Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis"

На правах рукописи

ЕЛЬЦОВ Михаил Юрьевич

RPA- и RРА/Кu-тельца в ядрах, сформированных в системе

in vitro Xenopus laevis

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Институте экспериментальной медицины Академии наук Чешской Республики, Прага и в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Иван Рашка

Институт экспериментальной медицины Академии наук Чешской Республики, Прага

доктор биологических наук,

профессор Парфёнов Владимир Николаевич

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Гагинская Елена Романовна

Биологический НИИ СПбГУ, Санкт-Петербург

доктор биологических наук,

чл.-корр. РАН Томилин Николай Викторович

Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Институт экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится 49 ноября 2004г, в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: Тихорецкий пр., д.4,194064 Санкт-Петербург

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан октября 2004 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук . И.И.Марахова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы

Репликация и репарация ДНК необходимы для сохранения и воспроизводства генетической информации. Изучение этих процессов имеет помимо огромного фундаментального важное прикладное значение. Полученные знания находят применение в медицине: в диагностике и лечении заболеваний, связанных с нарушениями в репликационном и репаративном аппаратах клетки (Freeman et al., 1999).

За последние годы достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных механизмов репликации и репарации ДНК у эукариот (DePamphilis, 2003; Friedberg, 2003). Тем не менее, многое остаётся неясным, в частности, как эти процессы организованы на уровне ядра высших эукариот.

«Неклеточная» система X. laevis является единственной широко используемой моделью in vitro, позволяющей изучать репликацию и репарацию ДНК у высших эукариот Данная экспериментальная система основана на способности экстрактов яйцеклеток X. laevis формировать функционально активные ядра на основе привнесённой ДНК, в качестве которой чаще всего используются демембранизированные ядра спермиев. Повышенный интерес к системе in vitro Xenopus объясняется двумя главными методическими преимуществами: во-первых, в ядрах, сформированных in vitro, не обнаруживается транскрипция (Blow and Laskey, 1986), а возможны только репликация и репарация ДНК; во-вторых, неклеточность системы, то есть отсутствие цитоплазматических мембран, открывает широкий спектр экспериментальных возможностей. Несмотря на интенсивное использование «неклеточной» системы Xenopus, ядра, формирующиеся in vitro, оставались мало изученными в плане структурной организации репликации и репарации ДНК. Большинство исследователей в основном ограничивались световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопией — методами, обладающими ограниченной разрешающей способностью (Malinsky et al., 2002). Однако детальное исследование структуры ядра требует дополнительного применения электронной микроскопии и иммуноцитохимии на ультраструктурном уровне.

В основу нашего исследования легли данные, полученные Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1992, 1994). Они изолировали белок, который обнаруживался в многочисленных точечных доменах перед началом репликации в ядрах, сформированных in vitro. Этот белок оказался гомологом репликационного белка A (RPA) у X. laevis. RPA -

3 гас. НАЦИОНАЛЬНАЯ

•ММ ПОТЕКА

консервативный белок, который связывается с одноцепочечной ДНК с высокой афинностью и участвует в процессах репликации, репарации и рекомбинации (Wold, 1997). Предпринятое нами ультраструктурное исследование показало, что в морфологическом отношении RPA-домены представляют собой субъядерные тельца. Кроме того, в ходе предварительных экспериментов нами было обнаружено, что обработка ядер спермиев рестрикционными ферментами стимулировала формирование RPA-доменов. В этом случае RPA-фокусы содержали ещё и белок и поэтому были названы RPA/Ku-доменами. Исходя из того, что белок является необходимым фактором для репарации двухцепочечных разрывов ДНК (ДЦР) по пути негомологичного сшивания концов, мы предположили, что RPA/Ku-домены могут быть связаны с репарацией ДНК, и провели серию экспериментов, результаты которых подтвердили правильность нашей гипотезы.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы является морфофункциональное исследование RPA- и RPA/Ku-доменов. Исходя из этого, были, поставлены следующие задачи:

1) с помощью иммуноэлектронных методов изучить ультраструктуру ЕРА- и RPA/Ku-доменов и их состав;

2) проанализировать функциональное значение RPA/Ku-доменов в процессе репарации ДЦР.

Список используемых сокращений

RPA (replication protein A) — репликационный белок А; НСС - низкоскоростной супернатант; ВСС - высокоскоростной супернатант; ДЦР - двухцепочечные разрывы ДНК; (т.) п.о. - (тысяч) пар оснований.

Научная новизна результатов

В настоящей работе впервые были описаны и охарактеризованы новые структурные единицы ядра - RPA- и RPA/Ku-тельца. По настоящее время данные домены являются единственными ультраструктурно охарактеризованными ядерными тельцами, связанными с синтезом ДНК.

Впервые для индукции двухцепочечных разрывов ДНК в системе in vitro X. laevis были использованы прокариотические рестрикционные ферменты. В отличие от других известных агентов, вызывающих двухцепочечные разрывы ДНК, таких как у-радиация

и некоторые химические вещества, рестриктазы обладают строгой специфичностью и не вызывают повреждений других компонентов клетки.

Впервые обнаружено, что наличие двухцепочечных разрывов ДНК в ядрах спермиев, проинкубированных в экстрактах яйцеклеток X. laevis, вызывает формирование ядерных доменов, содержащих белки RPA и

Дано первое ультраструктурное описание RPA- и RPA/Ku-доменов в ядрах, сформированных в «неклеточной» системе X. laevis.

Впервые проведено иммуноэлектронное картирование распределения RPA и сайтов инициации репликации в RPА-доменах.

Впервые обнаружен феномен «непланового» синтеза ДНК в RPA/Ku-доменах.

Впервые продемонстрировано формирование RPA/Ku-доменов на основе плазмидной ДНК, связанной с магнитными шариками, проинкубированными в экстракте яйцеклеток X. laevis.

Научно-практическая ценность работы

Данная работа является первым описанием новых структурных субъядерных доменов: RPA- и RPA/Ku-телец. Обнаружение структурных доменов, связанных с синтезом ДНК в ядрах, сформированных в «неклеточной» системе X. laevis, имеет теоретическое значение для понимания организации процессов репликации и репарации ДНК на уровне ядра эукариотической клетки. Проведённое ультраструктурное исследование представляет интерес для интерпретации результатов биохимических и молекулярно-биологических исследований, проводимых при использовании системы т vitro X. laevis.

Обнаруженный нами феномен формирования RPA/Ku-доменов может быть использован в качестве метода мониторинга двухцепочечных разрывов ДНК как в ядрах спермиев, так и в ДНК любого происхождения.

Материалы, полученные в данной работе, могут быть включены в курсы лекций по молекулярной и клеточной биологии для студентов соответствующих кафедр высших учебных заведений.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на ХП Всероссийском Симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1999), на семинарах

Лаборатории клеточной биологии и Лаборатории экспрессии генов Института экспериментальной медицины, Прага, Чешская Республика, Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 3 работы.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на_страницах машинописного текста и состоит из

введения и обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего_ссылок.

Работа проиллюстрирована_рисунками и_таблицами.

Автор благодарен сотрудникам лабораторий клеточной биологии и экспрессии генов Института экспериментальной медицины, Прага, Чешская Республика, Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН за постоянную помощь и поддержку в работе. Особую признательность автор выражает научным руководителям В.Н.Парфёнову и И.Рашке. Автор благодарен за помощь в работе ПХранди, У.Лэммли (Женевский университет, Швейцария) и Г.НПочукалиной за помощь в подготовке рукописи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Система in vitro X. laevis

Система in vitro X. laevis основана на способности цитозоля яйцеклеток, формировать

интерфазные ядра из привнесённой ДНК. Цитозольные экстракты могут быть получены

путем центрифугирования яйцеклеток X. laevis на относительно небольшой скорости

(приблизительно 10000х g). Полученные в результате супернатанты, так называемые

низкоскоростные супернатанты (НСС), поддерживают многие функции интактных

яйцеклеток. НСС содержат богатый партикулярный материал, включая рибосомы,

молекулы мРНК, мембранные везикулы, и могут поддерживать трансляцию и

формирование функционально активных ядер на основе экзогенной ДНК. В качестве

последней обычно используются ядра спермиев X. laevis, лишённые мембран путем

обработки детергентом. Будучи добавленными к цитозольному экстракту яйцеклеток,

демембранизованные головки спермиев подвергаются очень быстрой деконденсации

(менее чем за 5 мин), при которой протамины хроматина спермиев удаляются и

замещаются на гистоны, содержащиеся в экстракте (Blow, 1996). Затем на поверхности

6

хроматина аккумулируются мембранные везикулы, и происходит сборка ядерных пор (Lohka and Masui, 1983). В результате формируется ядерная оболочка, способная к избирательному ядерно-цитоплазматическому транспорту (Newmeyer et al., 1986). Подобные ядра, собранные in vitro, способны инициировать и завершить репликацию хромосомной ДНК (Blow and Laskey, 1986).

НСС может быть очищен от мембранных везикул путём центрифугирования на высокой скорости (100000 g.). Полученный супернатант называется высокоскоростной супернатант (ВСС). При инкубации в ВСС ядра спермиев деконденсируются, но ядерная оболочка не формируется. Такие структуры нами были названы ВСС-ядрами.

Структура ядра важна для репликации ДНК. В ВСС-ядрах хотя и формируются пререпликационные центры, не происходит инициации репликации ДНК. Инкубация ВСС-ядер в НСС приводит к формированию ядерной оболочки и инициации ДНК репликации (Sheehan et al., 1988). Таким образом, фракционирование экстрактов яйцеклеток X.laevis позволяет исследовать как события, предшествующие инициации репликации при помощи ВСС, так и последующую репликацию при помощи НСС. Более того, ВСС, приготовленный в условиях, стабилизирующих активность MPF, так называемый митотический экстракт, вызывает реорганизацию ядер спермиев непосредственно в высоко-конденсированные хромосомы (Murray, 1991). Для данного исследования НСС и ВСС были приготовлены по методике Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1992,1994) с незначительными модификациями. Митотический ВСС приготовляли по методу Мюррея (Murray, 1991).

Индукция двухцепочечных разрывов ДНК а ядрах спермиев Xenopus laevis Демембранизированные головки спермиев были приготовлены по методу Лока и Масуи (Lokha and Masui, 1983). Для того, чтобы вызвать ДЦР, была приготовлена следующая стандартная смесь: 40000 демембранизированных головок спермиев (что соответствует 200 нг ДНК), 0.2 единицы рестриктазы на окончательный объем 20 мкл буфера ХВ (10 мМ Hepes/KOH pH 7.4, 250 мМ сахароза, 50 мМ ацетат калия, 2.5 мМ ацетат магния, 1 мМ ДТТ). Смесь была проинкубирована 20 мин при температуре 23 °С. Для инактивации рестриктазы смесь была нагрета до 95 °С в течение 5 мин. Контроль переваривания ДНК был сделан посредством добавления такого же количества плазмидной ДНК (pUC19) на единицу энзима и анализа продуктов при помощи агарозного гель-электрофореза.

Непрямая иммунофлуоресцентнаямикроскопия Для иммунофлуоресценции использовали стандартную смесь для сборки ядер, которая содержала 5 мкл свежеразмороженного экстракта (НСС или ВСС), 5000 головок спермиев (интактных или обработанных рестриктазой), систему регенерации АТФ (2 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0.5 мкг/мл креатинкиназы). Объём смеси доводили до 10 мкл добавлением буфера ХВ. Смесь инкубировали 1 ч при температуре 23 °С. Для контроля зависимости реакции от температуры смесь инкубировали 1 ч при температуре 4 °С. Для контроля энергетической зависимости систему регенерации АТФ не добавляли или же было добавлено 5 мМ аденозин 5'-(Р,у-имидо)трифосфата (AMP-PNP) Эксперименты по конкуренции с одноцепочечной и двухцепочечной ДНК выполнены по методике Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1994) Для мечения синтеза ДНК был добавлен биотинилированный дУТФ в конечной концентрации 0.2 мМ.

После инкубации смесь охлаждали 5 мин на льду и фиксировали 10 мин добавлением свежеприготовленного формальдегида (конечная концентрация 2.5% в ХВ). После фиксации смесь была отцентрифугирована на покровные стекла через 30%-ную сахарозу в ХВ (5 мин, Beckman HB4 ротор, 3000 об/мин). После промывки в PBS (фосфатный буфер) покровные стекла инкубировали вначале с 3%-ным бычьим сывороточным альбумином (BSA, 5-я фракция; Sigma Chemical Co, St. Louis, МО, USA) в PBS в течение 20 мин для блокировки неспецифического связывания антител, затем 1 ч с первыми антителами (афинно-очищенные кроличьи антитела против ХКи86 или RPA 70/34/14 и куриные против RPA70), разведенными в 3%-ном BSA/PBS. Потом следовала промывка в PBS и инкубация со вторыми антителами, связанными с флуорохромом, разведенном в 3%-ном BSA/PBS. Для детекции биотина использовали стрептавидин- FITC.

Все инкубации проводили во влажной камере. После промывки в PBS покровные стекла монтировали на предметные стекла, используя 2-3 мкл монтировочной смеси (10 мМ HEPES/KOH рН 7.4, 1 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 60%-ный глицерин, 1 мкг/мкл парафенилендиамина, 1 мкг/мл DAPT). Для просмотра образцов использовали микроскоп Zeiss Axiophot и конфокальный микроскоп Biorad MRC 600.

Иммуноэпектроннаямикроскопия

Для электронной микроскопии ядра очищали от экстракта центрифугированием через

30%-ную сахарозу в ХВ. Для того, чтобы получить видимый осадок, перед

центрифугированием в пробу были добавлены ядра, изолированные из печени крысы

8

Образцы фиксировали либо в течение 1 ч в 2.5%-ном глютаральдегиде в 0.2 М буфере PIPES (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA, USA) pH 7.0 при комнатной температуре, либо 24 ч в свежеприготовленном 8%-ном формальдегиде (Е. Merck, Darmstadt, Germany) в том же буфере при 4 °С. После фиксации образцы были залиты в 2%-ную низкотемпературную агарозу (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) в PBS для поддержания целостности осадка.

После этого осадки были разрезаны скальпелем на кусочки приблизительно 1 мм3 и далее были сделаны 3 разные проводки: заливка в Эпон, низкотемпературная заливка в Ловикрил (Lowicryl K4M) и инфильтрация криопротектором с посредующим приготовлением ультратонких криосрезов по Токуясу (Tokuyasu, 1989).

Часть образцов, отобранных для заливки в Эпон, была дофиксирована 2%-ным тетроксидом осмия в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.4) 1 ч при 4 °С, промыта несколько раз в том же буфере, обезвожена в серии концентраций этанола, проведена через пропиленоксид и залита в Эпон по классическому протоколу.

Дегидратация образцов при понижающейся температуре (progressive lowering of temperature, PLT) и инфильтрация Ловикрилом (Lowicryl К4МБ, Chemische Werke Lowi GmbH, Waldkreiburg, Germany) были выполнены по модифицированному протоколу Амбрустера (Armbruster, 1983).

Ультратонкие срезы были получены при помощи алмазных ножей (Diatome Ltd., Biel, Switzerland) на ультрамикротоме Reichert Ultracut (Leica, Vienna, Austria). Для блоков из Эпона использовали нож с классическим режущим углом 45°, тогда как для блоков из Ловикрила использовали угол 35°, позволяющий существенно уменьшить компрессию срезов, особенно в случае свежеполимеризованных образцов. Для собирания срезов Ловикрила использовали сетки (200 mesh Gilder), покрытые формварной плёнкой, с последующим вакуумным напылением угля. Для срезов Эпона использовали такие же сетки, но без поддерживающей плёнки.

Для иммуноцитохимии сетки со свеженарезанными Ловикрил К4М срезами инкубировали 30 мин в 4%-ном бычьем сывороточном альбумине в PBS для блокирования неспецифического связывания антител. Все инкубации и промывки были выполнены при комнатной температуре на каплях растворов на поверхности листа парафильма. Объём капель разведений антител -10 мкл, промывок -100 мкл.

Первые и вторые антитела разводили в 1%-ном BSA/PBS. Инкубация с первыми антителами длилась 2 ч. Затем, после промывки в PBS (5 раз по б мин), сетки инкубировали 1 ч со вторыми антителами, конъюгированными с частицами коллоидного золота (диаметр частиц б или 12 нм) (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.). Затем сетки промывали в PBS 5 раз, 30 мин в сумме, фиксировали в 2.5%-ном глютаральдегиде в PBS, чтобы зафиксировать связавшиеся антитела и избежать потери сигнала при контрастировании уранилацетатом. После фиксации сетки промывали в деионизированной воде (5 раз по 4 мин) и высушивали на воздухе.

Реакция с терминальной деоксинуклеотидил трансферазой in situ была выполнена в основном по методу, описанному в литературе (Thiry, 1992; RaSka et al., 1995), с небольшими модификациями. В данном случае использовали золотые сетки, покрытые формвар-карбоновой пленкой. Сетки со срезами инкубировали 30 мин при температуре 37 °С на каплях инкубационной смеси во влажной камере. Инкубационная смесь содержала 20 мкМ биотинилированного дУТФ (Roche Biochemical GmbH, Mannheim, Germany) или 5-бромо-2-деоксиуридинтрифосфата (BrdUTP), 100 мМ какодилата натрия, pH 6.5, 2 мМ CoC12, 50 мг/л BSA (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, US) и 125 U/мл терминальной деоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) (Roche Molecular Biochemical GmbH, Mannheim, Germany). Затем сетки были перенесены на капли той же инкубационной смеси, содержащей 4 мкМ дЦГФ, 4 мкМ дГТФ и 4 мкМ дАТФ (Roche Molecular Biochemical GmbH, Mannheim, Germany) и проинкубированы 10 мин при 37 "С (Kitazawa et al., 1989) После этого сетки обрабатывали 1 ч насыщенным раствором йодида натрия (Е. Merck, Darmstadt, Germany). После промывки в деионизированной воде срезы были окрашены антителами к биотину или к бромоуридину в соответствии с описанным выше протоколом. Для локализации RPA и ДНК на ловикриловых срезах вначале проводили выявление RPA, а затем реакцию с терминальной деоксинуклеотидил трансферазой in situ и иммунодетекцию встроенных модифицированных нуклеотидов.

Срезы контрастировали в 5%-ном уранилацетате в воде (Е. Merck, Darmstadt, Germany) в течение 10 мин для Ловикрила и 30 мин для Эпона, быстро ополаскивали в деионизированной воде (3 капли) и высушивали на воздухе. Некоторые срезы дополнительно окрашивали 15-30 с 0.3%-ным цитратом свинца.

Электронные микроскопы Philips CM100 (Philips, Einthoven, Нидерланды), оснащенный поворачивающимся держателем образцов, и Opton EM 109 Turbo (Opton

Feintechnik GmbH, Oberkochen, Германия) были использованы для просмотра срезов и электроннографии.

Афинная очистка антител иудалениеRPA и Ки из экстрактов яйцеклеток при помощи антител

Белок RPA был очищен из экстрактов яйцеклеток, как описано у Адачи и Лэммли (1992). Субъединицы комплекса были разделены путём электрофореза на градиентном акриламидном геле (7.5-15%) в присутствии додецилсульфоната натрия (SDS-PAGE), перенесены на нитроцеллюлозные мембраны методом диффузии в буфере HCl pH 7, 50 мМ NaCI, 2 мМ EDTA, 0.1 мМ DTT в течение ночи при 50 °С.

После кратковременной окраски в Понсо С (Ponceau S) участки мембраны, содержащие субъединицы RPA, были вырезаны, промыты в PBS и проинкубированы в кроличьей сыворотке анти-RPA или в растворе куриных анти-RPA иммуноглобулинов. Связанные антитела были отмыты в глициновом буфере (рН 2) по протоколу Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1992).

Аффинная очистка антител к Х-Ки86 была выполнена таким же образом при использовании фрагмента Х-Ки8б длиной в 292 аминокислоты, синтезированного в Е. coli.

Для удаления белков из экстрактов при помощи антител 20 мг протеин А-сефарозы CL4B (Pharmacia) увлажняли и несколько раз промывали в PBS при 4 °С, а затем ресуспендировали в том же буфере до конечного объема 100 мкл. Затем добавляли 100 мкл анти-RPA или анти-Х-Ки86 сыворотки, и смесь инкубировали в течение ночи при температуре 4 °С и перемешивании на вращающемся колесе. Сгустки, содержащие антитела, связанные с протеин А-сефарозой, были отделены 30-секундным центрифугированием на центрифуге Clay, перенесены в пробирку объемом 12 мл (Falcon) и промыты 3 раза 8-10 мл PBS и дважды 1мл ХВ буфера.

Равные объемы экстракта яйцеклеток (содержащего систему регенерации АТФ) и сгустков были смешаны и проинкубированы 30 мин при комнатной температуре и перемешивании на вращающемся колесе. Затем смесь была отцентрифугирована 1 мин на центрифуге Clay. Супернатант был отделён и смешан с равным объёмом антитело-протеин А-сефарозных сгустков, и смесь опять была проинкубирована в течение 30 мин при комнатной температуре и перемешивании на вращающемся колесе. После чего смесь была отцентрифугирована дважды по 1 мин на центрифуге Clay, и полученный супернатант был

незамедлительно использован для экспериментов.

И

Мониторинг синтезаДНК

Мониторинг синтеза ДНК (репликационного и репарационного) проводился при помощи добавления в смесь для сборки ядер (1 мкКи на каждые 4 мл НСС или

ВСС). После инкубации в течение 1 или 2 ч (для репликационного и репарационного синтеза ДНК соответственно) были отобраны аликвоты объемом 6 мл. К каждой аликвоте были добавлены 6 мл буфера TENS (10 мМ Tris/HCl pH 8, 1 мМ EDTA, 100 мМ NaCi, 1% SDS), содержащие 10 мкг протеиназы К, и полученные смеси инкубировали 2 ч при 56 °С. Электрофорез в 0.8%-ном агарозном геле в однократном буфере ТВЕ проводили 4-5 ч при напряжении 100 В. Затем гель был высушен и проэкспонирован на плёнке X-omat Polaroid.

Градиенты плотности хлорида цезия были сделаны по методу Блоу и Ласкей (Blow and Laskey, 1986). Для измерения репликационного синтеза для каждого образца были использованы 30 мл НСС, тогда как в случае репарационного - 150 мл из-за меньшей интенсивности синтеза ДНК. Бромодезоксицитозинтрифосфат был добавлен до финальной концентрации 0.25 мМ, а а32р.дАТФ — до 5 мкКи. После реакции сборки ядер образцы были обработаны протеиназой К, экстрагированы фенол-хлороформом и очищены от свободных а32Р-дАТФ при помощи колонки Biogel 60 (BioRad). Фракции, содержащие меченую геномную ДНК, были проанализированы при помощи электрофореза в агарозном геле и авторадиографии.

Использование ДНК, связанной смагнитными шариками, для сборкихроматина

in vitro

Плазмидная ДНК, прикреплённая к магнитным шарикам, была приготовлена в соответствии с опубликованным протоколом (Heald et al., 1996) с небольшими изменениями. Плазмида pSP64 Sat-Sar8 8258 п.н. в длину (Strick and Laemmli, 1995) была разрезана в единственном ВатШ сайте. Полученные однонитевые концевые фрагменты были заполнены при помощи инкубации с фрагментом Клёнова и биотинилированными dATP/dUTP в течение 2 ч при 37 °С. Для того, чтобы устранить свободные биотинилированные нуклеотиды, к реакционной смеси были добавлены NaCl (конечная концентрация 2 М) и поливинилалкоголь (конечная концентрация 5%). Смесь была проинкубирована 20 мин на льду и отцентрифугирована 20 мин на максимальной скорости центрифуги Eppendorf minifuge при 4 °С. Осадок, обогащенный биотинилированной ДНК, был растворён в 100 мкл промывочного буфера: 10 мМ TRIS pH 8, 0.5 мМ EDTA pH 8,2М

NaCl, 5% поливинилалкоголя. Смесь охлаждали на льду 10 мин и центрифугировали, как описано выше. Очистку повторяли 3 раза. Затем осадок ДНК был растворён в 200 мкл буфера, содержащего 10 мМ TRIS рН 8, 1 мМ EDTA рН 8, и добавлен к 130 мкл магнитных шариков, покрытых стрептавидином (Dynal M 280, 10 мг/мл) и уравновешенных промывочным буфером. К смеси было добавлено 150 мкл 10%-ного поливинилалкоголя, 150 мкл 5 М NaCl, 37.5 мкл 1 М TRIS рН 8, 3 мкл 0.5 М EDTA рН 8. Полученную смесь инкубировали на вращающемся колесе в течение ночи при комнатной температуре. При помощи магнита шарики были отделены, 3 раза промыты в промывочном буфере и размешаны в 130 мкл того же буфера. Степень связывания ДНК с шариками, которую определяли при помощи агарозного гель-электрофореза с бромистым этидием, составляла 80-90% исходной плазмидной ДНК.

Магнитные шарики со связанной ДНК были уравновешены буфером Clal (NEB) и проинкубированы с рестриктазой Clal (1 единица/100 нг ДНК) 1 ч при 37 °С для того, чтобы разрезать молекулы ДНК, связанные с шариками обоими концами. В результате данной процедуры получали два связанных фрагмента ДНК: около 3 кб и около 5 кб. Перед добавлением к экстрактам яйцеклеток шарики с ДНК были уравновешены буфером ХВ. Иммуноцитохимия хроматина, связанного с магнитными шариками, была выполнена в точности так же, как и для ядер.

Перед изоляцией белков, связанных с ДНК, шарики были тщательно промыты в буфере ХВ + 0.01 % NP40, затем 2 раза в буфере для рестрикции и проинкубированы 1 ч с определённой рестриктазой.

Для экпериментов по сшиванию ДНК, связанная с шариками, была проинкубирована в присутствии экстрактов яйцеклеток с линеаризированной плазмидой pUC19, меченной на концах После инкубации (1 ч) шарики были промыты в буфере

Tween-20, в буфере ТЕ + 1% SDS и в буфере для рестриктазы Bgin. Затем была добавлена рестриктаза Bgln, и смесь инкубировали 2 ч при 37 °С. Полученные фрагменты ДНК анализировали в 1%-ном агарозном геле; электофорез проводили 5 ч в однократном буфере ТВЕ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка рестриктазами ядер спермиев вызывает образование RPA/Ku-доменов

Для того, чтобы вызвать ДЦР, демембранизированные ядра спермиев X. laevis были проинкубированы с различными рестриктазами 20 мин при 23 °С, Обработанные ядра спермиев инкубировали с ВСС. Подобно интактным они разбухали и деконденсировались в присутствии ВСС-экстракта. Для того, чтобы картировать RPA, использовали афинно-очищенные антитела к субъединице р70. Оказалось, что после обработки ядер спермиев рестриктазами формировалось гораздо больше RPA-доменов и флуоресцентный сигнал был сильнее по сравнению с интактными ядрами, проинкубированными в том же экстракте (Рис. 1А). Как оказалось, различные рестриктазы (например, EcoRI, Dral, PstI) могут активизировать формирование RPA-фокусов, однако их количество и яркость зависит от типа использованной рестриктазы (Рис. 1 А). Было обнаружено, что количество RPA-фокусов зависит от количества энзима, использованного для инкубации головок спермиев (Рис. 1В, сравните 0.02 U, 0.05 U и 1 U EcoRI). Более того, при использовании редко-режущей рестриктазы (например, Noil) выявлялось значительно меньшее количество RPA-доменов на ядро по сравнению с часто-режущей рестриктазой (Рис 1В). Обе рестриктазы были добавлены в одинаковом количестве и в использованных экспериментальных условиях одинаково эффективно линеализировали плазмиду pUC19 Эти данные свидетельствуют в пользу того, что формирование RPA-доменов стимулируется двухцепочечными разрывами ДНК и, по-видимому, в RPA-доменах концентрируются концы повреждённой ДНК.

Нами было обнаружено, что для формирования RPA-доменов в ядрах, содержащих ДЦР, необходимы физиологическая температура и гидролиз АТФ. RPA-фокусы не формируются во время инкубации при 4° С или при добавлении негидролизующегося аналога АТФ (ATP-PNP) (Рис. 1С).

Для того, чтобы оценить природу связи RPA в ДЦР-ядрах, были выполнены

эксперименты по конкуренции с двухцепочечной и одноцепочечной ДНК по методике

Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1994) Мы обнаружили, что RPA-фокусы исчезают

в ВСС ДЦР-ядрах, проинкубированных с одноцепочечной ДНК, связывающей RPA с

большой силой, но остаются неизменными в случае использования двухцепочечной ДНК,

имеющей значительно меньшую афинность к RPA (Рис. 1С). Таким образом, RPA-фокусы

в ДЦР-ядрах подобно RPA-фокусам в интактных ядрах (Adachi and Laemmli, 1994), по-

14

видимому, не содержат высокоаффинных мест связывания RPA, то есть одноцепочечной ДНК.

Формирование RPA-доменов наблюдалось при инкубации головок спермиев, содержащих ДЦР, во всех имеющихся типах экстрактов. НСС, ВСС и митотическом ВСС. В митотическом ВСС RPA-фокусы были выявлены в высоко-конденсированных хромосомах.

Активизация формирования RPA-фокусов в ответ на наличие ДЦр позволяла предположить, что данные домены могут быть местами репарации ДНК. Для того, чтобы проверить эту гипотезу, был картирован белок Ки, который является необходимым фактором репарации ДЦР по пути негомологичного соединения концов разрывов (NHEJ). Используя аффинно-очищенные антитела к белку Ки X. laevis (ХКи86), мы обнаружили, что присутствие двухцепочечных разрывов ДНК влияет на локализацию белка Ки в ВСС-ядрах, вызывая его перераспределение в точечные домены. Тогда как в. интактных ВСС-ядрах белок Ки распределён более диффузно. С помощью конфокального микроскопа было продемонстрировано, что домены RPA и Ки в ВСС-ядрах, содержащих двухцепочечные разрывы ДНК, перекрываются. Поэтому они получили название КРА/Ки-домены.

Рис. 1. (см. с.1б) RPA-фокусы в ядрах, сформированных из ядер спермиев, обработанных рестриктазами. А-С Иммунофлуоресценция с антителами к RPA (р70) на интактных ядрах и ядрах, обработанных рестриктазами. А) Обработка рестриктазой стимулирует формирование RPA-фокусов. Демембранизированные головки спермиев были обработаны в течение 20 мин буфером, не содержащим рестриктаз (no addition), либо содержащим 0 05 единицы активности одной из рестриктаз (EcoRI, Dral, PstI) и затем проинкубированы 1 ч в ВСС при 23 °С. В) Влияние количества рестриктазы (EcoRI 0 01, 0 05 и 1 единиц активности) и частотности разрезания (EcoRI, как часто-режущая, и NotI, как редко-режущая рестриктаза). С) Для формирования RPA-фокусов необходимы физиологическая температура и гидролиз АТФ: контроль (no addition) — ядра спермиев были обработаны 0.02 единиц EcoRI и проинкубированы с ВСС 1 ч при 23 °С; (4°С) -инкубация с ВСС проведена при 4 °С 1 ч с ВСС; (AMP-PNP) - инкубация с ВСС, содержащем 5 мМ AMP-PNP, 1 ч при 23 °С. Эксперимент по конкуренции: ядра спермиев были обработаны 0.02 единиц EcoRI, инкубированы с ВСС 1 ч при 23 °С, а затем выдержаны 30 мин в буфере, содержащем 40 мкМ двухцепочечной ДНК (+dsDNA) или одноцепочечной ДНК (+SSDNA). Каждая микрофотография является проекцией 10-12 оптических срезов. Масштабный отрезок равен 10 мкм.

Ультраструктурное исследование ИРЛ-доменов и ИРЛ/Ки-доменов

При изучении ультраструктуры ВСС- и ВСС/НСС-ядер были выявлены важные различия. ВСС-ядра на электронномикроскопическом уровне выглядели как вытянутые образования, сохраняющие форму ядра спермиев. Размеры ядер и степень конденсации хроматина варьировали. ВСС/НСС-ядра не имели какой-либо определенной формы, а хроматин в них выглядел менее конденсированным. Кроме того, эти ядра были окружены ядерной оболочкой и в них выявлялись предъядрышковые тельца.

В результате проведённых окрасок оказалось, что подавляющее большинство белка ИРА в ВСС- и ВСС/НСС-ядрах сконцентрировано в структурно выраженных тельцах (Рис. 2). Данные тельца были назвали ИРА-тельцами. ИРА-тельца в большинстве случаев имели округлую форму, однако встречались и вытянутые экземпляры. Диаметр телец достигал 500 нм. Количество ИРА-телец в ВСС-ядрах обычно коррелировало со структурой хроматина в ядре. Чем более хроматин был деконденсированным, тем больше телец обнаруживалось в таких ядрах.

На элекронограммах видно, что распределение белка ИРА внутри ИРА-телец не равномерно. Большинство частиц золота располагалось на периферии телец, в ряде случаев образуя кольцевидные фигуры (Рис. 2). В центральной части ИРА-телец частиц золота было значительно меньше. И лишь несколько ИРА-телец имели сигнал только в центре. Такое распределение метки, скорее всего, соответствовало срезам, прошедшим по периферии ИРА-телец. Преимущественно периферическое распределение метки было сходным для всех трёх антител, специфических к определённому компоненту ИРА-комплекса. Данное наблюдение послужило аргументом в пользу утверждения, что белок ИРА распределён преимущественно на периферии ИРА-телец.

Кроме того, мы обнаружили несколько гигантских ИРА-телец неправильной формы, с линейными размерами до 7 мкм. Только три таких ИРА-тельца было выявлено на всех наших препаратах. Белок ЯРА внутри этих гигантских телец был распределён диффузно.

Рис. 2. Электронограмма ультратонкого среза ВСС/НСС-ядра, заключённого в Ловикрил. RPA-тельца (стрелки) выявлены при помощи антител к р14 и вторых антител, связанных с частицами коллоидного золота (12 нм) Р, предъядрышковое тельце

Помимо исследования распределения белка RPA был проведен детальный анализ ультраструктуры RPA-телец Было показано, что по морфологическим признакам RPA-тельца отличаются от окружающего хроматина Таким образом, оказалось, что RPA-тельца могут быть идентифицированы и без окраски антителами к белку RPA. RPA-тельца особенно хорошо различимы на срезах Ловикрила, когда для контрастирования помимо уранилацетата был использован цитрат свинца. Такое контрастирование, однако, приводило к потере тонких структурных деталей На срезах Эпона, контрастированных только тетроксидом осмия и уранилацетатом, хорошо видна фибриллярная структура RPA-телец Фибриллы телец отличались от фибрилл окружающего хроматина

Структура RPA-телец была идентичной в ВСС- и ВСС/НСС-ядрах В ВСС-ядрах RPA-тельца были единственными структурно различимыми доменами В ВСС/НСС-ядрах помимо RPA-телец присутствовали предъядрышковые тельца, которые в отличие RPA-телец обладали гомогенной структурой и высокой электронной плотностью

Наблюдаемая фибриллярная структура RPA-телец позволяла предположить следующее: возможно, RPA-тельца могут содержать ДНК. Для проверки этой гипотезы была использована высокочувствительная реакция с терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой. Метка ДНК была обнаружена в RPA-тельцах и была связана с фибриллами. Таким образом, RPA-тельца содержат ДНК и, по-видимому, являются особым типом хроматина. Плотность сигнала ДНК внутри RPA-телец была, однако, ниже по сравнению с окружающим хроматином. По нашему мнению, это связано с меньшей концентрацией ДНК в RPA-тельцах, что, возможно, отражает меньшую степень компактизации ДНК.

Репликационные сайты на этапе инициации репликации в ВСС/НСС-ядрах были картированы при помощи биотинилированного дУТФ, который добавляли в экстракт, используемый для сборки ядер. Репликационный сигнал был почти исключительно связан с RPA-тельцами. Периферическое распределение кластеров частиц золота наблюдалось в большинстве репликационно позитивных RPA-тельцах. Репликационный сигнал в центре больших RPA-телец, т.е. на нетангентальных срезах, был редок и, если наблюдался, то одновременно с периферическим сигналом.

На ультраструктурном уровне RPA/Ku-домены, выявляемые при помощи непрямой иммунофлуоресценции, соответствовали округлым тельцам с диаметром до 300 нм, специфически окрашиваемым антителами к RPA или Ки86. Данные RPA/Ku-тельца являлись единственными структурно выраженными комлартментами в ядрах, собранных в ВСС на хроматине спермиев, содержащем ДЦР. Интересно, что ультраструктура и распределение RPA в RPA/Ku-тельцах были сходными с таковыми у RPA-телец в ядрах, собранных из интактного хроматина. На ловикриловых срезах RRA/Ки-тельца также имели тонко-фибриллярную структуру. Особенно хорошо фибриллы выявлялись на эпоновых срезах после фиксации тетроксидом осмия. Как показала реакция с терминальной деоксинуклеотидилтрансферазой, RPA/Ku-тельца тоже содержат ДНК, и концентрация метки ДНК в них была ниже, чем в окружающем хроматине.

В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый » синтез ДНК

Нами были подтверждены данные других исследователей (Adachi and Laemmli,1992)

о том, что в ВСС-ядрах синтез ДНК не наблюдается. Однако оказалось, что при наличии

ДЦР меченые дезоксинуклеотиды встраивались в ДНК ВСС-ядер, что показывало наличие

синтеза ДНК. При помощи конфокальной микроскопии и непрямой

19

иммунофлуоресценции было обнаружено, что данный процесс локализован в ИРА/Ки-доменах.

Присутствие синтеза ДНК, вызванного ДЦР, было обнаружено во всех имеющихся видах экстрактов: ВСС, НСС и митотическом ВСС. В последнем случае синтез ДНК наблюдался на конденсированных хромосомах. Таким образом, в ядрах, содержащих ДЦР, наблюдался синтез ДНК даже в условиях, в которых репликация невозможна Данный феномен нами был назван «неплановым» синтезом ДНК, в противоположность «плановому» репликационному, наблюдаемому в фазе 8 в НСС-ядрах.

Для дальнейшего исследования «непланового» синтеза ДНК мы использовали метод центрифугирования в градиенте хлорида цезия. Анализ миграции вновь синтезированной ДНК, меченной бромодезоксиуридином, показал, что в ДЦР-ядрах синтезируются только короткие фрагменты ДНК.

Для того, чтобы исследовать роль белков ИРА и Ки в процессе формирования соответствующих доменов и в «неплановом» синтезе ДНК, были использованы специфические антитела для деплеции этих белков из экстрактов. Удаление белка Ки не оказывало ВИДИМОГО ВЛИЯНИЯ как на неплановый ДНК синтез, так и на доменный характер распределения белка ИРА. Напротив, встраивание меченых деоксинуклеотидов резко падало после удаления белка ИРА. Кроме того, в отсутствие ИРА Ки-домены становились мельче, а их количество значительно сокращалось.

RPA и ^ связываются предпочтительно с последовательностями ДНК, проксимальными кДЦИ

Для исследования взаимодействий белков ИРА и Ки с ДНК/хроматином на молекулярном уровне мы использовали молекулы ДНК, присоединенные к твёрдой фазе (микроскопическим магнитным шарикам) Линейная плазмидная ДНК, содержащая биотинилированные нуклеотиды, была связана с магнитными шариками и затем проинкубирована с ВСС.

С помощью непрямой иммунофлуоресценции было обнаружено, что ИРА и Ки колокализированы в точечных доменах, распределённых вокруг всей поверхности магнитных частиц (рис.3). Причём характер флуоресценции (отсутствующей на голых частицах, проинкубированных в ВСС) был подобен свечению ИРА/Ки-доменов в ядрах, содержащих ДЦР. Кроме того, при изменении количества ДНК, связанной с магнитными частицами, количество ИРА/Ки-доменов пропорционально изменялось. Исходя из этих

данных, нами было сделано предположение о том, что белки RPA и Ки связываются с ДНК вблизи к концов нитей.

Для проверки данного предположения было проведено картирование распределения белков RPA и Ки вдоль нитей ДНК по отношению к ДЦР (т.е. в данном случае к концам нитей ДНК), С этой целью два фрагмента ДНК длиной 30 и 180 п.о. соответственно были отрезаны при помощи рестриктаз от концов ДНК проксимальных к ДЦР. Полученные фрагменты хроматина анализировали при помощи электрофореза и вестерн блота. В результате экспериментов было обнаружено, что количество RPA, связанное концевыми 30 п.о., составляет приблизительно 1/5-1/10 часть от общего количества этого белка, связанного с 6800 п.о. ДНК, прикрепленной к магнитным частицам. Таким образом, оказалось, что соотношение RPA/ДНК вблизи свободных концов ДНК в 10-20 раз выше, чем вдоль внутренней части ДНК. Кроме того, внутренний фрагмент длиной в 700 п о. связывал меньше RPA, чем концевые 30 п.о.

Что касается белка Ки, то его концентрация в месте 30 концевых п о. была значительно ниже, чем в случае белка RPA Тем не менее, большее количество белка Ки было связано с концевым фрагментом ДЛИНОЙ 180 п.о. по сравнению с остальной ДНК. Это может быть объяснено свойствами белка Ки, который, как известно, может быстро скользить вдоль цепи ДНК и также быстро перескакивать между концами ДНК (Dynan and Yoo, 1998). Таким образом, полученные результаты продемонстрировали, что белки RPA й Ки сконцентрированы вблизи ДЦР и, следовательно, RPA/Ки-домены представляют собой кластеры концов разрывов нитей ДНК.

Рис. 3 (см. с.22). RPA/Ku-фокусы формируются после инкубации с ВСС на линеаризированной плазмидной ДИК, прикреплённой к магнитным шарикам.

Иммунофлуоресценция с антителами к RPA (RPA) и Ки (ХКи86) на ДНК-магнитных шариках, проинкубированных с ВСС. ДНК, связанная с шариками, окрашена DAPI. В контрольном эксперименте (Control) магнитные шарики без ДНК были проинкубированы с ВСС и окрашены антителами к RPA (1С), рядом представлена микрофотография тех же шариков, сделанная с фазовым контрастом (PC). Иммунофлуоресценция контроля с антителами к Ки дала идентичный результат: отсутствие RPA/Ки-фокусов на шариках без ДНК. Масштабный отрезок равен 5 мкм.

\Ku86 DNA

Control 1С PC

Рис.3

Белки Ku и RPA необходимы для сшивания концов ДНК

Конечной целью репарации ДЦР является соединение концов разрыва путём сшивания. Для того, чтобы выяснить, происходит ли сшивание концов ДЦР в экстрактах яйцеклеток и какую роль в этом процессе играют белки RPA и Ku, в качестве модели нами была использована ДНК, связанная с магнитными шариками. Линеаризированная плазмидная ДНК меченая была добавлена к ДНК/шарикам.

Полученную смесь проинкубировали с интактным ВСС или с ВСС, из которого были удалены белки RPA или Ku при помощи антител. После 3 ч инкубации ДНК/шарики были отделены при помощи магнита, промыты и обработаны рестриктазой Последовательность, узнаваемая этой рестриктазой, имелась только в ДНК, связанной с магнитными шариками, на расстоянии приблизительно 5 т.п.о. или 3 т.п.о. от свободного конца в зависимости от того, каким концом молекула ДНК была прикреплена к шарику. Соответственно, в случае успешного сшивания линеаризированной плазмиды и прикреплённой ДНК должны были наблюдаться фрагменты приблизительно 7.7 и 5.7 т п о. Данные фрагменты обнаруживались после инкубации с контрольным ВСС. Однако в отсутствие белка Ku ни один из этих двух фрагментов не выявлялся. Удаление RPA вызывало значительное снижение эффективности сшивания. Таким образом, белок Ku и в меньшей степени белок RPA необходимы для сшивания концов ДЦР в экстрактах яиц X. laevis.

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ ультраструктуры и молекулярного состава RPA- и RPA/Ku-доменов в ядрах, собранных в системе in vitro X. laevis В настоящей работе мы описали новые структурные домены в ядрах, собранных in vitro в «неклеточной» системе X. laevis. Данные домены, в морфологическом отношении представляющие собой субъядерные тельца, были названы нами RPA-тельцами в соответствии с белком, обнаруженным в них. Эти тельца содержат ДНК и, по-видимому, представляют собой специфические хроматиновые домены. RPA-тельца, наблюдающиеся в ВСС- и ВСС/НСС-ядрах, имеют идентичную фибриллярную структуру. На электронограммах структура RPA-телец выглядит более тонко-фибриллярной по сравнению окружающим хроматином. Таким образом, организация хроматина в RPA-

тельцах отличается от остального хроматина ядра. Детальная организация хроматина RPA-телец требует дальнейшего изучения.

Наши результаты подтверждают данные предыдущих исследований, использовавших непрямую иммунофлуоресценцию и показавших, что белок RPA в ВСС- и ВСС/НСС-ядрах сконцентрирован в точечных доменах. При помощи иммуноцитохимии на электронномикроскопическом уровне нами было обнаружено, что внутри RPA-телец белок RPA распределён неравномерно и обнаруживается в основном на периферии телец. Более того, оказалось, что синтез ДНК в ВСС/НСС также локализован на периферии телец. Таким образом, можно думать, что компоненты, составляющие RPA-тельца, демонстрируют структурно-функциональную компарментализацию в пределах этих образований.

В предшествующих исследованиях высказывалось предположение, что RPA-тельца являются предшественниками репликационных центров, в которых инициируется и происходит репликация ДНК (Adachi and Laemmli, 1992, 1994). В соответствии с этой точкой зрения, более чем 1000 репликационных вилок должны возникнуть одновременно в каждом RPA-тельце. Однако, по нашим наблюдениям, плотность репликационного сигнала в КРА-тельцах в ВСС/НСС-ядрах была достаточно низкой, что может свидетельствовать о том, что либо репликационные вилки включаются не синхронно, но все же в районе RPA-телец, либо здесь осуществляется только какая-то часть инициации репликации. Второе предположение подтверждается данными Херрика и соавторов (Herrick et al., 2000), которые обнаружили, что инициация новых репликационных вилок в ядрах, собранных в системе in vitro X. laevis, продолжается в течение всей фазы синтеза ДНК. Причём частота инициации, как оказалось, увеличивается к концу фазы синтеза ДНК, когда, как известно, RPA-тельца уже не обнаруживаются (Herrick et al., 2000). Таким образом, вопрос о роли RPA-телец в репликации ДНК остаётся открытым.

Результаты других исследователей ставят под сомнение саму взаимосвязь RPA-доменов с репликацией. Оказывается, что RPA-домены могут быть сформированы в экстрактах, очищенных от необходимых пре-решшкационных факторов ORC и cdc6 (Coleman et al, 1996; Romanowski et al., 1996). RPA-домены не колокализуются с МСМ белками (Kubota et al., 1995; Coue et al., 1997) и могут появляться de novo в ядрах после завершения репликации ДНК (Yan and Newport, 1995). Однако недавние исследования структуры ядра в течение первых делений дробления при помощи иммунофлуоресценции

обнаружили точечное распределение RPA в ядре непосредственно перед началом репликации ДНК (Lemaitre et al, 1998).

Если возникают сомнения по поводу участия RPA-телец в репликации, какова же может быть их реальная функция? Имея в виду их состав, в первую очередь обогащённость белком RPA, который является важным фактором для репарации ДНК, то можно предположить участие RPA-телец в этом процессе.

Наши предварительные эксперименты подтвердили правильность данной гипотезы: действительно, обработка ядер спермиев рестриктазами стимулировала формирование RPA-телец. При этом тельца помимо белка RPA содержали белок Ки, который не обнаруживался в RPA-тельцах, сформированных в интактных ядрах. С одной стороны, это наблюдение подтверждало возможную связь RPA-телец с репарацией ДЦР, а с другой стороны, это могло указывать на существование двух независимых типов телец, содержащих RPA

Проведенное нами ультраструктурное исследование не выявило морфологических различий между RPA-тельцами в интактных ядрах и в ядрах, содержащих ДЦР. Оказалось, что в обоих случаях тельца отличаются от окружающего хроматина, а белок RPA обнаруживается преимущественно на их периферии. Отличительными чертами RPA-телец в ядрах, содержащих ДЦР, были их меньший размер и наличие в них белка Ки.

Обнаруженное структурное сходство между RPA-тельцами в интактных ядрах и в ядрах, содержащих ДЦР, позволяет предположить существование единого типа ядерных доменов - RPA-телец. Однако проверка этой гипотезы требует дальнейших исследований. Вместе с тем, принимая во внимание различия в составе телец (наличие или отсутствие белка Ки), нами были выделены два типа телец: тельца в ядрах, содержащих ДЦР, были названы RPA/Ku-тельцами, а тельца в интактных ядрах -RPA-тельцами.

Морфофункциональный анализ RPA/Ku-телец в ядрах, содержащих ДЦР

Итак, мы обнаружили, что ДЦР вызывают формирование ядерных телец, содержащих

белки RPA и Ки, которые, как отмечено ранее, мы назвали RPA/Ku-тельцами.

Формирование RPA/Ku-телец, так же как RPA-телец, по нашим данным, является

энергетически зависимым процессом. Нами было показано, что добавление

негидролизируемого аналога АТФ препятствует формированию RPA/Ku-телец. Такие же

данные для RPA-телец были получены в экспериментах Адачи и Лэммли (Adachi and

Laemmli, 1992,1994). Так как RPA/Ku-тельца и RPA-тельца являются доменами хроматина

25

с измененной структурой, можно думать, что энергия может быть необходима для модификации структуры хроматина. Такого рода предположение может быть подтверждено данными о необходимости для формирования RPA-доменов гомолога геликазы WRN - фермента, способного к энергетически-зависимой модификации структуры хроматина (Yan et al., 1998; Yan and Newport, 1995).

В RPA/Ки-тельцах нами был обнаружен синтез ДНК, который отличается от такового в RPA-тельцах. Во-первых, он происходит в условиях, когда репликационный синтез ДНК невозможен, как, например, в ВСС-ядрах и в сильно конденсированных хромосомах. Данный феномен нами был назван «неплановым» синтезом ДНК, в противоположность «плановому» репликационному, наблюдаемому в фазе S в НСС-ядрах. Во-вторых, в RPA/Ки-тельцах синтез ДНК ограничен короткими фрагментами. Интересно, что подобную картину синтеза ДНК наблюдали в случае репарации ДПР в клетках млекопитающих (Tomilin et al., 2001). Эксперименты по удалению белков RPA и Ки из экстрактов при помощи антител показали, что «неплановый» синтез ДНК зависит от белка RPA, но не зависит от белка Ки.

ЧИСЛО RPA-телец коррелировало с количеством и типом рестриктазы, использованной для нанесения ДПР. На основании этих данных вкупе с наличием в тельцах белка Ки, являющегося необходимым фактором для репарации ДЦР у метазоа по пути негомологического сшивания концов (Dynan and Yoo, 1998), мы предположили, что в RPA/Ки-тельцах концентрируются концы ДЦР для репарации.

Для того, чтобы проверить данное предположение, мы провели ряд дополнительных биохимических экспериментов, используя в качестве модели ДНК, связанную с магнитными шариками. Данные эксперименты показали, что белок RPA концентрируется вблизи концов ДЦР. Однако, в первую очередь, белок Ки и, в меньшей степени, белок RPA являются необходимыми для сшивания концов ДНК в системе in vitro X. laevis.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что RPA/Ки-тельца представляют собой активные репарационные фабрики, которые собираются и действуют на кластерах повреждений ДНК. Для того, чтобы выяснить взаимодействия белков RPA и Ки и их роль в распознавании и репарации ДЦР в RPA/Ки-тельцах, необходимы дальнейшие биохимические и функциональные исследования. Мы считаем, что разработанная нами экспериментальная система является перспективной моделью для проведения таких работ.

выводы

1. В ядрах, сформированных в системе in vitro X. laevis, можно обнаружить ранее неизвестные структуры, которые, в соответствии с маркерными белками, были названы RPA- и RPA/Ku-тельцами.

2. RPA- и RPA/Ku-тельца имеют сходную ультраструктуру и являются доменами специфически организованного хроматина.

3. RPA- и RPA/Ku-тельца компартментализированы. Белок RPA расположен в основном на периферии телец. В случае ВСС/НСС-ядер места синтеза ДНК также локализируются на периферии RPA-телец.

4. Формирование RPA/Ku-телец вызывается ДЦР и требует гидролиза АТФ.

5. В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый» RPA-зависимый синтез ДНК.

6. Белок RPA концентрируется вблизи концов ДЦР.

7. Белок и, в меньшей степени, белок RPA необходимы для сшивания концов ДНК в системе in vitro X. laevis.

8. RPA/Ku-тельца являются фабриками репарации, которые собираются на кластерах

ДЦР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Grandi, P., Eltsov, M., Neilsen, I, Raska, L (2001). DNA double-strand breaks induce formation of RP-A/Ku foci on in vitro reconstituted Xenopus sperm nuclei. J. CellSci. 114,33453357.

Eltsov, M., Grandi, P., Raska, I. (2000). Ultrastructural characterization of RPA-containing domains in nuclei assembled inXenopus egg extracts. J. Struct. Biol 129,211-217.

Ельцов М.Ю., Гранди П., Рашка И. (2000) Исследование ядерных структур, формируемых в экстрактах из яиц шпорцевой лягушки Xenopus laevis и содержащих репликационный протеин А. Цитология 42,279-280.

Список цитируемой литературы

Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1992) Identification of nuclear pre-replication centres poised for DNA synthesis in Xenopus egg extracts: immunolocalization study of replication protein A, J. CeJlBiol. 119,1-15.

Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1994) Study ofthe cell cycle-dependent assembly ofthe DNA pre-replication centres in Xenopus egg extracts, EMBO J. 13,4153-4164.

Armbruster, B.L., Garavito, R.M., Kellenberger, E. (1983) Dehydration and embedding temperatures affect the antigenic specificity of tubulin and immunolabeling by the protein A-colloidal gold technique, J. Histochem. Cytochem. 31,1380-1384.

Blow, J.J. (1996) Chromosome replication in Xenopus egg extracts, In: Blow J.J. (Ed.), Eukaryotic DNA replication, pp. 1-19, Oxford University Press, New York.

Blow, J.J., Laskey, R.A. (1986) Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract ofXenopus eggs, Cell47,577-587.

Coleman, T.R., Carpenter, P.B., Dunphy, W.G. (1996) The Xenopus Cdc6 protein is essential for the initiation of a single round of DNA replication in cell-free extracts, Cell 87, 5363.

Coue, M., Kearsey, S.E., Mechali, M (1997) Chromatin binding, nuclear localization and phosphorylation of Xenopus cdc21 are cell-cycle dependent and associated with the control of initiation of DNA replication, EMBO J. 15,1085-1097.

DePamphilis MX. (2003) The 'ORC cycle': a novel pathway for regulating eukaryotic DNA replication. Gene. 310,1-15.

Dynan, W.S., Yoo, S. (1998) Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids, М/с/. Adds Res. 26,1551-1559.

Freeman, A, Morris, L.S., Mills, A.D., Stoeber, K., Laskey, R.A., Williams, G.H., Coleman, N. (1999) Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy, Clin. Cancer. Res. 5,2121-2132.

Friedberg E.C. (2003) DNA damage and repair. Nature. 421,436Л440.

Heald, R, Tournebize, R, Blank, Т., Sandaltzopoulos, R, Becker, P., Hyman, A., Karsenti, E. (1996). Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts, Nature 382,420-425.

Herrick, J., Stanislawski, P., Hyrien, O., Bensimon, A. (2000) Replication fork density increases during DNA synthesis in X. laevis egg extracts, J. Mol. Biol. 300,1133-1142.

Kubota, Y., Mimura, S., Nishimoto, S., Takisawa, H., Nojima, H., (1995) Identification of the yeast МСМЗ-related protein as a component ofXenopus DNA replication licensing factor, Cell81,601 -609.

Lemaitre, J.M., Geraud, G., Mechali, M (1998) Dynamics of the genome during early Xenopus laevis development: karyomeres as independent units of replication. J Cell Biol. 142: 1159-1166.

Lohka, MJ., Masui, Y. (1983) Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science 220,719-721.

Malinsky, J., Kobema, K, Bednar, I, Stulik, J., Raska, I. (2002) Searching for active ribosomal genes in situ: light microscopy in light ofthe electron beam, J. Struct. Biol. 140, 227231.

Murray, A.W. (1991). Cell cycle extracts, Meth. Cell Biol. 36, 581-604.

Newmeyer, D.D., Lucocq, J.M, Burglin, T.R., De Robertis, E.M. (1986) Assembly in vitro of nuclei active in nuclear protein transport: ATP is required for nucleoplasmin accumulation, EMBOJ. 5,501-510.

Raska, L, Dundr, M, Kobema, K, Melcak, L, Risueno, M C, Torok, I. (1995) Does the synthesis of ribosomal RNA take place within nucleolar fibrillar centres or dense fibrillar components? A critical appraisal, J. Struct Biol .114,1-22.

Romanowski. P., Madine, MA., Rowles, A, Blow, J.J., Laskey, R.A. (1996) The Xenopus origin recognition complex is essential for DNA replication and MCM binding to chromatm, Curr.Biol 6,1416-1425.

Sheehan, MA., Mills, A.D., Sleeman, AM , Laskey, R.A., Blow, JJ. (1988) Steps in the assembly of replication-competent nuclei in a cell-free system from Xenopus eggs, J.Cell

BH106,1-12.

Thiry, M. (1992) Ultrastractural detection of DNA within the nucleolus by sensitive molecular immunocytochemistry, Exp. Cell. Res. 200,135-144.

Tokuyasu, K.T. (1989). Use of poly(vinylpyrrolidone) and poly(vinylalcohol) for cryoultramicrotomy, Histochem J. 21,163-171.

Tomilin, N.V., Solovjeva, L.V., Svetlova, MR, Pleskach, N M, Zalenskaya, I A., Yau, P.M., Bradbury, E.M. (2001) Visualization offocal nuclear sites ofDNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. RadiatRes. 156(4):347-354.

Wold, M.S. (1997). Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-bindmg protein required for eukaryotic DNA metabolism, Ann.Rev.Biochem. 66, 61-92.

Yan, H., Chen, C.Y., Kobayashi, R., Newport, J. (1998) Replication focus-forming activity 1 and the Werner syndrome gene product, Nat. Genet 19,375-378.

Yan, H., Newport, J. (1995) FFA-1, a protein that promotes the formation ofreplication centers within nuclei, Sciene 269,1883-1885.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать Формат 60x84/16. Печать офсетная.

Уч. печ. л 0 Тираж /й? . Заказ .

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

»21 1 i О

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ельцов, Михаил Юрьевич

1. Общее введение

2. Обзор литературы

2.1. Репликация ДНК у эукариот В

2.2. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК. Белок Ки

2.3. Обзор экспериментальной системы

2.4. Репликационный белок A. RPA-, RPA/Ku-домены

3. Материалы и методы

3.1. Система in vitro Xenopus laevis

3.2. Индукция двухцепочечных разрывов ДНК в ядрах спермиев

X. laevis

3.3. Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия

3.4. Иммуноэлектронная микроскопия

3.5. Афинная очистка антител и удаление RPA и Ки из экстрактов яйцеклеток при помощи антител

3.6. Мониторинг синтеза ДНК

3.7. Использование ДНК, связанной с магнитными шариками, для сборки хроматина in vitro

4. Основные результаты

4.1. Обработка рестриктазами ядер спермиев вызывает образование RPA/Ku-доменов

4.2. Ультраструктурное исследование RPA-доменов и RPA/Kuдоменов

4.3. В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый» синтез ДНК

4.4. RPA и Ku связываются предпочтительно с последовательностями ДНК, проксимальными к ДЦР

4.5. Белки Ku и RPA необходимы для сшивания концов ДНК

5. Обсуждение

5.1. Анализ ультраструктуры и молекулярного состава RPA-и RPA/Ku-доменов в ядрах, собранных в системе in vitro

X. laevis

5.2. Морфофункциональный анализ RPA/Ku-доменов в ядрах, содержащих ДЦР

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "RPA- и RPA/Ku-тельца в ядрах, сформированных в системе in vitro Xenopus laevis"

Репликация и репарация Д1Ж необходимы для сохранения и воспроизводства генетической информации. Изучение этих процессов имеет помимо огромного фундаментального важное прикладное значение. Полученные знания находят применение в медицине, в диагностике и лечении заболеваний, связанных с нарушениями в репликационном и репаративном аппаратах клетки (Freeman et al., 1999). За последние годы достигнут значительный прогресс в изучении молекулярных механизмов репликации и репарации ДНК у эукариот (DePamphilis, 2003; Friedberg, 2003). Тем не менее, в том, как эти процессы организованы на уровне ядра высших эукариот, многое остаётся неясным. «Неклеточная» система X. laevis является единственной широко используемой моделью, позволяющей иззать репликацию и репарацию ДНК у высших эукариот in vitro. Данная экспериментальная система основана на способности экстрактов яйцеклеток X. привнесённой laevis формировать функционально активные ядра на основе ДНК, в качестве которой чаще всего используются демембранизированные ядра спермиев. Повышенный интерес к данной системе объясняется двумя главными методическими преимуществами: во-первых, в ядрах, сформированных in vitro, не обнаруживается транскрипция, а возможны только репликация и репарация ДНК; во-вторых, неклеточность системы, то есть отсутствие цитоплазматических возможностей. Несмотря на интенсивное использование «неклеточной» системы Xenopus, структурная организации репликации и репарации ДНК в ядрах, формирующихся in vitro, оставалась мало изученной. Большинство исследователей в основном мембран, открывает широкий спектр экспериментальных ограничивалось методами световой, флуоресцентной и конфокальной микроскопии, обладающими ограниченной разрешающей способностью (Malinsky et al., 2002). Очевидно, что детальное изучение структуры ядра требует дополнительного применения электронной микроскопии и иммуноцитохимии на ультраструктурном уровне. Именно такие методы структурно-функционального анализа в совокупности с молекулярными подходами и позволили нам обнаружить и охарактеризовать новые структурные домены в ядрах, собранных in vitro. В основу нашего исследования были взяты данные, полученные Адачи и Лэммли (Adachi and Laemmli, 1992, 1994). Они изолировали белок, который обнаруживался в многочисленных точечных доменах перед началом репликации в ядрах, сформированных in vitro. Этот белок оказался гомологом репликационного белка А (RPA) у Xenopus. RPA консервативный белок, который связывается с одноцепочной ДНК с высокой афинностью и участвует в процессах репликации, репарации и рекомбинации (Wold, 1997). Нами было предпринято морфофункциональное исследование доменов RPA на ультраструктурном уровне. В ходе предварительных экспериментов нами было обнаружено, что обработка ядер спермиев рестрикционными ферментами стимул про вал cj формирование RPA- доменов. Однако в этом случае RPA-фокусы содержали ещё и белок Ки и были нами названы RPA/Ku-доменами. Так как белок Ки является необходимым фактором в репарации двухцепочечных разрывов ДДК (ДЦР), мы предположили, что RPA/Kuдомены могут быть связаны с репарацией ДНК. Для проверки данной гипотезы нами была проведена серия экспериментов, результаты которых подтвердили наше предположение об участии RPA/Ku-доменов в репарации ДЦР. Автор благодарен сотрудникам лабораторий клеточной биологии и экспрессии генов Института экспериментальной медицины, Прага, Чешская Республика, Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН за постоянную помощь и поддержку в работе. Особую признательность автор выражает научным руководителям Владимиру Николаевичу Парфёнову и Ивану Рашке. Автор благодарен Паоле Гранд и Ульриху Лэммли (Женевский университет, Швейцария) за помощь в работе, а таюке Дмитрию Сергеевичу Боголюбову и Галине Николаевне Почукалиной за помощь в подготовке рукописи.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ельцов, Михаил Юрьевич

6. выводы

1. В ядрах, сформированных в системе in vitro X. laevis, можно обнаружить новые неизвестные структуры, которые в соответствии с маркерными белками, были названы RPA- и RPA/Ku-тельцами.

2. RPA- и RPA/Ku-тельца имеют сходную ультраструктуру и являются доменами специфически организованного хроматина.

3. RPA- и RPA/Ku-тельца компартментализированы. Белок RPA расположен в основном на периферии телец. В случае ВСС НСС-ядер места синтеза ДНК также локализируются на периферии RPA-телец.

4. Формирование RPA/Ku-телец вызывается ДЦР и требует гидролиза АТФ.

5. В RPA/Ku-тельцах происходит «неплановый» RPA-зависимый синтез ДНК.

6. Белок RPA концентрируется вблизи концов ДЦР. 7?| Белок Ки и, в меньшей степени, белок RPA необходимы для сшивания концов ДНК в системе in vitro X. laevis.

8. RPA/Ku-тельца являются фабриками репарации, которые собираются на кластерах ДЦР. ^

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации

Grandi, P., Eltsov, М, Neilsen, I., Raska, I. (2001) DNA double-strand breaks induce formation of RP-A/Ku foci on in vitro reconstituted Xenopus sperm nuclei. J. Cell Sci. 114, 3345-3357.

Eltsov, M., Grandi, P., Raska, I. (2000) Ultrastructural characterization of RPA-containing domains in nuclei assembled in Xenopus egg extracts. J. Struct. Biol. 129, 211217.

Ельцов, М.Ю., Гранди, П., Рашка, И. (2000) Исследование ядерных структур формируемых в экстрактах яиц шпорцевой лягушки Xenopus laevis и содержащих репликационный протеин А. Цитология 42: 279-280.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ельцов, Михаил Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1992) Identification of nuclear pre-replication centres poised for DNA synthesis in Xenopus egg extracts: immunolocalization study of replication protein A, J. Cell Biol. 119, 1-15.

2. Adachi, Y., Laemmli, U.K. (1994) Study of the cell cycle-dependent assembly of the DNA pre-replication centres in Xenopus egg extracts, EMBO J. 13, 4153-4164.

3. Armbruster, B.L., Garavito, R.M., Kellenberger, E. (1983) Dehydration and embedding temperatures affect the antigenic specificity of tubulin and immunolabeling by the protein A-colloidal gold technique, J. Histochem. Cytochem. 31, 1380-1384.

4. Baumann, P., Benson, F.E., Hajibagheri, N., West, S.C. (1997) Purification of human Rad51 protein by selective spermidine precipitation, Mutat. Res. 384, 65-72

5. Baumann, P., West, S.C. (1997) The human Rad51 protein: polarity of strand transfer and stimulation by hRPA, EMBO J. 16, 5198-5206.

6. Blow, J. J., Laskey, R.A. (1986) Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs, Cell 47, 577-587.

7. Boubnov, N.V., Weaver, D.T. (1995) scid cells are deficient in Ku and replication protein A phosphorylation by the DNA-dependent protein kinase, Mol. Cell. Biol. 15, 57005706.

8. Brush, G.S., Anderson, C.W., Kelly, TJ. (1994) The DNA-activated protein kinase is required for the phosphorylation of replication protein A during simian virus 40 DNA replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12520-12524.

9. Brill, S.J., Stillman, B. (1991) Replication factor-A from Saccharomyces cerevisiae is encoded by three essential genes coordinately expressed at S phase, Genes Dev.5, 1589-1600.

10. Coleman, T.R., Carpenter, P.B., Dunphy, W.G. (1996) The Xenopus Cdc6 protein is essential for the initiation of a single round of DNA replication in cell-free extracts, Cell 87,53.63.

11. Coue, M., Kearsey, S.E., Mechali, M. (1997) Chromatin binding, nuclear localization and phosphorylation of Xenopus cdc21 are cell-cycle dependent and associated with the control of initiation of DNA replication, EMBOJ. 15, 1085-1097.

12. Cox, L.S. (1992) DNA replication in cell-free extracts from Xenopus eggs is prevented by disrupting nuclear envelope function, J. CellSci. 101, 43-53.

13. DePamphilis, M.L. (2000) Review: nuclear structure and DNA replication, J. Struct. Biol. 129, 186-197.

14. DePamphilis M.L. (2003) The 'ORC cycle': a novel pathway for regulating eukaryotic DNA replication. Gene. 310, 1-15.

15. Donovan, S., Harwood, J., Drury, L.S., Diffley, J.F. (1997) Cdc6p-dependent loading of Mem proteins onto pre-replicative chromatin in budding yeast, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5611-5616.

16. Dynan, W.S., Yoo, S. (1998) Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids, Nucl. Acids Res. 26, 1551-1559.

17. Ellis, D.J., Jenkins, H., Whitfield, W.G., Hutchison, C.J. (1997) GST-lamin fusion proteins act as dominant negative mutants in Xenopus egg extract and reveal the function of the lamina in DNA replication, J. Cell Sci. 110, 2507-2518.

18. Erdile, L.F., Wold, M.S., Kelly, T.J. (1990) The primary structure of the 32-kDa subunit of human replication protein A. J. Biol Chem. 265, 3177-3182.

19. Fairman, M., Prelich, G., Tsurimoto, Т., Stillman, B. (1988) Identification of cellular components required for SV40 DNA replication in vitro, Biochim. Biophys. Acta. 951, 382387.

20. Fakan, S., Hancock, R. (1974) Localization of newly-synthesized DNA in a mammalian cell as visualized by high resolution autoradiography, Exp. Cell Res. 83, 95-102.

21. Freeman, A., Morris, L.S., Mills, A.D., Stoeber, K., Laskey, R.A., Williams, G.H., Coleman, N. (1999) Minichromosome maintenance proteins as biological markers of dysplasia and malignancy, Clin. Cancer. Res. 5, 2121-2132.

22. Firmenich, A. A., Elias-Arnanz, M., Berg, P. (1995). A novel allele of Saccharomyces cerevisiae RFA1 that is deficient in recombination and repair and suppressible by RAD52, Mol. Cell. Biol. 15, 1620-1631.

23. Francon, P., Maiorano, D., Mechali, M. (1999) Initiation of DNA replication in eukaryotes: questioning the origin. FEBS Lett. 452,87-91.

24. Friedberg, E.C. (2003) DNA damage and repair. Nature. 421, 436-440.

25. Fugmann, S.D., Lee, A.I., Shockett, P.E., Villey, I.J., Schatz, D.G. (2000) The RAG proteins and V(D)J recombination: complexes, ends, and transposition, Annu Rev Immunol. 18, 495-527.

26. Goldberg, M., Jenkins, H., Allen, Т., Whitfield, W.G., Hutchison, C.J. (1995) Xenopus lamin B3 has a direct role in the assembly of a replication competent nucleus: evidence from cell-free egg extracts, J. Cell Sci. 108, 3451-3461

27. Gottlieb, T.M., Jackson, S.P. (1993) The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen, Cell. 72, 131-142.

28. Gottlich, В., Reichenberger, S., Feldmann, E., Pfeiffer, P. (1998) Rejoining of DNA double-strand breaks in vitro by single-strand annealing, Eur. J. Biochem. 258, 387-395.

29. Griffiths, G., McDowal, A., Back, R., and Dubochet, J. (1984) The preparation of cry о sections for immunocytochemistry, J. Ultrastruc. Res. 89, 65-78.

30. Hand, R. (1978) Eucaryotic DNA: organization of the genome for replication. Cell. 15, 317325.

31. Hartl, P., Olson, E., Dang, Т., Forbes, D.J. (1994) Nuclear assembly with lambda

32. DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate, J. Cell Biol. 124, 235-248.

33. Heald, R., Tournebize, R., Blank, Т., Sandaltzopoulos, R., Becker, P., Hyman, A., Karsenti, E. (1996) Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts, Nature 382, 420-425.

34. Herrick, J., Stanislawski, P., Hyrien, O., Bensimon, A. (2000) Replication fork density increases during DNA synthesis in X. laevis egg extracts, J. Mol. Biol. 300, 1133-1142.

35. Hofferer, L., Winterhalter, K.H., Althaus, F.R. (1995) Xenopus egg lysates repair heat-generated DNA nicks with an average patch size of 36 nucleotides, Nucleic Acids Res. 23, 1396-1397.

36. Jeggo, P.A. (1998) DNA breakage and repair. Adv Genet. 38:185-218.

37. Johnson, R.D., Jasin, M. (2000) Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells. EMBOJ. 19, 3398-3407.

38. Karran, P. (2000) DNA double strand break repair in mammalian cells, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 144-150.

39. Kitazawa, S., Takenaka, A., Abe, N., Maeda, S., Horio, M., Sugiyama, T. (1989) Insitu DNA-RNA hybridization using in vivo bromodeoxyuridine-labeled DNA probe, Histochemistry 92, 195-199.

40. Ma, H., Samarabandu, J., Devdhar, R.S., Acharya, R., Cheng, P.C., Meng, C., Berezney, R. (1998) Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells, J. Cell Biol. 143, 1415-1425.

41. Malinsky, J., Koberna, K., Bednar, J., Stulik, J., Raska, I. (2002) Searching for active ribosomal genes in situ: light microscopy in light of the electron beam, J. Struct. Biol. 140, 227-231.

42. Martensson, S., Hammarsten, O. (2002) DNA-dependent protein kinase catalytic subunit. Structural requirements for kinase activation by DNA ends. J Biol Chem. 277, 30203029.

43. Meier, J., Campbell, K.H., Ford, C.C., Stick, R., Hutchison, C.J. (1991) The role of lamin LIII in nuclear assembly and DNA replication, in cell-free extracts of Xenopus eggs, J.1. Cell Sci. 98, 271-279.

44. Murray, A.W., Kirschner, M.W. (1989) Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280.

45. Murray, A.W. (1991) Cell cycle extracts, Meth. Cell Biol. 36, 581-604.

46. Nakamura, H., Morita, Т., Sato, C. (1986) Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus, Exp. Cell Res. 165, 291297.

47. Newmeyer, D.D., Lucocq, J.M., Burglin, T.R., De Robertis, E.M. (1986) Assembly in vitro of nuclei active in nuclear protein transport: ATP is required for nucleoplasmin accumulation, EMBO J. 5, 501-510.

48. Newport, J. (1987) Nuclear reconstitution in vitro: stages of assembly around protein-free DNA, Cell 48, 205-217.

49. O'Keefe, R.T., Henderson, S.C., Spector, D.L. (1992) Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell nuclei: spatially and temporally defined replication of chromosome-specific alpha-satellite DNA sequences, J. Cell Biol. 116, 1095-1110.

50. Palzkill, T.G., Newlon, C.S. (1988) A yeast replication origin consists of multiple copies of a small conserved sequence. Cell. 53, 441-450.

51. Pasero, P., Gasser, S.M. (1998) New systems for replicating DNA in vitro, Curr. Opin. Cell Biol. 10,304-310.

52. Philpott, A., Leno, G.H. (1992) Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts, Cell 69, 759-767.

53. Raska, I., Dundr, M., Koberna, K., Melcak, I., Risueno, M.C., Тбгбк, I. (1995) Does the synthesis of ribosomal RNA take place within nucleolar fibrillar centers or dense fibrillar components? A critical appraisal, J. Struct. Biol. 114, 1-22.

54. Romanowski, P., Madine, M.A., Rowles, A., Blow, J.J., Laskey, R.A. (1996) The

55. Xenopus origin recognition complex is essential for DNA replication and MCM binding to chromatin, Curr. Biol. 6, 1416-1425.

56. Sancar, A. (1996) DNA excision repair, Ann.Rev.Biochem. 65, 43-81.

57. Schar, P. (2001) Spontaneous DNA damage, genome instability, and cancer—when DNA replication escapes control, Cell 104, 329-32.

58. Sharova, N.P., Abramova, E. B. (2002) Initiation of DNA replication in eukaryotes is an intriguing cascade of protein interactions. Biochemistry (Mosc). 67, 1217-1223.

59. Sheehan, M.A., Mills, A.D., Sleeman, A.M., Laskey, R.A., Blow, J.J. (1988) Steps in the assembly of replication-competent nuclei in a cell-free system from Xenopus eggs, J.Cell Biol. 106, 1-12.

60. Smith, G.C., Jackson, S.P. (1999) The DNA-dependent protein kinase, Genes Dev. 13, 916-934.

61. Smith, J. Rothstein, R. (1995) A mutation in the gene encoding the Saccharomyces cerevisiae single-stranded DNA-binding protein Rfal stimulates a RAD52-independent pathway for direct-repeat recombination, Mol. Cell Biol. 15, 1632-1641.

62. Spann, T.P., Moir, R.D., Goldman, A.E., Stick, R., Goldman, R.D. (1997) Disruption of nuclear lamin organization alters the distribution of replication factors and inhibits DNA synthesis, J. Cell Biol. 136, 1201-1212.

63. Strick, R., Laemmli, U.K. (1995) SARs are cis DNA elements of chromosome dynamics: synthesis of a SAR repressor protein, Cell 83, 1137-1148.

64. Sugiyama, Т., Zaitseva, E.M., Kowalczykowski, S.C. (1997) A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein, J. Biol. Chem. 272, 7940-7945.

65. Thiry, M. (1992) Ultrastructural detection of DNA within the nucleolus by sensitive molecular immunocytochemistry, Exp. Cell. Res. 200, 135-144.

66. Thode, S., Schafer, A., Pfeiffer, P., Vielmetter, W. (1990) A novel pathway of DNA end-to-end joining, Cell 60, 921-928.

67. Tokuyasu, K.T. (1989) Use of polyvinylpyrrolidone) and poly(vinyIalcohol) for cryoultramicrotomy, Histochem J. 21, 163-171.

68. Tomilin, N.V., Solovjeva, L.V., Svetlova, M.P., Pleskach, N.M., Zalenskaya, I.A., Yau, P.M., Bradbury, E.M. (2001) Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat Res. 156, 347-354.

69. Varlet, I., Canard, В., Brooks, P., Cerovic, G., Radman, M. (1996) Mismatch repair in Xenopus egg extracts: DNA strand breaks act as signals rather than excision points, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10156-10161.

70. Walker, J.R., Corpina, R.A., Goldberg, J. (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair, Nature 412 (6847),607-614.

71. Wold, M.S. (1997) Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism, Ann.Rev.Biochem. 66, 61-92.

72. Yan, H., Chen, C.Y., Kobayashi, R., Newport, J. (1998) Replication focus-forming activity 1 and the Werner syndrome gene product, Nat. Genet. 19, 375-378.

73. Yan, H., Newport, J. (1995) FFA-1, a protein that promotes the formation of replication centers within nuclei, Sciene 269, 1883-1885.

74. Zyskind, J.W., Smith, D.W. (1986) The bacterial origin of replication, oriC. Cell 46, 489-90.