Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойств гладких мышц
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойств гладких мышц"

На правах рукописи

Мельник Оксана Сергеевна

РОЛЬ ЦИТОСКЕЛЕТА В МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛАДКИХ МЫШЦ

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2010

684604750

004604750

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Баскаков Михаил Борисович

Байков Александр Николаевич Яхонтов Сергей Владиславович

Ведущая организация: НИИ физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится "_"_2010г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.01 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050 г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава

Автореферат разослан «_»_2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета Петрова И.В

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем фундаментальных знаний о механизмах адаптации и повреждения клеточных систем при физиологических воздействиях и патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся механизмы внутриклеточной сигнализации. Системы внутриклеточной трансдукции сигналов (кальциевая, цАМФ- и цГМФ-опосредованные, связанная с метаболизмом мембранных фосфоинозитидов) активируются различными факторами как физиологической природы, так и появляющимися в ходе развития патологического процесса. Большинство из них индуцируют продукцию активных форм кислорода (АФК). Окислительный стресс является универсальной формой реагирования и механизмом повреждения клеточных систем. Социально значимые заболевания, такие как сердечно-сосудистые, инфекционные, бронхиальная астма и др., характеризуются дисбалансом окислительного метаболизма клеток. При этом развиваются нарушения редокс-чувствительных регуляторных систем клеток.

Одними из важнейших элементов редокс-системы клеток являются супероксид анион и оксид азота (N0). Обоим агентам присущи и регуляторные и альтерирующие влияния на метаболизм и функциональные свойства клеток. В отношении супероксид аниона и его метаболитов остается открытым вопрос о том, являются ли они вторичными посредниками или выступают в роли модуляторов оперирования «классических» вторичных мессенджеров. В сущности роль этих АФК как вторичных посредников убедительно показана лишь для трансляции сигнала, вызванного действием ангиотензина II и, с меньшей доказательностью, агадреномиметиков.

Многочисленные исследования показали, что супероксид анион и, в основном, его стабильный продукт перекись водорода (Н20г), могут регулировать различные сигнальные каскады. Изменения редокс-статуса клеток при различных стрессовых воздействиях влияют на процессы сигнальной трансдукции при действии физиологически активных веществ и экспрессии ряда генов [Dröge W., 2002]. Действуя как пара- и /или аутокринный регулятор, АФК активируют протеинкиназу С, фосфолипазу А2, NO-синтазу, циклооксигеназу и гуанилатциклазу [Sheehan D.W. et al., 1993; Rodriguez-Martinez M.A. et al., 1998; Thakali K. et al., 2005], которые, являясь компонентами внутриклеточных сигнальных систем, сами находятся под их контролем и регулируют уровень АФК в клетке.

Общая феноменология влияния АФК на электрофизиологические и сократительные свойства гладкомышечных клеток (ГМК) достаточно подробно изучена. Установлены основные молекулярные и мембранные системы, обеспечивающие реализацию эффектов перекиси водорода. Это, прежде всего, К\ Са2+- и СГ- каналы мембраны ГМК [Yang Z.W. et al., 1998; Barlow R.S. et al., 2000; Thakali K. et al., 2006]. Вместе с тем, отсутствуют систематические исследования роли цитоскелета в молекулярных механизмах влияния дисбаланса редокс-состояния клеток на сократительную функцию гладких мышц. Хотя имеются отдельные указания на то, что актиновые

микрофиламенты являются обязательным компонентом сигнального каскада, индуцированного ангиотензином II в сосудистых ГМК [Touyz R.M. et al., 2005], а микротубулы опосредуют стимуляцию ангиотензином II продукции перекиси водорода [Zuo L. et al., 2004].

Не исключено, что сам цитоскелет является первичной мишенью окислительного стресса [Zhao Y., Davis H.W., 1998; Dalle-Donne I. et al., 2001]. Так показано, что диссоциация белков цитоскелета является начальным этапом повреждения клеток, вызванного окислительным стрессом [Valen G. et al., 1999; Aksenov M.Y. et al., 2001].

Оксид азота в качестве регулятора физиологических процессов стал рассматриваться после исследований природы релаксирующего фактора, синтезируемого эндотелиоцитами сосудов [Furchgott R., Vanhoutte P.,1989]. Изучению механизмов действия NO на функции нормальных и патологически измененных клеток посвящено огромное число работ. Эффекты оксида азота и нитросоединений - доноров NO в гладких мышцах хорошо известны. Во всех исследованных типах мышц доноры NO вызывали уменьшение механического напряжения, угнетали, если таковая имелась, спонтанную активность и снижали величину сократительных ответов на действие биологически активных веществ [Furchgott R., Vanhoutte P.,1989; Luscher Т.,1989; Moneada S„ 1992 и мн. др.]. Влияние оксида азота на электрические и сократительные свойства, а также сопряжение возбуждения-сокращения в ГМК достаточно полно исследовано в нашей лаборатории [Капилевич Л.В. с соавт.,1995,2005; Ковалев И.В. с соавт., 1997,2004].

Однако ряд вопросов не нашел удовлетворительного решения. И это, прежде всего, касается взаимоотношений оксида азота и цитоскелета. Цитоскелет может являться ключевым звеном взаимодействия различных внутриклеточных сигнальных систем или отдельных каскадов в пределах одной системы транедукции сигнала в ГМК [Anfínogenova YJ. et al., 2004; Burgstaller G., Gimona M., 2004; Zhang D. et al., 2001, 2006]. Сочетание деструктивных, защитных и регуляторных функций NO и перекиси водорода позволяют считать эти АФК одними из центральных фигур в поддержании жизнеобеспечения клеток, основанном на балансе между физиологическими и патофизиологическими процессами.

Выяснение механизмов, используемых биологическими системами с участием АФК и опосредованных участием цитоскелета, является актуальной задачей современной биологии и медицины. Проведение подобного рода исследований будет способствовать разработке технологических основ управления функциональным состоянием гладких мышц висцеральных органов и сосудов на основе идентификации ключевых редокс - зависимых звеньев внутриклеточной трансляции сигналов.

Цель исследования: Изучить роль микротубул и микрофиламенгов цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойства сосудистых гладких мышц.

Задачи исследования

1. Изучить влияние дезинтеграции микрофиламентов и микротубул на эффекты оксида азота в гладкой мышце аорты крысы.

2. Установить роль цитоскелета в цГМФ-опосредованном и независимом от этого циклического нуклеотида действии оксида азота на сократительную активность гладкой мышцы аорты.

3. Исследовать влияние перекиси водорода на сократительные реакции сосудистых гладких мышц при активации агадренергических рецепторов и гиперкалиевой деполяризации мембраны клеток.

4. Изучить участие микрофиламентов и микротубул цитоскелета в обеспечении влияния перекиси водорода на сократительную активность гладкой мышцы аорты.

Научная новизна

Впервые определена роль элементов цитоскелета в индуцированных оксидом азота сократительных реакциях гладкой мышцы аорты крысы. Установлено, что в расслабление гладких мышц сосудов, предсокращенных гиперкалиевым раствором, при действии оксида азота вовлечены микротубулы. Впервые показано, что эффективность релаксирующего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микрофиламентов и микротубул.

Впервые установлено разнонаправленное влияние перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором и действии фенилэфрина: снижение величины контрактуры в ответ на действие фенилэфрина и увеличение ее при действии гиперкалиевого раствора. Впервые показано, что элементы цитоскелета вовлечены в механизмы действия перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы, вызванные фенилэфрином, но не гиперкалиевым раствором.

Теоретическая и практическая значимость работы ■■■■ Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных ■ знаний 0 роли цитоскелета в механизмах регуляции сократительной функции гладких мышц. Полученные данные дополняют представления о механизмах сосудистых реакций при гипертонической болезни и патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями метаболических процессов в организме. Установленные в исследовании взаимодействия активных форм кислорода и цитоскелета создают перспективы для разработки молекулярных технологий фармакологической коррекции дисфункций гладких мышц висцеральных органов и сосудов, а также местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов. Основные положения работы используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета. Методические приемы и полученные данные используются в научных исследованиях, выполняемых на кафедрах биофизики и функциональной

диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета и в отделе сердечно-сосудистой хирургии НИИ кардиологии СО РАМН. Областями применения полученных данных являются физиология, биофизика, фармакология.

Положения, выносимые на защиту

1. Угнетение оксидом азота сокращений деполяризованной гладкой мышцы осуществляется с участием тубулиновых элементов цитоскелета.

2. Эффективность релаксирующего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микро-филаментов и микротубул.

3. Перекись водорода угнетает фенилэфрин-индуцированные сокращения гладких мышц аорты крысы, но потенцирует сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперкалиевым раствором. Эффекты перекиси водорода не зависят от эндотелия и сохраняются в условиях угнетения калиевой проводимости мембраны тетраэтиламмонием.

4. В механизмы действия перекиси водорода на фенилэфрин-индуцированные сокращения гладких мышц аорты вовлечены элементы цитоскелета.

Апробация работы

Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных научных форумах: Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации», посвященной памяти и 100-летию со дня рождения профессора В.А. Пегеля (Томск, 2006), VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.Ф. Ларина (Томск, 2007), IX Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), IV Международной научной конференции «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии», посвященной 90-летию со дня рождения П.Г. Богача, (Украина, Киев, 2008).

Исследования поддержаны грантами РФФИ - «Исследование механизмов регуляции цитоскелетом сократительной активности гладких мышц» (№ 07-0401184), «Исследование мембранных и молекулярных механизмов регуляции сократительной активности гладких мышц» (№ 08-04099037), «Разработка технологии селективного управления внутриклеточными редокс-зависимыми сигнальными системами» (№09-04-99026). ФЦП - «Разработка технологии селективного управления внутриклеточной газовой сигнализацией» (№02.740.11.5031), «Разработка технологических основ управления функциональным состоянием клеток на основе идентификации ключевых звеньев трансляции сигналов с участием активных форм кислорода и элементов цитоскелета» (№ П445).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из которых 5 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура диссертации Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы собственных результатов, их обсуждения и заключения, библиография включает 198 ссылок, в том числе 27 - работы отечественных авторов и 171-зарубежных. Работа иллюстрирована 28 рисунками и включает 1 taблйцy.

Личное участие автора Основные результаты исследования, вошедшие в диссертацию, получены лично автором. Анализ литературных данных по теме диссертации, статистическая обработка полученных результатов, их научный анализ, обсуждение и написание диссертации выполнены самостоятельно автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объект исследования: интактные и деэндотелизированные гладко-мышечные сегменты аорты 190 беспородных белых крыс самцов весом 180-250гр.

Подготовка гладкомышечных препаратов: сегменты из грудного отдела аорты шириной 2-3 мм нарезались после удаления адвентиции (в случаях использования деэндотелизированных сегментов и эндотелия) механическим путем [Cakici J. et al, 1993].

Все манипуляции выполнялись в препаровальных ванночках с раствором Кребса при комнатной температуре.

Исследование сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы. Для исследования сократительной активности сосудистые гладкомышечные сегменты после предварительной нагрузки 500 мг фиксировались в термостатируемой перфузионной камере объемом 1 мл в условиях постоянной смены раствора Кребса (1мл/мин).

Исследования сократительной активности гладкой мышцы проводились в условиях близких к изометрическим. Изменение механического напряжения ГМК передавалось на шток механоэлектрического преобразователя (6МХ2Б, Москва) и регистрировалось после усиления с помощью XY рекордера (Carl Zeiss, Jena, Germany). Силу сокращений выражали в процентах от величины контрольного сокращения. За 100% принималась амплитуда сократительных ответов сегментов на действие гиперкалиевого раствора (в растворе Кребса 30 мМ NaCl замещали KCl), которые регистрировали после 40-50 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса или после начала предобработки исследуемым раствором. В ряде экспериментов за 100% принимали амплитуду сократительных ответов на действие 10 мкМ фенилэфрина.

Используемые растворы. Растворы готовились на основе дистиллированной воды добавлением соответствующих реактивов (ХЧ, «Реахим», РФ). Физиологический раствор Кребса содержал (мМ): 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 СаС12, 1.2 MgCl2> 5.5 глюкозы, 15 G^AN [tris(oxymethyl)-aminometan]. Значения pH растворов поддерживались в пределах 7.35-7.40; при температуре 37±0.1 °С.

Используемые реактивы: колхицин, цитохалазин D, нокодазол, фенилэфрин, дибутирил- цГМФ, метиленовый синий, нитропруссид натрия (все Sigma); тетраэтиламмония хлорид (Serva), перекись водорода (Россия).

Статистическая обработка. Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (Х±т). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова-Смирнова. Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии [Гланц С., 1999]. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test). Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test). Статистически значимыми считали различия при значении р<0.05.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование роли цитоскелета в регуляции оксидом азота сокращений сосудистых гладких мышц при действии гиперкалиевого раствора Рдя изучения влияния оксида азота в экспериментальной практике широко используются нитросоединения - доноры NO. В своих экспериментах мы использовали нитропруссид натрия (НП) [Ignarro L., 1987].

I.I. Влияние нитропруссида натрия на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, вызванные гиперкалиевым раствором. При добавлении в перфузионный раствор нитропруссида натрия в концентрации О.ОЫмкМ, исходное механическое напряжение (МН) гладких мышц (ГМ) аорты крысы не изменялось. Хлорид калия (30 мМ) приводил к развитию поддерживаемого сокращения, величина которого принималась за 100%. Нитропруссид натрия (0.01-1 мкМ) вызывал снижение величины гиперкалиевого сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы. Расслабление близкое к полумаксимальному наблюдалось при добавлении 0.05 мкМ НП: МН снижалось до 41.6±3.7% (п=9, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения (рис.1 А).

Известно, что основные эффекты оксида азота в гладкомышечных клетках обусловлены активацией растворимой фракции гуанилатциклазы (ГЦ) [Северина И.С., 2002]. Вместе с тем, ранее в нашей лаборатории было установлено и цГМФ - независимое действие НП [Ковалев И.В.,1997]. Для выявления цГМФ - независимого компонента действия НП использовали ингибитор ГЦ - метиленовый синий [Реутов В.П.,1994; Drewett J., 1994]. В течение 30 минут наблюдения исходное МН гладких мышц при действии 10 мкМ метиленового синего не изменялось. Но в присутствии метиленового синего статистически значимо уменьшалось расслабляющее влияние НП (0.01-1мкМ) на предсокращенную гиперкалиевым раствором (30 мМ KCl) гладкую мышцу. При действии НП (0.05мкМ) в этих условиях МН ГМК снижалось до

83.2 ±5.7% (п=б, р<0.05), тогда как в отсутствии метиленового сииего - до 41.6±3.7%. ■ •

Полученные данные указывают на то, что основной мишенью для НП в исследуемых ГМК является растворимая фракция ГЦ и расслабляющее действие оксида азота на гиперкалиевое сокращение, в своей большей части, опосредовано цГМФ.

1.2. Влияние дестабилизации цитоскелета колхицином на эффекты оксида азота в предсокращенных гиперкалиевым раствором гладких мышцах аорты крысы. Для выяснения участия цитоскелета в регуляции оксидом азота сократительной активности ГМ использовали дезинтегратор микротубул и микрофиламентов колхицин [Ыакашига М. е1 а1., 2000]. Добавление 10 мкМ колхицина в раствор Кребса не изменяло исходное МН гладкомышечных сегментов аорты крысы. После 90-минутной обработки колхицином амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных гиперкалиевым раствором, снизилась до 74.7±11.6% (п=8, р<0.05) от контрольных значений (рис.1Б). Колхицин статистически значимо снижал влияние 0.05 мкМ НП на исследуемую ГМ (табл.1).

Результаты этих экспериментов свидетельствуют об участии цитоскелета в генерации сокращений сосудистых гладких мышц при деполяризации мембраны хлоридом калия и вовлечении элементов цитоскелета в МО-зависимую регуляцию сократительной активности, вызванной гиперкалиевым раствором.

1.3. Влияние деполимеризации микрофиламентов и микротубул цитоскелета на эффекты оксида азота в предсокращенных гиперкалиевым раствором гладких мышцах аорты крысы. Для оценки вклада отдельных элементов цитоскелета в сократительные реакции ГМ аорты при действии оксида азота использовались химические агенты, вызывающие деполимеризацию микротубул - нокодазол или микрофиламентов цитохалазин Б. Нокодазол (10 мкМ) в течение 60 минут действия не изменял исходное МН гладкомышечных сегментов аорты крысы. После 60-минутной обработки нокодазолом (ЮмкМ) амплитуда сокращений сосудистых сегментов на действие гиперкалиевого раствора статистически значимо увеличивалась до 121.5±1.7% (п=8, р<0.05) от контрольных значений. Расслабляющее влияние НП (0.05 мкМ) в присутствии нокодазола на предсокращенную гиперкалиевым раствором (30 мМ КС1) гладкую мышцу статистически значимо снижалось. На фоне нокодазола амплитуда сокращений при действии НП уменьшалась до 75.5±8.1% (п=6, р<0.05), против 41.6±3.7% в отсутствии нокодазола (рис.Ш).

Эти данные указывают на то, что микротубулы вовлечены в реализацию расслабляющего действия оксида азота на гладкую мышцу аорты крысы.

Для изучения роли актиновых микрофиламентов в регуляции оксидом азота сократительной активности ГМ аорты крысы использовался цитохалазин О. Добавление 0.5 мкМ цитохалазина О в раствор Кребса приводило к снижению исходного МН сегментов аорты крысы, величина которого к 40-й минуте эксперимента составила 11.4%±4.1% (п=6) от контрольной гиперкалиевой контрактуры. Амплитуда сокращений, вызванных

гиперкалиевым раствором, в этих условиях снизилась до 42.4±6.7% (п=6, р<0.05) от контрольных значений. Расслабляющее действие НП (0.05 мкм) на фоне цитохалазина Б статистически значимо усиливалось: сосудистый сегмент расслаблялся полностью (п=6, р<0.05) (рис.1Г).

Полученные данные свидетельствуют об участии микрофиламентов в поддержании исходного МН гладкой мышцы, вовлечении в генерацию и поддержание сокращений при деполяризации мембраны ГМК, а также о том, что эффективность релаксирующего влияния N0 в гладкой мышце аорты крысы при действии гиперкалиевого раствора зависит от состояния микрофиламентов.

0£ ЦО Бр»мя (часы]

17.5-

X

15Л

I

Г"'

I 1ЛЛ

X

ш

8 7.5 Н

и

ш

х 5Л"

X

а 15 Е

О-'

эо им ка

зо мы ка Г

Нятропруссм натрия р.МнкЫ)

У-^-У_

| Нпкодаип (10 дМ) |

-У/ I I I

0.5 и 2.0 Время (часы)

х 17.51 х

£ 15.0 [«, | Ш-

8 »

* 5.0

I

зоммка

J

зо мм ка

* V

Нитропруссяд

натрия

..... ШймиЮ

05

Копхицин ПО \

1й 2Л Время (часы)

ЭЛ

зо пика

Нитропрусгад натрия РЛ5 м»М)

ЦятшаламяР (ВЛдздД^

05 1Л 1.5 Время (часы)

Рис.1. Влияние нитропруссида натрия на механическое напряжение гладкой мышцы аорты крысы, предсокращенной гиперкалиевым (ЗОмМКСI) раствором (А); Б- то же, после предобработки колхицином;!}- то же, после предобработки нокодазолом; Г- то же, после предобработки цитохалазином й

По оси ординат - механическое напряжение (мН), ко оси абсцисс- время (час)

1.4. Изучение роли цитоскелета в цГМФ - независимом действии нитропруссида натрия на сократительную активность гладкой мышцы аорты крысы. После обработки гладкомышечиых препаратов колхицином (ЮмкМ, 90 минут) на фоне метиленового синего (10 мкМ) релаксирующий эффект НП (0.05 мкМ) статистически значимо уменьшался (табл. 1).

Полученные результаты свидетельствуют о вкладе элементов цитоскелета в реализацию цГМФ-независимого компонента расслабляющего действия НП.

1.5. Влияние колхицина на эффекты дибутирил-цГМФ в предсокращенной гиперкалиевым раствором гладкой мышце аорты. Для выяснения вклада цитоскелета в обеспечение цГМФ-зависимого компонента расслабляющего действия оксида азота были проведены исследования с использованием проникающего аналога цГМФ - дибутирил-цГМФ.

Дибутирил-цГМФ (100 мкМ) вызывал снижение МН гладкомышечиых сегментов аорты крысы, предсокращенных гиперкалиевым раствором до 78.5±6.4% (п=5, р<0.05) от контрольного сокращения (30 мМ KCl). После обработки гладкомышечиых препаратов колхицином (ЮмкМ) действие дибутирил-цГМФ статистически значимо снижалось (табл. 1).

Таблица 1

Влияние колхицина на эффекты НП и дибутирил-цГМФ в гладкой мышце аорты крысы, предсокращенной гиперкалиевым (ЗОмМ KCl) раствором

Амплитуда сокращений в,%

ЗОмМ KCl +НП(0.05мкМ) ЗОмМ KCl +НП(0.05мкМ) +метиленовый синий (ЮмкМ) ЗОмМ KCl +Дибутирил-цГМФ (ЮОмкМ)

Контроль 41.6±3.7% 83.2 ±5.7% 78.5±6.4%

+Колхицин (ЮмкМ) 68.9±7.2%* 91±1.2%* 91.4±7.3% *

* - статистически значимые различия по сравнению с эффектами НП или дибутирил цГМФ в отсутствие колхицина (р<0.05)

Полученные данные свидетельствуют о вовлечении цитоскелета в реализацию цГМФ-зависимого и независимого от этого циклического нуклеотида действия оксида азота на механическое напряжение гладкой мышцы аорты.

Результаты проведенных исследований указывают на то, что эффективность расслабляющего действия оксида азота в гладкомышечиых клетках аорты зависит от состояния микротубул и микрофиламентов. При этом они вовлечены в различные процессы, которые являются мишенями для N0. По-видимому, микрофиламенты контролируют внутриклеточные системы или процессы поддерживающие сокращение, напротив, микротубулы прямо или опосредованно участвуют в реализации расслабляющего действия оксида азота.

2. Исследование роли цитоскелета в регуляции оксидом азота сокращений гладкой мышцы аорты при действии фенилэфрина

Сократительные ответы сосудистых гладких мышц инициируются многими физиологически активными веществами. Для изучения роли цитоскелета в регуляции оксидом азота сократительной активности ГМ аорты крысы, вызванной стимуляцией арадренэргических рецепторов, применяли фенилэфрин (ФЭ).

2.1. Влияние нитропруссида натрия на амплитуду феншэфрин-индуцированного сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы. Амплитуда сокращений в ответ на добавление 10 мкМ ФЭ в раствор Кребса была сравнима с ответной реакцией ГМ на действие 30 мМ КС1. Нитропруссид натрия (0.001- 0.05 мкМ) вызывал снижение силы фенилэфрин-индуцированного сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы. При этом близкое к полумаксимальному расслабление наблюдалось при добавлении 0.005 мкМ НП: МН снижалось до 57.4±6.3% (п=6, р<0.05) относительно контрольных значений (рис.2А). В присутствии метиленового синего действие НП (0.005мкМ) на предсокращенную ФЭ гладкую мышцу статистически значимо уменьшалось: механическое напряжение ГМК снижалось до 84.3±9.1% (п=6, р<0.05), против 57.4±б.3% - в отсутствии метиленового синего.

Полученные данные указывают на то, что растворимая фракция ГЦ является основной мишенью для НП при фенилэфрин- индуцированном сокращении гладкой мышцы аорты крысы.

Следовательно, релаксирующее влияние НП на ГМ аорты проявлялось независимо от природы предсйкращающего фактора. Вместе с тем, НП оказывал более сильное действие на сокращения гладкомышечного сегмента, вызванные ФЭ, чем деполяризацией мембраны ГМК. Известно, что в обеспечение сокращения сосудистых гладких мышц в ответ на стимуляцию аг адренэргических рецепторов вовлечена протеинкиназа С [Вегпс^е М., 1984, 8ош1уо А.Р., вогЫуо А.V.,1994]. Возможно, более выраженное расслабляющее действие N0 на сокращения, вызванные фенилэфрином, обусловлено большей чувствительностью к действию оксида азота С- киназной ветви кальциевой сигнальной системы ГМК.

2.2. Влияние дестабилизации цитоскелета колхицином на эффекты оксида азота в предсокращенных фенилэфрином гладких мышцах аорты крысы. После 90-минутной обработки колхицином амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных добавлением ЮмкМ фенилэфрина, статистически значимо снижалась до 87.7±4.3% (п=6, р<0.05) от контрольных значений. В этих условиях расслабляющее влияние 0.005 мкМ НП статистически значимо усиливалось. Если в отсутствии колхицина амплитуда ФЭ-индуцированных сокращений при действии 0.005 мкМ НП снижалась до 57.4±6.3% от контрольных значений, то на фоне влияния колхицина амплитуда сокращений уменьшалась до 40.2±3.6% (п=6, р<0.05) от величины ФЭ-индуцированного сокращения в присутствии колхицина (рис.2Б). Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении цитоскелета в механизмы действия

оксида азота на сокращения гладкой мышцы аорты, вызванные стимуляцией арадренэргических рецепторов.

2.3. Влияние деполимеризации микрофиламентов и микротубул цитоскелета на эффекты оксида азота в предсокращенных феиилэфрином гладких мышцах аорты крысы. Для изучения роли микротубул в регуляции оксидом азота сократительной активности гладких мышц аорты крысы при фенилэфрин-индуцированном сокращении использовали специфический дезинтегратор микротубул нокодазол. После 60-минутной обработки нокодазолом (ЮмкМ) амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных добавлением ЮмкМ фенилэфрина, статистически значимо увеличилась до 119.9±4.3 (п=6, р<0.05). В этих условиях релаксирующий эффект 0.005 мкМ НП статистически значимо увеличился. В присутствии нокодазола амплитуда ФЭ-индуцированных сокращений при действии НП уменьшалась до 33.3±2.1% (п=6, р<0.05), в сравнении с 57.4±6.3% без нокодазола (рис.2В).

Для определения участия актиновых микрофиламентов цитоскелета в расслабляющем влиянии оксида азота на гладкую мышцу аорты при действии фенилэфрина использовали цитохалазин О.

После предобработки гладкомышечных сегментов цитохалазином Б (0.5 мкМ, 30 минут) амплитуда фенилэфрин-индуцированного сокращения, снизилась до 31.3±5.1% (п=6, р<0.05) от контрольной гиперкалиевой контрактуры (30 мМ КС1). Наблюдалось статистически значимое усиление расслабляющего действия НП, на фоне цитохалазина Б: в его присутствии сосудистый сегмент под влиянием НП (0.005 мкМ) расслаблялся полностью (п—6, р<0.05) (рис.2Г).

Как следует из полученных данных, актиновые элементы цитоскелета и микротубулы вовлекаются в развитие фенилэфрин-индуцированного сокращения. Эффективность действия оксида азота на сокращения ГМ, вызванные феиилэфрином, зависит от состояния микрофиламентов и микротубул. При этом, по-видимому, микротубулы в большей степени, чем микрофиламенты участвуют в реализации расслабляющего действия оксида азота на гладкую мышцу аорты.

3. Исследование влияния перекиси водорода на сократительную активность гладких мышц аорты крысы

Среди активных форм кислорода центральное место занимает супероксид анион. Несмотря на высокую реакционную активность, его физиологическая и патофизиологическая значимость невелика ввиду короткого времени «жизни». Поэтому основная роль отводится метаболиту супероксид аниона - перекиси водорода [АУоНп М., 2000]. Перекись водорода, как и оксид азота, является важным ауто- и паракринным регулятором в гладких мышцах висцеральных органов и сосудов.

В связи с этим, существенный интерес представляют данные о роли цитоскелета в реализации эффектов перекиси водорода на сократительные свойства сосудистых гладких мышц.

17.5'

Е

í 15Л

12.5 ■

f

ЮЛ ■

X

Ф 7.5.

К

9 5Д •

X

s 15-

ж 0.

А

X а 17.5

1 15.0 ■

а»

1 12.5 ■

10Л-

01

й 7.5-

SJ> -

Н 2.5-

0 J

Ннтр о прус с ид натрия,мкМ

. ОЛЮ „ 0-05

Фенилзфрин 10 мкИ

Фенилзфрин Ш мкМ f-

Нитропруссид истрия рДИдМ)

1Л ЛА

Время (часы)

Фвналзфркн 10 м«М ^""""ФР"" 111 »«"

Нитропруссид натрия (0-005 ми М)

17.5

я

1 15Л

X

| 12.5

в 10.0

§ 7.5

f

ж SJ>

а:

£ a 2.5

Фенилзфрин ЮыкМ

Л

Г

фшилэфрмн ЮмкМ

В

~7f~_

|Нокодааол (10 inMÍI

■ ■ Ihr

1.S 2.0

Время (часы)

1Л 1.5

Время (часы)

Рис.2. Влияние нитропруссида натрия на сокращение гладкой мышцы аорты крысы, вызванное фенилэфрином (А)

Б- то же, после предобработки колхицином; В- то же, после предобработки нокодазолом; Г- то же, после предобработки цитохалазином О

По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс- время (час)_

3.1. Влияние перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы, вызванные деполяризацией мембраны гиперкалиевыми растворами. При добавлении в перфузионный раствор перекиси водорода в концентрации 1- 500 мкМ исходное МН сегментов аорты не изменялось.

Для исследования влияния перекиси водорода (1-500 мкМ) на сокращения сегментов, вызванные деполяризацией мембраны клеток, воздействовали гиперкалиевыми растворами, содержащими 30, 60 и 120 мМ KCl. В этих условиях происходило увеличение МН до 129.1±6.8% (60 мМ KCl) и 145.5±13.6% (120 мМ KCl) (п=6,р<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения (30 мМ KCl).

Перекись водорода (500 мкМ) увеличивала механическое напряжение сегментов аорты, предсокращенных растворами с повышенной концентрацией ионов калия (30, 60 и 120 мМ KCl) до 125.2±2.9%, 125.4±7.7% и 126.3±2.3%

(n=6, p<0.05), соответственно, от гиперкалиевой (30, 60 и 120 мМ KCl) контрактуры (рис.3).

| зо «и ка

О 0.5 и 1.9 2.0

Время (чясЦ

Рис.3. Влияние перекиси водорода на механическое напряжение гладкой мышцы аорты крысы, предсокращенной гиперкалиевым (ЗОмМ KCl) раствором По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс- время (час)

| фшняязфрян ID мкИ |

-1-1-1 I-г

0.5 1Л Ii 2Л гл

Вряыя (ч»сЦ

Рис.4. Влияние перекиси водорода на сокращение гладкой мышцы аорты крысы, вызванное фенилэфрином По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс- время (час)

Амплитуда сокращений при действии хлорида калия (30, 60 и 120 мМ KCl) и активирующее влияние Н202 в интактных сегментах статистически значимо не различались от значений, полученных на сегментах с удаленным эндотелием (п=6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что, во-первых, перекись водорода оказывает возбуждающее действие на сегменты аорты, пред-сокращенные гиперкалиевым раствором, во-вторых, влияние перекиси водорода не зависит от наличия эндотелия, т.е. эффектором Н202 являются сами ГМК, в - третьих, деполяризация мембраны, по - видимому, является необходимым условием для проявления возбуждающего эффекта Н202 в гладкомышечных клетках, ив — четвертых, величина прироста сокращения на действие перекиси водорода не зависит от величины мембранного потенциала ГМК аорты крысы.

3.2. Влияние перекиси водорода на феншэфрин-индуцированпые сокращения гладких мышц аорты крысы. Амплитуда сокращений в ответ на добавление 10 мкМ фенипэфрина в раствор Кребса была сравнима с действием 30 мМ KCl. Перекись водорода (500 мкМ) статистически значимо уменьшала МН сосудистых сегментов, предсокращенных фенилэфрином, до 48.3±3.5% (п=7,р<0.05) (рис.4).

Для изучения влияния перекиси водорода на рецептор-управляемый вход ионов кальция ФЭ добавляли на фоне действия раствора, содержащего

120 мМ КС1. Фенилзфрин (10 мкМ) в присутствии 120 мМ КС1 вызывал повышение МН на 51.5±4.7% (п=6, р<0.05). В этих условиях Н202 (500 мкМ) не влияла на величину МН гладкомышечных сегментов.

Полученные данные указывают на то, что расслабляющие влияние Н202 на гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфрином, не связано с угнетением рецептор-управляемого входа ионов кальция в ГМК, а также на то, что расслабляющее действие перекиси водорода на фенилэфрин- индуцированные сокращения проявляется только при субмаксимальных концентрациях кальция в клетке. Последнее позволяет допустить, что расслабление ГМ, предсокращенной ФЭ, связано с угнетением перекисью водорода С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы.

3.3. Исследование роли калиевой проводимости мембраны в реализации эффектов перекиси водорода на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, индуцированные гиперкалиевым растворов или фенилэфрином. Изменения калиевой проводимости мембраны ГМК во многом определяют направленность и величину сократительных реакций гладких мышц на действие биологически активных веществ. Добавление 10 мкМ блокатора калиевых каналов тетраэтиламмония в раствор Кребса не влияло на исходный уровень механического напряжения ГМК и амплитуду гиперкалиевых (30 мМ КС1) сокращений, но вызывало увеличение амплитуды фенилэфрин-индуцированных сокращений до 111.4±7.2% (п=б, р<0.05) от контрольных значений.

Тетраэтиламмоний не оказывал влияния на эффекты перекиси водорода в предсокращенных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином гладкомышечных сегментах. Эти данные указывают на то, что действие перекиси водорода на величину сокращений, вызванных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином не связано с модуляцией потенциал-зависимой и Са2+-активируемой калиевой проводимости мембраны сосудистых ГМК.

4. Исследование роли цитоскелета в реализации эффектов перекиси водорода в гладкой мышце аорты крысы

Как показано в ряде исследований [Valen G. et al., 1999; Aksenov M.Y etal., 2001; Dalle-Donne I. et al., 2001] цитоскелет может быть одной из мишеней для АФК.

Для изучения участия цитоскелета в механизмах действия перекиси водорода на сократительные свойства ГМ аорты использовали колхицин, нокодазол и цитохалазин D.

4.1. Влияние дезинтеграции цитоскелета колхицином на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах. После предобработки сосудистых сегментов колхицином (ЮмкМ, 90 минут) активирующее влияние Н202 на сокращение, вызванное хлоридом калия, статистически значимо не изменялось. МН при действии Н202 (500 мкМ) увеличивалось до 125.6±5.1% (п=8) от величины гиперкалиевого сокращения в присутствии колхицина.

Предобработка сосудистых гладко-мышечных препаратов колхицином статистически значимо усиливала расслабляющее действие перекиси водорода на сокращения, вызванные фенилэфрином. Перекись водорода на фоне действия колхицина снижала амплитуду фенилэфрин-индуцированных сокращений до 1б.5±2.1%, против 48.3±3.5% (п=8, р<0.05) в отсутствии колхицина (рис. 5).

4.2. Влияние деполимеризации микротубул нокодазолом на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах, преде окращенных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином. После 60-минутной обработки сосудистых сегментов нокодазолом (ЮмкМ) активирующее влияние перекиси водорода (500 мкМ) на сокращения гладких мышц, вызванные хлоридом калия, статистически значимо не изменялось и составило 118.6±2.9% (п=8) от величины гиперкалиевого сокращения в присутствии нокодазола. Расслабляющее влияние перекиси водорода (500 мкМ) на сокращения, вызванные ФЭ, после предобработки сосудистого сегмента нокодазолом (10 мкМ), статистически значимо не изменялось: МН составляло 57.2±3.7% (п=6) от амплитуды ФЭ-индуцированного сокращения в присутствии нокодазола.

4.3. Влияние деполимеризации микрофшаментов цитохалазином О на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах, предсокращенных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином. После 30-минутной обработки цитохалазином С (0.5 мкМ) активирующее влияние Н202 (500 мкМ) на сокращения, вызванные хлоридом калия, статистически значимо не изменялось. Механическое напряжение при действии Н202 увеличивалось до 123.3±3.5% (п=6) от величины гиперкалиевого сокращения в присутствии цитохалазина Б. После предобработки гладкомышечных сегментов цитохалазином Э (0.5 мкМ, ЗОминут) релаксирующее влияние перекиси водорода (500 мкМ) на сокращения, вызванные ФЭ, статистически значимо увеличивалось. Перекись водорода на фоне действия цитохалазина Б снижала амплитуду ФЭ-индуцированных сокращений до 11.6±0.8%, против 48.3±3.5% (п=8, р<0.05) в отсутствии цитохалазина Э.

Потенцирование эффектов перекиси водорода на фоне колхицина при фенилэфрин-индуцированном сокращении гладких мышц аорты свидетельствует о вовлечении цитоскелета в механизмы расслабляющего действия Н202. Данные, полученные в экспериментах с нокодазолом и цитохалазином О, указывают на то, что микрофиламенты, но не микротубулы,

11Л 1!Л 1Ы ЮЛ Г5

:л-

25-

«кика 10"""

ЯЯмкИНгО,

V

и

Рис.5. Влияние колхицина на эффекты перекиси водорода в гладкой мышце аорты крысы, предсокращенной фенилэфрином По оси ординат - механическое напряжение (мН), по оси абсцисс- время (час)

'вовлечены в реализацию расслабляющего влияния перекиси водорода в ГМ предсокращённой фенилэфрином. Активирующее влияние перекиси водорода на сЬкращёния, индуцированные гиперкалиевым раствором, не зависит от состояния Цйтоскелета.

Заключение

Хорошо известно, что универсальным механизмом адаптации и повреждения клеточных систем является окислительный стресс. Одним из важнейших элементов редокс-системы клеток являются активные формы кислорода, выступающие в качестве вторичных посредников или модуляторов оперирования «классических» вторичных мессенджеров и обеспечивающие реализацию лиганд-рецепторных взаимодействий. К числу таких лигандов относятся гормоны, цитокины и факторы роста. Многочисленные исследования показали, что АФК могут регулировать различные сигнальные каскады, а изменения редокс-статуса клеток при различных стрессовых воздействиях влияют на процессы сигнальной трансдукции при действии физиологически активных веществ и экспрессии ряда генов как при адаптивной реакции клеток в экстремальных условиях, так и при развитии патологических процессов [Droge W., 2002]. В результате этого происходит изменение ключевых процессов регуляции клеточного гомеостаза, а также нарушение функциональных свойств клетки [Adler V. et al., 1999;. Esteve J.M. et al., 1999; Rogers M.A. et al., 2006].

Несмотря на существенный прогресс в изучении механизмов регуляции вторичными посредниками и другими сигнальными молекулами электрических и сократительных свойств гладкомышечных клеток, до настоящего времени целый ряд вопросов не нашел удовлетворительного решения. Это в первую очередь касается участия цйтоскелета в механизмах внутриклеточной коммуникации и роли элементов цйтоскелета как одного из каскадов в системе передачи сигналов в ГМК. Именно цитоскелет может оказаться одним из ключевых эффекторных звеньев, к которому конвергируют различные сигнальные пути, участвующие в регуляции сократительной активности ГМК. а Убедительно показано, что основные эффекты влияния окислительного стресса на функциональные свойства клеток, в частности на сократительную активность мышечных клеток, связаны с увеличением концентрации АФК. Многочисленные исследования свидетельствуют в пользу того, что АФК в результате проникновения, либо в результате синтеза на месте, оказываются в ГМК, где начинают активировать ряд ферментов (протеинкиназу С, N0-синтазу и др.) [Sheehan D.W. et al., 1993; Rodriguez-Martinez M.A. et al., 1998; Thakali K. et al., 2005]. Получены свидетельства о том, что многие эффекты АФК опосредованы изменением ионной проводимости мембраны клеток [Barlow R.S. et al., 2000; Wolin et al.,2002; Thakali K. et al., 2006].

Оксиду азота, как одной из активных форм кислорода, присущи как сигнальные, так и цитопротекторные и цитотоксические функции [Capaldo В., 2001; Ouchi N., 2001]. Сочетание регуляторных, деструктивных и защитных эффектов NO, позволяют считать эту молекулу одной из центральных фигур в

поддержании жизнеобеспечения клеток, основанном на существовании баланса между физиологическими и патофизиологическими процессами.

Из полученных результатов следует, что эффективность оперирования сигнального пути, вовлекающего оксид азота, зависит от состояния микрофиламентов и микротубул. При этом их влияние на расслабление гладкой мышцы аорты при гиперкалиевой деполяризации мембраны клеток, по-видимому, противоположно. Микрофиламенты контролируют внутриклеточные системы или процессы, отвечающие за сокращение и противодействующие расслабляющему влиянию оксида азота. Напротив, микротубулы прямо или опосредованно участвуют в реализации релаксирующего эффекта оксида азота.

В механизмы расслабляющего действия оксида азота на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные фенилзфрином вовлечены и микрофиламенты и микротубулы. Вероятнее всего, поддержание динамического состояния микротубул, в большей степени, чем микрофиламентов, значимо для обеспечения ЫО-индуцированного расслабления сосудистых сегментов.

Функциональным антагонистом оксида азота является нейтрализующий его супероксид аннон, продуцируемый эндотелиоцитами и гладкомышечными клетками. Однако короткий период жизни супероксид аниона ограничивает роль этой АФК как аутокринного, а тем более паракринного регулятора в сосудах. Его метаболит, перекись водорода, является устойчивой молекулой, и основные эффекты супероксид аниона связывают с действием Н202.

В нашем исследовании показано, что аппликация перекиси водорода приводит к дополнительному увеличению механического напряжения сосудистых сегментов, вызванного деполяризацией мембраны ГМК гиперкалиевым раствором, но уменьшает сокращение, индуцированное фенилзфрином. Полученные данные о том, что прирост механического напряжения гладких мышц сосуда при действии Н202. не зависел от степени деполяризации мембраны гиперкалиевыми растворами, указывают на то, что перекись водорода оперирует потенциал-независимыми звеньями регуляторного каскада в гладкомышечных клетках. Нельзя исключить, что в качестве такого звена выступает процесс освобождения ионов кальция из саркоплазматического ретикулума.

Нами была исследована роль рецептор-управляемых кальциевых каналов, как возможной мишени, через которую обеспечивается расслабляющее действие Н202. на сосудистые сегменты, предсокращенные фенилзфрином. Установлено, что расслабление сосудистых гладких мышц при действии перекиси водорода в этих условиях, не связано с угнетением рецептор-управляемого входа ионов кальция в ГМК.

Как было указано выше, расслабляющее действие перекиси водорода на фенилэфрин - индуцированное сокращение проявляется только при субмаксимальных концентрациях кальция в клетке и устраняется при высоких внутриклеточных концентрациях последнего. Этот факт позволяет допустить участие С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы в реализации расслабления, вызываемого Н202. или/и снижения сродства к кальцию самого

сократительного аппарата ГМК [Somlyo А.Р., Somlyo A.V.,1994],

Эффекты перекиси водорода как при гиперкалиевом так и при фенилэфрин-индуцированном сокращение не оказывают влияния на потенциал-зависимую и Са2+ -активируемую калиевую проводимость мембраны ГМК аорты.

По данным ряда авторов, сеть цитоскелета может являться первичной мишенью окислительного стресса [Dalle-Donne I., 2001]. Показано, что АФК выборочно влияют на белки цитоскелета [Aksenov M.Y., 2001].

Наши данные о том, что перекись водорода на фоне колхицина при фенилэфрин-индуцированном сокращении гладких мышц аорты вызывает достоверно большее расслабление, чем в контроле, свидетельствуют о вовлечении цитоскелета в механизмы расслабляющего действия Н202. Данные, полученные в экспериментах с избирательной дезинтеграцией элементов цитоскелета нокодазолом и цитохалазином D, указывают на то, что микрофиламенты, но не микротубулы, опосредуют расслабляющее влияние перекиси водорода в гладкой мышце предсокращенной фенилэфрином.

В отличие от сокращений гладкой мышцы, вызванных фенилэфрином, величина которых цитоскелет-зависимо модулируется перекисью водорода, активирующее действие Н202 на сократительные ответы ГМК при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором не зависит от состояния цитоскелета.

ВЫВОДЫ

1. Микрофиламенты цитоскелета участвуют в формировании исходного механического напряжения гладкой мышцы аорты крысы, вовлечены в генерацию и поддержание сокращений, индуцированных гиперкалиевым раствором и фенилэфрином.

2. Расслабляющее действие оксида азота на Деполяризованные гладкомышечные клетки аорты крысы реализуется с участием микротубул цитоскелета.

3. Эффективность расслабляющего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микротубул и микрофиламентов цитоскелета.

4. Перекись водорода независимо от эндотелия модулирует сократительные реакции гладких мышц: снижает величину сократительного ответа при действии фенилэфрина, но потенцирует сокращения гладких мышц аорты, вызванные гиперкалиевым раствором. Усиление сокращений деполяризованных гладкомышечных клеток обусловлено влиянием перекиси водорода на потенциал-независимые механизмы активации и поддержания сокращений гладкой мышцы аорты.

5. Снижение перекисью водорода сократительных ответов гладких мышц аорты крысы на действие фенилэфрина осуществляется с преимущественным участием микрофиламентов, тогда как активирующее влияние перекиси водорода на сокращения, индуцируемые гиперкалиевым раствором, не зависит от состояния цитоскелета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цигоскелет - зависимая регуляция цГМФ сократительной активности гладких мышц аорты крысы / О. С. Мельник, С. В. Гусакова, В. В. Дряпочка и др. // Науки о человеке: материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ, 2007. - С. 189-190.

2. Влияние состояния цитоскелета на цАМФ и цГМФ-зависимую регуляцию сократительной активности гладкомышечных сегментов аорты крысы / С. В. Гусакова, И. В.Ковалев, М. Б. Баскаков, О. С. Мельник и др. // Актуальные проблемы медицины: материалы межрегиональной научно-практической конференции. - Абакан, 2007. - С. 55-56.

3. Объем-зависимая регуляция сократительной активности гладкомышечных клеток: роль микрофиламентов / С. В. Гусакова, И. В. Ковалев, М. Б. Баскаков, М. А. Медведев, О. С. Мельник и др. // Нейрогуморальные механизмы регуляции органов пищеварительной системы в норме и при патологии: материалы международной научной конференции. - Томск: СибГМУ, 2007. -С. 62-65.

4. Влияние перекиси водорода на электрическую и сократительную активность гладкомышечных клеток / И. В. Ковалев, С. В. Гусакова, О. С. Мельник и др. // Нейрогуморальные механизмы регуляции органов пищеварительной системы в норме и при патологии: Материалы международной научной конференции. -Томск: СибГМУ, 2007. - С. 65-68.

5. Роль микротрубочек и микрофиламентов цитоскелета в цГМФ-зависимой регуляции сократительной активности сосудистых гладкомышечных клеток / С.

B. Гусакова, О. С. Мельник, И. В. Ковалев и др. // Четвертая Всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения. - М.: МГУ, 2008. - С. 26.

6. ЦГМФ-зависимая регуляция сократительной активности гладкомышечных клеток: роль цитоскелета. / А. И. Жданова, Л. В. Смаглий, О. С. Мельник //Вестник РГМУ. Материалы III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. - М., 2008. -№2(61).-С.286.

7. Гусакова, С. В. Влияние перекиси водорода на цитоскелет-зависимую регуляцию сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы /

C. В. Гусакова, О. С. Мельник, О. В. Шутова // Вестник Российской академии медицинских наук: приложение тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2008. - С. 122.

8. Мельник, О. С. Влияние перекиси водорода на сократительную активность гладкомышечных клеток: роль цитоскелета / О. С. Мельник, С. В. Гусакова,

0.В. Шутова // Науки о человеке: Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ, 2008. - С. 95-97.

9. Cytoskeleton-dependent mechanisms of smooth muscle contraction / S. Gusakova,

1. Kovalev, M. Baskakov, O. Melnik et al. // Hypertension : The 18th Scientific Meeting European Society on Hypertension. - Berlin, 2008. - P.323.

10. Regulation contractile activity in smooth muscle cell: The role of cytoskeleton and cyclic nucleotides / O. Melnik S. Gusakova, I. Kovalev et al. // Hypertension : The 18th Scientific Meeting European Society on Hypertension. - Berlin, 2008. -P.324. '

11. Роль цитоскелета в регуляции электрической и сократительной активности гйадких мышц / И. В. Ковалев, С. В. Гусакова, О. С. Мельник и др. // VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов. - Барнаул: Принтэкспресс, 2008. - Т. 1. - С. 118.

12. Влияние перекиси водорода на сократительную активность гладкомышечных клеток аорты крысы / О. С.Мельник, С. В. Гусакова, И. В.Ковалев и др. // VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов. -Барнаул: Принтэкспресс, 2008. - Т. 1. - С. 118.

13. Гусакова, С. В. Влияние модуляции состояния цитоскелета на цАМФ- и цГМФ-зависимую регуляцию сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / С. В. Гусакова, О. С. Мельник, И. В. Ковалев // VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов. - Барнаул: Принтэкспресс, 2008. - Т. 1. - С. 125.

14. Исследование роли цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / М. Б. Баскаков, И. В. Ковалев, С. В. Гусакова, О. С. Мельник и др. // IV Международная научная конференция «Психофизиологические и висцеральные функции в норме и патологии», посвященная 90-летию со дня рождения П.Г. Богача. - Киев: КНУ им. Т. Шевченко, 2008,- С. 39-40.

15. Механизмы регуляции электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток: роль цитоскелета / М. А. Медведев, М. Б. Баскаков, С. В. Гусакова, И. В. Ковалев, О. С. Мельник и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - Т. 7. - № 4. - С. 31-36.

16. Влияние перекиси водорода на фенилэфрин-индуцированное сокращение гладких мышц аорта крысы: роль цитоскелета / Л. В. Капилевич, О. С. Мельник, С. В. Гусакова и др. // Вестник российского университета дружбы народов. - 2008. - №7. - С.65 8-660.

17. Цитоскелет и активные формы кислорода в механизмах регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток / С. В. Гусакова, М. Б. Баскаков, И. В. Ковалев, О. С. Мельник и др. // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». - М.:РУДН, 2009.-С. 1191-1192.

18. Роль оксида азота и элементов цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток / С. В. Гусакова, М. Б. Баскаков, И. В. Ковалев, О. С. Мельник и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - Т.8. -№ З.-С. 17-23.

19. Влияние перекиси водорода на сократительную активность гладкомышечных клеток: роль цитоскелета / И.В. Ковалев, C.B. Гусакова, О.С. Мельник и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - Т.8. - № 4. - С. 4147.

20. Исследование цитоскелет-зависимых механизмов регуляции сократительной активности гладких мышц / C.B. Гусакова, И.В. Ковалев, М.Б. Баскаков, М.А. Медведев, О.С. Мельник и др // Российский физиологический журнал им. И.А. Сеченова. - 2009. - Т. 95. -№ 6. - С. 583-593.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Н202 - перекись водорода N0 - оксид азота

АФК - активные формы кислорода ГМК - гладкомышечная клетка ГМ - гладкая мышца

ГЦ - гуанилатциклаза МН - механическое напряжение НП - нитропруссид натрия ФЭ - фенилэфрин

цГМФ - циклический 3:5-гуанозинмонофосфат

Подписано в печать 06.04.2010 г. Усл. печ. листов 0 65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии ГОУ ВПО СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт,2, тел. 53-04-08 Заказ № 76 Тираж 100 экземпляров

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Мельник, Оксана Сергеевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структурно-функциональная характеристика гладких мышц.

1.2 Функциональная организация внутриклеточных сигнальных систем.

1.3 Активные формы кислорода в регуляции сократительной активности гладких мышц.

1.4 Роль цитоскелета в регуляции сократительной активности сосудистых гладких лтшц.

ГЛАВА II.

МАТЕРИАЛ И МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Методика исследования.

2.3. Растворы и реактивы.

2.4. Статистическая обработка.

ГЛАВА III.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Исследование роли цитоскелета в регуляции оксидом азота сокращений сосудистых гладких мышц при действии гиперкалиевого раствора.

3.1.1 Влияние нитропруссида натрия на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, вызванные гиперкалиевым раствором.

3.1.2. Влияние метиленового синего на эффекты нитропруссида натрия в гладкой мышце аорты крысы, предсокращенной гиперкалиевым раствором.

3.1.3 Влияние дестабилизации элементов цитоскелета колхицином на эффекты оксида азота в предсокращенных гиперкалиевым раствором гладких мышцах аорты крысы.

3.1.4 Влияние дестабилизации микрофиламентое и микротубул цитоскелета на эффекты оксида азота в предсокращенных гиперкалиевым раствором гладких мышцах аорты крысы.

3.1.5 Изучение роли цитоскелета в цГМФ — независимом действии нитропруссида натрия на сократительную активность гладкой мышцы аорты крысы.

3.1.6 Влияние колхицина на эффекты дибутирил-цГМФ в предсокращенной гиперкалиевым раствором гладкой мышце аорты крысы.

3.2 Исследование роли цитоскелета в регуляции оксидом азота сокращений гладкой мышцы при действии фенилэфрина.

3.2.1 Влияние нитропруссида натрия на амплитуду фенилэфрин-индуцированного сокращения гпадкомышечных сегментов аорты крысы

3.2.2 Влияние дестабилизации цитоскелета колхицином на эффекты оксида азота в предсокращенных фенилэфрином гладких мышцах аорты крысы.

3.2.3. Влияние деполимеризации микрофиламентое и микротубул цитоскелета на эффекты оксида азота в предсокращенных фенилэфрином гладких мышцах аорты крысы.

3.3 Исследование влияния перекиси водорода на сократительную активность гладких мышц аорты крысы.

3.3.1 Влияние перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы, вызванные деполяризацией мембраны гиперкалиевыми растворами.

3.3.2 Влияние перекиси водорода на фенилэфрин-индуцированные сокращения гладких мышц аорты крысы.

3.3.3 Исследование роли калиевой проводимости мембраны в реализации эффектов перекиси водорода на сокращения гладкомышечных сегментов аорты крысы, индуцированные гиперкалиевым растворов или фенилэфрином.

3.4 Исследование влияния перекиси водорода на 1}итоскелет-зависимую регуляцию сократительной активности гладких мышц аорты крысы.

3.4.1 Влияние дезинтеграции цитоскелета колхицином на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах.

3.4.2 Влияние деполимеризации микротубул нокодазолом на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах, предсокращенных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином.

3.4.3 Влияние деполимеризации микрофиламентов цитохалазином И на эффекты перекиси водорода в сосудистых гладких мышцах, предсокращенных гиперкалиевым раствором или фенилэфрином.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойств гладких мышц"

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем фундаментальных знаний о механизмах адаптации и повреждения клеточных систем при физиологических воздействиях и патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся механизмы внутриклеточной сигнализации. Системы внутриклеточной трансдукции сигналов (кальциевая, цАМФ- и цГМФ-опосредованные, связанная с метаболизмом мембранных фосфоинозитидов) активируются различными факторами как физиологической природы, так и появляющимися в ходе развития патологического процесса. Большинство из них индуцируют продукцию активных форм кислорода (АФК). Окислительный стресс является универсальной формой реагирования и механизмом повреждения клеточных систем. Социально значимые заболевания, такие как сердечно-сосудистые, инфекционные, бронхиальная астма и др., характеризуются дисбалансом окислительного метаболизма клеток. При этом развиваются нарушения редокс-чувствительных регуляторных систем клеток.

Одними из важнейших элементов редокс-системы клеток являются супероксид анион и оксид азота (N0). Обоим агентам присущи и регуляторные и альтерирующие влияния на метаболизм и функциональные свойства клеток. В отношении супероксид аниона и его метаболитов остается открытым вопрос о том, являются ли они вторичными посредниками или выступают в роли модуляторов оперирования «классических» вторичных мессенджеров. В сущности роль этих АФК как вторичных посредников убедительно показана лишь для трансляции сигнала, вызванного действием ангиотензина II и, с меньшей доказательностью, ои-адреномиметиков.

Многочисленные исследования показали, что супероксид анион и, в основном, его стабильный продукт перекись водорода (Н2О2), могут регулировать различные сигнальные каскады. Изменения редокс-статуса клеток при различных стрессовых воздействиях влияют на процессы сигнальной трансдукции при действии физиологически активных веществ и экспрессии ряда генов [62]. Действуя как пара- и /или аутокринный N регулятор, АФК активируют протеинкиназу С, фосфолипазу А2,1\Ю-синтазу, циклооксигеназу и гуанилатциклазу [149,161,176], которые, являясь компонентами внутриклеточных сигнальных систем, сами находятся под их контролем и регулируют уровень АФК в клетке.

Общая феноменология влияния АФК на электрофизиологические и сократительные свойства гладкомышечных клеток (ГМК) достаточно подробно изучена. Установлены основные молекулярные и мембранные системы, обеспечивающие реализацию эффектов перекиси водорода. Это, прежде всего, К+-, Са2+- и СГ- каналы мембраны ГМК [38,176,192]. Вместе с тем, отсутствуют систематические исследования роли цитоскелета в молекулярных механизмах влияния дисбаланса редокс-состояния клеток на сократительную функцию гладких мышц. Хотя имеются отдельные указания на то, что актиновые микрофиламенты являются обязательным компонентом сигнального каскада, индуцированного ангиотензином II в сосудистых ГМК [181], а микротубулы опосредуют стимуляцию ангиотензином II продукции перекиси водорода [198].

Не исключено, что сам цитоскелет является первичной мишенью окислительного стресса [57,196]. Так показано, что диссоциация белков цитоскелета является начальным этапом повреждения клеток, вызванного окислительным стрессом [32,182].

Оксид азота в качестве регулятора физиологических процессов стал рассматриваться после исследований природы релаксирующего фактора, синтезируемого эндотелиоцитами сосудов [71]. Изучению механизмов действия N0 на функции нормальных и патологически измененных клеток посвящено огромное число работ. Эффекты оксида азота и нитросоединений - доноров N0 в гладких мышцах хорошо известны. Во всех исследованных типах мышц доноры N0 вызывали уменьшение механического напряжения, угнетали, если таковая имелась, спонтанную активность и снижали величину сократительных ответов на действие биологически активных веществ [71, 126,117]. Влияние оксида азота на электрические и сократительные свойства, а также сопряжение возбуждения-сокращения в ГМК достаточно полно исследовано в нашей лаборатории [8,9,10,11].

Однако ряд вопросов не нашел удовлетворительного решения. И это, прежде всего, касается взаимоотношений оксида азота и цитоскелета. Цитоскелет может являться ключевым звеном взаимодействия различных внутриклеточных сигнальных систем или отдельных каскадов в пределах одной системы трансдукции сигнала в ГМК [34,49,194,195]. Сочетание деструктивных, защитных и регуляторных функций N0 и перекиси водорода позволяют считать эти АФК одними из центральных фигур в поддержании жизнеобеспечения клеток, основанном на балансе между физиологическими и патофизиологическими процессами.

Выяснение механизмов, используемых биологическими системами с участием АФК и опосредованных участием цитоскелета, является актуальной задачей современной биологии и медицины. Проведение подобного рода исследований будет способствовать разработке технологических основ управления функциональным состоянием гладких мышц висцеральных органов и сосудов на основе идентификации ключевых редокс — зависимых звеньев внутриклеточной трансляции сигналов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучить роль микротубул и микрофиламентов цитоскелета в механизмах действия активных форм кислорода на сократительные свойства сосудистых гладких мышц.

ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить влияние дезинтеграции микрофиламентов и микротубул на эффекты оксида азота в гладкой мышце аорты крысы.

2. Установить роль цитоскелета в цГМФ-опосредованном и независимом от этого циклического нуклеотида действии оксида азота на сократительную активность гладкой мышцы аорты.

3. Исследовать влияние перекиси водорода на сократительные реакции сосудистых гладких мышц при активации агадренергических рецепторов и гиперкалиевой деполяризации мембраны клеток.

4. Изучить участие микрофиламентов и микротубул цитоскелета в обеспечении влияния перекиси водорода на сократительную активность гладкой мышцы аорты.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Угнетение оксидом азота сокращений деполяризованной гладкой мышцы осуществляется с участием тубулиновых элементов цитоскелета.

2. Эффективность релаксирующего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микрофиламентов и микротубул.

3. Перекись водорода угнетает фенилэфрин-индуцированные сокращения гладких мышц аорты крысы, но потенцирует сокращения сосудистых гладких мышц, вызванные гиперкалиевым раствором. Эффекты перекиси водорода не зависят от эндотелия и сохраняются в условиях угнетения калиевой проводимости мембраны тетраэтиламмонием.

4. В механизмы действия перекиси водорода на фенилэфрин-индуцированные сокращения гладких мышц аорты вовлечены элементы цитоскелета.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые определена роль элементов цитоскелета в индуцированных оксидом азота сократительных реакциях гладкой мышцы аорты крысы. Установлено, что в расслабление гладких мышц сосудов, предсокращенных гиперкалиевым раствором, при действии оксида азота вовлечены микротубулы. Впервые показано, что эффективность релаксирующего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микрофиламентов и микротубул.

Впервые установлено разнонаправленное влияние перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором и действии фенилэфрина: снижение величины контрактуры в ответ на действие фенилэфрина и увеличение ее при действии гиперкалиевого раствора. Впервые показано, что элементы цитоскелета вовлечены в механизмы действия перекиси водорода на сокращения гладких мышц аорты крысы, вызванные фенилэфрином, но не гиперкалиевым раствором.

НА УЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНА ЧИМОСТЬ

Результаты исследования являются вкладом в развитие фундаментальных знаний о роли цитоскелета в механизмах регуляции сократительной функции гладких мышц. Полученные данные дополняют представления о механизмах сосудистых реакций при гипертонической болезни и патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями метаболических процессов в организме. Установленные в исследовании взаимодействия активных форм кислорода и цитоскелета создают перспективы для разработки молекулярных технологий фармакологической коррекции дисфункций гладких мышц висцеральных органов и сосудов, а также местной профилактики спастических состояний и рестеноза сосудистых трансплантатов. Основные положения работы используются в курсах лекций и практических занятиях, проводимых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета. Методические приемы и полученные данные используются в научных исследованиях, выполняемых на кафедрах биофизики и функциональной диагностики, нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета и в отделе сердечно-сосудистой хирургии НИИ кардиологии СО РАМН. Областями применения полученных данных являются физиология, биофизика, фармакология.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы собственных результатов, их обсуждения и заключения. Библиография включает 198 ссылок, в том числе 27 - работы отечественных авторов и 171— зарубежных. Работа иллюстрирована 28 рисунками и включает 1 таблицу.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Мельник, Оксана Сергеевна

выводы

1. Микрофиламенты цитоскелета участвуют в формировании исходного механического напряжения гладкой мышцы аорты крысы, вовлечены в генерацию и поддержание сокращений, индуцированных гиперкалиевым раствором и фенилэфрином.

2. Расслабляющее действие оксида азота на деполяризованные гладкомышечные клетки аорты крысы реализуется с участием микротубул цитоскелета.

3. Эффективность расслабляющего влияния оксида азота в гладкой мышце аорты крысы при действии фенилэфрина зависит от состояния микротубул и микрофиламентов цитоскелета.

4. Перекись водорода независимо от эндотелия модулирует сократительные реакции гладких мышц: снижает величину сократительного ответа при действии фенилэфрина, но потенцирует сокращения гладких мышц аорты, вызванные гиперкалиевым раствором. Усиление сокращений деполяризованных гладкомышечных клеток обусловлено влиянием перекиси водорода на потенциал-независимые механизмы активации и поддержания сокращений гладкой мышцы аорты.

5. Снижение перекисью водорода сократительных ответов гладких мышц аорты крысы при действии фенилэфрина осуществляется с преимущественным участием микрофиламентов, тогда как активирующее влияние перекиси водорода на сокращения, индуцированные гиперкалиевым раствором, не зависит от состояния цитоскелета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Хорошо известно, что универсальным механизмом адаптации и повреждения клеточных систем является окислительный стресс. Одними из важнейших элементов редокс-системы клеток являются активные формы кислорода, выступающие в качестве вторичных посредников или модуляторов оперирования «классических» вторичных мессенджеров и обеспечивающие реализацию лиганд-рецепторных взаимодействий. К числу таких лигандов относятся гормоны, цитокины и факторы роста. Многочисленные исследования показали, что АФК могут^ регулировать различные сигнальные каскады, а изменения редокс-статуса клеток при различных стрессовых воздействиях влияют на процессы сигнальной трансдукции при действии физиологически активных веществ и экспрессии ряда генов как при адаптивной реакции клеток в экстремальных условиях, так и при развитии патологических процессов [62]. В результате этого происходит изменение ключевых процессов регуляции клеточного гомеостаза, а также нарушение функциональных свойств клетки [30,65,150].

Несмотря на существенный прогресс в изучении механизмов регуляции вторичными посредниками и другими сигнальными молекулами электрических и сократительных свойств гладкомышечных клеток, до настоящего времени целый ряд вопросов не нашел удовлетворительного решения. Это в первую очередь касается участия цитоскелета в механизмах внутриклеточной коммуникации и роли элементов цитоскелета как одного из каскадов в системе передачи сигналов в ГМК. Именно цитоскелет может оказаться одним из ключевых эффекторных звеньев, к которому конвергируют различные сигнальные пути, участвующие в регуляции сократительной активности ГМК.

Убедительно показано, что основные эффекты влияния окислительного стресса на функциональные свойства клеток, в частности на сократительную активность мышечных клеток, связаны с увеличением концентрации АФК.

Многочисленные исследования свидетельствуют в пользу того, что АФК в результате проникновения, либо в результате синтеза на месте, оказываются в ГМК, где начинают активировать ряд ферментов (протеинкиназу С, N0-синтазу и др.) [149,161,176]. Получены свидетельства о том, что многие эффекты АФК опосредованы изменением ионной проводимости мембраны клеток [38,177,188].

Оксиду азота, как одной из активных форм кислорода, присущи как сигнальные, так и цитопротекторные и цитотоксические функции [51,136]. Сочетание регуляторных, деструктивных и защитных эффектов N0, позволяют считать эту молекулу одной из центральных фигур в поддержании жизнеобеспечения клеток, основанном на существовании баланса между физиологическими и патофизиологическими процессами.

Из полученных результатов следует, что эффективность оперирования сигнального пути, вовлекающего оксид азота, зависит от состояния микрофиламентов и микротубул. При этом их влияние на расслабление гладкой мышцы аорты при гиперкалиевой деполяризации мембраны клеток, по-видимому, противоположно. Микрофиламенты контролируют внутриклеточные системы или процессы, отвечающие за сокращение и противодействующие расслабляющему влиянию оксида азота. Напротив, микротубулы прямо или опосредованно участвуют в реализации релаксирующего эффекта оксида азота.

В механизмы расслабляющего действия оксида азота на сосудистые гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфрином вовлечены и микрофиламенты и микротубулы. Вероятнее всего, поддержание динамического состояния микротубул, в большей степени, чем микрофиламентов, значимо для обеспечения МЭ-индуцированного расслабления сосудистых сегментов.

Функциональным антагонистом оксида азота является нейтрализующий его супероксид анион, продуцируемый эндотелиоцитами и гладкомышечными клетками. Однако короткий период жизни супероксид аниона ограничивает роль этой АФК как аутокринного, а тем более паракринного регулятора в сосудах. Его метаболит, перекись водорода, является устойчивой молекулой, и основные эффекты супероксид аниона связывают с действием Н202.

В нашем исследовании показано, что аппликация перекиси водорода приводит к дополнительному увеличению механического напряжения сосудистых сегментов, вызванного деполяризацией мембраны ГМК гиперкалиевым раствором, но уменьшает сокращение, индуцированное фенилэфрином. Полученные данные о том, что прирост механического напряжения гладких мышц сосуда при действии Н202 не зависел от степени деполяризации мембраны гиперкалиевыми растворами, указывают на то, что перекись водорода оперирует потенциал-независимыми звеньями регуляторного каскада в гладкомышечных клетках. Нельзя исключить, что в качестве такого звена выступает процесс освобождения ионов кальция из саркоплазматического ретикулума.

Нами была исследована роль рецептор-управляемых кальциевых каналов, как возможной мишени, через которую обеспечивается расслабляющее действие Н202 на сосудистые сегменты, предсокращенные фенилэфрином. Установлено, что расслабление сосудистых гладких мышц при действии перекиси водорода в этих условиях, не связано с угнетением рецептор-управляемого входа ионов кальция в ГМК.

Как было указано выше, расслабляющее действие перекиси водорода на фенилэфрин - индуцированное сокращение проявляется только при субмаксимальных концентрациях кальция в клетке и устраняется при высоких внутриклеточных концентрациях последнего. Этот факт позволяет допустить участие С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы в реализации расслабления, вызываемого Н202 или/и снижения сродства к кальцию самого сократительного аппарата ГМК [165].

Эффекты перекиси водорода как при гиперкалиевом так и при фенилэфрин-индуцированном сокращение не оказывают влияния на потенциал-зависимую и Са2+-активируемую калиевую проводимость мембраны ГМК аорты.

По данным ряда авторов, сеть цитоскелета может являться первичной мишенью окислительного стресса [57]. Показано, что АФК выборочно влияют на белки цитоскелета [32].

Наши данные о том, что перекись водорода на фоне колхицина при фенилэфрин-индуцированном сокращении гладких мышц аорты вызывает достоверно большее расслабление, чем в контроле, свидетельствуют о вовлечении цитоскелета в механизмы расслабляющего действия Н202. Данные, полученные в экспериментах с избирательной дезинтеграцией элементов цитоскелета нокодазолом и цитохалазином Т), указывают на то, что микрофиламенты, но не микротубулы, опосредуют расслабляющее влияние перекиси водорода в гладкой мышце предсокращенной фенилэфрином.

В отличие от сокращений гладкой мышцы, вызванных фенилэфрином, величина которых цитоскелет-зависимо модулируется перекисью водорода, активирующее действие Н202 на сократительные ответы ГМК при деполяризации мембраны гиперкалиевым раствором не зависит от состояния цитоскелета.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мельник, Оксана Сергеевна, Томск

1. Антипенко, А.Е. Вторичные посредники в клетках сердца игладких мышц сосудов / А.Е. Антипенко // Биохимия. — 1991. — Т. 56, вып. 4. С. 589-620.

2. Баскаков, М.Б. Кальмодулин в механизмах регуляции сократительной функции гладкой мускулатуры / М.Б. Баскаков, М. А. Медведев // Бюлл. СО АМН СССР. 1984. - N4. - С. 83-88.

3. Баскаков, М.Б. Механизмы регуляции вторичными посредниками электрической и сократительной активности гладких мышц / М.Б. Баскаков: Дисс. д.м.н. — Томск, 1988. — 367с.

4. Баскаков, М.Б. Роль протеинкиназы С в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц: эффект форболового эфира / М.Б. Баскаков, В.Б Студницкий, М.А. Медведев, Б. И. Ходоров // Бюлл. эксперим. биол. мед. 1987.-№ 7.-С. 8-11.

5. Бурый, В.А. Роль внутриклеточного кальция в активации сокращения гладких мышц легочных артерий / В.А. Бурый, A.B. Гурковская, Н.И. Гокина, М.Ф. Шуба // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1989. - Т. 105, № 9. - С. 261-264.

6. Гланц, С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц //М.: "Практика". 1999. - 459 С.

7. Зинчук, В.В. Участие оксида азота в формировании кислородсвязывающих свойств гемоглобина / В.В. Зинчук // Успехи физиологических наук. 2003. - Т. 34, № 2. - С. 33-45.

8. Капилевич, JI.B. Эпителий-зависимая регуляция тонуса бронхов / JI.B. Капилевич, М.Б. Баскаков, М.А. Медведев и др. // Матер. Всерос. конф., Сыктывкар, 6 8 июля 1994. - Сыктывкар, 1994. - С. 82 - 85.

9. Ю.Ковалев, И.В. Влияние нитропруссида натрия на мембранный потенциал и механическое напряжение гладкомышечных клеток аорты крысы / И.В. Ковалев, М.Б. Баскаков, A.A. Панов и др. // Российский Физиол.ж. им. И.М. Сеченова.-1997.-Т.83,№ 7.-С.70-76.

10. П.Ковалев, И.В. Механизмы регуляции оксидом азота электрической и сократительной активности гладких мышц / И.В. Ковалев, М.Б. Баскаков, Л.В. Капилевич // Успехи физол. наук. -2004.-Т.35,№ 3.-С.36-52.

11. Кочемасова, Н.Г. Роль ионов кальция в формировании плато потенциала действия гладкомышечных клеток мочеточника морской свинки в безнатриевых растворах / Н. Г. Кочемасова // Физиол. ж. 1982. -Т. 28, №2.-С. 206-214.

12. Медведева, М.В. Современные представления о многообразии форм ФДЭ циклических нуклеотидов в тканях млекопитающих / М.В. Медведева // Биохимия. 1995. - Т.бО.вып.З. - С. 25 - 32.

13. Орлов, С.Н. Кальмодулин / С.Н. Орлов. М: Итоги науки и техники. - 1987.-209с.

14. Петренко, Ю.М. Новые источники оксида азота, их возможная физиологическая роль и значение / Ю.М. Петренко, Д.А. Шашурин, В.Ю. Титов // Эксперим. клинич. фармакол. 2001. - Т. 64, № 2. - С. 72-80.

15. Расмуссен, Г. Циркуляция кальция и внутриклеточная передача сигнала / Г. Расмуссен. В мире науки. - 1989. - № 12.-С. 36-43.

16. Реутов, В.П.Физиологическая роль цикла окиси азота в организме человека и животных / В.П. Реутов, Л.П. Каюшин, Е.Г. Сорокина // Физиология человека. 1994. - Т.20,№ 3. - С. 165-174.

17. Северина, И.С. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах ее физиологических эффектов / И.С. Северина // Вопросы мед. химии. 2002. -Т.48,вып.1.-С .4-30.

18. Скок, В.И. Нервно-мышечная физиология / В.И. Скок, М.Ф. Шуба. — Киев: В. школа. 1986. - 224 с.

19. Тепперман, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы / Дж. Тепперман, X. Тепперман : Пер. с англ. М.: Мир. — 1989. — 656с.

20. Ткачук, В.А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов / В.А. Ткачук // Российский Физиол. ж. им. И.М.Сеченова. — 1998. Т.84, № 10. - С. 1006-1018.

21. Ткачук, В.А. Регуляция кальцием аденилатциклазной системы сердца / В.А. Ткачук // Кальций регулятор метаболизма. — Томск. — 1987.-С. 25-37.

22. Фултон, А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки / А.Фултон. М.: «Мир». - 1987. - 120с.

23. Ширинский, В.П. Клеточная подвижность в сердечнососудистой системе / В.П. Ширинский, A.B. Воротников // Природа. — № 12.-2005.-С. 39-44.

24. Шуба, М.Ф. Мембранные механизмы возбуждения гладкомышечных клеток / М.Ф. Шуба, В.А Бурый // Физиол. ж. 1984. -Т.30, №5.-С. 545-559.

25. Шуба, М.Ф. 'Пути и механизмы трансмембранного входа в гладкомышечные клетки ионов кальция, участвующих в активации сокращения / М.Ф. Шуба // Физиологический журнал. — 1981. Т.27, № 4. -С. 533-541.

26. Шуба, М.Ф. Физиология сосудистых гладких мышц / М.Ф. Шуба, Н.Г Кочемасова. Киев: Наукова думка. - 1988. - 250с.

27. Abedi, Н. Cytochalasin D stimulation of tyrosine phosphorylation and phosphotyrosine-associated kinase activity in vascular smooth musclecells / H. Abedi, I. Zachary // Biochem Biophys Res Commun. — 1998. — № 245 (3)-P. 646-650.

28. Adames, N.R. Microtubule interactions with the cell cortex causing nuclear movements in Saccharomyces cerevisiae / N.R. Adames, J.A. Cooper // J. Cell Biol. 2000. - № 149 (4). - P. 863-874.

29. Adler, V. Role of redox potential and reactive oxygen species in stress signaling / V. Adler, Z. Yin, K. Tew // J. Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 61046111.

30. Ago, T. Nox4 as the major catalytic component of an endothelial NAD(P)H oxidase / T.Ago, T. Kitazono, H. Ooboshi, T. Iyama, YH. Han, J. Takada et al. // Circulation. 2004. - Vol. 109. - P.227-233.

31. Aksenov, M. Y. Protein oxidation in the brain in Alzheimer's disease / M. Y.Aksenov, M. V. Aksenova, D. A. Butterfield et al. // J. Neuroscience.- 2001. -Vol. 103.-P. 373-383.

32. Alioua, A. PKG-I phosphorylates the cosubunit and upregulates reconstituted GKCa channels from tracheal smooth muscle cells / A. Alioua, P. Huggins, E. Rousseau // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 1995. - Vol. 268. -P. 1057-1063.

33. Barany, M. Protein phosphorylation during contraction and relaxation / M. Barany, K. Barany // Biochemistry of Smooth Muscle Contraction. 1996. - P. 321-339.

34. Barany, M. Exchange of the actin-bound nucleotide in intact arterial smooth muscle / M. Barany, J.T Barron, L.Gu, K. Barany // J. Biol. Chem. — 2001.-Vol. 276.-P. 398-403.

35. Barlow, R.S. Hydrogen peroxide relaxes porcine coronary arteries by stimulating BKCa channel activity / R.S. Barlow, R.E. White // Am J Physiol. -1998. Vol. 275. - P. 1283-1289.

36. Barnes, P.J. Beta-adrenoreceptors smooth muscle, nerves cells / P. J.Barnes // Life sci. 1993. - Vol. 52, № 26. - P. 2101- 2109.

37. Berridge, M. Receptors and on calcium signaling / M. Berridge // Tends. Pharmacol. Sci. 1984. - Vol. 21. - P. 345-360.

38. Bharadwaj, L. Mediation of H202-induced vascular relaxation by endothelium-derived relaxing factor / L.Bharadwaj, K.Prasad // Mol Cell Biochem. 1995.-Vol. 149. -P.267—270.

39. Brady, T. Nitric oxide inhalation transiently elevates pulmonary levels of cGMP, iNOS mRNA, and TNF-alpha / T. Brady, J. Crapo, R. Mercer // Am.J.Physiol. 1998. - Vol. 275. - P 509-515.

40. Brum, C. Disruption of microtubular network attenuates histamine-induced dilation in rat mesenteric vessels / C. Brum, I. Gama Duarte // Am J Physiol Cell Physio. 2005. - Vol. 288. - P. C443-C449.

41. Burke-Wolin, T.M. Hydrogen peroxide-induced pulmonary vasodilation: role of guanosine 3,5- cyclic monophosphate / T.M. Burke-Wolin, C.J. Abate, M.S. Wolin, G.H. Gurtner // Am J Physiol. 1991. - Vol. 5. - P. 393-398.

42. Burgstaller, G. Actin cytoskeleton remodelling via local inhibition of contractility at discrete microdomains / G. Burgstaller, M. Gimona // J Cell Sci. -2004.-Vol. 117 (Pt 2). P. 223-231.

43. Corbin, J. Phosphorylation of phosphodiesterase-5 by cyclic nucleotide-dependent protein kinase alters its catalytic and allosteric cGMP-binding activities / J. Corbin, I. Turko, A. Beasley, S. Francis // Eur. J.Biochem. 2000. - № 9. - P. 2760-2767.

44. Capaldo, B. Abnormal Vascular Reactivity in Growth Hormone Deficiency / B. Capaldo, V.Guardasole, F. Pardo // Circulation. 2001. - Vol. 103. - P. 520-524.

45. Cavallini, L. Prostacyclin and sodium nitroprusside inhibit the activity of the platelet inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and promote its phosphorylation / L. Cavallini, M. Coassin, A. Borean //A J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - P.545-551.

46. Carreras, M.S. Nitric oxide: biological mediator, modulator and effector / M.S. Carreras, G.A. Pargament, S.D. Catz, J.J. Poderoso, A. Boveris // Ann. Med. -1994. -№27.-P. 321-329.

47. Chitaley, K. Microtubule depolymerization facilitates contraction of vascular smooth muscle via increased activation of RhoA/Rho-kinase / K. Chitaley, R.C. Webb // Med Hypotheses. 2001. - Vol. 56 (3). - P. 381-385.

48. Cooke, J.P. Nitric oxide synthase: role in the genesis of vascular disease / J.P. Cooke, V.J. Dzau // Ann. Rev. Med. 1997. - Vol. 48. - P. 489-509.

49. Damron, D.S. Role of PKC, tyrosine kinases, and Rho kinase in a-adrenoceptor-mediated PASM contraction /D.S. Damron, N. Kanaya, Y. Homma, S.O. Kim et al // Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol. 2002. -Vol. 283.-P. L1051-L1064.

50. Dawson, T.M. Nitric oxide actions in neurochemistry / T.M. Dawson, V.L. Dawson, S.H. Snyder // Neurochem. Int. 1992. - № 29. - P. 97-110.

51. Droge, W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function / W. Droge // Physiological Reviews. 2002. - Vol. 82, № 1. - P. 47-95.

52. Dukarm, R. Pulmonary and systemic effects of the phosphodiesterase inhibitor dipyridamole in newborn lambs with persistent pulmonary hypertension / R. Dukarm F. Morin, J. Russell, R. Steinhorn // Pediatries.- 1998. Vol. 44, № 6.-P.831-837.

53. Eggermont, J. Ca2+-transport by smooth muscle membranes and its regulation / J. Eggermont, L. Racymackers, R. Castels // Biomed.et biochim. acta.-1989. Vol. 48, №5/6. - P. 370-383.

54. Esteve, J.M. Oxidative damage to mitochondrial DNA and glutathione oxidation in apoptosis: studies in vivo and in vitro / J.M. Esteve, J. Mompo, J. Garcia de Laasuncioon, J. Sastre//The FASEB Journal. 1999. - № 13. - P.1055-1064.

55. Favero, T.G. Hydrogen peroxide stimulates the Ca2+ release channel from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum / T.G. Favero, A.C. Zable, JJ. Abramson // J Biol Chem. 1995. - . Vol. 270. - P.557-563.

56. Fukai, T. Modulation of extracellular superoxide dismutase expression by angiotensin II and hypertension / T. Fukai, M.R. Siegfried, M. Ushio-Fukai, K.K. Griendling, D.G. Harrison // Circ Res. 1999. - Vol. 85. - P. 23-28.

57. Cai, H. NAD(P)H oxidase-derived hydrogen peroxide mediates endothelial nitric oxide production in response to angiotensin II / H. Cai, Z. Li, S. Dikalov, S.M. Holland, J. Hwang // J Biol Chem. 2002. - Vol. 277. - P.48311-48317.

58. Gao, Y.J. Hydrogen peroxide induces a greater contraction in mesenteric arteries of spontaneously hypertensive rats.through thromboxane A(2) production / Y.J. Gao, R.M. Lee // Br J Pharmacol. 2001. - Vol. 134. - P.1639-1646.

59. Gao, YJ. Mechanisms of hydrogen-peroxide-induced biphasic response in rat mesenteric arteiy / Y.J. Gao, S. Hirota, D.W. Zhang, L.J. Janssen, R.M. Lee // Br J Pharmacol. 2003. - Vol. 138. - P. 1085-1092.

60. Gao, Y.J. Vascular relaxation response to hydrogen peroxide is impaired in hypertension / Y.J. Gao, Y. Zhang, S. Hirota, L.J. Janssen, R.M. Lee // Br J Pharmacol. 2004. - Vol. 142. - P. 143-149.

61. Gorren, A. The versatil and complex enzymology of nitric oxide synthase / A. Gorren, B. Mayer // Biochemestry (Moscow). 1997. - Vol. 63, № 7. - P.745-755.

62. Griendling, K.K. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells / K.K. Griendling, C.A. Minieri, J.D. Ollerenshaw, R.W. Alexander // Circ Res. 1994. - Vol. 74. - P. 1141-1148.

63. Grover, A.K. Peroxide inactivates calcium pumps in pig coronary artery / A.K. Grover, S.E. Samson, V.P. Fomin // Am J Physiol. 1992. - Vol. 263. -P. 537-543.

64. Guikema, B.J. Catalase potentiates interleukin-1 beta-induced expression of nitric oxide synthase in rat vascular smooth muscle cells / B.J. Guikema, R. Ginnan, H.A. Singer, D. Jourd'heuil // Free Radic Biol Med. 2005. - Vol. 38. -P. 597-605.

65. Hamilton, C. Calmodulin and excitation-contraction coupling / C. Hamilton, I. Serysheva, G. Strasburg // News Physiol. Sci. 2000. - Vol. 15, № 12. - P. 201-204.

66. Hilenski, L.L. Distinct subcellular localizations of noxl and nox4 in vascular smooth muscle cells / L.L. Hilenski, R.E. Clempus, M.T. Quinn, J.D. Lambeth, K.K. Griendling // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004. - Vol. 24. -P. 677-683.

67. Hofmann, F. Rising behind NO: cGMP-dependent protein kinase / F. Hofmann, A. Ammendola, J. Schlossmann // J Cell Sci. 2000. - Vol. 113. — P. 1671-1676.

68. Hughes, S. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo / S. Hughes, T. Chan-Ling // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004. - Vol. 45 (8). - P. 2795-2806.

69. Hughes, A.D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells / A.D. Hughes // J Vase Res . 1995. - Vol. 32. - P. 353-370.

70. Hutcheson, I.R. Mechanotransduction through the endothelial cytoskeleton: mediation of flow- but not agonist-induced EDRF release / I.R. Hutcheson, T.M. Griffith // Br J Pharmacol. 1996. - Vol. 118. - P.720-726.

71. Ignarro, L. Endothelium-derived relaxing factor produced and secreted from artery and vein is nitric oxide / L. Ignarro, G. Buga, K. Wood, et al. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1987. - Vol. 84. - P. 9265-9269.

72. Jaimes, E.A. Effects of the reactive oxygen species hydrogen peroxide and hypochlorite on endothelial nitric oxide production / E.A. Jaimes, C. Sweeney, L. Raij // Hypertension. 2001. - Vol. 38. - P.877-883.

73. Jin, L. Activation of Rho/Rho kinase signaling pathway by reactive oxygen species in rat aorta / L. Jin, Z. Ying, R.C. Webb // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004. - Vol. 287. - P. 1495-1500.

74. Jones, K.A. F-actin stabilization increases tension cost during contraction of permeabilized airway smooth muscles in dog / K.A. Jones, W.J. Perkins, R.R. Lorenz, Y.S. Prakash et al. // J. Physiol. 1999. - Vol. 519. - P. 527-538.

75. Johnson, R.M. Effects of nitroprusside, glyceryl trinitrate and 8-bromo-cyclic GMP on phosphorylase a formation and myosin light chain / R.M. Johnson, T.M. Lincoln // Mol Pharmacol. 1985. - Vol. 27. - P. 333-342.

76. Kaibuchi, K. Regulation of the cytoskeleton and cell adhesion by the rho family GTPases in mammalian cells / K. Kaibuchi, S, Kuroda, M. Amano // Rev. Biochem. 1999. - Vol. 68. - P. 459-486.

77. Kanner, J. Neurons that say NO / J. Kanner // Free Radic. Biol, and Med. 1990. -№ l.-P. 12-18.

78. Karaki, H. Calcium release in smooth muscle / H. Karaki, B. Weiss // Life sci. 1988. - Vol. 42, № 2. - P. 111-122.

79. Katayama, Y. Niric oxide mysterious messenger / Y. Katayama // Dojindo Newsletter 1995. - № 1. - P. 1-20.

80. Kawada, T. cGMP-kinase mediates cGMP- and cAMP-induced Ca desensitization of skinned rat artery / T. Kawada, A. Toyosato, O. Islam, Y. Yoshida, S. Imai // Eur J Pharmacol. 1997. - Vol. 323. - P.75-82.

81. Korn, E.D. Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells / E.D. Korn // Physiological Rev. 1982. - Vol. 62. - P. 672-737.

82. Krieger-Brauer, H.I. Human fat cells possess a plasma membrane-bound H202-generating system that is activated by insulin via a mechanism bypassing the receptor kinase / H.I. Krieger-Brauer, H. Kather // J Clin Invest. -1992.-Vol. 89.-P. 1006-1013.

83. Kubo, M. Atrial natriuretic factor and isosorbide dinitrate modulate the gating of ATP-sensitive K+ -channels in cultured vascular smooth muscle cells / M. Kubo, Y. Nakaya, S. Matsuoka, et al. // Circ. Res.-1994. Vol. 74, № 3. - P. 471-476.

84. Kuriyama, H. Physiological features of visceral smooth muscle cells, with special reference to receptors and ion channels / H. Kuriyama, K. Kitamura, T. Itoh, R. Inoue // Physiol. Rev. 1998. - Vol. 78, № 3 - P. 811-920.

85. Lancaster, J.R. Nitric oxide: Biology and chemistry / J.R. Lancaster, J.B. Hibbs // Lancet. 1990. - № 335. - P. 669-671.

86. Leffler, C.W. Nitric oxide increases carbon monoxide production by piglet cerebral microvessels / C.W. Leffler, L. Balabanova, A.L. Fedinec, H. Parfenova // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005. - 289. - P. 1442-1447.

87. Li, H. Nitric oxide in the pathogenesis of vascular disease / H. Li, U. Forstermann // J. Pathol. 2000. - Vol. 190 - P. 244-254.

88. Li, S. Signal transduction in matrix contraction and the migration of vascular smooth muscle cells in three-dimensional matrix / S. Li, J.J. Moon, H. Miao, G. Jin et al. // J. Vase Res. 2003. - Vol. 40 (4). - P.378-388.

89. Lee, K. Inhibition of PTPs by H202 regulates the activation of distinct MAPK pathways / K. Lee, W.J. Esselman // Free Radic Biol Med. 2002. - Vol. 33. -P.1121—1132.

90. Lee, M. Signal transduction in vascular smooth muscle: diacylglycerol second messendgers and PKC action / M. Lee, D. Severson // Am. J. Physiol. -1994. № 3. - P.659-687.

91. Lee, M. Cyclic GMP causes Ca desensitization in vascular smoothmuscle by activating the myosin light chain phosphatase / M. Lee, L. Li, T.Kitazawa // J Biol Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 5063-5068.

92. Lincoln, T.M. Effects of nitroprusside and 8-bromo-cyclic GMP on the contractile activity of the rat aorta / T.M. Lincoln // J Pharmacol Exp Ther. -1983.-Vol. 224.-P. 100-107.

93. Lincoln, T.M. Cyclic GMP-mediated signaling mechanisms in smooth muscle / T.M. Lincoln, P. Komalavilas // J New York: Academic. 2000. - P. 401425.

94. Lucchesi, P.A. Hydrogen peroxide acts as both vasodilator and vasoconstrictor in the control of perfused mouse mesenteric resistance arteries / P.A. Lucchesi, S. Belmadani, K. Matrougui // J Hypertens. 2005. - Vol. 23. - P. 571-579.

95. Luscher, T. Endothelium-derived ralaxing and contracting factors / T. Luscher // Eur. Heart. J. 1989. - № 9. - P. 847-857.

96. Luscher, T. The endothelium: modulator of cardiovascular function / T. Luscher, G. Noll, P.M. Vanhoutte // J. Hypertens. 1996. - Vol. 14 (5). - P. 383393.

97. Lymn, J. Phospholipase C isoforms, cytoskeletal organization, and vascular smooth muscle / J. Lymn, A. Hughes //News Physiol. Sci. 2000. - Vol. 15, №2. -P. 41-45.

98. Marczin, N. Cytoskeleton-dependent activation of the inducible nitric oxide synthase in cultured aortic smooth muscle cells / N. Marczin, T. Jilling, A. Papapetropoulos, C. Go, J.D. Catravas // Br J Pharmacol. 1996. - Vol. 118. — P. 1085-1094.

99. Matoba, T. Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in human mesenteric arteries / T. Matoba, H. Shimokawa, H. Kubota, K. Morikawa, T. Fujiki // Biochem Biophys Res Commun. 2002. -Vol. 290.-P. 909-913.

100. Mehta, D. Actin polymerization stimulated by contractile activation regulates force development in canine tracheal smooth muscle / D. Mehta, S.J. Gunst// J. Physiol. 1999. - Vol. 519. - P. 820-840.

101. Mohazzab-H, K.M. NADH oxidoreductase is a major source of superoxide anion in bovine coronary artery endothelium / K.M. Mohazzab-H, P.M. Kaminski, M.S. Wolin // Am J Physiol. 1994. - Vol. 266. - P. 2568-2572.

102. Moncada, S. The L-arginin: nitric oxide pathway / S. Moncada //Acta Physiol.Scand. 1992. - Vol. 145. - P. 201-227.

103. Monks, D. Expression of cGMP-dependent protein kinase I and its substrate VASP in neointimal cells of the injured rat carotid artery / D. Monks, V. Lange, R. Silber et al. //Eur.J.Clin.Invest. 1998. - Vol. 28, № 5. - P. 416-423.

104. Murphy, H. An inflammatory mediator of glomerular mesangial cells / H. Murphy, J. Pfeilschifter, D. Kunz // Nephron. 1993. - Vol. 64. - P. 518-528.

105. Murthy, K. Heterologous desensitization of response mediated by selective PKC-dependent phosphorylation of G(j.i) and G(j2) / K. Murthy, J. Grider, G. Makhlouf //Am.J.Physiol.Cell Physiol. 2000. - Vol. 279, № 4. - P. 925-934.

106. Nagumo, H. Rho-kinase inhibitor HA-1077 prevents rho-mediatedmyosin phosphatase inhibition in smooth muscle cells / H. Nagumo, Y. Sasaki, Y. Ono et al. // Am. J. Physiol. 2000. - Vol. 278. - P. 57-65.

107. Nakamura, M. Actin filament disruption inhibits L-type Ca2+ channel current in cultured vascular smooth muscle cells / M. Nakamura, M. Sunagawa, T. Kosugi, N. Sperelakis // Am. J. Physiol. Cell. 2000. - Vol. 279. - P. 480-487.

108. Nakane, M. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. / M. Nakane, H.H. Schmidt, J.S. Pollock // FEDS Lett. 1993. - Vol. 316. - P. 175180.

109. Nunes, J.P. Cytoskeleton, passive tension and the contraction of the rat aorta to phorbol 12, 13-dibutyrate / J.P. Nunes // Pharmacol. Res. 2002. -Vol. 46(2).-P. 113-117.

110. Ohashi, T. Dynamics and Elasticity of the Fibronectin Matrix in Living Cell Culture Visualized by Fibronectin Green Fluorescent Protein / T. Ohashi, D. Kiehart, H. P. Erickson, // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1999. - Vol. 96.-P. 2153-2158.

111. Ouchi, N. Novel modulator for endothelial adhesion molecules: Adipocyte-derived plasma protein adiponectin / N. Ouchi, S. Kihara, Y. Arita // Circulation. 2001. - Vol. 103. - P. 1057-1063.

112. Pagano, P.J. An NADPH oxidase superoxide-generating system in the rabbit aorta / P.J. Pagano, Y. Ito, K. Tornheim, M. Gallop , A.I. Tauber // Am J Physiol. 1995. - Vol. 268. - P. 2274-2280.

113. Pagano, P.J. Localization of a constitutively active, phagocyte-like

114. NADPH oxidase in rabbit aortic adventitial enhancement by angiotensin II / P.J. Pagano, J.K. Clark, M.E. Cifuentes-Pagano, S.M. Clark // Callis Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - Vol. 94. - P.483-488.

115. Paul, R.J. Effects of microtubule disruption on force, velocity, stiffnessty Iand Ca .i in porcine coronary arteries / R.J. Paul, P.S. Bowman, M.S. Kolodney // Am J. Physiol Heart Circ Physiol. 2000. - Vol. 279 (5). - P. 2493- 2501.

116. Pelaez, N.J. MAPK and PKC activity are not required for H202-induced arterial muscle contraction / N.J. Pelaez, S.L. Osterhaus, A.S. Mak, Y. Zhao, H.W. Davis // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000. - Vol. 279. - P. 1194- 1200.

117. Pfeifer, A. Defective smooth muscle regulation in cGMP kinase I-deficient mice / A. Pfeifer, P. Klatt, S. Massberg // EMBO J. 1998. - Vol. 17, № 11. - P. 3045-3051.

118. Platts, S.H. Microtubule-dependent regulation of vasomotor tone requires Rho-kinase / S.H. Platts, L.A. Martinez-Lemus, G.A. Meininger // J. Vase Res. 2002. - Vol. 39 (2). - P. 173-182.

119. Porter, V.A. Frequency modulation of Ca sparks is involved in regulation of arterial diameter by cyclic nucleotides / V.A. Porter, A.D. Bonev, H.J. Knot, T.J. Heppner, A.S. Stevenson // Am J Physiol Cell Physiol. 1998. -Vol. 274.-P. 1346-1355.

120. Rey, F.E. Perivascular superoxide anion contributes to impairment of endothelium-dependent relaxation. Role of Gp91phox / F.E. Rey, X.C. Li, O.A. Carretero, J.L. Garvin, P.J. Pagano // Circulation. 2002. - Vol. 106. - P. 24972502.

121. Rogers, A.M. Rapid vasoregulatory mechanisms in exercising human skeletal muscle: dynamic response to repeated changes in contraction intensity / A.M. Rogers // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006. - Vol. 10. - P. 355-368.

122. Rovner, A.S. A long, weakly charged actin-binding loop is required for phosphorylation dependent regulation of smooth muscle myosin /A.S. Rovner // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 939-944.

123. Rovner, A.S. The carboxyl-terminal isoforms of smooth muscle myosin heavy chain determine thick filament assembly properties / A.S.Rovner, P.M.Fagnant, S. Lowey, K.M. Trybus // J. Cell. Biol. 2002. - Vol. 156. - P.' 113124.

124. Sato, A. Mechanism of dilation to reactive oxygen species in human coronary arterioles / A. Sato, I. Sakuma // Am J Physiol Heart Circ Physiol Gutterman DD. 2003. - Vol. 285. - P.2345-2354.

125. Schlossmann, J. Regulation of intracellular calcium by a signalling complex of IRAG, IP3 receptor and cGMP kinase IP / J. Schlossmann, A. Ammendola, K. Ashman, X. Zong, A. Huber // Nature. 2000. - Vol. 404. -P. 197-201.

126. Schmidt, H.H. The nitric oxide and cGMP signal transduction system: Regulation and mechanism of action / H.H. Schmidt, H. Nau, W. Wittfoht // Europ. J. Pharmacol. 1988. - Vol. 154. - P. 213-216.

127. Schmidt, H.H. The role of nitric oxide in physiology and patophysiology / H.H. Schmidt // FEDS Lett. 1992. - Vol. 307, № 1. - P. 102107.

128. Schubert, J. Does hydrogen peroxide exist "free" in biological systems / J. Schubert, J.W. Wilmer // Free Radic Biol Med. 1991. - Vol. 11. -P. 545-555.

129. Sendao Oliveira, A.P. Relaxation induced by acetylcholine involves endothelium-derived hyperpolarizing factor in 2-kidney 1-clip hypertensive rat carotid arteries / A.P. Sendao Oliveira, L.M. Bendhack // Pharmacology. 2004. -Vol. 72.-P.231-239.

130. Shaw, L. Inhibitors of actin filament polymerisation attenuate force but not global intracellular calcium in isolated pressurised resistance arteries / L. Shaw, S. Ahmed, C. Austin, M.J. Taggart // J. Vase Res. 2003. - Vol. 40 (1). - P.l-10.

131. Sheehan, D. Characterization and mechanisms of H202 —induced contraction of pulmonary arterios / D. Sheehan, E. Giese, S. Guugino // Am. J. Physiol. 1993. - Vol. 264. - P. 1542-1547.

132. Shimokawa, H. Anti-anginal effect of fasudil, a Rho-kinase inhibitor, in patients with stable effort angina: a multicenter study / H. Shimokawa, K. Hiramori, H. Iinuma, S. Hosoda et al. // J. Cardiovasc Pharmacol. 2002. - Vol. 40(5). - P. 751-761.

133. Small, C. The cytoskeleton of the vertebrate smooth muscle cell / C. Small, H. Gimona // Acta Physiologia Scandinavica. 1998. - Vol. 164. - P. 341356.

134. Solaro, R.J. Myosin light chain phosphatase a Cinderella of cellular signaling / R.J. Solaro // Circ. Res. 2000. - Vol. 87. - P. 173-175

135. Somlyo, A.P. Signal transduction and regulation in smooth muscle / A.P. Somlyo, A.V. Somlyo //Nature. 1994. - Vol. 372. - P. 231-236.

136. Sotnikova, R. Investigation of the mechanisms underlying H2O2-evoked contraction in the isolated rat aorta / R. Sotnikova // Gen Pharmacol.-1998. — Vol. 31. PI 15—119.

137. Sperelakis, N. Regulation of calcium slow channels of heart by cyclic nucleo-tides and effects of ischemia / N. Sperelakis //Adv.Pharmacol. 1994. -Vol. 31.-P. 1-24.

138. Stull, J.T. Myosin light chain kinase / J.T. Stull, J.K. Krueger, K.E. Kamm, Z.H. Gao et al. // In Biochemistry of Smooth Muscle Contraction. 1996. -P. 119-130.

139. Suh, Y.A. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl / Y.A. Suh, R.S. Arnold, B. Lassegue, J. Shi, X. Xu // Nature. 1999. - Vol. 401.-P. 79-82.

140. Surks, H.K. Myosin phosphatase-Rho interacting protein. A new member of the myosin phosphatase complex that directly binds RhoA / H.K. Surks, C.T. Richards, M.E. Mendelsohn et al. // J. Biol Chem. 2003. - Vol. 278(51).-P. 484-493.

141. Suvorava, T. Endogenous vascular hydrogen peroxide regulates arteriolar tension in vivo / T. Suvorava, N. Lauer, S. Kumpf, R. Jacob, W. Meyer // Circulation. 2005. - Vol. 112. - P.2487-2495.

142. Sward, K. The role of RhoA and Rho-associated kinase in vascular smooth muscle contraction / K. Sward, M. Mita, D.P. Wilson, J.T. Deng et al. // Curr Hypertens Rep. 2003. - Vol. 5 (1). - P. 66-72.

143. Tang, D.D. Downregulation of profilin with antisense oligodeoxynucleotides inhibits force development during stimulation of smooth muscle / D.D. Tang, J. Tan // Am J. Physiol Heart Circ Physiol. 2003. - Vol. 285(4).-P. 1528- 1536.

144. Tani, E. Continuous elevation of intracellular Ca2+ is essential for the development of cerebral vasospasm / E. Tani, T. Matsumoto // Curr. Vase. Pharmacol. 2004. - Vol. 2(1). - P.13-21.

145. Timasheff, S.N. In vitro assembly of cytoplasmic microtubules / S.N. Timasheff, L.M. Grisham // Ann. Rev. Biohem. 1980 - Vol. 49. - P. 565-591.

146. Thakali, K. Endothelin- 1-induced contraction in veins is independent of hydrogen peroxide / K. Thakali, S. Demel, G. Fink, et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005. - Vol. 289. - P. 1115—1122.

147. Thakali, K. Pleiotropic Effects of Hydrogen Peroxide in Arteries and Veins From Normotensive and Hypertensive Rats / K. Thakali, L. Davenport, G. D. Fink et al. // Hypertension. 2006. - Vol. 47(3). - P.482 - 487.

148. Theurkauf, W.E. / Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated 2 / W.E. Theurkauf, R.B. Vallee // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 3284-3290.

149. Valen, G. Hydrogen peroxide induces endothelial cell atypia and cytoskeleton depolymerization / G. Valen, A.Sonden, J. Vaage. // Free Radical Biology and Medicine. 1999. - Vol. 26, N. 11. - P. 1480 - 1488.

150. Vanin, A.F. Biology of nitric oxide / A.F. Vanin, I.V. Malenkova, V.A. Serezhenlcov // Biochemistry. 1997. - № 1. - P. 191-203.

151. Wede, O.K. Mechanical function of intermediate filaments in arteries of different size examined using desmin deficient mice / O.K. Wede, M. Lofgren, Z. Li, D. Paulin et al. // J. Physiol. 2002. - Vol. 540(3). - P. 941-949.

152. Wedgwood, S. Endothelin-1 decreases endothelial NOS expression and activity through ETA receptor-mediated generation of hydrogen peroxide / S. Wedgwood, S.M. Black // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005. - Vol. 288.-P. 480-487.

153. Wei, E.P. Mechanisms of cerebral vasodilation by superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite / E.P. Wei, H.A. Kontos, J.S. Beckman // Am J Physiol. 1996. - Vol. 271. - P. 1262-1266.

154. Wolin, M. Interactions of Oxidants With Vascular Signaling Systems / M.Wolin // J. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2000. — Vol. 20.-P. 1430-1442.

155. Wolin, M. Superoxide in the vascular system / M. Wolin, S. Gupte, and R. Oeckler // J. Vas. Res. 2002. - Vol. 39. - P. 191-207.

156. Yada, T. Hydrogen peroxide, an endogenous endothelium-derived hyperpolarizing factor, plays an important role in coronary autoregulation in vivo / T. Yada, H. Shimokawa, O. Hiramatsu, T. Kajita // Circulation. 2003. - Vol. 107.-P. 1040-1045.

157. Yang, Z. Mechanisms of hydrogen peroxide-induced contraction of rat aorta. Z. Yang, T. Zheng, A. Zhang, B.T. Altura, B.M. Altura // Eur J Pharmacol. -1998.-Vol. 344.-P. 169-181.

158. Zembowicz, A. Involvement of nitric oxide in the endothelium-dependent relaxation induced by hydrogen peroxide in the rabbit aorta / A. Zembowicz, R.J. Hatchett, A.M. Jakubowski, R.J. Gryglewski // Br J Pharmacol.- 1993.-Vol. 110.-P. 151-158.

159. Zhang, D. Microtubule disruption modulates the Rho-kinase pathway in vascular smooth muscle / D. Zhang, Z. Wang, N. Jin, L. Li Rhoades et al. // J. Muscle Res. Cell. Motil. 2001. - Vol. 22(2). - P. 193-200.

160. Zhang, D. State-to-state quantum reactive scattering for four-atom chemical reactions: Deferential cross section for the H+H20-> H2+OH abstraction reaction / D. Zhang // J. Chem. Phys. 2006. - Vol. 125. - P. 133-145.

161. Zhao, Y. Hydrogen peroxide-induced cytoskeletal rearrangement in cultured pulmonary endothelial cells / Y. Zhao, H.W. Davis // J Cell Physiol-1998.-Vol. 174. -P.370-379.

162. Zhu, D. Hydrogen peroxide alters membrane and cytoskeleton properties and increases intercellular connections in astrocytes / D. Zhu, K. S. Tan, X. Zhang et al. // Journal of Cell Science. 2005. - Vol. 188. - P. 3695-3703.