Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль видимого света в процессе спорогенеза ASPERGILLUS JAPONICUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль видимого света в процессе спорогенеза ASPERGILLUS JAPONICUS"

ТГл; Я ''•

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ РАН

На правах рукописи Ш 582.282.123.4:632.335.43:577.1

ГОРНОВА ИРИНА БОРИСОВНА

РОЛЬ ВИДИМОГО СВЕТА В ПРОЦЕССЕ СПОРОГЕНЕЗА абршлылб лароглсиб

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1Э92

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель:

доктор бяологнчаских наух: профзссор Е.П.Фвофалова

Стадиальные оппоненты:

д.б.н., прсфссор Градова Н.Б.

д.О.н., профессор Плакунов В .К.

Вздутая организации: Московский Государственный Ушторситот ш. У.В.Ломоносова

на засоданш Специализированного совета Д.002.64.01. п Институте ьшкройпологш РАН по адресу: 117811, Цоскв пр-т 60-лэтея Октября, д.7, кор.2.

С диссертацией кожно ознакомиться в бнблаотвке 1ЕЙ ГА Автореферат разослан ¿¿¿^^л 19Э2 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат бяолзгяческих наук Лг^/и^-гя.е. }Шппш

Защита состоится

РОССИЙСКАЯ 1ГГ'- ..»

;УДАРС fвгннАЯ " ' • -Щ

БИБЛИОТЕКА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Свет с дашнаки волн 400-650 ™ является цним из постоянно действующих и ш)5роко распространенных природных акторов.

В настоящее время хорошо изучено влияние света на фотосинте-аческую активность организмов. Однако этому природному фактору но двляли должного внимания в биологических исследованиях и биотэх-ологичоских разработках с гетеротрофными организмами. Там не мв-ее, в последние годы существенная роль видимого света в жизнадея-ельности нефототрофных организмов подтверждается все новыми кс-лэдованиями. Показано, что под фотоконтролем находятся: образова-не репродуктивных клэток у некоторых низших эуквриотов; прорэста-ие спор грибов и бацилл, скорость роста клеток и in размеры, кле-очное дыхание, циркадные рят-и, биосинтез пигментов, транспорт ощэств, скптэз и активность ферментов, дефэсфорилированиэ белков, такта процессы движения (Конев, Волотовсккй, 1979, Hareling, ihrophir, 1980; Рубин, 1988; Songer, 1384; lauter, Russo, 1990).

Среди фотоэффектов видимого света наиболее изучено его влия-ие на процесс спорообразования у грибов. Однако исследования ог-шичивались изучением действия света на интенсивность спорогенеза [ поисками возможного фоторецэптора, контролирующего этот процесс, [здостагочно внимания уделялось действию света на липидный и углэ-гадный состав спор в процессе их формирования, способности таких шор (С-спор) к прорастанию и хранению, а также исследованию бно-даических отличий в метаболизма мицелпя, выросшего из С-спор.

Мевду тем, результаты этих исследований могли бы дать ценную шфэрмзцию для понимания важнейших вопросов современной фотобиоло-ш. Например, такого малоисследованного явления, как "световая гамять" у грибов /Leutham, sta.trr.an, 1987/, изменения в липидной соштоненте мембран при трансдукции светового сигнала, влияние света на способность клеток переносить состояние онтогенетического знабиоза.

Следует такке отметить, что основные исследования по действий ;вэта на спорообразование грибов проводились с коротковолновой 1эстью оптического излучения: с БУФ и синим светом. Наименее изу-шншм .оставался зеленый свот, считавшийся малоактивным. Мезду гом, в последние годы било установлено, что зеленый свот является

регулятором морфогенеза растений / Негрецкий с соав., 1990/ и вли яет на процесс спорообразования гриба АарегвдПив ¿ароп1оид, повы шая выход спор в начале терминальной фазы в 2-3 раза по сравнени с темновш контролем /Феофшюва с соавт., 1988/. Споры А.¿ароп! с из, образованные при освещении светом с \=530 нм (зеленым) и 65 нм (красный), при прорастании образовывали мицелий, синтезирующи более активную целлобиогидролазу и целлобмеэу соответственно /Фео филова с соав., 1988/.

В свете этих данных, представляло интерес изучение изменени в хипидоом и углеводном составе спор, образованных при освещени спороносцев длинноволновым видимым светом, а также тех изменений которые происходят в химическом составе клеток и интенсивности ростовых процессов у выросшего из таких спор мицелия. Полученные ! этом направлении данные могли также лечь в основу ряда практичен ких результатов и способствовать разработке новых биотехнологий.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установлен» роли видимого света в процессе спорогенеза, а именно изучение ег< влияния на ростовые процессы-, на состав лшшдов и углеводов клето] производственного штамма мщелиаяьного гриба А. ¿ароп!сиз ВКМР-2145.

Конкретные задачи исследования касались следующих вопросов:

1.Изучить изменения в липидаом составе клеток А.э'арогисиз 1 процессе спорообразования.

2.Исследовать влияние видимого света различного спектральной состава на лшюгеяез у спор А.. Зарои!сия в процессе их формирования.

3.определить изменения в составе липидов и интенсивности ростовых процессов мицелия, выросшего из "световых" спор (С-спор), Установить влияние света на образование регуляторов роста у грибет (гиббереллшов, эфиров стерннов). ■

4.Изучить изменения в углеводном составе спор "в процессе и формирования и выявить влияние света с Х^ИО и 650 ни на содержание в спорах резервных соединений: трегалозы, солиолов, триац&п-глицеринов.

5.Исследовать действие света на прорастание спор и установит! связи между этим процессом, химическим составом спор, а также ш способностью к длительному хранению.

6.Выяснить роль длинноволнового видимого света в: I).кодификации липидной компоненты мембран и ростовых процессов в клетка:

- } -

. о'ароп1сиз; 2) образовании запасных соединений в процессе онтоге-этического анабиоза; 3) обеспечении способности спор к прораста-ею и длительному "покою".

Научная новизна работа. Установлена способность длинноволно-ого видимого света влиять на активность ростовых процессов клеток .¿зроп1оиз, а также на их липидный и углеводный состав.

Показано, что действие светового сигнала передеется в следую-ую стадию онтогенеза. А именно, из спор, образованных при освеще-ии, вырастает в темнота мицелий, который активнее образует Оио-ассу и имеет измененный липидинй состав. Характер модификаций ипидного пула зависит от даны волны и интенсивности света.

У А.;)арсп1оив впервые обнаружены гибберэллиноподобные соеди-ения (ГС), присутствующие в свободной и связанной форма и контро-ирующие активность ростовых процессов. В онтогенезе А.Зарогиоив роксходит смена регуляторов роста (ГС на эфира стеринов), которая скоряется под действием света. Так, свет поникает содержание ГС в порах, но повышает уровень других ростактивирущих соединений -фиров стеринов.

Впервые у аскомицетшх грибов изучены изменения в составо и одэржашш углеводов в процессе спорогенеза. Показано, что при армировании спор происходит уменьшение пула глвкози и увелкчива-тся содержание маннита, а далее трегалозы. Свет активно изменяет глеводный пул спор, увеличивая содержание глюкозы. Выявлены корреляции между содержанием з спорах определенных углеводов (глюко-ц, трегалозы) и способностью спор А..)ароп1сиз к длительному хра-:ению и прорастанию. Установлена способность трегалозы предохранять клеточные мембраны от повревдений при дегидратации. На осно-юнш полученных данных высказываются предположения о биологичес-:ой функцни глюкозы и трегалозы в клетках грибов.

Практическая значимость работы. Выращивание спорового посев-гаго материала в условиях освещения зеленил светом дает воэмож-гость, не изменяя существенно технологическую схему, активировать юст млцелия. Данные о действии света на лишда клеток л. Зарогпсия гогут быть использованы для получения более ненасыщенных лшшдов, Юогащетшх определенными длшшоцепочечкыми кирнвдяг кислотами и :одержапих в различных соотношениях основные фосфоливдн грибов: росфотидялэтаиоламин к фосфэтвдилхолш, что представляет интерес-уш микробной олообиотехнологки.

Результаты исв/едэвзкйй о влиянии света на запасные со едина-

ния спор (трэгалозу, полиолн, триацилглицерины) могут быть исполь зоваш работниками коллекций при изучении способности спор гриба к длительному хранений и прорастанию.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опу Слпковано 10 работ. Основнне -результаты исследования были доложен на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" /Пу щшю, 1989/, 10-м Европейском Конгрессе микробиологов /Таллин 1989/, Всесоюзной конференции "Микроорганизм - стимуляторы и ин габиторы роста растений и животных" /Ташкент, 1989/, конференци молодых ученых биологического факультета МРУ "Проблемы современно биологии" /Москва, 1990/, Всесоюзной конференции "Целлюлоза-ЭО /Казань, 1990/, Республиканской конференции молодых ученых по био химии /Ростов Великий, 1991/. Цикл работ по материалам диссертант отмечен премией на конкурсе научных работ Института микробиологи РАН /1991/.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах каашнописшго текста п содержит 4 таблицы и 39 рисунков Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной час та, обсукдения результатов и выводов. Список датируемой литератур включает ^¿наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования.' Объектом исследования служи! шщелиаль ный гриб порядка Eurotiales класса Asocrnycetes рода Aspergillu штамм Aspergillus ¿japonicus ВИЙ1- 2145.

Условия культивировышя. Культивирование гриба проводили колбах емкостью мл, содержащих 50 мл ферментационной среды при 28°С ± 1° на круговой качалке (1б0-170о0/мин). В работе ис пользовали шдифицированну» среду Тудвшга /Михайлова и др.,1983/.

Для получения спор A.japonious выращивали в чашках Петри и сусло-агаровой среде. Для последующего культивирования на кидас среде использовали 3-х суточные спори. Спора собирали "водным спс собой" /Uaiidels, 1981/.

Липида экстрагировали по методу Фольча /Polch et al., 1957/ определяли гравиметрически.

Разделение липидов на полярные и нейтральные фракции провода ли методом колоночной хроматографии на силикагеле I, I007Ï60 chems ро1/Кейтс,1975/, а 7 атасе на микроколоиках с сшшкагелем "SEP- PAS

фирмы WatorB Associates (США) /Juaneda,Rooquelln,19S5/.

Состаз яирных кислот липидов в Форчэ т. метиловых эфиров определяли методом ГНХ /Кейтс,1375/ на газояидхосгиом хроматографе "Модель 3700".В качество стандартов использовали скэсь L-207 и IISÖOp ИОТЙЛОЕЫХ ЭффОВ ХИрНЫХ КИСЛОТ С Cjg по (Serva).

ГонкослоЯяуз хроматограф®» липидов проводили на пластонках с спликагелят КСК и на пластинках фирмы líerk. Для хроматография пвйтральпшс липидов использовали систему растворителей гаксан-серный эфир-уксусная кислота /05:15:1/. Для разделения фосфолипидов применяли двутарную хроматографии в esc течах растворителей гексан-сершй эфетр-уксуснзя кислота (85:15:1) и хлороформ-кетанол-уксусная телота-вода (25:15:4:2). Для разделения глшеолшвдов использовала снетега: хпороформ-мзтанол-ацэтон-уксусняя кислота (10,5:2,1:3,6:0,05 и 10,5:3,6:3,6:0,15), а такнэ систему хяоро-форм-кетанол-вода (65:25:4). Содержание хгшздов определяли на спектрофотоиотре-денситометре 'Hitachi" (Япония), модель 557.

Включение меченого углэрода в лшнда грибов определяли, Еьгра-щязая~грибн на среде Гудвпна с равномерно меченной гликозоЭ (1,25 Я) с удельной вктиеностыо 50-70 кхКи/г. Для получения индивидуальны« липидов использовали метод хроматографии па бумаге /Kaltes, 1976/. Радиоактивность липидпнх гфепаратов измеряли методом зщд-ксстной сцинциляшш на радиометре LKB -1217 (Швэцяя).

Содержите гиббэреллинов определяли биологическим методом /Протасовэ и др., 1980/. Лля бяотастоа использовались проростка карликового гороха Пионер. Точность опыта ±7%.

Общее содержание водорастворимых углеводов в спорах определяли фенол-сэрным методом /Dubois et al., 1956/ после экстракода! водой на ¡отшдай бэяе.

Качественный анализ Сахаров проводили методом ГЗЮС триме гаяси-лильиых производоня Сахаров /ßpoöci 1975/ на хроматографе "Модель 3700" на колонке длиной 2,0 м с 5% SE-30 на хроматом. Хроматогра-фирование проводили при температурной программе от 130°С до 270°С, со скоростью 4° в минуту.. В качестве внутреннего стандарта использовали а-метил-и-маянозид.

Метод электронного парамагнитного резоязнса спиновых зондов (ЭПР) использовали для исследования поврёадзгай клеточных мемаран. Сгекгры ЭПР определяли на ЭПР-сггекгрсмегре АЕ 4700 • (совместные-исследования со с.н.с. MP РАН Головиной Е.А.).

Микроскопические veтолы исследования

Х.Фазово-контрастное мшсросколирование осуществляли на микроскопе "Reichert Zetopan" (Австрия) с фотонасадкой, сканирукдое -на сканирующем микроскопе "jeol jsm-гЗСО" модель 405 А.

Источниками света служили люминесцентные лампы излучавдие в областа~БШ-700 нм /получены -из ИФР РАН/.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием медианы (MoTi повторность опытов- 5-6 /Ашарин, Воробьев, 1962/. Как дополнительную оценку существенности различий использовали критерий знаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Согласно современным представлениям, у грибов свет воспринимается фотороцептаром, связанны?.», с цитоплазматической мембраной /Witten, Lareon, 1934, КркцккЯ, Чэрнышова, 198Э/. При этом в процессе трансдукщш светового сигнала происходят изменения в липид-ной компоненте мембран, которые могут привести к существенным модификациям в клеточном метаболизма /Shinitsky, 1987; Kumagai, 1983; Феофшюва, 1991/.

Поэтому изучение изменений в лнпидком составе клеток в процессе фотосыорогенеза может дать ценную информацию для рассшрровкк стимулирующего эффекта света на конидаэобразование A.japonio-аз.

Предварительно исследовали изменения в лищдком составе клеток в процесса сворогеноза A.japonicus в темповых условиях.

I. Изменения в липидном составе клеток а.japonicus в процессе

спорообразования. :

В процессе спорообразования различают двэ осно!знш: стадии: индуктивную - образование спороносцэв и терминальную - формирование к созревание спор. У А.з'арогпоиз первая стадия продолжается около 30 часов, а вторая - трое-четверо суток.

Споры А. Зароп1ош обладают экзогенным покоем и характерным для данного типа покоя относительно шзш обида содержанием лши-дов: 5-7% от веса сухой биомассы. Общее содержание лигшдов в процессе спорообразования сохраняется на постоянном уровне, однако

• состав и соотношение отделышх лншдных фракций специфичны для каадой фазы спорогенеза.

Для индуктивной фазы А.оароп1оиз характерно более высокое

содержание полярных липидов, преобладание в составе гликолипидов /Г Л/ моно- и дигалактозилглицеринов, а в состава фоефолкпидов /ФА/ - фосфзтидилэтанолакина /ФЭА/. В терминальной фазо спорогенеза наблюдается увеличение содержания нейтральных липидов /ИЛ/, уровень моно- и дигалактозилглицеринов понижается, а в составе ФЛ начинают преобладать более насыщенные и трудно окисляемо: фосфз-тидилхолин /ФХ/, сфингомиелин /СН/ и фосфатидилинозит /ФИ/. В цл~ тозоло спор, находящихся в начальной терминальной фазе ("молодых* спор), резко возрастает содержание эфиров стерииов, а в липидном пуло зрелых спор повьгаается уровень свободных жирных кислот.

В процессе спорогенеза наблюдаются изменеия в степени ненасн-иенности /СН/ липидов клеток A.o'aponlous. №шболоо низкие значения этой величины характерна для "молода" спор - 0,5-0,6. В отличив от данных, полученных для мукоровызс грибов /Фесфиова, Писареве-кая, 1387/, по мере созревания конидий A.japónicus СК их липидов увеличивается (до 0,8-1,0), что четко коррелирует с увеличением в состава зцилышх цепей липидов линолевой кислоты.

Итак, в данной части рабски установлено, что отдельные стадии спорообразования А.Japonieus отличаются друг от друга по составу липидов, содержанию в них отдельных жирных кислот и по степени яеяэсыаешюсти лшшдоз.

2. Влияние света на лшшддай состав клеток A.japonicus и пе~ редача свотового стимула в после"дущую стадию онтогенеза.

Отмеченные в процессе спорогенеза существенные изменения в липидном пуле позволили предположить, что фотоактквация спорообразования может быть связана со значительными изменениями в липидном составе клеток л.;ароп1сшз. Для проверю! данного предположения исследовали влияние зеленого и красного света на жпидныЯ состав ююток А.¿арогпоив.

Установлено, что в зависимости от длины волны свет окезнвеэт различное действие на фракционный состав липидов, причем действие света проявляется наиболее отчетливо на ранних стадиях спорогенеза. Так, в начале терминальной фазы зеленый свот резко поштааот, а красный увеличивает содержание фракции ГЛ. Противополокное вллян.га 'оказывают зеленый и красный свет и на относительное содэркаште &Ч /Рис.1/.

В индукткрко.1 Зззг спорогекеээ под действием золеного света

Рис Л. Мзизнэшв фракционного состава полярных липидов A. japcnioue в процессе спорообразования под действием света. 1,2 - селзныа сват, 3,4 - красшЗ свет; 1,3 - &Л, 2,4 - ГЛ. » В качества контроля здесь к в дальнейшем использовала спори, выращенные в текшвнх условиях.

ЕОЕШЕехся содержанке непасищенвых £Л: СОА и фосфатцццлсерлнй /ДО/ /Рис.2./. Значительное увеличение уровня ФС нзблэдоется н в зролas гагарет. Содержание Щ под действием залепого света остается шш-хаягха в тэтаяаз зсого процесса спорообразования, хотя шслздово-шя с кочанной по углероду глюкозой показали, что биосинтез КГ при освзцаищ идет активнее. Освещение красным свэтоы напротив увала-члвзег содоргагыю ©lit в такке ФХ. Эти данные, а такаэ сведения, кнзещиэся в литература /Беррада. 1985; Doi et al., 1983; Свлицава, Козлов» 1883/ позволяет предположить, что в передаче зеленого а красного света в клетке грибов иогут участвовать различило спстош езссэздарэв; передача первого, вероятно, осуществляется по енозе-•тцдвшу пути, в второго - по пути, связанному с цДШ.

■ Подтверэденввы сказанному кожет .служить тот (¿акт, что под дайстшеы света активируется синтез фосфагидной кислоты, которая сяушт активатором шсвобоздения арахидоновой кислоты (С20.4) 1:3 других фосфолшодов. Последшш в настоящее время рассматривают как

один лз внеклеточных посредников в метаболизме фосфоляладов /Швец с соавт., 1987/.

опыт/контроль

Рпс.2. Кгкзнаши з составе мембранных лшгадов в процессе спорообразования А.¿ароп1сиз под действием зеленого света.

В пуле гярных кислот под действием золеного света наиболее сильно меняется содержанка олеиновой кислоты, особенно во фракции ©Я. В этой же фракции заметные изменения претерпевают лшголввая кислота, а также СИ лпшдов. Как общую тенденция для всех фракций лдаздотз (ГЛ, ФЛ, НЛ) можно отмотать возрастание при освещении СК в конце тердашальпой фазы. Наиболее значительные различия в действии зеленого и красного света на содержание яиркнх кислот наблюдаются в спсроносцах, где первый поникает, а второй резко увеличивает ив только уровень лкноленовой кислоты, но и СК липидов.

Было показано, что из образованных в условиях освещения спор /С-спор/ вырастает в темноте мицелий, емэщий измененный липидный состав. Т.е. вызванные светом изменения в липидном составе спор передаются в слэдутхцуп стадию онтогенеза. Характер таких изменений зависит от длины волны и интенсивности света, при которых выращи-

вался споровый посевной материал. Отмечены определенные корреляции мевду лигшдным составом С-спор и выросшего из них в темноте мицелия. В случае зеленого света с интенсивностью 1,7 Вт/м2 это: повы-вение СН, уменьшение относительного содержания полярных лшвдов

Опыт/контроль

Опыт/контроль

НА

Рис.З. Передача изменений в соотношении фракций липидов (1) и отдельных фосфолишдов (II), вызванных действием зеленого света в процессе онтогенеза А.Зароп1ош. А - в С-спорах, Б - в шцелш, выросшем в темноте из С-спор.

/Рис.3,I/, резкое возрастание уровня ФС /Рис.3,II/, а также значительные колебания в уровне эфиров стеринов /ЭС/. В мицелии, выросшем из спор, образованных при освещении зеленым светом, повыаэно содержание арахидоновой кислоты, что, как было сказано выше, и в данном случае может быть связано с функционированием инозитидного пути передачи сигнала.

Таким образом, установлено, что свет существенно модифицирует лйпядный состав клеток А.^ёфоп1оиа, причем действие света на ли-пидаую компоненту мембран передается в следу ¡аду» стадию онтогенезг (от спор к мицелию).

3. Действие света на ростовые процессы и образование рогуля-торов роста в процессе онтогенеза а.¿ароп1ошз.

Изложенные выше данные позволяли предположить, что существен-

- rr -

roi9 изменения в липидном составе мембран под действием света долины коррелировать с модификациями в метаболизме A.Japonious и влиять на его ростовые процессы.

Установлено, что зеленый свет влияет на процесс прорастания спор A.japonious, а именно стимулирует набухание конидий и образование ростовой трубки /ТаблЛ/. Однако в дальнейшем элонгация ростовой трубки замедляется и отстает от темпового контроля. Такая смена стимулирующего эффекта на ингибирувдий приводит к ускоренной остановке роста, что в соответствии с законом Клебса способствует интенсификации процесса спорообразования, которую отмечали ранее /Фэофилова с соавт., 1988/.

Изучение прорастания С-спор в условиях темнота показало, что аффект стимуляции светом стадий набухания и образования ростовых трубок передается в следующую генерации /ТаблЛ/. Более того, у прораставших в темноте С-спор бала значительно ускорена элонгация ростовых трубок, чего в первом поколении на наблюдалось. Данная закономерность проявлялась и в условиях глубинного культивирования, причем скорость накопления биомассы (отдаляем, растущим в темноте из С-спор, зависала от длиш волны я интенсивности света, при котором были образованы С-спори. Наиболее эффективным оказалось действие зеленого света с 1=1,7 Вт/м".

Данные о действия света на ростовые процессы гриба и передача этого эффекта во вторув генерации позволили предположить, что при освещения в метках гриба синтезируются какие-то ростстимулирующие соединения. Теоретически такими соединениями могли быть гибберел-линн - гормоны, регулирующие прорастание семян у растений /Taylor, Warsing, 1979; Yanaura et al., 1991/, и рост некоторых грибов, или стерты и их эфиры (ЭС) - нейтральные лттадо, участвующие в иници-. ации роста мицелиальных грибов /Weete, 1989/.

Методом биотестирования удалось показать, что в спорах и мицелии A.japonicus содеряатся гиббереллиноподобнкп соединения й свободной и связапной форме. В пересчете в эквивалента гаСйервлло-вой <шслотн в спорах содержится свободных гиббервллинов - 93,3 кг/г, а связанных - 51,1 пг/г сухой б/смчссн. Содержание ЭС в спорах составляет величину около 15 мг/г. В молодом мицелии (24 часа от начала инкубации) происходит емелэ регуляторов роста: содержание гиббереллияов понижается (свободных до 39,2 нг/г, а связанных до 48,7 нг/г), из сильно возрастает содержание ЭС (от 15 до 50 мг/г). Установлено, что свет значительно ускоряет смену рогуля-

Таблица I. Влнятз зеленого екгта »в нрср&ст&нце спор А. рропкиз

Вр*:?ХП.Ч Вариант Количество спор в стадии Количество спор с рогггоЕоЯ трубочкой

инициация набуяакия мсаыт» ДКЕ-мзтраейеры бояькэ диаметра ¿пори

Генерация I

7 Спет* 22 22 —

/ Темнота" 84 Н г —

8 Свет* — 41 '33 20

8 Темнота* — 61 22 17

Генерация П

7 С-споры 60 25 - 15 - —

7 Т-сяэрь: 62 14 4 _

С-СПОрМ — 18 24 58

8 ..... Т-спорм *** 50 36 14

в)

В и»г всри&хтех сгзста в качества кнрхулята нсполыопым Т-споры.

ИЛ

I / '

я

Ряс.4. Изменения в хзшическом составе спор, образованиях прз освещении зеленим светом (I) ив выросием из них в темноте мицелии (II). I - общее содерзание нейтральных липидов; 2 - содержание ЗС; 3 - свободных гЕбСореллинов; 4 - связешнх гябберэллинов.

торов роста /Рас.4/, что, в свои очередь, вероятно, обеспечивает активацию накопления биомассы .мицелием, выращенным из С-спор в темповых условиях.

В связи с введением метода активации спорного материала свете;? п практику встал вопрос - как такие споры будут храниться п прорастать после хранения? Для этого нужно бнло выяснить, что происходит шд действием света с резервными соединениш^я спор такими, как триацплглшдертш и углевода, поскольку именно от атпх соединения в значительной степени зависит способность грябнст клеток к длительному анабиозу или к активному росту.

4. Углеводный состав клеток А.Зароп1оив и его изменения под действием света в процессе спорообразования.

Было установлено, что в состав водорастворимых углеводов спор

А. Зароп1оиз кроме трзгалозы и гликозн входит рад многовтокныг сшфтов: манниг, арабиг, эритрит н шозит /Рис.Б/.

Рис.Б. Изменение углеводного состава (в % от сукмы Сахаров, А) и суммарного содержания Сахаров (в % от веса сухой биомассн, Б) в процессе спорообразования А. ¿ароп1оия. I - машит, 2 - трегалоза, 3 - глюкоза, 4 - арабит, 5 - эритрит, 6 - шозит. X - суммарное содержание углеводов.

В индуктивной фазе спорообразования в клетках гриба отмечается высокое относительноэ содержание глюкозы, которая является срэ-обладавдим углеводом и составляет около БСЙ от суммы углеводов. В процессе спорогевеза происходит интенсификация синтеза трудншоби-жзуемых углеводов: трегалозы и маннита, а содержание глшозн значительно уменьшается. Понижается в процессе образования спор к общий уровень углеводов /ОУ/, что мокет быть связано с накопленном запасных липидов - триацилглицерийов /ТАГ/, предшественникам! синтеза которых могут слукить резервные углевода /Weete, 1930; ®еофи-лова, 1991/.

Под действием света у спор в процессе созревания повышается оОяее содержание углеводов, но падает уровень ТАГ /Рис.6./, что нэ характерно для покоящихся клеток, но хорошо, согласуется с фактом

в

я

Рис.6. Влияние зеленого света с 1=1,7 Вт/м2 на содержание ОУ и ТАГ в спорах A. Japonioun в процессе та формирования.

Рис.7. Влияние света на содержание осповпчх углеводов платок A.japcnious в процесса скорозбрезованая. При оснащения за.погож слетом (1=1,7 Вт/м2) - А, красным сеттом (1=2,6 Бт/м2) - Б.

I - глшоза, IX - наяЕЯТ, III - трегалоза. - .

ускоренного прорастания С-спор.

Ускорение прорастания спор тесно связано с еще одним впервые установленным феноменом. Под действием красного и особенно зеленого света в созреващих спорах начинает резко возрастать уровень глюкозы по сравнению с темновыми спорами /Рис.7/. Интересно, что данный эффект наблюдается лишь под действием света с меныйей интенсивностью (около 2 Вт/м2). При увеличении интенсивности освещения вдвое свет практически перестает влиять на углеводный состав спор.

5. Взаимосвязь между углеводным составом спор к. japonious и их способностью к хранению и прорастанию. Роль трегалозы "в стабилизации клеточных мембран при дегидратации.

В заводской практике споровый посевной материал A.japonious гранят либо в виде спорукадейся культуры на сусло-агаровых косяках, либо в лиофильно высушенном виде. Оказалось, что при хранении в течении месяца на сусло-агаровой среде, повышенный уровень гликозн в С-спорах понижается до уровня контроля. Бри хранении кз спор в лиофилизированном состоянии даже через 3,5 месяца сохраняется разница в содержании глюкозы мэвду С-спорами и спорами,образованными в темноте /Т-спорами/. Уровень глюкоза в спорах коррелировал с интенсивностью процесса прорастания. У спор, хранившихся на сусло-агаре, разницы в прорастании мэвду опытом а контролем на было, а у лпофшшзированных С-спор сохранялась способность к ускоренного прорастанию (количество проросших спор через 6 часов инкубации было вдвое выше, чем в контроле).

Показано, что при гранении лиофилизярованшх спор понижается ях всхожесть. Однако лиофялизировапш: С-спор« сохраняли всхоезсгь лучше контрольных. Вместе с тем в процессе хранения нвблвдаэтсл понижение в спорах уровня трегалозы, содержание которой в конидиях A.japcnious составляет 35% от суши Сахаров. Предполагают, что этот дисахарид помимо резервной функции может способствовать выживанию клеток при воздействии стрессовых факторов. Это может быть связано с тем, что трогалоза предохраняет мембраны клеток при до-гидратации /Сгояе, Сго«е', 1982; Platt-Aloia, 1988/, Проводя процесс спорообразования при повышенной температуре, получили споры, в которых уровень трегалозы был повывен втрое. Методом ЭПР спиновых зондов удалось показать, что, действительно, среди таких спор

поело лпофильного высушваная содержится в 4,6 раза меньше шор с поврзвденной мембраной /Табл.2/.

Таблица 2. Содержание трегалози а относительное количество спор с неповрендешимя мембран а?,а в лисфяльно ¿»высушенных образцах спор

образец спор содержание трегалоза а

в % от суммы Сахаров от биомассы

<4 26.65 2.42 а.74±О.ОЗЕ

стегш 7.57 1.25 1.70^0.07<*

• %/Н2 - Отноаониэ ошшггуда сигнала от Тгг.шона (спинового зонда) в водной фазе внутри ¡слеток к ишлитудэ сигнала от зепда в лппзд-ной фазе в мембране - отражает отпосатэльноо количество спор с пэповраздзппши вяошшш! ценбраншн в образце. •

Итак, в данном раздело работы не только впервые изучены из!.а-шш!я в пула Сахаров спор аскокицэтного гриба а процессе спорогэ-наза, но и показано роль света как модификатора углеводяого состава котодтй а. ¿ароп!оио. Получению далные позволяет такта высказать предпологгениа о биологической функции глшозы и трогалось в процессах прорастепия спор и при переходе к онтогенетическому анабиозу.

овекдаош РЕЗУЛЬТАТОВ

Приведенные выиэ дапные позволят; вцдвпнуть ряд прадполозоггай о рола длинноволювого света з фотоспорогонезо и онтогенезе А.^а-роп1оиа.

Согласно современным прздетавлениям,, трансформация энергии света в различных фотсбиологических процессах включает.ряд последовательных стадий» первыми из которые являются: поглощение света в биоструктурах, миграция энергии и возбуздениз фотоактивного хро-:.»$орного комплекса /Рубин,. 1988/. Химическая природа фоторецепто-

ра(ов) у грибов неизвестна, хотя предполагают, что в "синей" области светового спектра хромофором фоторецептора может быть, как и у растений, флавин или его производные /сь1в1а е1; а1., 1984; Криц-кий, Черкышова, 1989/. Учитывая, что хромофорный комплекс у грибов ассоциирован, вероятно, с внешней мембраной, трансформация светового си щала может сопровождаться изменениями в лилидной компоненте мембран. Недаром мембраны эукариотов рассматривают как первичный сайт при внешних воздействиях /А1ЪасЦ, Согсиега, 1991/, а мембранным J¡иralдaм отводится особая роль в процессе передачи, хранения, записи информации /Архипова с соавт., 1991/, росте клеток, их размножении и метаболической активности Л?ее1е, 1989; Фео-филова, 1990; 1991/. Поэтому правомочным представлялось начать изучение светового воздействия с исследования изменений, возникающих в люшдном составе клеток А.л'арогисиа. Отметим, что влияние света на лиггадную компоненту мембран является мало изученной областью фотобиологии.

В настоящей работе впервые показало, что зеленый свег но только интенсифицирует процесс спорообразования, но и существенно изменяет липидный состав спор. Значительные изменения отмечаются в составе ФЛ (особенно в содержании ФИ.ФХ и £С), в СН глико- и фос-фолипидов, в составе их ацильных цепей. 00 изменении в составе лилидной компоненты мембран спор при экспозиции зеленым светом свидетельствуют также опыты по изучению кинетики синтеза М с использованием С14-глюкозы.

Обнаружен новый биологический феномен, состсяадай в том, что изменения в лшацдаом составе С-спор, вызванные действием зеленого света, передаются в следующую стадии онтогенеза, а именно, от споры к мицелию, причем для некоторых классов лшщдов зтп изменения носят однотипный характер. Наиболее фотолабильныш оказываются минорные лтшды мембран - ФИ в ФС, связанные с функционированием инозитидгюго пути. У С-мишлия огнечаэтея также изменение СН ляпи-дов и их жирно-кислотного состава, особенно сильно изменяется содержание длинноцепочечных ■ ненасыщенных гзгрпых кислот: С^д.д.

С18:3* С20:4' С22:2.

Сватовой сигнал, преобразованный, вероятно, в химические соединения влияет на ростовые процессы, причем и в данном случае этот стнмулирущий эффект света передается в последующую стадию онтогенеза. При г-сэм С-мицелий в первые часа рзста активнее накашивает биомассу, чем Т-мицелкй. Иакнто^икация гост г гшлу.тлэуюоих соедине-

кий - ГС и ЭС - позволяла высказать предположение о механизме действия света на ростовые процессы. Вероятно, свет оказывает влияние на смену данных терпеноидных соединений, являвдихся регуляторами роста, стимулируя тем самым активность накопления биомассы. В то Ев время эти результата исследований, а такие появившиеся в по-следшю года данные об участии липидов в передаче информации /Бер-рида, 1985; Расмуссен, 1989/ позволяют предположить, что способность зеленого света стимулировать ростовые процесссы и в последующей стадии онтогенеза осуществляется в виде химического сигнала, роль которого могут виполнять липофильныв соединения терпеноидной природы.

Оказалось также, что в процессе фотоспорогенеза происходят значительные изменения и в углеводном пуле спор. Обнаружено, что свет увеличивает уровень глюкозы, но не оказывает существенного влияния на содержание трегалози. Исходя из современных представлений о роли этих углеводов в состоянии онтогенетического анабиоза у грибов, можно обнаружить четкую корреляцию между интенсификацией под действием света прорастания спор и повышением в цитозоле уровня глюкозы.

Дальнейшая расшифровка возможной роли углеводов спор, показала, что повышение уровня трегалози способствует усилению их устойчивости при действия неблагоприятных факторов, в частности при дегидратации. Данные, получешше методом ЭПР, позволяют считать, что трегадоза участвует в сохранетга мембран при потере свободной воды. В процессе хранения спор происходит уменьшение пула трогало-зы и увеличение пула наннита, вместе с тем понижается зсизнеспособ-ность спор a.Japónicas. Это подтверждает резервную роль трегалозы при длнтельгом анабиозе. Установлено, что С-споры обладают повышенной жизнеспособностью при хранении по сравнонии с Т-спорами. Приведенные результаты свидетельствуют о тесной взаимосвязи меаду метаболизмом запасных углеводов и процессом онтогенетического анабиоза, а тзкйэ о его зависимости от действия света.

Полученные данзшэ о рола света в процессах роста и спорогено-за A.japonicus позволяют с новых позиций оценить значение этого фактора в экологии грибов. Согласно ранее существующим представлениям считалось, что видимый свет оказывает ограниченное влияние на гетеротрофные организмы, в частности грибы. Особенно это относилось к зеленому свету, который считали "неактивной" частью оптического излучения. Исходя из полученных данных, следует с новых

- 20 -I

позиций оценить роль видимого света в экологии грибов к еозмоено в их эволюции, учитываягот факт, что изменения в метаболизма; вызванные сватовым стимулом» прослеживаются на дальнейших стадиях онтогенеза, даже протекающих в темповых условиях. Следует подчеркнуть, что в настоящей работа использовали интенсивность освещения, соответствующую таковой в природных местах обитания грибов (1,75,0 Вт/м2).

Наконец, способность свата влиять на рост грибов и на ряд метаболических процессов позволяет рассматривать свет как экологически чистый фактор, с помощью которого в биотехнологии открываются ионыв возможности та только для интенсификации биосинтеза биологически активных соединений, но и для оценки спорового посевного материала с точки зрения его хранения и "всхожести".

ВЫВОДЫ

Получены новыэ данные о роли длинноволнового видимого света в процессе роста к онтогенеткческого анабиоза есжомицэтпого гриба

А,¿гроп1аиз:

1.Установлен ростстамулярущай эффект свата с длиной волна 530 нм на прорастание спор, а .именно на стадию образования ростовых трубок. Обнаружено, что спори, сфорггировашше в условиях освещения, способны к ускоренному прорастанию в томновых условиях и более активному образованию мицелия. Тем самым» впервые показано, что стимулирующий эффект света на ростовые процесса способен передаваться во вторую стадию онтогенеза, т.е. от споры к мицелию.

2.Переход от стадии споры к активно растущему мицеляю у А-з'а-ротсив сопровождается изменением в содержании гибОерэллшгоподоб-ных соединений и эфиров стеринов. Предполагается участие йтих регуляторов роста в контроле фотозашеимыя ростовнх процессов /I. ¿а-рогисиз, так как зеленый свет изменяет соотношение данных соедаканий в процессе онтогенеза.

3.Свет влияет на липидный и углеводный состав клеток ¿.¿аро-гЦсш в процессе онтогенеза:

а) Свет изменяет степень ненасыщенное™ лшшдов во время Фотоспорогенеза к вызывает значительные изменения в составе фосфо-липидов и гликолипидов. При этом эффект света на лигидную компо-ньнту момЗрзн спор А.^ароп1сиЕ зависит от длиа волга и стадии эрообраз овзнкя.

- "di -

б) Ущелий, выращенный в темновых условиях из спор, образованных при освещении светом с К БСО и 650 им, также отличается от контрольного по составу лишдов. Причем эти изменения зависят от длины волны и интенсивности света, при котором выращивали посевные споры. Тем самым и в данном случае установлена способность светового стенала влиять на последу вдув стадию онтогенеза грибов.

в) СЕетозависимш изменения установлены и в углеводном составе спор д.. japonious, а именно обнаружена способность малоинтен-спвного (1,7-2,6 Вт/м2) зеленого и красного света повивать содержание глюкозы и общее содераание углеводов в спорах. При увеличении интенсивности светового потока до 5,0 Вт/м^ отмеченный эффект света не обпарукивается.

4.Получены сгюра с различным уровнем трегалозы и методом ЗПР показано, что сохранность клеточных мембран при дегидратации корродирует с более высоким уровнем этого дксахарида. Обнаружено, что в процессе хранения спор в них уменьшается содержание трегалозы п увелиштвается уровень мапнита, что сопровождается пониженном "всхожести" спор. Показано, что С-споры сохраняют при хранешш в лиофялизированпом состоянии повышенное содержание глюкозы и способность к более активному прорастания.

5.Приведенные выше данные позволяют установить определенные корреляции мэзду содернанием запасных соединений в спорах, их "всхожестью" и способностью к длительному хранению, а такае выявить значение видимого света в этих процессах. С этих позиций изложенные результаты и особенно данные о длительном действии светового сигнала на рост грибов представят интерес для экологов, работников коллекций и биотехнологов, работающих в области интенсификации биосинтеза биологически активных соединений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фэофшюва Е.П., Михайлова М.В., Грязнова М.В., Горнова Я.Б. Участие липпдов в фотоспорогенезе Aspergillus japonicus // Доклады Академии наук СССР. - 1989. - Т.307. № I. - С.234-237.

2. Горнова И.В., Михайлова М.В., Грязнова М.В., ©еофилова Е.П. Участие липмдов в светозависимой регуляции активности целлюлолити-ческих ферментов грибов рода Aspergillus // Тез.докл.Всесоызн. конф. "Регуляция микробного метаболизма". - Пущшо, 1889. - С.47.

3. Feofilova Е.Р., Goraova I.В., Gryasnova M.V., Uikhaylova M.V.

Visible light as a faotor controlling the processes of fungal cell differentiation and metabolism in modern bioteohnology // Abstracts Tenth congress of European rayoologiBta. - Tallinn, 1989. -P. 33.

4. Феофилова Е.П., Михайлова M.B., Грязнова M.B., Горнова К.Б. Влияние видимого света на лшщдный состав биомассы мицелиальных грибов // Тез.докл.Всесоюз.конф. "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных", часть 2.- Ташкент, 1989. -С.206.

5. Горнова И.Б., Михайлова М.В., Поглазова М.Н., Феофилова Е.П. Действие зеленого света на процесс прорастания конидий и липидо образование Aspergillus japonicus // Микробиология. - 1991. - Т. 60, Выл.2. - С.258-262.

6. Феофилова Е.П., Лозкникова В.Н., Горнова И.В., Михайлова М.В., Дудко Н.Д., академик Чайлахян М.К. Действие зеленого света на прорастание конидий и образование регуляторов роста у мицелиального гриба Aspergilli japonious // Доклады Академии наук СССР. - 1991. - Т.319. JS I. - С.235-237.

7. Горнйва И.Б., Михайлова Ы.В., .Феофилова Е.П. О длительноств действия светового сигнала в онтогенезе мицеллзльных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1991. - Т.27, Вып.4. - С. 616-622.

8. Горнова И.В., Феофилова Е.П., Терешина В.М. Действие света на состав резервных углеводов клеток Aspergillus Japonious в процессе спорообразования // Микробиология. - 1992. - Т.61. - Вып.2. -

с. ¿08-Л/3.

9. Горнова И.Б., Феофилова Е.П., Терошша В.М., Головина Е.А., К роткова Н.Б., Холодова В.П. Влияние углеводного состава спор Aspergillus ¿aponious но их способность к хранению и прорастанию // Микробиология. - 1992. - Т.61. - Вып.4. - С.

10.Горнова И.Б., Феофилова Е.П., Михайлова Ы.В.О влиянии света различного спектрального состава и интенсивности на рост п состав липидов гриба Aspergillus japonious в процессе онтогенеза// Прикладная биохимия п микробиология. - 1992. - Т. 28. - Вып.З. - С. 73