растенип-хо-зяину, чем у фитопатогенных псевдомойад, где это соотновение сманено в сторону непатогенных (авирулентйых) ятаммов (Король, 1992).' "

. По морфологическим и некоторым . биохимическим свойствам ятаммы соответствовали признакам рода ХапШнопая (Вегду, 1974), и какой-либо дифференциации выявлено не было (за исключением гидролиза крахмала, интенсивности окраски и синтеза ЗЛС на среде с сахарозой, различия по которым были количественными). Менее однородным было отноаение к источникам углерода. По утилизации рада углеводов (мальтозы, рамнозы, галактозы и глицерина) показана високая вариабельность, не соответствунцая видовым характеристикам X. сапрезЬг^ ру. савре^Нз (Вегееу, 1974). Лла выявления природы этой вариабельности нами был проведен групповой анализ биохимических признаков у сильно, средне и слабопатогенннх втамыов. Как показывает таблица 1, силь-нопатогениые итамма являются наиболее стабильной по биохимическим' признакам группой, соответствухцей патовару X., саирезЬП5 рV,. савре5ЬН5> Вариабельность свойств средне и слабопатогенных «таммов моает указывать на генетическую нестабильность и затрудняет определение видовой принадлежности этих

А В

feo. t. Распределение штаммов X.c.pv.campeatrle по оетогенности; ЬслаОопатогенние;

Таблица 1.

Анализ групповых особенностей в ттилизашга углеводов 7 сильно-'» средне- и слабопато-генншс итаимов хапгьопвпаз сашрезгпэ р». сзшрезгпз.

* группа по пато-генности показатель Углеводы:

СХ ГАЛ *Р НАЛ АР НЛН ТРЕ ПЕЛ РАН СОР ДУЛ ГЛИН ЛАК

г ЭТАЛОН" сильно Иода Частота дисперсия ♦ . й ♦ ♦ ♦ ♦ - 4 - 4 <1 ♦ ♦ ♦ ♦ - ♦ * * ♦ - • • ♦ ."..-■ 1* 1 .67 .87 .6 1 1 1 1 1 ,53 1 .93 .73 О О .12 .12 .26 0 О 0 О О .27 0 . 02 . 21

1 Средне Иода частота дисперсия ♦ .■-.♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ +/- - ♦ 1 1 .83 .92 .58 .91 1 1 .63 .67 .5 .83 .75 .67 0 0 . 15 .08 .27.11 0 0 . 15 .24 .27 . 15 .20 .24

0 Слабо Иода частота Дисперсия .94.94 .83 .83 .61 .94 .94 1 .94 . 61 . 54 .69 . 72 . 72 .06 .06 . 13 . 15 .25 .06 .08 0 .08 .24 .27 . 1 .21 .21

гл-глгасоза. сх-сахароза. гал-галактоза. ФР-ФРпстоза. нал-нальтоза. ар-арабиноза. кан-ианвоэа. тре-трегояоза, НБЛ-цедлобиоза, ран-рамноза. сор-сорсит, дул-дульшгг. глиц-глияерин. лак-лактоза. » - птакн РПО СС13 (Вегвеу.1974)

групп.

Анализ признаков вновь выделенных изолятов позволил определить критерии достаточности числа проведенных тестов для идентификации выделяемых бактерий с вероятностью правильного результата не менее 952. Аналогичная работа,' выполненная для Pseudononas syringae pv. 1асЬгувап5%позволяет значительно уде-вевить и ускорить ход оценки популяций патогенных бактерий (Король , 1992), снизив число необходимых тестов с полутора десятков до 5-?. Они основывались на специфичных морфологических и биохимических признаках X. canpestris pv. catpestris и сопутствующих фитопатогенных и эпифитных бактерий. (Ногвап. «Uvares. 1989)

Основными тестами, позволявшими отобрать изоляты X. caipestrls pv. canpestris, являются морфологические признаки, патогвнность на растении-хозяине, использование глицерина, целлобиоза, отсутствие способности использовать рамнозу, синтез ЗПС и редукция нитратов. Достоверность отбора по этим 5 тестам, проверенная при полном анализе, составляла 9J-39Z.

Анализ результатов оценки активности зкэоферментов. X, campestr1s pv. caapestrls показал отсуствие обязательной связи ленду патогенностьв и. активность» экзоферментов (коэффициенты корреляции 0.35, 0.24 и 0.4 для протеазы, амилазы и пектиноли-тических ферментов соответственно), хотя в группах близких по' происхояденив штаммов, такая зависимость наблюдается.Ыохно проследить обвдю тенденцию в распределении втаыаов по активности Ферментов, имеющее максиму« частот слева от средней, (критерий Скауннеса 0.78 для протеаз, 1.19 для амилазы) (Рис. 2) Такое распределение характерно для признаков, находящихся под негативной регуляцией (Tang et al., 1990 ). 'Активность группы петинолитических ферментов, видимо, является более важным свойством для бактерии, поэтому распределение смещено к нормальному типу, показывая высокую приспособленность штаммов со средней активностью пектинолитических ферментов.

Проведенное изучение электрофоре-тического прй$йля;с-тДель

■ • ■ • .;■■ - и - ■.

них ферментов, показали високув вариабельность их как мевду патоварами X. caapestrls, так и внутри их. (Strlpecke and Rósalo, 1988). Поэтому мы остановились на анализе спектра об-цих водорастворимых белков. Навей задачей в данном разделе работы было удостовериться в однородности выделенных втаммов X. caapestrls pv. canpestris, найти простой способ различить их от велтопигнентированных элифитннх бактерий, в основном Erulnla herbicoia (Королева, 1981) и оценить степень изменения мутантов, имевних морфологические отличия от родительских втаммов.

Был использован вертикальный электрофорез в присутствии DDC-Na по методу Лэммли (Laemuli. 1370) с модификациями. Результаты анализа показали, что спектры белков природных втаммов очень близки друг к другу, независимо от места выделения, мутации проявлявшиеся фенотипически сходным образом сопровоа-давтся аналогичными изйенеииямии спектра белков^ Мутации,,связанные с глубокими изменениями оболочки и физиологии бактерии (бесцветные втаммы),приводят к несопоставимым изменениям белкового спектра. Проведенное; сравнение спектров X. caapestrls pv. caapestrls и Erulnla herbicola показало присутствие не менее 10 отдельных мазерных полос, позволявцих отличать эти два вида, что показывает пригодность метода для анализа видовой принадлевности зелтопигментированных бактерий.

Плазмиды, являясь наиболее мобильной частьв бактериального генома, в то яе время остаются очень стабильным признаком, когда выполняют вазнув роль в приспосабливаемое™ патогена и растенио-хозяину или окрунавщей среде. (Lazo and Gabriel, 1987) Видимо, это определяется особой рольв генов,локализован* них в плазми&ах. Для изучения плазмидного профиля X. caapestrls pv. - caapestrls была проведена подготовительная работа по выбору методик . поззолявдих наиболее детально охватить весь спектр плазмид втаммов и доступных для массовой оценки втаммов.

В работе были использованы стаямы, различающиеся по мор-

- ■ -12 -; фокультуральным, "биохимическим признакам и патогенности. Применение для выделения плазмид X. caapestrls pv. caapestrls десяти микро-методик, рекомендованных для родов Xanthoaonas и Pseudoaonas показало, что:

- ни один из опробованных методов не обеспечивает выделения всего спектра плазмид X. caipestrls pv. caipestrls, и для анализа плаэмидного профиля лучме всего применять методы Kado & Liu (модификация Svanson et al.,1988) и метод Blrnbola, Dolv, '1988 г.: '

- кольцевав молекул» плазмид массой более 45 КД видимо находятся в колллексе с белками и требует для выделения предварительной обработки 30 «1 NaCl в 50 мМ растворе глюкозы или сахарозы (для поддержана« осмотического давления перед лизирова-иием клеток):

-обнаружены по иеньвей мере 4 типа плазмид с массой от 45 до 18 мДа, из которых 2 с наименьвей массой встречаются у 952 атаммов в боль»ом числе копий:

-потеря »тих плазмид. у мутантного втамма МП ( родительский втамм <1) сочеталась с утратой пигментации и.патогенности. •там* 4U был получен с помощью воздействия метаболитами фито-яатогеяного гриба при совместном культивировании (Самохвалов. »88): - :

■ ■ ■ v ■,'•''■■

~огшты,.проведенные с целью элиминирования плазмид традицион-'

■ними методами (высокими температурами и акридином оранжевым),, яе дали ожидаемого эффекта.

На основе полученных результатов мы'можем предположить, • что биохимические признаки у итакмов X. caspostris pv. caapestrls находятся под контролем блока генов, обладающих высокой гомологичностьп в естественной популяции патогена и обеспечивающих контроль за фенотипическим проявлением основной части генома бактерии.

НАСЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ КАПУСТЫ К СОСУДИСТОМУ БАКТЕРИОЗУ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОПЙЛЯЦИИ Xanthoeor.as caapestri? pv.caspestris ПО ОТНОШЕНИИ К ГйСТгНйЮ-ХОЗЯИКЬ".

- 13 '

Принадлеаность -возбудителя сосудистого бактериоза к виду общему с хорошо исследованными в расовом отношении патогенами (X. caapestrls pv. vesicatoria, X. caapestrls pv'. oryzaé, X. caapestrls pv. Malvocearua) и обвие с ними черты в механизме патогенеза CTodd et al.. 1990), заставляет предположить суг чествование расовой дифференциации g X. caapestrls pv. caapestrls. Ряд исследователей отмечая необходимость использовать для оценки устойчивости капусты изолята возбудителя сосудистого бактериоза, выделенные из разных источников (Hunter et al., 1981: Сухорукова. 1987). Несмотря на это, работ по выявление расовых различий а X. caapestrls pv. caapestrls нами не обнаружено.

Используя поколения F2, полученные при скрецивании ряда линий белокочанной капусты с линией PI 436608 китайской селекции, несущей рецессивный ген устойчивости к сосудистому бактериозу (Dlckson, Hunter,199?) и любезно предоставленные нам лабораторией селекции и семеноводства напусти ВНИИССОК, мн разработали метод оценки устойчивости по высечкам из листовой пластинки растений. Из 2-4 листа.сверху с номодьв пробкового сверла высекаат диски диаметром 7 мм,' которые помещав: в1 пробирки с 2-3 мл суспензий бактерий концентрацией 104кл/ал. Пробирки инкубируют в течении 2 суток при 22-24*С, освещенность 4 -6 тыс.лк. Учет проводили по разработанной нами 5 балльной акале: 0 - отсутствие реакции: 1 - слабая мацерация по крав диска; 2 - мацерация не более 1/5 диска; 3 - не более 3/4; 4 -полная мацерация диска. Отдельно учитывали присутствие темно-окравенного кольца, образованного фенольннми ввчестоаии на границе айвой и пораженный тканей.

При оценке влияния концентрации суспензии патогена а температуры были получены результаты, интерполированные методам Кригинга прикладного пакета программ SURFER. Овеяно представленный результат опыта показывает, что период до появления симптомов является минимальным при температуре около 23 С яда всех вариантов (Рис. 3). что указывает на факт наибольшей ско-

А, час.

стесенЬ' < с Основанием 10Рис.Ь.Ьависимость . инкубационного периода (А) от температуры!В) я концентрации : суспензии патогена (С)

в

1 2

6

7

8

9 10

Рве. 4. Распределение впамыде

Хапишшшм сахар««Ш* рт.сыюреЛги ка группы по нуупеюшя» с 20 р&стенпк ¿«пусты с гекяма устойчивости от лвяикР! 438606

А — Степе» вирулентности («г I до 20)

В — • Степень сходства СО

ростк установления совместимости в системе патоген-растение в диапазоне температур оптимальных для растения. Иав вывод подтверждает результаты, полученные для растений напусти с f-геном устойчивости к сосудистому бактериозу.(Staub & Hi1llams. 1972) При анализе устойчивости гибридов Fl, полученных при скрещивании менду собой 6 среднеустойчивых и восприимчивых линий белокочанной капусты, нами был получен слоеный характер наследования устойчивости с аддитивным, нейтральным и негативным взаимодействием генор. Характерен неоднозначный вклад » устойчивость муяских и «снских гамет, знак которого такве зависит от комбинации линий. При теоретическом расчете, полученный результат должен обеспечиваться не менее чем б различными генами. Некоторые из этих комбинаций затем были оценены на устойчивость к нескольким атаммам патогена. Результат подтвердил существование нескольких генов устойчивости, обладавши втам-моспецифичным действием. Этот факт поставил задачу выделения втаммов отличапщихся по вирулентности к линиям и гибридам несущим разные гены устойчивости. Как видно из таблицы 2, в которой представлены .гибриды и сорта капусты, более половины из оцененых образцов (группа Ü) не обладали какой-либо специфичность!) по отновенив к штаммам возбудителя. Средняя пораяен-ность сосудистым бактериозом для них составила 41.5%, для группы В (более устойчивой к штамму 41) - 18.82 (12.67. для самого итаыма 41). а для группы С (устойчивой к штамму Ш) -23.4 X (3.77. для штамма Н1).

Такой результат позволяет говорить о том, что ген (гены) устойчивости к ютамму 41 обладают более общим действием, или находятся в блоке с генами отвечавшими за неспецифичнув устойчивость, тогда как ген (гени) устойчивости к ИГ более специализированы. .В таблице 3 представлены данные по распределении рстений гибридов Fl, устойчивых и восприимчивых к атаммам Л/Иб и 923, вирулентных к генам устойчивости -линии PI 436606. Как видно из этих результатов, суцествует достаточно .большое количесто генов устойчивости к сосудистому бактериозу.

Таблица 2

Распределение некоторых линий и гибридов капусты по отновенивк ктаммам Ка^Ьсвопаг са«рез1г15 р^самрезЬНз.

Поражвнность. X Огнонение

Образец* поравенно-

41 VI лл1( сти 41 к XI

Зимовка 50.0 34.4 50.0 1.42/Я*

1474

К125 ■ 14.4 30.4 45.6 " 0.53/В

КЗ? 50 24.5 40.7 1.78/С

Фора 42.5 5.5 ИЛ • 6.54/С

Ва-йл 35.4 43,7 50.0 .8/0

Лемяй 41,1 31.8 • 50.0 1.39/й

ймагерб^ 56.6 45.7 50.0 \.гт

5.6 13.3 8.5 0 .4 /в

Во-Фо 12.5 20. 0.65/В

40 7.5 15 4.85/С

Таб 10.8 7,2 - 1.82/С

Дт-См 51 36.8 - . ' 1.39/Й

Тр 32.8 37,6 0.92/Й

Дт-Июнм 18.0 35 0.51/В

Июньская 45.7 73.7 - 0.82/й

Ксрб 34.4 30.6 1.12/й

Кср7 15 16.7 0.9 /Й

НСР 95 3.1 2.3 4.0

* группы по преобладания устойчивости к одному из «танков.

Таблица 3 ;

Анализ характера наследования устойчивости к сосудистому бактериозу у гибридов И белокочанной капусты.

Комбина- Доля!2) устойчивых растений Вероятность

ция . и вероятное распределение к: одинаковых

генбв устойчивости

вт ЛЛ16 вт.923 хи-квадрат

иЗ/1 47.7/1:1 42.2/1:1 0.05/0.47 0.73 2.0*10"*

и5/3 23.5/1:3 82.3/3:1* 0.06/0.61

и5/3 «'.5/1:1 81.5/1:1 0.00/0.60 1.0 •:;■.

и7/1 66.7/3:1 83,3/3:1 0.67/0.22 0.81.

и7/1 52.9/1:1 52.9/1:1 0.05/0.05 1.0 V

и11/1 43.8/1:1 50,0/1:1 0.25/0.0 0.62 :

и11/1 25.0/1:3 15.0/3:13 0.0/0.4 0.42

ЗЬ2/1*Р1 42.8/1:1 50.0/1:1 0.28/0.0 0.60 .

2604*ЬЬ1 6.3/0:1 75.0/3:1 0.30/0.0 г.о^кг1

2604*ЬЬ2 12./3:13 100.0/1:0 0.32/0.0 2.1*10^

2604#ЬЬЗ 30,0/1:3 50.0/1:1 0.21/0.0 0.07

*. Вероятность определения устойчивости к обоин «таммам одни» или несколькими сцепленными генами.

Таблица 4

Распределение устойчивых (И), стюдне'устойчивых (М) и восприимчивых (I!) растений в поколении ?2 (один из родителей-линия Р1 436606 )

серия втамм число растений teop, распред.* хи-кв. 355! <т,=.352)

R И S

10 LL1 12 10 23 4(г1г1):3(г1г2):9 0.18

S31 6 22 3(г1г2)'.4(г2И9 0.23

23 LL1 Í2 7 28 4:3:9 0.10

S31 б 13 25 3:4:9 0.16

»для гипотезы, что:гI и г2 - рецессивные гены, г1 действует независимо, г2 действует в присутствии г1.

показывающих разные 'типа взаимодействия, наследуемых возможно независимо, и обладающих специфичности по отношению к отдельным «таймам. Можно предположить, что устойчивость к сосудистому бактериозу наследуется как признак,определяемый многими вариантами одной или нескольких аллелей, подобно признаку самонесовместимости. Это предположение было проверено при анализе более изученной устойчивой линии капусты.

По сообщению М.Диксона, линия китайской селекции РГ 436606 несет рецессивный, ген устойчивости и несколько генов-модификаторов (Dickson, Hunter, 1987). Для изучения характера наследования устойчивости был проведен анализ родительских форм и растений, полученных при скрещивании с линией PI436606 на устойчивость к различным штаммам патогена, отобранных из коллекции Xanthononas caipestris pv, caipestris и дававвих различную реакцию на растениях поколения F2. Штаммы LLI, S31 и штамм 6132. вирулентный к линии PI 436606, использовались для дальнейвей оценки.

Все родительские линии в этом опыте ( кроме PI 436606) и растения F1 были восприимчивы к патогену. При изучении расщепления ' фенотипа в F2 наблюдалось отклонение от соотновёния восприимчивых и устойчивых растений 3:1, ожидаемого для одного рецессивного гена устойчивости. Это отклонение выража-

лось в виде наличия больного числа растений промежуточного ( среднеустойчивого) фенотипа, подходящего под соотновение 4:3:9, характерное для расщепления 2 генов с аддитивным взаимодействием. Одновременная оценка растений к двум различающимся штаммам позволила показать присутствие в линии PI 436606 как минимум, еще одного гена устойчивости, зависимого от г1, определяющего устойчивость к итамму S31, и действующего аддитивно с г1 и только в его присутствии (Табл.ЧV Распределение устойчивых и восприимчивых к LLi (к группе которого по этому признаку относятся 80 7. изученных атаммов) растений, полностью совпадает с результатами, полученными М.Диксоном.В большинстве вариантов, имеющих балл поражения от 1 до 3. .наблюдалось'четко

Таблица 5

распределение птамнов х. с. сатрезичз по группам в соответствия с результатом кластерного анализа (Рис. 'Я.

Группа Итаниы

1 611 26 83 23

2 22 20 31

з Н1Т ЧС21 ВС4 НХ21

4 М1 923^ 921 922

9 41 29 1-12 90-18-1

в ЛЛ1УУ ЛЛ1 46 ЛЛ16

'7 331 88Я7 вВЯв

в дл1ы ЛЛУУ ллг

9 АЛ14П АЛ13 АЛ15 АЛ16

10 АЛ11 АЛ4 £311

таблияа б.

Возникновение и устойчивость иннунизадкн по времени, (сорт Аиагер 611)

Вреия экспозиции, час

О 16

24 40

б сгг. 9 сгг.

ПСР 95

Степень развитии болезни, '/. в варианте:

с преинокУл.

98. О 60.0 55. 6 14. 3 20.0 21.6

б. б

в контроле

97. 5 100 . О 100. О

66. О 100.0 91,0

9. 8

снихеиие развитая болезни к контролю» *

о

го. о

44. 4 83. 4 60.0 ео. 5

Прккачаггне: Экспозиция - с «онеита прекпокудянин до-заражения.

выраженное темноокравенное кольцо на границе здоровой и пораженной ткани, типичное для хиноновых веществ/накапливающихся в тканях устойчивых растений в ответ на вторжение патогена в результате окисления производных фенола.

При оценке растений поколения отнесенных к группе устойчивых, наблюдалось появление фенотипов устойчивых к «таймам, вирулентным к родительской линии Р1436606. Это может означать, что присутствие генов от другого родителя может модифицировать правление устойчивости, расширяя спектр действия на вирулентные прежде втаммы. Результаты проведенного для каждой серии анализа степени влияния второго родителя на проявление (экспрессию) признака устойчивости, полученного от линии Р1 436606. показывают отсутствие связи между реакцией растений к двум разным по происхождению штамма« Ш? и 6112), вирулентным к генам устойчивости в исходной линии Р1 436606. . Ко-

эффициент корреляции между реакцией растений к этим двум втам-мам находился в рамках -0.07 - 0.25, а проведенный методом хи-квадрат анализ сложившихся комбинаций у 167 растений показал, что вероятность определения устойчивости только общими г-гена-ми составляет 2.2*10.

На основании оценки на устойчивость к популяции возбудителя сосудстого бактериоза, нами были отобраны растения высокоустойчивые ко' всем втамкам патогена,и использующиеся в дальнейшей работе по созданию родительских самонесовместимых линий для получения гибридов П.

Полученные результаты показывают, что при выполнении селекционных программ по получению сортов и гибридов белокочанной капусты, устойчивых к сосудистому бактериозу, необходимо использовать доноры специфичной (или олигогенной устойчивости), например Р1436606, в сочетании с родительскими линиями, обепечивавщими стабильность проявления признака для максимально больвей части популяции патогена. Полученные результаты также дают подход к изучению расового состава популяции возбудителя сосудистого бактериоза и прогнозированию успевности -

внедрения устойчивых сортов и гибридов капусты в производство.

На основе анализа результатов оиенки 34 ктзнмов X. саврез1г!з ру. савре51г1з, выбранных случайно из популяции патогена, на 168 растениях поколения Р2, полученных при скрещивании линии Р1 436606 с 6 другими линиями, были выбраны 20 растений,показавшихНаиболее дифференцированную реакцию на за-раяение патогеном. Для изучения степени различия этих 34 штаммов был использован мотод кластерного анализа (Двран, Оделл, 197?) - группировка объектов на основе коэффициента принадлежности (В-Коэффициент). На практике мы вычисляли Б как коэффициент сходства.по формуле:

В= (Нвс.-Нобц.З/Ивс.«100, где N064,- число общих признаков, Нвс,- число признаков, участвовавших в анализе (число отобранных растений).

На рисунке 3 приведены результаты анализа. Выделенные десять групп штаммов были сопоставлены между собой по биохимическим признакам, включая активность зкзоферыентов. Признак вирулентности к определенным генотипам растений не бил связан с биохимическими свойствами и с общим уровнем патогенности и являлся наиболее стабильной характеристикой штаммов, меныае всего изменяющейся при мутагенезе и естественной диссоциации штаммов, в отличие от биохимических показателей. Видна группировка штаммов, связанных общим местом выделения или родителем («таммн белорусского происхоядения, группы с названиями и 93-, ЛЛ-.йл.) (Табл.5).

Полученные результаты не противоречат нашим предполонени-ям о существовании расоспецифичности во взаимоотношениях патогена с белокочанной капустой и ставят задачу выделения константных линий растений, обеспечивающих стабильные результаты при дифференциации-популяции X.с.ру.сашрезЬг СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИШНИЗИРЗЮЦИХ"ЙТЙММОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ. ' . Потеря патогенности мояет вызываться мутациями в локусах с разными фенотипическими проявлениями: от появления авиру-лентности,- потери ёктивности зкзоферментов или синтеза ЗПС до

• " ■ ■ - 22 - ' '

изменения проницаемости оболочки и ее компонентов (Натышевс-на.я. 1980: Daniels et al. .1904; flou et al.. 1987; .Suanson et al., 1987). Поэтому не каждый непатогешшй мтамм способен служить эффективным индуктором защитной реакции растения, а только сохранивший компоненты, активно взаимодействующие с растение*,(Conrads-Strauch et al., 1990)

Для оценки времен^необходимого для иммунизации, растения лопле преинокуляции спонтанным нелатогенным мутантом /)Я9 с интервалом от S часов до 9 суток проводили инокуляции итаммом АЛ 14/п. Развитие болезни оценивалось через 3 суток.(Табл.&) Как видно из полученного результата реакция растения на преинокуляции непатогенным итаммом занимает не менее S-7 часов, причем до появления максимального эффекта проходит около 40 часов. Результат, полученный для турнепса (Brassica caepestrls) показывает, что через 7-30 часов после инокуляции несовместимым патоваром Х.с. pv.vltians происходит увеличение активности 1,3 -глюконазы и хитиназ/лизоцима в листьях растения, продолжающее наростать в течении 2 суток (50 часов) (Conrads-Strauch et al.. 1990)

Спонтанные мутанты, как правило, происходят от слабопатогенных втаммов, и редко обладают иммунизирующим эффектом. Линь 32Х от общего числа непатогенных итаммов проявляли такую способность и только у 4% втаммов эффективность иммунизации была выае<502. При оценке пар родительский штамм - мутант, выявлена тесная связь между патогенностыо родителя и иммунизирующей способностью мутанта, коэффициент корреляции составил 0.73. Эффективность искусственно полученных мутантов была намного выве, чем у естественных.-непатегеапих итамиов.-Вязиовно,иммунизация связана не только с накоплением антимикробных веществ типа фитоалексинов, но и с активизацией более специфичных к патогену механизмов защиты растения. Больиая эффективность: иммунизации итаммом ЙЛ9 при инокуляция ПЛ14/п, чем при инокуляции Ml (542 и 5Z>, и atuitiias кэ'ирательность втаама Ô/114/3 (78Х и 52.6;г соответственней'. показанная при иммунизации моло;

'' - 23'- ■

дых растений с локоиьв обработки семян. позволяет нам предположить многовариантность защитной реакции и растений капус т, специфичность которой доходит до итаммовой дифференциации.Такой вывод требует от.нас более детального изучения разнообразия популяций патогена и растения-хозяина- применительно к характеру их взаимовтноиений. • ■

Для получения непатогенных втаммов бактерий нам представляется целесообразным использовать глубокие перестановки в ге-• номе,происходящих в состоянии покоя (т.н. диссоциация) и зл\ш-минирование плазмид, в ^расчете на то. что эти изменения поддаются контролю и воспроизводимы.. (ЕегЬагЬ е1 а1., 1981 'Нам не удалось достичь поставленной цели путем применеия традиционных методов, направленных на элиминирование плазмид. Эф-, фективнам приемом здесь оказалось культивирование Х.саврезЬг1з р\>; Ъаврез1г1з с фитопатогенным грибом из рода Й11егпаг1а (Самохвалов, 1988), приводнваее к потере экзофериентной активности, пигментации и утрате 2 легких плазмид массой около 15-20 ИДа. К соваленив, полученные таким методом нутантные итамиы .имели не самуо высокую иммуниэирувцув способность в ходе двухлетних испытаний. •

Наиболее аффективным методом получения инмуниэируючих втаммов оказалось введение культуры бактерий в состояние покоя с последующим отбором диссоцикроваавих фора. Таким способом был получен мутант ЯЛ14/3, показавший эффективность по снивенив развития сосудистого бактериоза в полевых условиях от 25 до 5? у,. Двухлетние испытания на искуствонном инфекционном участка показали, что:

.-иммунизация при двух или трех-кратних обработках, начиная с •ранних стадий развития капусты,сильнее сниаает площадь под линией кривой развития,чем само развитие болезни: :-максииальное снижение развития болезни к моменту уборки кочанов достигается при одной обработке в фазу завязывания кочана; -эффективность иммунизации зависит от условий разви/ия болезни и сорта;: наиболее" отзывчивой, среди 4 испытанных средне и позд-

неспелых сортов оказалась Слава грибовская 231, наименее -Московская поздняя 15;

-возможно дальнейиее увеличение эффективности иммунзации растений во взрослом состоянии за счет селекции непатогенных втаммов, т.к. при увеличении концентрации суспензии эффект возрастал.

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая степень гетерогенности по патогеннос-ти популяции возбудителя сосудистого бактериоза капусты в Нечерноземье с преобладанием среднепатогенных втаммов (4Т/Л, но наиболее стабильными по культуральным и биохимическим признакам были сильнопатогенные штаммы, составлявшие 242 от общего числа

2. Найдены по меньвей мере 4 типа плазмид с массой от 45 до 1В МДа и показана высокая однородность изученных втаммов по плазмидному профилю и спектру общих водорастворимых белков.

3. Установлено, что для идентификации патогена с 952 вероятностью достаточно провести тестирование изолята по морфологии, патогенности на растении-хозяине, утилизации глицерина, рамнозы, целлобиози, синтез экзополисахарида на среде с сахарозой и редукции нитратов.

4. Результаты кластерного анализа показали, что для выделения групп втаммов главным признаком является вирулентность к образцам белокочанной капусты, обладаюцих дифференцированной реакцией к возбудители, а не биохимические признаки или пато-генность.

■ 5.На основе анализа расщеплений в и Р2 показано наличие как минимум двух рецессивных аддитивных генов устойчивости к сосудистому бактериозу у линии Р1 436606, действие которых может модифицироваться при скрещивании со среднеустойчивнми линиями белокочанной капусты.

: В. Разработан ускоренный метод оценки устойчивости селекционных образцов в комбинациях . несуиих гены устойчивости . к сосудистому.бактериозу, заключающийся в оценке степени мацерации листовых высечек в бактериальной суспензии возбудителя при температуре 22-24®С, концентрации суспензии 10* кл/ыл и экспозиции 2 суток.

7. Выделены два споо-оба получения непатогенных мутантов, ■

более эффективных по сравнении с традиционными: культюирова-ние с фитопатогенным грибом рода ftlternaria и многократное прохождение культуры патогена через состояний покоя. С их по-моцью выделены 17 мутантных штаммов, способных иммунизировать растение капусты против сосудистого бактериоза.

8, Эффективность иммунизации составляла в лабораторных условиях до.932, в полевых- до 57'/.. Наибольшее снижение развития болезни достигалось при иммунизации в фазу завязывания кочана. Наиболее восприимчивой к иммунизации в полевых условиях среди четырех испытанных сортов была Слава грибовсиая 231, наименее - Московская поздняя 15.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Рекомендуется испытание селекционных образцов белокочанной капусты на устойчивость к сосудистому бактериозу на основе раздельной оценки к группам штаммов патогена.

2. Целесообразно использовать в качестве источников устойчивости высоко и среднеустойчивые самонесовместимые линии капусты, по-разному относящиеся к группам штаммов возбудителя сосудистого бактериоза: PI436606, St, Й1, ВВ и 2604.

3. Рекомендуется проведение испытаний имунизирушщих.штаммов X, caapestrls pv. caupestris. способных снижать развитие болезни в полевых условиях.

По материалам диссертации опубликованы 3 работы;

Самохвалов А.Н., Игнатов fi.K. Активирование иммунитета Brassica oleracea против сосудистого бактериоза, // Биологические науки.-1991.-Но 12.-стр.34-3?

Самохвалов Й.Н., Рогачев И.Б., Игнатов fl.H. Разработка методов-защити капусты от килы и бактериозов //'Тезисы докладов республиканской конференции молодых ученых и специалистов, пос-вяценной 60-летив образования Казахского Ш. ч. И, Алма-Ата, 1990, 165с. ;

Самохвалов Й.Н., Рогачев а.Б.. Игнатов Й.И, Изучение совместного развития возбудителей слизистого и сосудистого бактериоза in vitro // Тезисы докладов конференции молодых ученых. Экологические проблемы защиты растений (21-24 ноября. 1990г.) Л., 1990. -178с.