Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов

Пимкин, Максим Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов"

На правах рукописи

ПИМКИН МАКСИМ АНДРЕЕВИЧ

РОЛЬ СУБДОМЕНА ИНОЗИН-5-МОНОФОСФАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ПРОЦЕССАХ ОБМЕНА ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

оиГ ' ■ ~

Санкт-Петербург - 2009

003477787

Работа выполнена на кафедре биологии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Соловьёв Александр Семёнович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Денисенко Александр Дорофеевич

доктор медицинских наук, профессор Галебская Людвига Вячеславовна

Ведущая организация: Институт цитологии РАН.

Защита диссертации состоится 22 октября 2009 года в « часов на заседании диссертационного совета Д001.022.03 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).

Ж.

Автореферат разослант сентября 2009 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В. Пучкова

Актуальность темы. Пуриновые нуклеотиды - важнейшие компоненты клетки, участвующие в процессах хранения и передачи наследственной информации, хранения и передачи энергии, сигнальной трансдукции (A.G. Chapman, 1977; Ю.И. Бауков, 2009). Клетка осуществляет строгий контроль биосинтеза и деградации пуриновых нуклеотидов, что является необходимым условием адекватного функционирования всех клеточных процессов, происходящих с их участием (Н. Zalkin, 1992). Однако значительная часть механизмов этого контроля остаётся неизученной (F.I. Ataullakhanov, 2002). Роль гуаниловых нуклеотидов в клетке многогранна и включает синтез ДНК, РНК, белка, процессы G-трансдукции и многочисленные ферментативные реакции, в ходе которых GTP выступает в качестве энергодонора (Ю.И. Бауков, 2009; Е.С. Северин, 2008). Инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназа (ИМФДГ; Е.С. 1.1.1.205) - фермент de novo синтеза гуаниловых нуклеотидов, катализирующий превращение инозин-5'-монофосфата (IMP) в ксантозин-5'-монофосфат (ХМР) (L. Hedstrom, 2006). Клетки ряда опухолей, а также эмбриональные ткани характеризуются повышенной экспрессией ИМФДГ, что свидетельствует о важной роли фермента в процессах канцеро- и эмбриогенеза (R.C. Jackson, 1975). Ингибиторы ИМФДГ снижают клеточный пул гуаниловых нуклеотидов и обладают антипролиферативным действием, что является основой их клинического применения для иммунносуппрессивной, противоопухолевой и антивирусной терапии (K.W. Pankiewicz, 2003). Более глубокое понимание регуляторных процессов, протекающих с участием ИМФДГ, может способствовать дальнейшей разработке и совершенствованию лекарственных препаратов-ингибиторов фермента.

В дополнение к коровому (каталитическому) домену в структуре ИМФДГ выделяют эволюционно консервативный домен Бейтмана (субдомен), функциональное назначение которого в настоящее время не установлено (S. Ignoul, 2005). Мутации последовательности гена ИМФДГ-1 человека, кодирующей субдомен, вызывают наследственную форму пигментного ретинита - тяжелого дегенеративного заболевания сетчатки, приводящего к слепоте. Патогенетические механизмы развития этого заболевания неизвестны (A. Aherne, 2004). Аминокислотные замены в субдомене ИМФДГ, как и полное удаление субдомена, не вызывают изменений каталитической активности фермента in vitro (L. Hedstrom, 2008). Данный факт свидетельствует, что развитие пигментного ретинита, по-видимому, не связано с недостатком гуаниловых нуклеотидов в клетках сетчатки, и субдомен ИМФДГ может выполнять какую-то регуляторную роль в обмене пуриновых нуклеотидов, не связанную с основной функцией фермента.

Целью настоящего исследования было изучение функциональной роли субдомена ИМФДГ в процессах обмена пуриновых нуклеотидов.

Согласно поставленной цели было предусмотрено решение следующих

задач:

1. Сконструировать мутант Escherichia coli с удаленной последовательностью субдомена ИМФДГ на хромосоме.

2. Исследовать влияние мутации на способность клетки к поддержанию нормального внутриклеточного пула свободных пуриновых нуклеотидов Е. coli, а также на распределение потока IMP в направлении синтеза гуаниловых и адениловых нуклеотидов.

3. Изучить изменения протеома Е. coli в ответ на удаление субдомена ИМФДГ.

4. Найти «неожиданные» фенотипические проявления мутации с помощью методов метаболического фетотипического скрининга.

5. Изучить влияние точковых мутаций гена ИМФДГ, ассоциированных с пигментным ретинитом, на нуклеотидный метаболизм Е. coli.

Научная новизна. Впервые сконструированы бактериальные штаммы, позволяющие прицельно изучать физиологическую роль субдомена ИМФДГ in vivo. Впервые изучен эффект удаления субдомена ИМФДГ in vivo на нуклеотидые пулы клетки и распределение потоков IMP в направлении синтеза адениловых и гуаниловых нуклеотидов. Впервые показана роль субдомена ИМФДГ в процессах регуляции синтеза адениловых нуклеотидов. Впервые исследован in vivo эффект мутаций, ассоциированных с пигментным ретинитом.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в создании новых представлений о роли субдомена ИМФДГ в обмене пуриновых нуклеотидов клетки. Результаты исследования позволяют рекомендовать сконструированную нами мутантную форму Е. coli как модель для исследования функциональной значимости субдомена ИМФДГ. Полученные данные могут быть использованы при рассмотрении патогенетических механизмов развития пигментного ретинита.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 листах машинописного текста и включают 37 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы содержит 211 источников, из них 12 отечественных и 199 иностранных.

Апробация работы. Основные положения диссетрации доложены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии «Иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской

государственной медицинской академии (2006-2009); доложены на 36-й конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2008 г.), 12-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2007 г.), 13-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2008 г.), 2-й конференции «Интеграция метаболизма и геномики» Американской микробиологической ассоциации (Монреаль, Канада, 2007 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Штамм Е. coli MPI01 (мутация guaBACBS) может быть использован для изучения in vivo физиологической роли субдомена ИМФДГ.

2. Субдомен ИМФДГ является транс-регулятором de novo синтеза адениловых нуклеотидов из IMP.

3. Мутации гена ИМФДГ, ассоциированные с развитием пигментного ретинита, вызывают снижение пула адениловых нуклеотидов клетки, но не оказывают влияния на пул гуаниловых нуклеотидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименальная часть работы выполнена в лаборатории биохимии и молекулярной биофизики онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США), руководимой профессором Джорджем Дугласом Маркамом.

Штамм Е. coli МР101 (guaBACBS) был сконструирован на основе штамма Е. coli BW25113 с применением технологии рекомбинирования (К.A. Datsenko, 2000). На первом этапе, нуклеотидная последовательность, кодирующая субдомен в стуктуре хромосомного гена guaB (аминокислотные остатки №№ 116-238 в структуре ИМФДГ), замещалась геном канамицин фосфотрансферазы (кап), фланкированным сайтами распознавания FRT-рекомбиназы. Для этого ген кап, фланкированный FRT-последовательностями, ПЦР-амплифицировали с плазмиды pKD4, используя химерные праймеры, содержащие на 5'-концах ДНК-последовательности, гомологичные последовательностям, фланкирующим сайт рекомбинации на хромосоме. Как и следовало ожидать, полученный штам (МР41) был ауксотрофен по отношению к гуанину. На втором этапе рекомбинации ген канамицин фосфотрансферазы удаляли действием FRT рекомбиназы (К.А. Datsenko, 2000). Рекомбинанты селектировали на минимальной среде как колонии, вновь приобредшие способность к прототрофии. Таким образом, полученный штамм, обозначенный MP 101, содержал делецию субдомена ИМФДГ с сохранением рамки считывания каталитического домена (здесь и далее мутация обозначена как «guaBACBS»).

Штаммы МР501, МР502, МР503, МР504, МР505, МР506, МР507, несущие точковые мутации в хромосомном гене guaB, конструировали на основе штамма МР41 (см. Табл. 1). На первом этапе точечные мутации вносили в плазмиду pGUAB (Табл. 2), содержащую дикий ген guaB под контролем нативного промотора. Для мутагенеза использовали процедуру QuikChange (Stratagene). На втором этапе мутированные аллели guaB ПЦР-амплифицировали с промежуточных плазмид и gam-bet-exo-рекомбинировали в штамм МР41, замещая ген канамицин-фосфотрансферазы нужным аллелем guaB.

Плазмиду pGUA6, кодирующую ИМФДГС305А, конструировали путем сайт-направленного мутагенеза плазмиды pGUAB, для чего использовали стандартный протокол QuikChange (Stratagene, США). Плазмида pPRS была

сконструирована путем ПЦР-амплификации гена prs, кодирующего PRPP-синтетазу, с хромосомы штамма Е. coli BW25113. Полученный ПЦР-фрагмент был клонирован в однокопийную плазмиду рСС1 (Табл. 2). Плазмида pPRS-Al, несущая мутантный аллель PRPP-синтетазы, нечувствительный к ингиброванию адениловыми нуклеотидами, была сконструирована путем сайт-направленного мутагенеза плазмиды pPRS. Для мутагенеза использовали стандартный протокол QuikChange. В ходе мутагенеза была проведена нуклеотидная замена А386С; кодон GAT (Aspl28) был таким образом заменен на кодон GCT (Ala) (S.G. Bower, 1989).

Табл. 1. Штаммы, сконструированные и использованные в ходе исследования

Штамм Материнский штамм/Генотип Стратегия конструкции/Источник

BW25113 /ас/4 rrnB-[\t AlacZvini hsdR514 АагаВЛОлтз krhaBADum (К.A. Datsenko, 2000)

МР41 [BW25113] guaB::kan рекомбинирование; замена последовательности субдомена на кап с сохранением последовательности корового

[MP41] guaBiCBS домена; KanR

МР101 удаление кап FRT-рекомбиназой (М. Pimkin, 2008)

JW1615 [BW25113) add:.kan Keio collection (Т. Baba, 2006)

JW5401 [BW25U3]guaBr.kan Keio collection (Т. Baba, 2006)

JW0466 [BW25113) gsk::kan Keio collection (Т. Baba, 2006)

JW4135 [BW25113] purA::kan Keio collection (Т. Baba, 2006)

ТТ25401 tet* TetR; лаборатория J. Roth

МР310 [BW25113] guaBiCBS add::kcm MP101 xPl(JW1615), Kan'

МРЗЗО [B W25113] guaBiCBS gsk::kan MP101 x P1(JW0466), Kan'

МР255 [BW25113] deoD::tet рекомбинирование, BW25113 deoD^tet, Tef

МР350 [BW25113] guaBiCBS deoD::tet рекомбинирование, MP101 deoD^tet, Tet'

МР2501 [BW25113] deoD:: let pur A: :kan MP255 X P1(JW4135), Kan'Tet'

МР3501 [BW25113] gvaBiCBS deoD::lel purA::kan MP350 x P1(JW4135), Kan' Tet'

МР402 . [BW25113] purB::kan рекомбинирование, BW25113 purB~>kan. Kan'

МР4021 [BW25113] deoD::tetpurB::kan MP255 x РЦМР402), Kan'Tet'

МР4022 [BW25113] guaB&CBS deoD::tel MP350 x P1(MP402), Kan' Tet1

purB::kan рекомбинирование, ИМФДГ"8™

МР501 [MP41]

МР502 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГт95м

МР503 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГшз8м

МР504 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГШ0°"

МР505 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГЕ205Р

МР506 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГК2|2Е

МР507 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГта2'

Измерение внутриклеточных концентраций нуклеотидов (нуклеотидных пулов) проводили методом мечения экспоненциально-растущих клеток Е. coli в минимальной среде с добавлением радиоактивного изотопа фосфора в виде Н333Р04 (B.R. Bochner, 1982; K.F. Jensen, 1979). Для получения клеточных экстрактов, содержащих нуклеотиды, порции экспоненциалыю-растущей культуры смешивались с холодной муравьиной кислотой. Для разделения, визуализации и измерения меченых нуклеотидов смеси применялись методы одно- и двухмерной тонкослойной жидкостной хроматографии на фосфоэтиленимин-целлюлозных пластинах (B.R. Bochner, 1982; K.F. Jensen, 1979). Радиоавтографы получали экспозицией хроматографической пластины с радиочувствительным phosphorimaging-экраном компании Fujifilm. Компьютерная программа MultiGauge компании Fujifilm использовалась для измерения и нормализации сигнала «пятен» хроматограмм, соответствующих индивидуальным нуклеотидам. Абсолютные клеточные конценрации АТР измеряли с использованием люциферазного анализа в составе набора Enliten® Luciferase ATP Assay System (компания Promega, США). Объем клетки Е. coli был принят за 0,8285 микрон3 в соответствии с ранее опубликованными данными (R.J. Harvey, 1967). Концентрации прочих нуклеотидов были установлены путем сравнения интенсивности полученнного от соответствующих пятен радиосигнала с интенсивностью сигнала от ATP (B.R. Bochner, 1982).

Табл. 2. Плазмиды, сконструированные и использованные в ходе исследования

Плазмида Материнская плазмида Стратегия конструкции/Источник

pKD4 матрица для ПЦР-амплификации конструкции FRT-faw-FRT (К.А. Datsenko, 2000)

pGUAB pCCl ген guaB' дикого типа; нативный промотор

pGUA4 pCCl ген guaBiCSS; нативный промотор

pGUA6 pGUAB ген guaBTGT(9""6l*GCa, кодирующий ИМФДГ030";

нативный промотор ген guaB' дикого типа; КОНСТИТУТИВНЫЙ ПрОМОТОр РиcUV5

pGUA22 pCR2.1-TOPO

pPRS pCCl ген prs дикого типа, кодирующий PRPP синтетазу; нативный промотор

pPRS-Al pPRS генprsAI, кодирующий ADP/AMP-

нечувствительную PRPP синтетазу (prsA386c); нативный промотор

(S.G. Bower, 1989)

Для получения белковых экстрактов клеточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, осаждали центрифугированием. После ресуспендирования в растворе для экстракции клетки лизировали аппаратом

French pressure cell press производства компании American Instrument Company, США. Полученный лизат фильтровали через 0,2-микронный вакуумный фильтр и подвергали диализу с использованием раствора для экстракции. Общую концентрацию белка в препаратах определяли по Bradford (М.М. Bradford, 1976).

Активности ИМФДГ, АСС, ГМФР измеряли с использованием [ИС]-меченых субстратов субстрата с последующим ТСХ-разделением продуктов реакции (B.R. Bochner, 1982; R.H. Juang, 1993; Н. Nakamura, 1992).

Фенотипическое метаболическое профилирование на десяти 96-луночных планшетах проводили в компании Biolog, Inc (США). Каждая лунка планшета представляет собой уникальную композицию минимальной микробиологической среды (B.R. Bochner, 2009; B.R. Bochner, 2001). Скорость роста культуры регистрировали путем проведения постоянной видеозаписи инкубируемых планшетов.

Для проведения дифференциального гель-дисплея лизаты штамма BW25113 метили красителем Су5 (зеленый); лизаты штамма МР101 метили красителем СуЗ (красный). Разгонка первого измерения проводилась методом изоэлектрофокусирования на ИЭФ-пластинках (диапазон рН от 3 до 10). Для разгонки второго измерения пластинка вставлялась в 9-12% градиентный SDS-полиакриламидный гель и подвергалась стандартному денатурирующему электрофорезу. Гель сканировали с использованием сканнера Typhoon Trio производства компании GE Healthcare/Amersham. Анализ изображений проводился в программах ImageQuant и DeCyder (GE Healthcare/Amersham). Белки, отличающиеся по количественному преобладанию между двумя сравниваемыми штаммами, вырезали роботом Ettan (GE Healthcare/Amersham), экстрагировали из геля и трипсинизировали. MALDI-TOF-идентификацию полученных пептидных смесей проводили на масс-спектрометре ABI-4700 (Applied Biosystems, Inc.)

Ошибки измерений физиологических параметров клетки (пулы нукпеотидов, активности ферментов) анализировали путем расчета стандартного отклонения (В.А. Медик, 2000). В каждом случае проводили не менее 3 измерений. Статистическую достоверность различий измеряемых параметров оценивали путем расчета t-критерия Стьюдента в программе SigmaPlot v. 10.0. Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Мутант guaBKCSS характеризовался идентичной дикому типу скорости роста на минимальных средах, что свидетельствует о сохранении каталитической функции ИМФДГ и подтверждает данные литературы, полученные in vitro. Измерение нуклеотидных пулов мутанта продемонстрировало увеличение пулов адениловых нуклеотидов и менее значительные изменения пулов гуанилатов и пиримидинов (Табл. 3). Активности ИМФДГ, АСС и ГМФР в экстрактах MP 101 оказались в 2-3 раза ниже обнаруженных в экстрактах дикого штамма (Табл. 4). Снижение

активности АСС контрастирует с повышенными концентрациями адениловых нуклеотидов штамма МР101 и позволяет предположить, что другие механизмы (такие, например, как нарушенная аллостерическая регуляция ферментов аденилового метаболизма) ответственны за увеличение пулов адениловых нуклеотидов.

Табл. 3. Внутриклеточные концентрации (пулы) нуклеотидов штаммов Е. coli МР101 и Е. coli BW25113

Штамм

Пул (мМ) ± а BW25113 MP101 P

АТР 3,500 ±0,200 6,190 ±0,270 <0.001

ADP 0,220 ± 0,022 0,264 ± 0,057 0.193

AMP 0,215 ±0,078 0,255 ± 0,090 0.523

dATP 0,193 ±0,025 0,278 ±0,019 0.001

GTP 1,726 ±0,132 1,228 ±0,179 0.002

GDP 0,069 ±0,011 0,060 ±0,014 0.691

dGTP 0,109 ±0,019 0,086 ±0,031 0.226

IMP 0,386 ± 0,064 0,513 ±0,153 0.164

NAD 0,610 ±0,094 0,861 ±0,154 0.024

UTP 1,163 ±0,253 0,732 ±0,150 0.019

CTP 0,662 ±0,119 0,443 ± 0,068 0.013

dCTP 0,157 ±0,049 0,105 ±0,049 0.168

NADPH 0,071 ±0,016 0,086 ± 0,003 0.273

(p)ppGpp 0,366 ± 0,045 0,285 ± 0,045 0.149

XMP 0,147 ±0,015 0,203 ± 0,053 0.129

Несмотря на то, что целым рядом исследований было показано, что удаление субдомена ИМФДГ не сказывается на каталитической активности ИМФДГ in vitro, мы наблюдаем снижение активности ИМФДГ in vivo. Для дальнейшего исследования этого явления нами были приготовлены поликлональные антитела к ИМФДГ кишечной палочки, которые были использованы для стандартного иммунноблоттинга белковых клеточных экстрактов штаммов BW25113 и MP10I (Рис. 1). Было обнаружено, что снижение ферментативной активности ИМФДГ сопровождается снижением количества фермента, регистрируемого иммунноблоттингом.

Табл. 4. Активности ИМФДГ, АСС и ГМФР в экстрактах £ coli BW25113 и Е. coli MPI 01 при росте на минимальной среде MOPS.

_Ферментативная активность (нмоль/ч/мг белка)_

Штамм_ИМФДГ_АСС_ГМФР

BW25113 25,55 ± 3,43 295,56 ± 12,36 43,87 ±11,08 МР101_11,83 ± 1,41 124,36 ± 15,24 14,64 ± 2,86

Это позволяет заключить, что удаление субдомена не оказывает влияния на каталитические параметры фермента-мутанта, по снижает его количество в клетке, что и регистрируется как снижение ферментативной активности в белковом клеточном экстракте. Кроме того, мы наблюдали значительное накопление низкомолекулярных продуктов, детектируемых анти-ИМФДГ антителами в белковых экстрактах штамма МР101 (¿'¡шйл<"вь).

Таким образом, удаление субдомеиа снижает внутриклеточную стабильность ММФДГ и предрасполагает белок к протеолизу, что регистрируется иммунноблоттингом как накопление низкомолекулярных

продукта я прогс-олрш,

60 КОа

Рис. 1. Иммункоблоттинг белковых экстрактов штаммов ВУУ25113 и МР101 (диэВ1СВ5) с поликлональными анти-ИМФДГ антителами.

Результаты измерений пулов пури новых нуклеотидов позволяют заключить, что субдомен ИМФДГ выполняет некую регуляторную роль в процессах синтеза адениловых нуклетидов. Однако эти данные не дают однозначного ответа о конкретной роли субдомена, что побудило нас использовать альтернативную стратегию изучения возможных эффектов удаления субдомена: фенотипические микропланшеты, которые могут быть использованы для поиска неожиданных фенотппнческих проявлений мутации (13.К. ВосИпег, 2001). Действительно, в ходе скринга было обнаружено, что штамм МР101 (^маВ4 ) не способен расти и присутствии аденозина (см. Рис, 28). Таким образом, мутация ^гшВ&<'т является условно-летальной, что делает возможным использование методов классической генетики.

Для дальнейшего изучения роли превращений аденозина в механизме его токсичности нами были сконструирован!!!.! «двойные» и «тройные» мутанты, сочетающие в себе мутацию и полное удаление одного или

нескольких генов пуринового метаболизма (с!еоО, ригА, риг В). Было обнаружено, что мутации генов айУ, риг А, риг В являются вторичными супрессорами токсичности инозина.

Аденоэин, 1 vM

Рис. 2. Рост штаммов BW25113 и МР101 (gua£)"lCBS) на минимальной среде MOPS а присутствии аденоэина.

Таким образом, чтобы вызвать прекращение роста штамма MP 101, аденозин должен быть превращен в IMP, а затем в ЛМР последовательным действием аденозин деаминазы, гуанозин-ипозин киназы, адснплоеукцмпат синтетазы и аденилосукцннат лиазы (см. Рис. 5). В этом случае добавление в среду инозина должно ммсть токсический эффект идентичный аде поз и ну. Действительно, инозин вызывал прекращений роста культуры МР101 (рюй4 ) но не оказывал токсического действия на дикий штамм BW251 13 (см. Рис. ЗВ). Так как эфоект нукдеозида на нукяеотидный метаболизм клетки необходимо изучать в системе, где результаты не искажены обратимым взаимопревращением пуклеозидов и оснований, последующие эксперименты проводились с использованием производных штаммов МР101 н BW251 ! 3 с делением гена deoD, кодирующего пурин нуклеозид фосфорит азу: МР255 (deoD) и МР350 [deoD guaB" ).

Измерения нукяеотидных пулов штамма МР350 (deoD guaS***) в присутствии инозина показали значительное (до 17 мМ) накопление ATP, а также снижение пулов пиримидиновых нуклеотидов (UTP и СТР) (см. Рис. 4). Такой результат позволил предположить, что снижение пулов пиримидиновых нуклеотидов является главным фактором, обеспечивающим остановку роста штамма МР350 (deoD gh-aB'^1^) в присутствии инозина. Действительно, добавление в среду уридина позволило штамму МР350 (deoD 'щраВлСМ) продолжать рост в присутствии ииозина (см. Рис. 3D). При исследовании пулов нуклеотидов штамма МР350 (deoDguaBA BS), растущего в присутствии инозина и уридина, было обнаружено, что уридин предотвращает снижение пулов пиримидиновых нуклеотидов, однако почти не сказывается па увеличении пула АТР (см. Рис. 4). Таким образам, увеличение пула АТР является первичным ответом штамма МР350 {.deoD р4аВ*св ) на добавление в среду инозина или аденина, тогда как снижение пулов пиримидиновых нуклеотидов является вторичным эффектом.

Поскольку AMP и ADP являются аллостерическими йвибиторами PRPP-синтетазы (С. Petersen, 1999), мы предположили, что увеличение пулов адениловых нуклеотидов в присутствии инозина может приводить к снижению пула Р14РР, что, в свою очередь, приведет к снижению синтеза пиримидиновых нуклеотидов до уровня, когда дальнейший клеточный рост станет

невозможным. Действительно, аллель prsAl (S.G. Bower, 1989), кодирующий PRPP-синтетазу, нечувствительную к ингнбированию аде н пловы ми

нуклеотидами, способен транс-комплементировать мутацию guaBiC&s (Рис. 3).

Инозин,

2г-деэокси. И HO J Им 2 мМ

м » »41

О «

а ч

9 < ,

3 3 I

Sil1

л 8 ö ш Zü и

3 & 1 Ц ä S cd

3 g 3 Е

& & № & СП ё,

Инозин. ^ Q с Q о 1 О о Q ■и О §

мМ 3 1 1 1 ■g I й

л«Г Ж I I * ЖЖЖЛ

о, рМ ® О '.'Öl

RH* • в ' «1

RH© во •

1 пп • > О

Яо © <": ©

ЯЯо э • <5 Ö

Уридин 02Ж 1П-П

Гуакоэин 0,3

• • • в • о

_ D Q О)

Гипоксашин, о о * UM с а 5 а ■ Г11Е

мМ й щ rn 3 S

I £ о г* ■<г X 5 I 3 CQ 1 ж «t; Щ « ääsä

1 £ 0 1 К ■ö 8 11 О О О О Щ « $; 1

- - - -

[III IUI

* -

♦ •

• ■ - ГГГГХД

• ■ IUI]

Рис. 3. Анализ роста мутантов Е. coli на минимальной среде MOPS с глюкозой в качестве источника углерода и добавлением указанных компонентов. Свежую разведенную культуру клеток использовали для нанесения на агар в количестве 10 КОЕ на «пятном, после чего чашки инкубировали е течение 36-4В часов при 37°С. Основные из представленных на рисунке фенотипов подвергали верификации в жидкой среде. А -чувсгвительность мутантов к аденозину и вторичные супрессоры токсичности эденозина. В - чувствительность мутантов к инозину и вторичные суппрессоры токсичности инозина. С - Эффект оверекслрессии gsk, а также транс-комплементация токсичности инозина аллелями диеВс305А и prsA 1. D - эффект нуклеоэидю и оснований на рост в присутствии 4 мМ инозина. Е - рост в присутствии гипаксантинэ. Р - рост пурин-ауксотрофных штаммов в присутствии указанных оснований и нуклеоэидов.

Измерение нуклеотидных пулов штамма MP35()/pPRS-A 1 в присутствии инозина показало, что аллель prsAl предотвращает уменьшение пулов гшрнмндмиовых нуклеотидов в ответ на повышение пулов адениловых иуклсотилов, No не оказывает зн ими тельного влияния на адснилатный пул штамма (см. Рис. 4). Итак, совокупность результатов измерений нуклеотидных пулов, вторичных суп рессор о в и транс-компл ементнров ан ия, позволило нам установить точный механизм ингнбпроваппя клеточного роста мутанта gttaB* в присутствии инозина. Главным компонентом этого механизма является значительное увеличение пула аденилатов штамма MP10I (guuB^^). Таким образом, субдомен ИМФДГ может выступать в качестве негативного транс-регулятора синтеза адениловых нуклеотидов клетки (предположительно адени лосу кци нат синтетазы).

Для получения дополнительных доказательств релаксации контроля синтеза адениловых нуклеотидов мы внесли дополнительные мутации в штамм МР350 (deoD guaB* ). 13 частности, мы поочередно удалили гены pur А (адеиплосукципат синтетаза) и ригВ (аденалосукцинат л паза), отвечающие за синтез адениловых нуклеотидов из IMP. 13 результате этих манипуляций были получены штаммы МР2501 {deoD purA), МР350! (deoD purA ¿иаВ"СЪ\ МР402\[deoDpurB) и МР4022 (deoDpurBguaBACBS). Как и следовало ожидать, все эти штаммы были ауксотрофами по отношению к аденину, то есть были способны к росту па минимальной среде только при условии добавления адспипа (см. Рис. 3F). Кроме того, штаммы МР3501 {deoD purA gudS^ ) и МР4022 {a'coD ригВ guuB^ lt:,j потеряли чувствительность; к аденозяну/инозину, т.к. были неспособны к синтезу АТР из инозина (см. Рис. 3F и Рис. 4). Этот результат подтвердил, что увеличение аденилатного пула штамма MP10I (^wflt8iCBS) в присутствии инозина происходит путем непосредственного превращения IMP в AMP. Полностью путь токсичности инозина отображен на Рис. 5.

Мы предположили, что если субдомен ИМФДГ выполняет регуляторную фунцию, не связанную непосредственно с каталитической функцией корового домена фермента, фенотип guaBh мутанта может быть транс-ком пле мент про ван каталитически неактивной ИМФДГ, содержащей нормальный субдомен. Химический механизм реакции ИМФДГ проходит через стадию формирования ковалентпого аддукта между С; пуринов о го кольца субстрата и цистсином активного центра (Cys305 в ИМФДГ кишечной палочкн). Аминокислотая замена Cys305Ala в активном центре фермента лишит фермент каталитической функции, по с высокой вероятностью не повлияет на его третичную структуру. Результаты, полученные с плазмидой pGUAfi, кодирующей ИМФДГ , были идентичны результатам, полученным с Плазмидой pGUAB: плазмида pGUA6 успешно транс-комплсментировала чувствительность штамма МР350 (deoD guaB'iCBS) к инозину (см. Рис. ЗС) и почти полностью предотвращала изменения пулов пуриновых и пиримидпновых нуклеотидов при росте на минимальной среде в присутствии инозина {см. Рис. 4).

5 б

с'

С 4

* г

I ЛТР

гН

§ % I ш

&. I. 1

! 1яр стр

^ Ш Ш %

Инозин. 4 ыМ - - + + + + 4- + 4 + + + + +

Уридин, 0.2 мм - - - - + + - -

Аденин. 0.1 м.М - - - - - - - - + + + + - -

Гранин, 0.1 мм - - - - - - - - - + + - -

л Ч 1

Е § с а 1 1 а о а <Э 1 о о | СО I □ ■5 & о 1 □а '-1 О % а о» I о. а а § со 1 о

2 4 1 1 3 1 § 1 1 1 $ § 1 1

Ппаэмкаа

рРН5-А1

р'ЗНАб

Рис. 4.

Нуклеотидные гулы штаммов при росте в присутствии указанных оснований и нуклеозидс®- Звездочкой выборочно показана статистическая достоверность (р < 0,05) наиболее важных изменений пулоЕ нуклеотидов.

Таким образом, комплементация мутации вектором рСи'Аб,

экспрсссирующим каталитически неактивную ИМФДГ, содержащую в своей

структуре субдомен (ИМФДГ ' ), позволяет заключить, что присутствие субдомена ИМФДГ является необходимым и достаточным условием нормального физиологического контроля синтеза адениловых нуклеотидов, в независимости от того, является ли субдомен частью каталитически активной ИМФДГ.

Рис. 5. Механизм чувствительности мутанта gusBlCBS к инозину и аде н один у (выделен серым),

В дополнение к метаболическому скринингу нами было проведено сравнительное исследование белкового профиля (протсома) штаммов BW25113 и МР101 (guafiiCSS). Исследование проводилось методом дифференциального гель-дисплея (J.F. Timms, 2008; J, Minden, 2007). Результаты такого исследования штаммов штаммов BW25113 и МР101 (gwaßAt:lis) приведены в Табл. 5. Показавшими количественно Значимую разницу считали белки с отношением BW25113/МР101 не менее 2 (Табл. 5). Самым значительным с количественной точки зрения изменением было передвижение пягна, соответствующего ИМОДГ, вследствие мутации, которая изменила как изоэлектрическую точку, так и массу фермента. Наиболее значительным изменением, не относящимся к ИМФДГ, было почти шестикратное снижение количества а-субьедииины АТР синтазы в штамме МР101 (Табл. 5). Для

проверки результата, полученного дифференциальным гель-дисплеем, мы использовали поликлопальные антитела, распознающие а-субъсдишщу АТР синтетазы (анти-aATPS). Однако иммунноблоттинг экстрактов не обнаружил разницы в количестве a-АТР синтетазы между двумя штаммами (Рис. 6).

Табл. 5. Результаты сравнения протеомов штаммов BW25113 и MP1Q1 с

помощью дифференциального гель-Дисплея Белки расположены в порядке убывания абсолютны); значений отношения BW25113/MP101

а.

■у р

ь gä р

■У ~ _ и - Ы

■ а« sЕ 9

5 о У £ ё Е

3 es I. &S

° ® Название (результат Иде ити фи канн и)

-14,77 ИМФДГ 6

+8,95 ИМФДГ 8

+5,54 АТР синтетаза, а-субъединнца 7

-2,77 Фактор зМ>ягации Tu 2

-2,30 ГМФС 6

-2,04 З-фосфоглииерал кипаза 4

-t ,91 Питччдт формат лнаЗЯ

Итак, иммунноблоттинг не подтвердил результата дифференциального гель-дисплея. Тем не менее, результат дифференциального гель-дисплея был значителен по величине и хорошо воспроизводим, что не позволяет усомниться в его валидпости. Мы полагаем, что результат дифференциального гель-дисплея объясняется тем, что a-АТР синтстаза штамма MP10I (guaB^) претерпевает модификацию (например, фосфорплирование или ацетилирование), которая не изменяет общего количества субъединицы в клетке (что детектируется иммупноблоттингом), по изменяет положение на двухмерном геле (что и детектируется дифференциальным гель-дисплеем). В любом случае полученные нами данные свидетельствуют в пользу нового механизма регуляции функции АТР синтетазы Е. coli и являются привлекательным объектом для дальнейших исследований.

Меньшие по величине изменения включала увеличение в штамме MP 101 (giJCiBiCES) количеств ГМФС, фактора элонгации Tu, а также 3-фосфоглицерат кинаэы. Интересно, что ГМФС регистрировалась как два отдельных пятна, что может свидетельствовать о по стран спя ни о иной модификации этого фермента в клетке. Увеличение количеств 3-фосфоглицерат киназы и пируват формат лиазы (увеличение последнего фермента было лишь незначительно ниже установленного вами двукратного порога) может свидетельствовать об интенсификации процессов анаэробного метаболизма глюкозы и может иметь

отношение к вышеупомянутым изменениям а-субъедикицы АТР синтезы. В целом, несмотря на всю свою неопределенность, данные, полученные в результате двумерного дифференциального гель-дисплея, свидетельствуют об определенном влиянии мутацииguaB^5 на энергетический метаболизм клетки и требу ют дальнейшего подробного изучения,

BW25113 МР101

Рис. 6. Иммунноблоттинг экстрактов штаммов BW25113 и МР101 (j;uaSiCBS) с поликл опальными анти-tiATPS антителами

До сих пор главным объектом нашего исследования был штамм MPI01 с удаленной последовательность го с убдомаш ИМФДГ, Мы пришли к выводу, что удаление субдомена редактирует синтез аденнловых нуклеотидов из IMP и приводит к увеличению пула АТР. Однако эффект точковых мутаций субдомена ИМФДГ может отличаться от полного удаления этой структуры. Выравнивание аминокислотных последовательностей ИМФДГ Е. coli и человека показывает, что все аминокислотные остатки ИМФДГ-1 человека, Замены которых приводят к пигментному ретиниту (S.J. Bownc, 20U6; L. Hedslrom, 2008), консервативны или иолу консервативны в ИМФДГ Е. coli.

Табл. 6. Аминокислотные замены в структуре ИМФДГ-1 человека,

ассоциированные с пигментным ретинитом, и соответствующие им по результатам структурного выравнивания замены ИМФДГ E.coli

__А/к замены в ИМФДГ _

Номер соот '< и tZKG (5.

Штамм Человек, ИМФДГ-1 Ii. coli pyogenes)

МР501 R105W RS4W 88

МР502 TI16M T95M 99

MP50Î Dl 62* D138N 144

M H 50 J D226N D200N 205

МР505 R23IP 12205P 210

МР506 К238Е K2I2E 217

МР507 V2681 V242I 247

С цслыо более точного моделирования эффекта мутаций, ассоциированных с пигмеитым ретинитом, мы создали коллекцию штаммов Е coli, несущих соответствующие мутации на хромосоме (Табл. 6). Следует отметить, что одна из мутаций, внесенных в хромомоссму (DI62N, отмеченная в таблице как «*»), не ассоциирована с пигменты М ретинитом, а является

симметричной замене 0226М в силу зеркальной симметрии доменов Бейтмана (А. Ба1егаап, 1997).

Результаты измерений нуклеотидных пулов мутантов показали неожиданный результат: некоторые мутации гена ИМФДГ, ассоциировапые с пигментным ретинитом, вызывали снижение пулов АТР, тогда как пулы гуаниловых нуклеотидов оставались нормальными (Рис. 7).

BW2S113 MPS01 МР502 МР503 МРЯМ №5(15 MP ЯК МР507

Рис. 7. Эффект мутаций, ассоциированных с пигментным ретинитом, на

нуклеотидные пулы E.coli. Звездочкой обозначены пулы, показавшие статистически достоверные различия (р < 0.05) с соответствующим значением дикого типа (пул ATP BW25113).

Эти данные позволяют сделать несколько выводов. Во-первых, точковые мутации в гене ИМФДГ, ассоциированные с пигментным ретинитом, имеют аффект, противоположный полному удалению субдомена, н, по-видимому, снижают синтез адениловых нуклеотидов. Это свидетельствует о двустороннем регуляторном эффекте субдомена ИМФДГ на адениловый синтез. Во-вторых, мутации совершенно не оказывают эффекта на пул гуаниловых нуклеотидов, что позволяет с уверенностью утверждать, что субдомен ИМФДГ не оказывает регулятор но го влияния на синтез гуанилатой-

ВЫВОДЫ

1, Гуанин-протогрофный штамм MPI01 с удаленной хромосомной ДНК-последовательностью, кодирующей субдомен (мутация gwaBiClis): может быть использован для изучения функциональной роли субдомена ИМФДГ.

2, Субдомен ИМФДГ является транс-регулятором синтеза адениловых нуклеотидов из IMP. Удаление субдомена релаксирует синтез адениловых нуклеотидов из IMP при росте на минимальной среде, что приводит к увеличению пула АТР.

3. Мутация giiaBACBS является условно-летальной. Штамм МР101 (g¡/aSACDS) не способен к росту на минимальной среде в присутствии предшественников IMP (аденозина, инозина, гипоксантина) за счет бесконтрольного увеличения пулов адениловых нуклеотидов, приводящего к дефициту пиримидиновых нуклеотидов и остановке роста.

4. Каталитическая активность корового домена ИМФДГ и регуляторная роль субдомена ИМФДГ функционально независимы. Присутствие субдомена ИМФДГ является необходимым и достаточным условием нормального контроля синтеза адениловых нуклеотидов, вне зависимости от того, прикреплен ли субдомен к каталитически активному или инактивированному коровому домену.

5. Возможным эффектом мутации guaBACDS могут являться изменения посттрансляционной модификации а-АТР синтетазы, а также увеличение экспрессии GMP-синтетазы, фактора элонгации Tu и 3-фосфоглицерат-киназы.

6. Точковые мутации в гене ИМФДГ, ассоциированные с пигментным ретинитом, снижают синтез адениловых нуклеотидов. Это свидетельствует о двустороннем эффекте субдомена ИМФДГ на биосинтез аденилатов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пимкин, М.А. Изучение физиологической роли CBS домена инозин-5'-монофосфат дегидрогеназы (ИМФДГ) Escherichia coli путем метаболического скрининга. Тезисы международной научной студенческой конференции МНСК-46, Новосибирск, 26-30 апреля 2008 г.

2. Пимкин, М.А., Соловьев, A.C., Маркам, Дж.Д. Инозин 5'-монофосфат дегидрогеназа как регулятор нуклеотидного и энергетического метаболизма. Тезисы 36 конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии, Смоленск, 24 апреля 2008 г.

3. Пимкин, М.А., Соловьев, A.C., Пимкина, Ю.С., Маркам, Дж.Д. Внутриклеточные концентрации нуклеотидов и активности ферментов пуринового метаболизма штамма Escherichia coli с делецией субдомена инозин-5'-монофосфат дегидрогеназы. // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2008 - №.3. -С. 19-23.

4. Pimkin, М., Pimkina, }., Markham, G.D. A regulatory role of the Bateman domain of IMP dehydrogenase in adenylate nucleotide biosynthesis. // Journal of Biological Chemistiy - 2009. - N. 284 - V. 12 - P. 7960-7969.

5. Pimkin, M., Markham, G.D. The CBS subdomain of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase regulates purine nucleotide turnover. // Molecular Microbiology - 2008. - N. 68 - V. 2 - P. 342-359.

6. Pimkin, M., Markham, G.D. Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase. // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. - 2009. -N. 76-P. 1-54.

7. Pimkin, M., Markham, G.D. A regulatory role for the CBS subdomain of inosine 5'- monophosphate dehydrogenase in ATP homeostasis. Abstracts of the 13th Annual Fox Chase Cancer Center Postdoctoral & Graduate Student Research Conference, Philadelphia, June 6, 2008.

8. Pimkin, M., Hussein, M., Markham, G.D. Deletion of the CBS domain of IMPDH sensitizes Escherichia coli to growth arrest by adenosine. Abstracts of the 12th Annual Fox Chase Cancer Center Postdoctoral & Graduate Student Research Conference, Philadelphia, June 1, 2007.

9. Pimkin, M., Markham, G.D. The regulatory roles of the CBS domain of IMPDH in purine nucleotide and energy metabolism. Abstract 19(A) of the 2nd ASM Conference on Integrating Metabolism and Genomics (IMAGE2), Montreal, Canada, April, 30 - May, 3, 2007.

Пимкин Максим Андреевич Роль субдомена инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата мед. наук.

Подписано в печать 16.09.2009 г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная № 1. Печать офсетная Объем 1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 9073.

Отпечатано ОАО «Смоленская городская типография», 214000, г. Смоленск, ул. Маршала Жукова, 16, тел.: 59-99-07, 38-28-65, 38-14-53.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Пимкин, Максим Андреевич

ВВЕДЕНИЕ.:.:.

ГЛАВА I. ИНОЗИН-5 '-МОНОФОСФАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗА И ОБМЕН ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Обмен пуриновых ну клеотидов.

1.1.1 Фосфорибозил-пирофосфат-синтетаза.

1.1.2 Регуляция синтеза IMP fife novo.

1.1.3 Синтез адениловых и гуаниловых нуклеотидов из IMP.

1.1.4 Утилизация пуриновых оснований и нуклеозидов.

1.1.5 Взаимопревращения пуриновых нуклеотидов.

1.2 Инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназа.20;

1.2:1 Место ИМФДГ в биосинтезе пуриновых нуклеотидов.20"

1.2.2 Структура и механизм ферментативного катализа ИМФДГ.

1.2.3 Ингибиторы ИМФДГ: клиническое значение и роль в изучении ферментативного механизма.

1.2.4 Структура субдомена ИМФДГ и его роль в развитии аутосомно-доминантного пигментного ретинита.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов"

I ! ' j энергодонора [2,10]. Инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназа (ИМФДГ; Е.С. I

1.1.1.205) — фермент de novo синтеза гуаниловых нуклеотидов, катализирующий превращение инозин-5'-монофосфата (IMP) в ксантозин-5' 1 монофосфат (ХМР) [79]. Клетки ряда опухолей, а также эмбриональные ткани характеризуются повышенной» экспрессией ИМФДГ, что свидетельствует о важной роли фермента в процессах канцеро- и эмбриогенеза. Ингибиторы ИМФДГ снижают клеточный пул гуаниловых нуклеотидов и обладают антипролиферагивным действием, что является основой их клинического применения для иммунносуппрессивной, противоопухолевой и антивирусной терапии [155]. Более глубокое понимание регуляторных процессов, протекающих с участием ИМФДГ, может способствовать дальнейшей разработке и совершенствованию лекарственных препаратов-ингибиторов фермента [155].

Мутации последовательности гена ИМФДГ-1 человека, кодирующей субдомен, вызывают наследственную форму пигментного ретинита - тяжелого дегенеративного заболевания сетчатки, приводящего к слепоте. Патогенетические механизмы развития этого заболевания неизвестны [14]. Аминокислотные замены в субдомене ИМФДГ, как и полное удаление субдомена, не вызывают изменений каталитической активности фермента in vitro [78]. Данный факт свидетельствует, что развитие пигментного ретинита, по-видимому, не связано с недостатком гуаниловых нуклеотидов в клетках сетчатки, и субдомен ИМФДГ может выполнять какую-то регуляторную роль в, обмене пуриновых нуклеотидов, не связанную с основной функцией фермента.

Целью настоящего исследования явилось изучение функциональной роли субдомена ИМФДГ в процессах обмена пуриновых нуклеотидов. Согласно'

• « » ' ' . ( « ! поставленной цели было предусмотрено решение следующих задач:

1. Сконструировать мутант Escherichia• coli с удаленной последовательностью субдомена ИМФДГ на хромосоме.

2. Исследовать влияние мутации на способность клетки к. поддержанию нормального внутриклеточного пула свободных пуриновых, нуклеотидов Е. coli, а также на распределение потока

IMP в направлении синтеза гуаниловых и адениловых нуклеотидов. i

3. Изучить изменения протеома Е. coli в ответ на-удаление субдомена ИМФДГ.

1 »

Научная новизна. Впервые сконструированы бактериальные штаммы, позволяющие прицельно изучать физиологическую роль субдомена ИМФДГ in vivo. Впервые описан эффект удаления субдомена ИМФДГ in vivo на нуклеотидые пулы клетки и распределение потоков IMP в направлении синтеза адениловых и гуаниловых нуклеотидов. Впервые показана роль субдомена ИМФДГ в процессах регуляции синтеза адениловых нуклеотидов. Впервые исследован in vivo эффект мутаций, ассоциированных с пигментным. ретинитом.

Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое значение работы состоит в создании новых представлений, о роли субдомена ИМФДГ в обмене пуриновых нуклеотидов клетки.

Результаты, исследования позволяют рекомендовать сконструированную нами мутантную форму Е. coli как модель для исследования функциональной значимости субдомена ИМФДГ.

Полученные данные могут быть использованы при рассмотрении патогенетических механизмов развития пигментного ретинита.

Личный^ вклад автора заключается в* самостоятельном - проведении всех представленных экспериментальных исследований,, за исключением^ синтеза олигонуклеотидов (синтез, выполнен в" Fannie Rippel DNA Synthesis and Biotechnology Facility, Fox Chase Cancer Center), автоматического ДНК-сиквенирования (выполнено в DNA Sequencing Facility, Fox Chase Cancer Center), пептидного! синтеза и.приготовления антител (выполнены в компании 21st Century Biochemicals, USA), метаболического скрининга (компания Biolog, USA) и,. • дифференциального гель-дисплея» с последующей масс-спектрометрической детификацией белков (компания Applied Biomics, USA).

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе, а также в лекционном курсе и на практических занятиях Há кафедрах биологической химии и медицинской биологии Смоленской государственной медицинской академии.

-, i : ■ ¡ 1 '

Апробация работы. Основные положения диссетрации- доложены и обсуждены на заседаниях проблемной- комиссии (иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология) Смоленской государственной, медицинской, академии (2006-2009); доложены на 36-й конференции молодых ученых Смоленской государственной' медицинской академии (Смоленск, 2008 г.), 12-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2007 г.), 13-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2008 г.), 2-й конференции «Интеграция метаболизма и геномики» Американской микробиологической ассоциации (Монреаль, Канада, 2007 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Штамм Е. coli MP 101 (мутация guaB^CBS) может быть использован для изучения in vivo физиологической роли субдомена ИМФДГ.

2. Субдомен ИМФДГ является транс-регулятором de novo синтеза адениловых нуклеотидов из IMP.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пимкин, Максим Андреевич

выводы

1. Гуанин-прототрофный штамм МР101 с удаленной хромосомной ДНК-последовательностью, кодирующей субдомен (мутация guaBACBS), может быть использован для изучения функциональной роли субдомена ИМФДГ.

2. Субдомен ИМФДГ является транс-регулятором синтеза адениловых нуклеотидов из IMP. Удаление субдомена релаксирует синтез адениловых нуклеотидов из IMP при росте на минимальной среде, что приводит к увеличению пула АТР.

3. Мутация guaB является условно-летальной. Штамм MP 101 aCBS guaBr ) не способен к росту на минимальной среде в присутствии I предшественников IMP (аденозина, инозина, гипоксантина) за счет 1 > бесконтрольного увеличения пулов адениловых нуклеотидов, приводящего к дефициту пиримидиновых нуклеотидов и остановке г роста. i 1 .

4. Каталитическая активность корового домена ИМФДГ и регуляторная i I роль субдомена ИМФДГ функционально независимы. Присутствие субдомена ИМФДГ является необходимым и достаточным условием нормального контроля синтеза адениловых нуклеотидов, вне зависимости от того, прикреплен ли субдомен к каталитически активному или инактивированному коровому домену.

5. Возможным эффектом мутации guaBACBS могут являться изменения посттрансляционной модификации а-АТР синтетазы, а также увеличение экспрессии GMP-синтетазы, фактора элонгации Ти и 3-ф ос ф оглицерат-киназы.

6. Точковые мутации в гене ИМФДГ, ассоциированные с пигментным ретинитом, снижают синтез адениловых нуклеотидов. Это t w [ , ) I 1 свидетельствует о двустороннем эффекте субдомена ИМФДГ на биосинтез аденилатов.

1.3 Заключение

По данным литературы, интактность субдомена ИМФДГ не является обязательным условием для'сохранения нормальной каталитической функции фермента in vitro [56,97,149]. Однако в литературе не представлено данных об in vivo эффекте удаления субдомена. Согласно принципу A. Krogh, для изучения любой физиологической функции существует или может быть создан оптимальный организм [125]. Почти абсолютная эволюционная консервативность путей синтеза пуриновых нуклеотидов и структуры ИМФДГ оставляет широкие возможности выбора модельного организма. По ряду причин, наиболее оптимальной моделью, очевидно, является Е. coli: во-первых, в отличие от эукариот, у бактерий имеется лишь один ген ИМФДГ (геном человека кодирует 2 изофермента, геном дрожжевых грибов - 4 изофермента); i 4 во-вторых, бактерии, и в особенности Е. coli, являются наиболее легким объектом для генетического манипулирования; в-третьих, в силу своей

1 ) относительной простоты, Е. coli — наиболее глубоко охарактеризованный клеточный организм планеты. Очевидно, для изучения функции субдомена ИМФДГ, оптимальным организмом являлся бы бактериальный штамм, у которого хромосомная последовательность, кодирующая CBS домен ИМФГ

1 ■ i * « располагающаяся внутри последовательности корового домена), была бы i ' i i i i , удалена без смещения рамки считывания корового домена. Ожидается, что i \ t подобный мутант (назовем его guaBACBs) будет способен к de novo синтезу пуриновых нуклеотидов и, как следствие, росту на минимальной среде (т.е. прототрофии). Сравнительное изучение пуринового обмена мутанта guaBACBS и дикого штамма может пролить свет на возможные функции субдомена ИМФДГ in vivo.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Микробиологические методы

Бактериальные клетки выращивались на минимальных средах MOPS [147] и М9 [141,173]. Рост культуры клеток оценивался путем измерения оптической плотности культуры спектрофотометром Hewlett Packard 8452А при длине волны 600 нм. Антибиотики добавляли в среду роста в следующих

• » > i * концентрациях: тетрациклин - 20 мкг/мл; канамицин - 35 мкг/мл; хлорамфеникол, 12,5 мкг/мл; ампициллин- - 100 мкг/мл. Все минимальные среды приготавливались с добавлением 1 мкг/мл тиамина. Пуриновые основания и нуклеозиды добавлялись в среду в концентрациях, указанных в описаниях отдельных экспериментов.

2.2 Молекулярно-генетические методы

Синтез олигонуклеотидов осуществлялся на автоматическом ДНК' 1 ч i синтезаторе; последовательности использованных олигонуклеотидов приведены в Табл. 4. Основные молекулярно-генетические процедуры« (ПЦР, очистка продуктов амплификации, лигирование, приготовление компетентных клеток, трансформация, выделение плазмид, автоматическое сиквенирование, Р1 шУ-трансду кция) осуществлялись в соответствии со стандартными протоколами и рекомендациями [141,173]. Все вновь сконструированные плазмиды и штаммы подвергались автоматическому сиквенированию для проверки соответствия ДНК-конструкции ожидаемому результату.

Табл. 4. Олигонуклеотиды, использованные в исследовании. Мутагенные последовательности, а также химерные последовательности, содержащие промоторы и участки для рекомбинирования с хромосомой, обозначены подчеркиванием.

Олигонуклеотид Последовательность нукпеотидов

DM373 5'-CAGG CAG AAG AAGTTCGCCGTGTG ААААААС ACG AATCTG GTGG AG CTG CT TCGAAGTTCC

DM374 5'-ACCCGCACCTGCGCCAACCGCTGCACCAACACGCAGACGGCCATGAATATC CTCCTTAGTTCC

DM378 5'-ATTCAGTCGATAGTAACCCGCCCT

DM416 5 '-GTG AGCG AG ATCAAATTCTAAATCAG CAG G

DM417 5 '-TC AG GAG С CCAG ACG GTAGTTC

DM429 5'-CGGCATTGGCCCTGGCTCTATCGCGACAACTCGTATCGTGACTGGCG

DM430 5'-CGCCAGTCACGATACGAGTTGTCGCGATAGAGCCAGGGCCAATGCCG

DM457 5 '-ACCCCAG G CTTTAC ACTTTATG CTTC С G G CTC GTATAATGTGTG GACAATATT TATTAACCACTCTGGTCGAG

DM465 5'-GAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACACACCAAAC ACCCCCCAAAACC

DM466 5'-CTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAACACAC AACCACACCACACCAC

DM475 5'-CTCAG G С AAAAC AAATTCTTGCTCATTTAACCCCG GAGTTGTG ATCTG GAG С TGCTTCGAAGTTCC

DM476 5'-CTTAATAAGCAGGCCGGACAGCATCGCCATCCGGCACTGATACGAGGTATG AATATCCTCCTTAGTTCC

DM479 5'-TCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGTTTCAAT AATTTCACACAGGAAACAGCTATGAAATTTCCCGGTAAACGTA

DM480 5'-TTAACGATCCCAGTAAGACTCTTCC

DM481 5 '-GCCAAAAAG GTC AATAGAAACGTTG

DM482 5'-GCATAGGTCATACAAATGGATATTACAGAC

DM483 5'-CGGTGTTGACCGTGTGCTGACAGTGGCTCTGCACGCTGAACAGATTCAGGG TTTC

DM484 5'-GAAACCCTGAATCTGTTCAGCGTGCAGAGCCACTGTCAGCACACGGTCAAC ACCG

DM498 5'-CAGATAATATAAATCGCCCGACATGAAGTCGGGCGAAGAGAATCAGGAGCC CAGACGGTAGTTC

IDT-1 5'-CGGCATTGGCCCTGGCTCTATCGCGACAACTCGTATCGTGACTGGCG

IDT-2 5'-CGCCAGTCACGATACGAGTTGTCGCGATAGAGCCAGGGCCAATGCCG

2.2.1 Gam-Bet-Exo рекомбинирование

Штамм Е. coli MPI Ol (guaBACBS) был сконструирован на основе штамма Е. coli BW25113 [40] с применением технологии рекомбинирования [40,52,203]. На первом этапе, нуклеотидная последовательность, кодирующая CBS-домен в стуктуре хромосомного гена gnaB (аминокислотные остатки №№ 116-238 в структуре ИМФДГ), замещалась геном канамицин фосфотрансферазы {кап), фланкированным FRT-последовательностями (сайтами распознавания. FRT-рекомбиназы). Для этого ген кап, фланкированный FRT-последовательностями, ПЦР-амплифицировали с плазмиды pKD4, используя химерные праймеры (DM373, DM374),, , содержащие на 5'-концах ДНК-последовательности, гомологичные последовательностям, фланкирующим сайт рекомбинации на хромосоме. Как и следовало ожидать, полученный штам (МР41) был

1 • 1 ауксотрофен по отношению к гуанину. На втором этапе рекомбинации ген канамицин фосфотрансферазы «вырезали» действием FRT рекомбиназы [40]. I

Рекомбинанты селектировали на минимальной среде как колонии, вновь I приобредшие способность к прототрофии. Данный метод оставляет на месте замещаемого сегмента хромосомной ДНК т.н. «шрам»: нуклеотиную I последовательность одной копии FRT сайта, соответствующую открытой рамке

I ' ' I считывания из 24 аминокислотных остатков

I . • <

GAASKFLYFLENRNFGIGTKEDIH). Таким образом, полученный штамм, обозначенный МР101, содержал делецию субдомена ИМФДГ с сохранением рамки считывания каталитического домена (здесь и далее мутация обозначена как «guaBüCBS»), г ' ( ч

Табл. 5. Штаммы, сконструированные и использованные в ходе исследования

Штамм Материнский штамм/Генотип Стратегия конструкции/Ссылку»

BW25113 lacP rrnBrl4 AlacZwn6 hsdR514 [40]

AaraBADAm3 ArhaBADLD1$

MP41 [BW25113] guaB::kan рекомбинирование; замена последовательности субдомена на кап

I I • * I с С0ХРанением последовательности 'корового домена; KanR , > - •

Штамм Материнский штамм/Генотип Стратегия конструкции/Ссылки

МР101 [МР41] guaBACBS удаление кап FRT-рекомбиназой [161]

JW1615 [BW25113] add::кап Keio collection [17]

JW5401 [BW25113] guaB::kan Keio collection [17]

JW0466 [BW25113] gsk::kan Keio collection [17]

JW4135 [BW25113] purAr.kan Keio collection [17]

JW0101 [BW25113] guaCr.kan Keio collection [17]

ТТ25401 tet TetR; лаборатория J. Roth

МР310 [BW25113] guaBACBS addr.kan MP101 x P1(JW1615), Kan'

МРЗЗО [BW25113] guaBACBS gsk::kan MP101 x Pl(JW0466),Kanr

МР255 [BW25113] deoDr.tet рекомбинирование, BW25113 deoD-btet, Tetr

МР350 [BW25113] guaBACBS deoDr.tet рекомбинирование, MP101 deoD-^tet, Tetr

МР2501 [BW25113] deoDr.tet purAr.kan MP255 x P1(JW4135), Kanr Tetr

МР3501 [BW25113] guaBACBS deoDr.tet purAr.kan MP350 x P1(JW4135), Kanr Tetr

МР402 [B W25113] purBr.kan рекомбинирование, BW25113 purB-Ъкап, Kanr

МР4021 [BW25113] deoDr.tet purBr.kan MP255 x P1(MP402), Kanr Tetr

МР4022 [BW25113] guaBACBS deoDr.tet purBr.kan MP350 x P1(MP402), Kanr Tetr

МР2502 [BW25113] deoDr.tet guaCr.kan MP255 x P1(JW0101), Kanr Tetr

МР3502 [BW25113] guaBACBS deoDr.tet guaCr.kan MP350 x P1(JW0101), Kanr Tetr

МР501 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГК84У;

МР502 [MP41] ' - рекомбинирование, ИМФДГТ95М

МР503 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГШ38Ы

МР504 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГШ00Ы

МР505 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГЕ205Р

МР506 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГК212Е

МР507 [MP41] рекомбинирование, ИМФДГУ2421

Штаммы МР255 (deoD::tet)' к МР350 (guaB*CBS deoD::tet) получали

1 » рекомбинированием, путем замены открытой рамки считывания гена deoD на ген tet, являющийся детерминантой устойчивости к тетрациклину (см. Табл. 5). Для ПЦР-амплификации гена tet с хромосомной ДНК штамма ТТ25401 воспользовались химерными олигонуклеотидами DM465 и DM456 (см: Табл. 4). Аналогичным образом был сконструирован штамм МР402: последовательность гена ригВ была замещена геном канамицин фосфотрансфразы, амплифицированным с плазмиды pKD4 с помощью химерных олигонуклеотидов DM475 и DM475. Во всех случаях использовался стандартный протокол рекомбинирования [40].

Штаммы МР501, МР502, МР503, МР504, МР505, МР506, МР507,-несущие точковые мутации в хромосомном гене giiaB, конструировали на основе штамма МР41 (см. Табл. 5). На первом этапе точечные мутации вносили в плазмиду pGUAB (Табл. 7), содержащую дикий ген giiaB под контролем нативного промотора. Для мутагенеза использовали процедуру QuikChange (Stratagene) и мутагенные олигонуклеотиды, последовательности которых даны, в Табл. 6. Таким образом, полученные промежуточные плазмиды содержали I нужные мутантные аллели guaB, кодирующие гены ИМФДГ с \ аминокислотными заменами, указанными в Табл: 6 и Табл. 12. На втором этапе мутированные аллели guaB ПЦР-амплифицировали с промежуточных плазмид t > , и gam-йе/'-е.хо-рекомбинировали в штамм МР41, замещая ген канамицин-фосфотрансферазы нужным аллелем guaB. Для амплификации использовались праймеры DM378 и DM498 (Табл. 4). v ' 1

Табл 6. Олигонуклеотиды, использованные для сайт-направленного мутагенеза в ходе конструкции промежуточных плазмид, несущих гены ИМФДГ с аминокислотными заменами, ассоциированными с пигментным ретинитом. Подчеркиванием отмечены мутагенные кодоны «+»-нитевых праймеров. замена Олигонуклеотиды для мутагенеза.

R84W DM486:5'-TGAACGCCAGGCAGAAGAAGTTTGGCGTGTGAAAAAACACGAATCTG

DM487: 5'-CAGATTCGTGTTTTTTCACACGCCAAACTTCTTCTGCCTGGCGTTCA t

T95М DM488: 5' AAAACACGAATCTGGTGTGGTGATGGATCCGCAGACTGTTCTGCCAA DM489: 5' TTGGCAGAACAGTCTGCGGATCCATCACCACACCAGATTCGTGTTTT

D138N DM490: 5' GGTGGGTATTATCACCGGTCGTAACGTGCGTTTTGTTACCGACCTGA DM491: 5' TCAGGTCGGTAACAAAACGCACGTTACGACCGGTGATAATACCCACC

D200N DM503 : 5' GATCGGCATGATCACCGTGAAAAACTTCCAGAAAGCGGAACGTAAAC DM504: 5' GTTTACGTTCCGCTTTCTGGAAGTTTTTCACGGTGATCATGCCGATC

А/к замена Олигонуклеотиды для мутагенеза

Е205Р DM502: 5' CGTGAAAGACTTCCAGAAAGCGCCGCGTAAACCGAACGCCTGTAAAG

DM501: 5' CTTTACAGGCGTTCGGTTTACGCGGCGCTTTCTGGAAGTCTTTCACG

V242I DM496: 5' TGACGCGCTGGTTGCCGCAGGCATTGACGTTCTGCTGATCGACTCCT DM497: 5' AGGAGTCGATCAGCAGAACGTCAATGCCTGCGGCAACCAGCGCGTCA

2.2.2 Конструкция плазмид

Однокопийные плазмиды, несущие гены guaB+ и guaBACBS под контролем нативного промотора, конструировали на основе вектора pCCl (Copy Control PCR Cloning Kit, компания Epicentre, США). Гены guaB+ и guaBACBS с 5' регуляторными последовательностями амплифицировали с геномной ДНК штаммов Е. coli BW25113 и Е. coli МР101, соответственно. Геномную ДНК Е. coli выделяли с помощью набора PureLink™ Genomic DNA Purification Kit (кат. < I I ' V I ill''. 4 ■ 45-7005, Invitrogen, USA). ,Для амплификации использовали олигонуклеотиды DM417 и DM417. ПЦР-продукты клонировали в вектор pCCl в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (см. Табл. 7).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Пимкин, Максим Андреевич, Санкт-Петербург

1. Дудиньска, В., Хлыпчак, А. Й., Скотницка, Е., Суска, М. Метаболизм пуринов в эритроцитах человека. // Биохимия. — 2006. — Т. 71. — №. 5. — С. 581-591.

2. Жаров, С. Н., Лучшев, В. Н. Комплексная терапия больных хроническимгепатитом С с применением препарата рибавирин медуна. // Российский. j ',медицинский журнал. 2006. - Т. 2. - С. 37-38.

3. Мауриня, X. А. Использование и трансформация пуриновых и пиримидиновых соединений микроорганизмами. // Межвуз. сб. науч. тр. ЛГУ, Рига; 1981. '

4. Медик, В. А., Токмачев, М. С., Фишман, Б. Б. Статистика в медицине иг ^ *. *. \ !биологии. М.: Медицина, 2000. - 412 с.

5. Северин; Е. С. Биохимия. М.: Гэотар-Медиа, 2008. - 759 с.

6. Фатеев, И. В., Константинова, И. Д., Швец, В; И. Биотехнологический способ синтеза новых аналогов рибавирина. // Вестник МИТХТ им. М:В; Ломоносова. 2008: - Т. 3. - №. 4. - С. 56-60.

7. Шницын, А. В:, Широкова, Е. А. Рибонуклеозид-5-монофосфаты с дизамещенным фосфатом не взаимодействуют с инозин монофосфат дегидрогеназой: // Биоорганическая химия. — 1997. Т. 23. - №. 1. - С. 45.

8. Abrahams, J. Р;, Leslie, A. G;, Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria. // Nature. 1994. -V 370: - N. 6491; - P. ¡621-628;

9. Ataullakhanov, F. I:,.Yitvitsky, V. Mi What determines the intracellular ATP concentration. // Biosci Rep. 2002. - V. 22. - N. 5-6. - P. 501-511.

10. Bateman, A. The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein. // Trends Biochem Sci: 1997. - V. 22. - N. 1. -P. 12-13.

11. Benson, G. E., Gots, J. S. Regulation of GMP reductase in Salmonella typhimurium: // Biochim Biophys Acta. 1975. - V. 403. - N. 1. - P. 47-57.

12. Berry, R. M. ATP synthesis: the world's smallest wind-up toy. // Curr Biol. -2005,- V. 15. N. 10.-P. R385-387.

13. Biemans-Oldehinkel,, E., Mahmood, N. A., Poolman, B. A sensor, for intracellular ionic strength. //Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. - V. 103. - N. 28.-P. 10624-10629.

14. Bochner, B. R., Gadzinski, P., Panomitros, E. Phenotype microarrays for high-throughput phenotypic testing and' assay of gene function: II- Genome Res. -2001.-V. ll.-N. 7.-P. 1246-1255.

15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation ofi >microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. //1 hi V-!. i •. ;

16. Anal Biochem. 1976. - V. 72. - N. - P. 248-254.! .

17. Brox, L. W., Hampton, A. Inosine 5-phosphate dehydrogenase. Kinetic mechanism and evidence for selective reaction of the 6-chloro analog of inosine 5'-phosphate with a cysteine residue at the inosine 5-phosphate site. //1 r ' '

18. Biochemistry. 1968. - V. 7. - N. 7. - P. 2589-2596.i i '

19. Butland, G., Peregrin-Alvarez, J. M., Li, J., Yang, W., Yang, X., Canadien, V.,i

20. Cashel, M., Gallant, J. Two compounds implicated in the function of the RCi ' ' . i i i i •gene of Escherichia coli. // Nature. 1969. - V. 221. -N. 5183. - P. 838-841.

21. Chapman, A. G., Atkinson, D. E. Adenine nucleotide concentrations and turnover rates. Their correlation with biological activity in bacteria and yeast. // Adv Microb Physiol: —1977. V. 151 - P. 253-306.

22. Escherichia coli K-12 using PCR product^. II, Proc Natl Acad Sci U S A,. .'i, > i. ! .'•,:. • .2000. V. 97. - N. 12. - P. 6640-6645.

23. Davies, I. J., Drabble, W. T. Stringent and growth-rate-dependent control of the gua operon of Escherichia coli K-12. // Microbiology. 1996. - V. 1421. N. 9-P. 2429-2437. .

24. Deckers-Hebestreit, G., Greie, J., Stalz, W., Altendorf, K. The ATP synthase of' . i * « i . . i ••<' I*«'»

25. Escherichia coli: structure and function of F(0) subunits. // Biochim Biophys Acta. 2000. - V. 145.8.-N. 2-3.-P. 364-373.

26. Derreumaux, P., Schlick, T. The loop opening/closing motion of the enzyme triosephosphate isomerase. // Biophys. J. 1998. - V. 74. - N. 1. - P. 72-81.

27. Di Bisceglie, A. M., McHutchison, J., Rice, C. M. New therapeutic strategies' \ i , 1 \for hepatitis C. // Hepatology. 2002. - V. 35. - N. 1. - P. 224-231.

28. Digits, J. A., Hedstrom, L. Kinetic mechanism of Tritrichomonas foetus inosine 5-monophosphate dehydrogenase. // Biochemistry. 1999: - V. 38.1. N. 8.-P. 2295-2306.t ,

29. Digits, J. A., Hedstrom, L. Kinetic mechanism of Tritrichomonas foetus inosine 5-monophosphate dehydrogenase. // Biochemistry. 1999. - V1. 38. -N. 8.-P. 2295-2306.

30. Digits, J. A., Hedstrom, L. Species-specific inhibition of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase by mycophenolic acid. // Biochemistry. 1999. -V. 38.-N. 46.-P. 15388-15397.

31. Dimroth, P. Operation of the F(0) motor of the ATP synthase. // Biochim. i

32. Biophys Acta. 2000,- V. 1458. -N. 2-3. - P. 374-386.i

33. Elion, G. B. The purine path to chemotherapy. // Science. 1989. - V*. 244. -N. 4900.-P. 41-47.i . i >. i

34. Ellis, H. M., Yu, D., DiTizio, T., Court, D: L. High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-strandedoligonucleotides. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. - V. 98: - N. 12. - P. 6742-6746;

35. Eriksen; T. A., Kadziola, A., Bentsen, A. K., Harlow, K. W., Larsen, S. Structural basis for the function of Bacillus subtilis- phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase. // Nat Struct Biol. 2000. - V. 7. - N. 4. - P. 303308: . •

36. Farber, G. K., Petsko, G. A. The evolution ofv alpha/beta* barrel enzymes; // Trends Biochem. Sci: 1990;- V. 15. -N;.6.— P; 228-234;

37. Goldstein,, B. M., Bell, J. E., Marquez, V. E. Dehydrogenase binding by tiazofurin anabolites. // J. Med; Chem. 1990; - V. 33: - N: 4. -P. 1123-1127.

38. Goldstein; B: M., Pankiewicz, K. W., (Eds.), Inosine Mophosphate Dehydrogenases, Oxford University Press, 2002. '

39. Green, S. Mi,. Malik, T., Giles, I. G;, Drabble, W. T. The purB gene of• • • ■ .

40. Escherichia coli K-12 is located in an; operon. // Microbiology: — 1996. — V. 142.-N. 11 P. 3219-3230,.

41. Grifantini; M. Tiazofiirine ICN Pharmaceuticals. // Curr. Opin. Invest. Drugs. -2000. V. 1. N. 2, - P: 257-262.

42. Gu, J. J., Stegmann; S., fGathy, K., Murray, R:, Laliberte, J., Ayscue, L., Mitchell, B. S, Inhibition of T lymphoc^e activation in mice heterozygous for loss of the IMPDH II gene. // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106. - N. 4. - P: 599606. . ,

43. Guillen Schlippe, Y. iV., I ledstrom, L. Is Arg418 the catalj^tic base required for the hydrolysis step; of; the IMP dehydrogenase reaction? // Biochemistry. -2005; -V,'44: -N. 35: P. 11700-11707:

44. Guillen Schlippe, Y. V., Riera, T. V., Seyedsayamdost, M. R., Hedstrom; L. Substitution of the conserved Arg-Tyr dyad "selectively disrupts the hydrolysis phase of the IMP dehydrogenase reaction. // Biochemistry. 2004; - V. 43. -N. 15.-P. 4511-4521.

45. Hammer-Jespersen, K., Buxton, R. S., Hansen, T. D. A second purine nucleoside phosphorylase in Escherichia coli K-12. II: Properties of xanthosine Phosphorylase and its induction by xanthosine. // Mol Gen Genet. 1980. - V. 179.-N. 2.-P. 341-348.

46. Hammer-Jespersen, K., Munch-Petersen, A., Schwartz, M., Nygaard, P. Induction of enzymes involed in the catabolism of deoxyribonucleosides and ribonucleosides in Escherichia coli K 12. // Eur J Biochem. 19711 — V. 19. -N. 4.-P. 533-538.

47. Harlow, K. W., Nygaard, P., Hove-Jensen, B. Cloning and characterization of the gsk gene encoding guanosine kinase of Escherichia coli. // J Bacteriol. — 1995; — Vs. 177. -N. 8. P. 2236-2240;

48. He, B., Zalkin, H. Regulation of Escherichia coli purA by purine repressor, one component of a dual control*mechanism: // J Bacterid. 1994! -V. 176. — N. 4.-P. 1009-1013.

49. Hedstrom, L. IMP dehydrogenase-linked retinitis pigmentosa. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008: - V. 27. - N. 6. - P. 839-849.

50. Hedstrom,. L., Gan, L. IMP dehydrogenase: structural schizophrenia' and an unusual base. // Curr Opin Chem Biol: -2006: V. 10. -K 5.-P. 520-525.

51. Hershey, H. V., Taylor, M. W. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Escherichia coli adenine phosphoribosyltransferase and comparison with other analogous enzymes. // Gene. 1986. — V. 43. — N*. 3. — P. 287-293. . .

52. Heyde, E., Morrison, .J- F. Studies on inosine monophosphate dehydrogenase. Isotope exchange at equilibriumi // Biochim Biophys Acta. 1976. -- V. 429. -N. 3. - -P. 661-67,1. . ,

53. Heyde, E., Nagabhushanam, A., Vonarx, M., Morrison, J. F. Studies on inosine monophosphate dehydrogenase. Steady, state kinetics. // Biochim Biophys Acta: 1976; — V. 429L-N. 3. -P: 645-660:*

54. Ho, Y., Gruhler, A., Heilbut, A., Bader, G. D., Moore, L., Adams, S. L., Millar,

55. A., Taylor, P.,. Bennett, K., Boutilier, K., Yang, L., Wolting, C., Donaldson; I., Schandorff, S., Shewnarane, J., Vo, M., Taggart, J., Goudreault, M., Muskat,

56. Hochstadt, J. Adenine phosphoribosyltransferase from Escherichia coli; // Methods EnzymoL 1978;-V. 51.-P. 558-567.

57. P binding site in. the IMP. dehydrogenase from Tritrichomonas foetus. // Biochemistry. 1995.- V. 34. -N. 42.-P. 13889-13894.

58. Huete-Perez, J. A., Wu, J. C., Whitby, F. G., Wang, C. C. Identification of the IMP binding site in the IMP dehydrogenase from Tritrichomonas foetus. // Biochemistry. 1995. - V. 34. - N. 42. - P. 13889-13894.

59. Husnain, S. I., Thomas, M. S. The UP element is necessary but not sufficient for growth rate-dependent control of the Escherichia coli guaB promoter. // J Bacterid. 2008. - V. 190. - N. 7. - P. 2450-2457.

60. Hyle, J. W., Shaw, R. J., Reines, D. Functional distinctions between IMP dehydrogenase genes in providing mycophenolate resistance and guanine prototrophy to yeast. // J Biol Chem. 2003. - V. 278. - N. 31. - P. 2847028478.

61. Ignoul, S., Eggermont, J. CBS domains: structure, function, and pathology in human proteins. // Am J Physiol Cell Physipl. 2005. - V. 289. - N! 6. - P. C1369-1378.

62. Ikegami, T., Natsumeda, Y., Weber, G. Recovery of the activities of IMP dehydrogenase and GMP synthase after treatment with tiazofiirin and acivicin in hepatoma cells invito. //Adv. Exp. Med. Biol. 1989. - V. 253B. - P. 299-304.

63. Ishikawa, H. Mizoribine and, mycophenolate mofetil. // Curr. Med. Chem.i . \ ■ > >1999. V. 6.-N. 7. - P. 575-597.

64. Ishikawa, H. Mizoribine and mycophenolate mofetil. 11 Curr Med Chem.1999. V. 6.-N. 7. - P. 575-597.• t ' '

65. Jackson, R. C., Weber, G., Morris, H. P. IMP dehydrogenase, an enzyme linked with proliferation and malignancy. // Nature. 1975. - V. 256. - N. 5515.-P. 331-333.v » . • * . , »

66. Jackson, R. C., Weber, G., Morris, H. P. IMP dehydrogenase, an enzyme linked with proliferation and malignancy. // Nature. 1975. — V. 256. — N. 5515.-P. 331-333.t

67. Jain, J., Almquist, S. J., Shlyakhter, D., Harding, M. W. VX-497: a novel, selective IMPDH inhibitor and immunosuppressive agent. // J Pharm Sci. -2001.-V. 90. -N. 5. P. 625-637.

68. Jensen, K. F. Apparent involvement of purines in the control of expression of Salmonella typhimurium pyr genes: analysis of a leaky guaB mutant resistant to pyrimidine analogs. // J Bacteriol. 1979.' - V. 138. - N. 3. - P. 731-738.

69. Jensen, K. F. Purine-nucleoside phosphorylase from Salmonella typhimurium and Escherichia coli. Initial velocity, kinetics, ligand banding, and reactionmechanism. // Eur J Biochem. 1976. - V. 61. - N. 2. - P. 377-386.i

70. Jensen, K. F. Regulation of Salmonella typhimurium pyr gene expression: effect, of changing both purine and pyrimidine nucleotide pools. // J Gen Microbiol. 1989. - V. 135. - N. 4. - P. 805-815.

71. Jensen, K. F., Nygaard, P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli- and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. // Eur J

72. Biochem. 1975. - V. 51. - N. 1. - P. 253-265.t

73. Jhee, K. H., Kruger, W. D. The role of cystathionine beta-synthase in homocysteine metabolism. // Antioxid Redox Signal. 2005. - V. 7. - N. 5-6. -P. 813-822.

74. Jochimsen, B. U., Hove-Jensen, B., Garber, B. B., Gots, J. S. Characterization1 tof a Salmonella typhimurium, mutant defective intiii 'phosphoribosylpyrophosphate synthetase. // J Gen Microbiol. 1985. -V. 131.^ ^ ♦-N. 2.-P. 245-252.r f I1.f

75. Juang, R. H., McCue, K. F., Ow, D. W. Two purine biosynthetic enzymes thati 1 • . i . .are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe utilizecysteine sulfinate in vitro. // Arch Biochem Biophys. 1993. - V. 304. - N. 2. -P. 392-401.

76. Kahn, B. B., Alquier, T., Carling, D., Hardie, D. G. AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism. // Cell Metab. 2005. - V. 1. - N. 1. - P. 15-25.

77. Kang, C., Kim, S., Fromm, H. J. Subunit complementation of Escherichia coli adenylosuccinate synthetase. // J Biol Chem. 1996. - V. 271. - N. 47. - P. 29722-29728.

78. Karlstrom, H. O. Inability of Escherichia coli B to incorporate addeddeoxycytidine, deoxyandenosine, and deoxyguanosine into DNA. // Eur J

79. Biochem.-1970.-V. 17.-N. l.-P. 68-71.

80. Kawasaki, H., Shimaoka, M., Usuda, Y., Utagawa, T. End-product regulation! . •and kinetic mechanism of guanosine-inosine kinase from Escherichia coli. //

81. Biosci Biotechnol Biochem. 2000. - V. 64. - N. 5. - P. 972-979.i i <

82. Kennan, A., Aherne, A., Humphries, P. Light in retinitis pigmentosa. // Trends

83. Genet.-2005.-V. 21.-N. 2.-P. 103-110.i

84. Kerr, K. M., Cahoon, M., Bosco, D. A., Hedstrom, L. Monovalent cation activation in Escherichia coli inosine 5'-monophosphate dehydrogenase. // Arch Biochem Biophys.-2000.-V. 375.-N. l.-P. 131-137.

85. Keseler, I. M., Bonavides-Martinez, C., Collado-Vides, J., Gama-Castro, S.,i

86. Gunsalus, R. P., Johnson, D. A., Krummenacker, M., Nolan, L. M., Paley, S.,i i

87. Paulsen, I. T., Peralta-Gil, M., Santos-Zavaleta, A., Shearer, A. G., Karp, P. D.i ! i . < i

88. EcoCyc: a comprehensive view of Escherichia coli biology. // Nucleic Acids Res. 2009. - V. 37. -N. Database issue. - P. D464-470.

89. Kessler, A. I., Gots, J. S. Regulation of guaC expression in Escherichia coli. // J Bacteriol. 1985. — V. 164.-N. 3.-P. 1288-1293.

90. Krath, B. N., Hove-Jensen, B. Bacillus caldolyticus prs gene encoding phosphoribosyl-diphosphate synthase. // Gene. 1996. - V. 176. - N. 1-2. - P. 73-79.

91. Krogan, N. J., Peng, W. T., Cagney, G., Robinson, M. D., Haw, R., Zhong, G., Guo, X., Zhang, X., Canadien, V., Richards, D. P., Beattie, B. K., Lalev, A.,

92. Zhang, W., Davierwala, A. P., Mnaimneh, S., Starostine, A., Tikuisis, A. P.,i, i v > •

93. Grigull, J., ,Datta, N., Bray, J. E., Hughes, T. R., Emili, A., Greenblatt, J. F. High-de finition macromolecular composition of yeast RNA-processing complexes. // Mol Cell. 2004. - V. 13. - N. 2. - P. 225-239.

94. Krogh, A. Progress in physiology. // Am. J. Physiology. 1920. - V. 90. - N. -P. 243-251.

95. Lambden, P. R., Drabble, W. T. The gua operon of Escherichia coli K-12: evidence for polarity from guaB to guaA. // J Bacteriol. 1973. - V. 115. — N. 3.-P. 992-1002.

96. Leung, H. B., Schramni, V. L. Adenylate degradation in Escherichia coli. Therole of AMP nucleosidase and properties of the purified enzyme. // J Biol« I ' ' ! *

97. Chem. 1980. - V. 255. - N. 22. - P. 10867-10874.

98. Leung, H. B., Schramm, V. L. The structural gene for AMP nucleosidase. Mapping, cloning, and overproduction of the enzyme. // J Biol Chem. 1984. - Y. 259. - N. 11. - P. 6972-6978.

99. Lieberman, I., Kornberg, A., Simms, E. S. Enzymatic synthesis of pyrimidine nucleotides; orotidine-5'-phosphate and uridine-5-phosphate. // J Biol Chem. -1955.-V. 215.-N. l.-P. 403-451.

100. Liu, Y., Bohn, S. A., Sherley, J. L. Inosine-5-monophosphate dehydrogenase is a rate-determining factor for p53-dependent growth regulation. // Mol Biol Cell. 1998. - Y. 9. - N. 1. - P. 15-28.

101. Luecke, H., Prosise, G. L., Whitby, F. G. Tritrichomonas foetus: a strategy forstructure-based inhibitor design of a protozoan inosine-5-monophosphate1 . ■dehydrogenase. // Exp Parasitol. 1997. - V. 87. - N. 3. - P. 203-211.i :1' i

102. Mager, J., Magasnik, B. Guanosine 5-phosphate reductase and.its role in the interconversion of purine nucleotides. // J Biol Chem. 1960. - V. 235. - P. 14741478.i i > i

103. Markham, G. D., Monovalent cation activation of IMP dehydrogenase, in: Pankiewicz, K.W.,Goldstein, B.M., (Eds.), Inosine mophosphate dehydrogenase: a major theraputic target, Oxford University Press, 2002.s

104. Markovic, S., Dutzler, R. The Structure of the Cytoplasmic Domain of the

105. Chloride Channel CIC-Ka Reveals a Conserved Interaction Interface. //■ i /!

106. Structure. 2007. - V. 15. - N. 6. - P. 715-725.» ^ »

107. McLean, J. E., Hamaguchi, N., Belenky, P., Mortimer, S. E., Stanton, M., Hedstrom, L. Inosine 5-monophosphate dehydrogenase binds nucleic acids in vitro and in vivo. // Biochem J. 2004. - V. 379. - N. 2. - P. 243-251.

108. McMillan, F. M., Cahoon, M., White, A., Hedstrom, L., Petsko, G. A., Ringe,

109. D. Crystal structure at 2.4 A resolution of Borrelia burgdorferi inosine 5'. N '. ,> i >' i i \ ■ i \monophosphate dehydrogenase: evidence of a substrate-induced hinged-lid motion by loop 6. // Biochemistry. 2000. - V. 39. - N. 15. - P. 4533-4542.

110. Meng, L. M., Kilstrup, M., Nygaard, P. Autoregulation of PurR repressor synthesis and involvement of purR in the regulation of purB, purC, purL, purMN and guaBA expression in Escherichia coli. // Eur J Biochem. 1990. -V. 187.-N. 2.-P. 373-379. '

111. Messenger, L. J., Zalkin, H. Glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase from Escherichia coli. Purification and properties. // J Biol

112. Chem. 1979. - V. 254. - N. 9. - P. 3382-3392.i

113. Meyer, S., Savaresi, S., Forster, I. C., Dutzler,R. Nucleotide recognition by the cytoplasmic domain of the human chloride transporter C1C-5. // Nat Struct Mol Biol. 2007. - V. ,14. -N. 1. - P. 60-67.

114. Miller, J. H. A short course in bacterial genetics. A laboratory manual and' ;' . i t, i 'handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1992. c.

115. Miller, M. D., Schwarzenbacher, R., von Delft, F., Abdubek, P., Ambing, E.,

116. Biorac, T., Brinen, L. S., Canaves, J. M., Cambell, J., Chiu, H. J., Dai, X.,i 1 i i ,

117. H., Velasquez, J., Vincent, J., Wang, X., West, B., Wolf, G., Xu, Q., Hodgson,!i . i. j,. i ;

118. K. O., Wooley, J., Wilson, I. A. Crystal structure of a tandem cystathionine-beta-synthase (CBS) domain protein (TM0935) from Thermotoga maritima at

119. A resolution. // Proteins. 2004. - V. 57. - N. 1. - P. 213-217.

120. Minden, J. Comparative proteomics and difference gel electrophoresis. // Biotechniques. 2007. - V. 43. - N. 6. - P. 739, 741, 743 passim.

121. Mori, H., Iida, A., Teshiba, S., Fujio, T. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. // J Bacteriol. 1995: - V. 177. - N. 17. - P. 4921-4926.

122. Mortimer, S. E., Hedstrom, L. Autosomal dominant retinitis pigmentosa mutations in inosine 5-monophosphate dehydrogenase type I disrupt nucleic acid binding. //Biochem J. -2005. -V. 390. -N. 1. P. 41-47.

123. Nakamura, H., Natsumeda, Y., Nagai, M., Shiotani, T., Weber, G. Direct assay method for guanosine 5-monophosphate reductase activity. // Anal Biochem.i V ^ I1992.-V. 206.-N. l.-P. 115-118.I

124. Nilsson, D., Hove-Jensen, B. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Bacillus subtilis. Cloning, characterization and chromosomal mapping of the1 ' 4 jprs gene. // Gene. 1987. - V. 53. - N. 2-3. - P. 247-255.

125. Nimmesgern, E., Black, J., Futer, O., Fulghum, J. R., Chambers, S. P.,

126. Brummel, C. L., Raybuck, S. A., Sintchak, M. D. Biochemical analysis of thetmodular enzyme inosine 5-monophosphate dehydrogenase. // Protein Expr

127. Purif. 1999. - V. 17. - N. 2. - P. 282-289.

128. Nimmesgern, E., Fox, T., Fleming, M. A., Thomson, J. A. Conformational changes and stabilization of inosine 5-monophosphate dehydrogenaseassociated with ligand binding and inhibition by mycophenolic acid. // J Biolt

129. Chem. 1996. - V. 271. -N. 32. - P. 19421-19427.t . '

130. Nygaard, P., Multiple functions of purine nucleoside phosphorylase andvadenosine deaminase in Escherichia coli. in: Barth, A., Haschen, R., Laibach,j < i

131. F.H., Possin, H.,Schowen, R.L., (Eds.), Molecular and cellular regulation of enzyme activity, Martin-Luther-Universitat, Halle, Germany, 1984, pp. 96

132. Pankiewicz, K. W., Goldstein, B. M. Inosine monophosphate dehydrogenase. A major therapeutic target. Oxford University Press, Washington, DC, 2003. c.

133. Pankiewicz, K. W., Patterson; Sv E., Black, P. L., Jayaram, IT. N., Risal, D:,1. N . ., . . ' , . '

134. Goldstein; B. M., Stuyver, L. J., Schinazi, R. E. Cofactor mimics as selective inhibitors! of NAD-dep.endent inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH)--the major therapeutic target. II Cuit Med Chem. 2004: — V. 11. — N. 7. - P. 887-900.

135. Pimkin, M., Markham, G. D. Inosine 5-monophosphate dehydrogenase. // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 2009. - V. 76. - P. 1-53.

136. Pimkin, M., Markham, G. D. The CBS subdomain of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase regulates purine nucleotide turnover. // Molecular Microbiology. 2008. - V. 68. -N. 2. - P. 342-359. ,

137. Poland, B. W., Brans, C., Fromm, H. J., Honzatko, R. B. Entrapment of 6-thiophosphoryl-IMP in the active site of crystalline adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli. // J Biol Chem. 1997. - V. 272. - N. 24. -P. 15200-15205.

138. Prosise, G. L., Luecke, H. Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor andanalogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism. //i . '

139. J Mol Biol.-2003. TV. 326.-N. 2.-P. 517-527.

140. Robertson, B. C., Hoffee, P. A. Purification and properties of purine nucleoside phosphorylase from Salmonella typhimurium. // J Biol Chem. 1973. - V.t V i i i248.-N. 6.-P. 2040-2043.

141. Rolfes, R. J., Zalkin, H. Autoregulation of Escherichia coli purR requires two11 . ■■ i i > i 11control sites downstream of the promoter. // J Bacteriol. 1990. - V. 172. - N.10.-P. 5758-5766.^ i ,' i 1

142. Rudolph, M; J.,.Amodeo, G. A., Iram, S. H., Hong, S. P., Pirino, G., Carlson, M., Tong, L. Structure of the Bateman2 domain of yeast Snf4: dimeric association and relevance for AMP binding. // Structure. 2007. - V. 15. - N. 1. - P. 65-74.

143. Sambrook, J., Russell, Dl W. Molecular cloning. A laboratory mainual: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring I larbor, New York, 2001. c.

144. Schumacher, M. A., Choi, K. Y., Lu, F., Zalkin, Hi, Brennan, R. G. Mechanism of corepressor-mediated specific. DNA binding by the. purine repressor.//Celli 1995.-V; 83. - Ni l. - P; 147-155:

145. Seeger, C., Poulsen, C., Dandanell, G. Identification and characterization of genes (xapA, xapB, and xapR) involved in xanthosine catabolism in Escherichia coli. // J Bacterid. 1995. -V. 177. -N. 19. - P. 5506-5516.

146. Shad, J. A., McHutchison, J. G. Current and future therapies of hepatitis C. // Clin. Liver Dis. 2001. - V. 5. - N. 2. - P. 335-359.

147. Sherley, J. L. Guanine nucleotide biosynthesis is regulated by the cellular p53 concentration. // J Biol Chem. 1991. - V. 266. -N. 36. - P. 24815-24828.

148. Sin, I. L., Finch, L. R. Adenine phosphoribosyltransferase in Mycoplasma mycoides and Escherichia coli. // J Bacteriol. 1972. - V. 112. - N. 1. - P. 439-444.i 1

149. Sintchak, M. D., Fleming, M. A., Futer, O., Raybuck, S. A., Chambers, S. P.,f i

150. Caron, P. R., Murcko, M. A., Wilson, K. P. Structure and mechanism ofi iinosine monophosphate dehydrogenase in complex with thei11 . > > . I ' , «immunosuppressant mycophenolic acid. // Cell. 1996. - V. 85. - N. 6. - P. 921-930.

151. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. // Immunopharmacology.2000.-V. 47.-N. 2-3.-P. 1.63-184.i

152. Sokoloski, J. A., Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Induction of the differentiation of synchronized HL-60 leukemia cells by tiazofiirin. // Exp. Cell. Res. 1989. -V. 182. -N. 1. - P. 234-241.

153. Stayton, M. M., Rudolph, F. B., Fromm, H. J. Regulation, genetics, and properties of adenylosuccinate synthetase: a review. // Curr Top Cell Regul. -1983.-V. 22.-P. 103-141.

154. Tesfa-Selase, F., Drabble, W. T. Regulation of the gua operon of Escherichiacoli by the DnaA protein. // Mol Gen Genet. 1992. - V. 231. - N. 2. - P. 256264.

155. Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. // Proteomics. 2008.• V (- V. 8. N. 23-24. - P. 4886-4897.i

156. Townley, R., Shapiro, L. Crystal structures of the adenylate sensor from fission yeast AMP-activated protein kinase. // Science. 2007. - V. 315. -N. 5819. -P. 1726-1729.

157. Valentin-Hansen, P., Hammer, K., Love Larsen, J. E., Svendsen, I. The internalregulated promoter of the deo operon of' Escherichia coli K-12. // Nucleict< >

158. Acids Res. 1984. - V. 12. - N. 13. - P. 5211-5224.1 i • i i i > i ,1190. van Alphen, W., van Seim, N., Lugtenberg, B. Pores in the outer membrane of1.I 1 !, • I ,

159. Escherichia coli K12: involvement of proteins b and e in the functioning of pores for nucleotides.// Mol Gen Genet. 1978. - V. 159. - N. 1. - P. 75-83.1 ' . t ! . i ' . i v ' i * <)

160. Vasantha, N., Freese, E. Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulationi icaused by deprivation of guanine nucleotides. // J Bacterid. 1980. - V. 144. -N. 3.-P. 1119-1125.1 ' . .

161. Verham, R., Meek, , T. D.,. Hedstrom, L., Wang, C. C. Purification, characterization, and kinetic analysis of inosine 5-monophosphate dehydrogenase of Tritrichomonas foetus. // Mol Biochem Parasitol. 1987. -V. 24.-N. l.-P. 1-12.

162. Wang, C. C., Verham, R., Rice, A., Tzeng, S. Purine salvage byr

163. Tritrichomonas foetus. // Mol. Biochem. Parasitol. 1983. - V. 8. - N. 4. - P.1 ' t *325.337.

164. Wang, G. P., Cahill, S. M., Liu, X., Girvin, M. E., Grubmeyer, C. Motional dynamics of the catalytic loop in OMP synthase. // Biochemistry. 1999. - V. 38.-N. l.-P. 284-295.i

165. Wang, W., Hedstrom, L. Kinetic mechanism of human inosine 5'-'i .monophosphate dehydrogenase type II: random addition of substrates andordered release of products. // Biochemistry. 1997. - V. 36. - N. 28. - P. 8479-8483.

166. Wang, W., Hou, Z., Honzatko, R. B., Fromm, H. J. Relationship of conserved residues in the IMP binding site to substrate recognition and catalysis in Escherichia coli adenylosuccinate synthetase. // J Biol Chem. 1997. — V. 272. -N. 27.-P. 16911-16916.

167. Watterson, S: H., Chen, P., Zhao, Y., Gu, H. H., Dhar, T. G., Xiao, Z., Ballentine, S. K., Shen, Z., Fleener, C. A., Rouleau, K. A., Obermeier, M., Yang, Z., Mclntyre, K. W., Shuster, D. J., Witmer, M., Dambach, D., Chao, S.,

168. Mathur, A., Chen, B. C., Barrish, J. C., Robl, J. A., Townsend, R., Iwanowicz,1 >

169. Weber, G. Enzymes of purine metabolism in cancer. // Clin. Biochem. 1983.-V. 16.-N. l.-P. 57-63.i < ' , ' / >

170. Xiang, B:, Taylor, J. C., Markham, G. D. Monovalent cation activation and kinetic mechanism of inosine 15-monophosphate dehydrogenase. // J Biol Chem. 1996. - V. 271.-N. 3. -P. 1435-1440.

171. Yamada, Y., Natsumeda, Y., Weber, G. Action of the active metabolites of tiazofurin and ribavirin on purified IMP dehydrogenase. // Biochemistry.1 1 I ' . IS . I1988. -V. 27. -N. 6. P. 2193-2196.i ' 1 , : .' !'

172. Yu, D., Ellis, H. M., Lee, E. C., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Court, D. L. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. V. 97. - N. 11. - P. 5978-5983.

173. Yuan, J., Fowler, W. U., Kimball, E., Lu, W., Rabinowitz, J. D. Kinetic flux profiling of nitrogen assimilation in Escherichia coli. // Nat Chem Biol. — 2006. -V. 2.-N. 10.-P. 529-530.

174. Zalkin, H., Dixon, J. E. De novo purine nucleotide biosynthesis. // Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1992. - V. 42. - N. - P. 259-287.

175. Zhang, R., Evans, G., Rotella, F. J., Westbrook, E. M., Beno, D., Huberman,i

176. E., Joachimiak, A., Collart, F. R1. Characteristics and crystal structure of bacterial inosine-5'-monophosphate dehydrogenase. // Biochemistry. 1999. -V. 38. - N. 15. - P. 4691-4700.

177. Zhou, X., Cahoon, M., Rosa, P., Hedstrom, L. Expression, purification, and characterization of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase from Borrelia burgdorferi. // J Biol Chem. 1997. - V. 272. - N. 35. - P. 21977-21981.

Информация о работе

Пимкин, Максим Андреевич
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль субдомена инозин-5-монофосфат-дегидрогеназы в процессах обмена пуриновых нуклеотидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы