Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рол синего света в регуляции роста, морфогенеза и баланса эндогенных фитогормонов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Рол синего света в регуляции роста, морфогенеза и баланса эндогенных фитогормонов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh."

На правах рукописи

РГВ ол

•2 5 СЕН 71/1*7

ТИ1ДЕНК0 СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА

РОЛЬ СИНЕГО СВЕТА В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, МОРФОГЕНЕЗА И БАЛАНСА ЭНДОГЕННЫХ ФИТОГОРМОНОВ АгаЫйоръ'т ИшИапа (I.) Неупк

03.00.05 - ботаника 03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2000

Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений Томского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Р. А. Карначук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.Н. Меняйло

кандидат биологических наук Е.С. Гвоздева

Ведущая организация:

Центральный Сибирский ботанический сад г. Новосибирск

Защита диссертации состоится " 29 " июня 2000 г. в М часов на заседании Специализированного совета К.063.53.08 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Гербарии им. П.Н.Крылова Томского государственного университета.

634050, Томск-50, пр. Ленина, 36

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Томского государственного университета.

Автореферат разослан " 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ЕМЬ-ЦЪ

рш ■ т. /. о

кандидат биологических наук, доцент С.Н. Кирпотин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Свет является одним из самых важных факторов окружающей среды, регулирующих рост и развитие растений. Регулятор-ное действие света проявляется на всех этапах жизненного цикла, от прорастания до образования семян. Эта регуляция осуществляется благодаря наличию специфических фоторецепторов, поглощающих, в том числе, и коротковолновую область спектра. Известно, что многие реакции растений регулируются синим светом (Воскресенская, 1975; Briggs, lino, 1983).

Существует предположение, что на одном из этапов в цепь реакций, инициированных фоторецепторами, включаются фитогормоны, и под влиянием преобразованной информации происходит изменение гормонального баланса растения (Mohr, 1962; Кефели, 1987; Карначук и др., 1990). Показано, что гормональный баланс растений изменяется под влиянием света разного спектрального состава (Dofler, Goring, 1978; Kohler, 1985; Карначук и др., 1990). Наряду с этим существуют многочисленные данные о том, что роли света и фитогормо-нов в регуляции развития растений значительно перекрываются. В частности, фитогормоны вызывают реакции, подобные тем, которые запускаются светом (Moore, 1979; Chory et al., 1994; Su, Howwell, 1995). Связь между световым сигналом и уровнем эндогенных фитогормонов мало изучена. Для изучения этой связи удобно использовать в качестве модели мутанты Arabidopsis thaliana (L.) Hcynh. Молскулярко-гспстичсскии подход с использованием" такой модели позволил за сравнительно короткий промежуток времени продвинуться в области идентификации фоторецепторов. Доказано существование специфических фоторецепторов синего света, молекулярная структура которых была расшифрована недавно (Ahmad, Cashmore, 1993; 1996; Christie et ai., 1998). Однако, представления о механизмах передачи сигналов синего света до сих пор остаются фрагментарными. Роль эндогенных фитогормонов в реализации этих сигналов в морфогенетические ответы не исследована.

Показано влияние экзогенных брассиностероидов (БС) на фотоморфоге-нетические реакции арабидопсиса. Это позволило предположить важную роль БС в обработке светового сигнала у растений (Li et al., 1996; 1997; Szekeres et al., 1996). Возможно, что эффект БС связан также с регуляцией уровня основных эндогенных гормонов, контролирующих рост и морфогенез.

Представляло интерес исследовать роль синего света и БС в регуляции ростовых реакций и гормонального баланса арабидопсиса дикого типа и мутанта пу4, имеющего нарушение в восприятии синего света в связи с дефектом фоторецептора криптохрома 1 (CRY1).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснение влияния синего света на рост, морфогенез и формирование гормонального баланса арабидопсиса для понимания взаимодействия сигналов внешней среды с эндогенными регуляторами жизнедеятельности растеннй. Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Проанализировать исходный уровень эндогенных гормонов в набухших семенах дикого типа и мутанта hy4 в норме и под влиянием БС;

2. Изучить особенности роста, фотосинтетического аппарата и уровня эндогенных гормонов арабидопсиса дикого типа и мутанта ку4 при выращивании на белом свету;

3. Исследовать влияние синего света на рост гипокотилей и баланс эндогенных гормонов проростков дикого типа и мутанта ку4;

4. Оценить влияние экзогенного БС на рост гипокотилей и баланс эндогенных гормонов проростков дикого типа и мутанта Иу4 в темноте и на синем свету.

Научная новизна. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в развитие представлений об участии эндогенных гормонов в трансляции световых сигналов, регулирующих ростовые реакции растений на примере ЛгаЫ(1орз1В гИаИапа.

Впервые показано, что трансляция сигнала синего света сопряжена с изменением уровня эндогенных гормонов. Это стало возможным благодаря использованию в экспериментах удачной модели - мутанта Иу4, с нарушением восприятия синего света. Утрата функции фоторецептора СЯУ1 у мутанта ку4 сказывалась на изменении гормонального баланса набухающих семян, листьев растений, выращенных на белом свету, а также при выращивании проростков в темноте. Синий свет неоднозначно влиял на рост гипокотилей нормальных и мутантных проростков, и это проявилось в изменении их гормонального баланса. Продемонстрирована возможность участия цитокининов (ЦТК) в преобразовании сигналов синего света, воспринимаемых фоторецептором СЯУ1. Кроме того, мутация сгу! значительно влияет на баланс ГА4Л - основных биоактивных гиббереллинов (ГА) арабидопсиса. Изменение уровня ГА, ИУК и АБК сопряжено с трансляцией сигналов синего света, воспринимаемых другими фоторецепторами, отличными от СЯУ1. Показана возможность взаимодействия сигналов синего света и БС з регуляции уровня фитогормонов.

Практическая значимость работы. Полученные результаты дают материал для решения вопросов создания светокорректирующих пленок, используемых в растениеводстве закрытого фунта, с целью управления продукционным процессом растений. Результаты данной работы используются в учебном процессе при чтении курса "Физиология растений", "Рост и морфогенез растений" Томского государственного и педагогического университетов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийском совещании к 120-летию ТГУ и 75-летию кафедры физиологии и биотехнологии растений (Томск, 1998); V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); IV Съезде физиологов растений России (Москва, 1999); Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 1999); научных семинарах Томского отделения РОФР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах, содержит 30 рисунков, 14 таблиц, состоит из введения, шести глав, включающих обзор литературы, описание объекта и методик исследования, ре-

зультаты экспериментов и их обсуждение, основных выводов и списка литературы (174 наименования, из них 122 зарубежных издания).

Автор выражает глубокую благодарность зав. лабораторией химии стероидов ИБОХ HAH Беларуси проф. В.А. Хрипачу за предоставленный БС для экспериментов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Арабидопсис или резушка Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) - однолетнее травянистое растение из семейства крестоцветных Brassicaceae (Cruciferae). В работе использовали две линии арабидопсиса, предоставленные Центром Арабидопсиса NASC (UK): линию Landsberg erecta (Ler), являющуюся фоновой (дикий тип) и мутантную линию hy4, полученную на основе Ler (Koomneef et al., 1980). Рост гипокотиля у hy4 не ингибируется при продолжительном освещении синим светом. Растения hy4 отличаются от дикого типа бледно-зеленой окраской и слегка удлиненным гипокотилем на белом свету. У Иу4 утрачена функция фоторецептора синего света CRY1 в связи с мутацией (Ahmad, Cashmore, 1993).

При выращивании в почвенной культуре на белом свету (интенсивность 30 Вт/м , 18 -часовой фотопериод) измеряли морфологические параметры растений в возрасте 7 суток, 1 и 2 месяца (длина гипокотиля, размеры семядолей, число и размеры листьев, цветоносов, плодов). В возрасте 1 и 2 месяца определяли содержание фотосинтетических пигментов в листьях по. методу (Шлык, 1971), в возрасте 1 месяц отбирали растительный материал (листья) для определения содержания эндогенных фитогормонов.

В экспериментах с использованием синего света и экзогенного БС семена поверхностно стерилизовали Н202 в 80% этаноле, высевали в чашки Петри на питательную среду, содержащую соли по MC (стандартная среда), либо на среду того же состава, с добавлением 10"6М брассинолида. Прорастание стимулировали трехдневным охлаждением при 4-6°С и освещением белым светом 16 ч (люминесцентные лампы ЛБ-65, интенсивность 30 Вт/м2). После этого часть семенного материала отбирали и фиксировали для определения содержания эндогенных гормонов. В экспериментах с синим светом во всех вариантах проростки выращивали на стандартной среде в разных условиях: в темноте; в темноте с ежедневным досвечиванием синим светом 15 мин или 30 мин. Продолжительность эксперимента - 7 суток. Источник синего света - галогеновая лампа с интерференционным светофильтром (лтах=43б нм, ширина полосы 9 нм, плотность потока квантов 5,2 мкмоль/(м2 с)). В экспериментах с БС и синим светом проростки выращивали на стандартной среде, и на среде с брассинолидом в течение 7 суток в темноте и в темноте с ежедневным досвечиванием синим светом 30 мин. У 7-суточных проростков измеряли длину гипокотилей и размеры семядолей. Одновременно фиксировали растительный материал для определения эндогенных гормонов.

Выделение эндогенных гормонов проводили из навески сырого растительного материала 1500 мг. Растительный материал фиксировали и экстраги-

ровали этанолом. Выделение свободных и связанных ИУК и АБК проводили по методу (Кефели, Турецкая, 1966), свободных ЦТК - по методу (Негрецкий, 1988), свободных и связанных ГА - по методу (Ложникова и др., 1973). Идентификацию гормонов проводили с помощью ТСХ, используя стандартные метчики ИУК, ГА3, ГА» ("Serva", Германия), АБК, зеатин (3), рибозид зеатина (РЗ) и изопентениладенин (ИПА) ("Sigma", США). Учитывая, что ГАЬ ГА3 и изо-ГАз, а также ГА4, ГА7 и изо-ГА- не разделяются и элюируются в виде общих зон (Обут и др., 1983), анализировали их смеси, которые соответственно обозначали как ГАи и ГА4,7. Количественное определение гормонов проводили с помощью твердофазного ИФА. Содержание ЦТК, ИУК, АБК определяли по методу (Кудоярова и др., 1989); ГА - по методу (Холодарь и др., 1995).

При выращивании на белом свету морфологические параметры и содержание фотосинтетических пигментов определяли для 20 растений в каждом варианте. В экспериментах с синим светом и БС морфологические параметры определяли для ста проростков в каждом варианте. Эксперименты проводили в 3-х биологических повторностях, определение уровня гормонов — в 3-х биологических и 6-ти аналитических повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета "Statistica for Windows 5.0", использовали двухфакторный дисперсионный, корреляционный и дискриминантный анализы (выборки близки к нормальному распределению) (Лакин, 1980). В таблицах приведены данные в виде средних арифметических со стандартной ошибкой, на рисунках - в виде средних арифметических с двухсторонним доверительным

______ÍTi^n Оч\

till i W-/-

РОСТ, ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС АРАБИДОПСИСА ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ НА БЕЛОМ СВЕТУ

При выращивании на белом свету в возрасте 7 суток мутанты отличались от проростков дикого типа: hy4 имели более длинные гипокотяли и меньшие размеры семядолей (табл. i).

Таблица 1 - Морфологические параметры 7-суточных проростков дикого типа Ler и мутанта hy4, выращенных на белом свету

Параметр Ler ky4

Длина гипокотиля, мм 3,50 ±0,11 4,91 ±0,13

Длина семядоли, мм 0,75 ± 0,03 0.55 + 0,02

Ширина семядоли, мм 0,47 + 0,01 0,44 + 0,01

Площадь семядоли, мм" 0,25 ±0,01 0,17 ± 0,01

Растения Ьу4 отставали от дикого типа по скорости формирования розе-точных листьев. В возрасте 1 месяц мутанты имели в среднем меньшее число листьев в розетке. Наблюдались различия и в морфологии листьев: у Ъу4 был усилен рост листовой пластинки в ширину, в связи с этим у мутантов формиро-

вались округлые листья большей площади, в то время как у Ьег длина листьев значительно превышала ширину. Месячные растения ку4 имели меньшую общую сухую массу и массу листьев, а также меньшую суммарную листовую поверхность, чем Ьег (табл. 2).

Начало формирования цветоноса и цветение у Иу4 происходило позже в среднем на неделю. Цветоносы мутантов более облиственны, и суммарная площадь листьев цветоноса у Ъу4 была больше, чем у Ьег. Урожай плодов и семян у Иу4 оказался значительно ниже, чем у Ьег, при этом наблюдались отличия по морфологии плодов (табл. 2).

Обнаружено, что у Иу4 значительно снижено содержание фотосинтетических пигментов на единицу площади листа одно- и 2-месячных растений: хло-рофиллов а, Ь в 1,3-1,5 раза, а суммы каротиноидов в 1,1 раза. Мутанты отличались более высоким относительным содержанием каротиноидов.

Таблица 2 - Ростовые и морфологические параметры растений дикого типа Ьег и мутанта Иу4, выращенных на белом свету

Возраст, параметр | Генотип

1 месяц Ьег Иу4

Число листьев в розетке Суммарная площадь розеточных листьев, см2 Сухая масса листьев, мг Длина розеточного листа среднего яруса, с.м Ширина розеточного листа среднего яруса, см Площадь розеточного листа среднего яруса, см2 10,00 ±2,00 4,15+1,63 11,43 + 0,84 1,24 + 0,05 0,75 ± 0,05 0,66 ± 0,05 7,00 + 2,00 2,84 + 0,75 9.02 + 0,32 1,18 ±0,07 0,94 ± 0,03 0,82 + 0,07

2 месяца

Длина основного цветоноса, см Число цветоносов 2-го порядка Суммарная площадь листьев цветоноса, см" Общее число плодов Длина плода, мм Толщина плода, мм 23,05 ± 1,49 2,00 ± 1,00 1,93 ± 0,41 29,00+10,00 12,2 + 0,70 0,91 ± 0,05 15,00 ± 1,08 4,00 + 2,00 2,81 +0,54 14,00 + 5,00 6,30 ± 0,59 1,07 ±0,06

Изменение характера и скорости роста листьев Иу4 по сравнению с Ьег сопровождалось изменением бачанса эндогенных гормонов (рис. 1). В листьях 1ту4, выращенных на белом свету, значительно снижено содержание свободных ГА4.7, принимающих участие в регуляции роста мезофилла. Также понижен уровень ЦТК - 3 и РЗ, участвующих в регуляции фотосинтетической функции и клеточного деления. У мутантных растений повышен уровень свободной ИУК, контролирующей клеточное растяжение, а также высок уровень эндогенного ингибитора роста - свободной АБ1С (рис. 1).

□ ГА 1,3 свободные В ГА4,7свободные

□ ИУК свободная В АБК свободная

□ Зеатин

□ Рибозид зеатина

□ HITA

Ler

hy4

Рисунок 1. Содержание эндогенных гормонов в листьях месячных растений дикого типа Ьег и мутанта Лу-Л выращенных на белом свету

Из таблицы 2 видно, что у мутантных растений достаточно четко прослеживается тенденция усиления роста органов в латеральном направлении, что, вероятно, может происходить из-за усиления растяжения клеток в поперечном направлении. Вероятно, что увеличение площади листа hy4 растений происходит не из-за усиления деления клеток, а за счет их растяжения (Карначук, Голо-вацкая, 1998). Возможно, что наличие относительно высокого уровня свободной ИУК у hy4 является причиной усиленного растяжения листовой пластинки в латеральном направлении. Снижение накопления хлорофиллов в листьях мутантов, вероятно, связано с нарушением биосинтеза этих пигментов из-за дефекта в его регуляции синим светом (Воскресенская и др., 1968; Gao, Kaufman, 1994). У hy4 понижен уровень ЦТК, что согласуется с предположением о совместном действии синего света и ЦТК в регуляции формирования фотосинтетического аппарата (Воскресенская и др., 1968). Недостаточность ассимилирующей поверхности у мутантов на момент цветения и пониженное содержание пигментов фотосинтеза приводят к снижению урожая семян. Повышенное содержание АБК и пониженное содержание ЦТК у hy4 могут быть одной из причин отставания в росте.

Таким образом, дефект в восприятии синей области спектра у мутантных растений приводит к изменениям скорости протекания стадий жизненного цикла, морфологии органов, снижению содержания фотосинтетических пигментов, что связано с изменением гормонального баланса Иу4.

ВЛИЯНИЕ СИНЕГО СВЕТА НА РОСТ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС ПРОРОСТКОВ АРАБИДОПСИСА

Рост проростков. Проростки арабидопсиса Ler и Иу4, выращенные в темноте, в возрасте 7 суток имели этиолированный вид, вытянутые гипокотили, нераскрытые семядоли. При этом гипокотили Ler были почти в два раза длиннее, чем у hy4 (рис. 2А). При ежедневной экспозиции на синем свету 30 мин у Ler наблюдалось ингибирование роста гипокотиля на 14 % по сравнению с темновым вариантом, а также распрямление верхушечной петли. В то же время у hy4 происходило вытягивание пшокотилей, по сравнению с темновым вариантом, а распрямления верхушечной петли не было (рис. 2А). Полученные результаты свидетельствуют, что мутация cry1 влияет на ростовые реакции проростков как при выращивании на синем свету, так и в темноте. Вероятно, дефект CRY1 у hy4 вызывает изменение в программе морфогенеза как в темноте так и на синем свету, что может быть связано с изменением гормонального баланса проростков.

S S

СВ

□ Ler Uhv4

16 -]

I i

12 -I

П

A

Б

cc

T

cc

Рисунок 2. Длина пшокотилей 7-суточных проростков дикого типа Ьег и мутанта ку4. вырашенных на стандартной питательной среде (А) и с добавлением брассино-лида Ю^М (Б) в разных условиях

Т - темнота : СС - темнота с ежедневным досвечиванием синим светом 30 мин

Эндогенные гормоны. Как в набухших семенах, так и в 7-суточных проростках дикого типа и Иу4, вырашенных в темноте и на синем свету, обнаружены существенные различия по уровню основных эндогенных гормонов. В семенах ку4 содержание свободной ИУК было понижено в 2 раза, содержание свободных ГА4.7 и АБК повышено (в 1,3 и 1,5 раза соответственно), а также изменен баланс ЦТК. В 7-суточных проростках Ъу4, выращенных в темноте, со-

держание свободной ИУК было в два раза ниже, а содержание свободной АБК -2,3 раза выше, чем у Ьег (рис. ЗА). Это может служить объяснением наблюдаемому ингибированию роста гипокотиля Иу4 в темноте - высокий уровень активной формы АБК в совокупности с низким содержанием свободной ИУК тормозит рост проростков.

При выращивании в темноте 7-суточные проростки Ьег и ку4 не отличались по содержанию свободных ГАд,7 и ГАи, но связанных форм ГА4,7 у Ьу4 было в два раза больше, чем у дикого типа (рис. ЗА). Изменение баланса ГА^г у мутантов наблюдалось уже перед прорастанием: уровень как свободной так и связанной формы этого гормона у Ау4 в набухших семенах значительно повышен. Это свидетельствует о влиянии мутации сгу1 на баланс ГА^. Уровень РЗ и ИЛА в темноте у Ъу4 был практически одинаков с Ьег, но содержание 3 снижено на порядок (рис. 4А).

Освещение проростков синим светом вызывало ингабирование роста гипокотиля у Ьег, которое сопровождалось повышением уровня связанных ГА4 7, и свободной ИУК, снижением свободной АБК, а также значительным повышением содержания 3, РЗ и ИПА (рис. ЗА, 4А). В то же время у проростков Ъу4, у которых синий свет способствовал удлинению гипокотиля, также наблюдалось повышение уровня свободной ИУК почти в два раза, снижение содержания свободной АБК на 40% по сравнению с вариантом в темноте (рис ЗА). Однако, у Иу4 на синем свету содержание свободной и связанной форм ГА4.7 значительно уменьшалось (рис. ЗА), а содержание всех исследованных ЦТК не изменялось по сравнению с темповым вариантом (рис. 4А).

Обнаружена взаимосвязь между длиной гипокотилей Ьег в темноте а содержанием свободной ИУК (г=0,65). В то же время у ку4 в темноте такой взаимосвязи выявлено не было, однако имела место достоверная отрицательная корреляция между длиной гипокотилей и количеством свободной АБК (г=-0,79). Это свидетельствует о том, что ингибирование роста гипокотиля у ку4 в темноте связано с высоким уровнем свободной АБК. Длина гипокотилей проростков обоих генотипов сильно коррелирует с уровнем свободных ГА4.7 как в темноте (для Ьег г = 0,97, для ку4 г = 0,90), так и на синем свету (г = 0,85 и 0,83 соответственно), что подтверждает участие ГА в регуляции роста гипокотиля. Достоверных корреляций между длиной гипокотилей и уровнем определяемых ЦТК выявлено не было. Это означает, что несмотря на сильные изменения уровня этих гормонов под влиянием синего света у Ьег, ЦТК не принимают значительного участия в регуляции роста гипокотиля, а, вероятно, играют роль в других реакциях деэтиоляции.

Повышение уровня определяемых ЦТК под влиянием синего света у Ьег и отсутствие этой реакции у ку4 позволяет предполагать, что работа фоторецептора СЯУ1 контролирует уровень эндогенных ЦТК. Можно заключить, что уровень ГА,.7 также, в определенной степени, связан с работой фоторецептора СЯУ1. Кроме того, данные позволяют предполагать, что в регуляции уровня ГА у арабидопсиса принимают участие несколько фоторецепторов, воспринимающих синий свет, сигналы которых взаимодействуют между собой, и это отражается на конечном результате.

280 -240 200 160 -1 120 80 -40 " 0

Ьег

сс

Иу4

СС

Ьу4

Л ГА4,7 свободные О ГА4,7 связанные □ ИУК свободная

т СС

IАБК свободная

Рисунок 3. Содержание эндогенных гормонов в 7-суточных проростках дикого типа 1лг и мутанта ку4, выращенных на стандартной питательной среде (А) и с добавлением браесинолида 10'6М (Б) в разных условиях

Т - темнота ; СС - темнота с ежедневным досвечиванием синим светом 30 мин

20

16 ~ 12 8

• 1.ег

Т СС В Зеатнн

Иу4

Т СС

20

16

12 1

4 -

Ьег

£

0 -г1

□ Рибозид зеатнна

СС т

□ ИПА

СС

Рисунок 4. Содержание эндогенных цнтокининов в 7-суточных проростках дикого типа Ьег и мутанта ку4. выращенных на стандартной питательной среде (А) и с добавлением брассинолнда Ю^М (Б) в разных условиях

Т - темнота : СС - темнота с ежедневным досвечиванием синим светом 30 мин

Т

Некоторыми авторами было показано, что помимо фоторецептора CRY1 в регуляции реакций гипокотиля синим светом могут участвовать фитохромы А и В, а также фоторецептор CRY2 (Poppe et al., 1998; Parks et al., 1998). ИУК и АБК, вероятно, также вовлечены в систему передачи сигналов синего света, но регуляция их уровня зависит преимущественно от работы фоторецептором синего света, отличных от CRY1.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО БРАССИНОЛИДА НА РОСТ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС ПРОРОСТКОВ АРАБИДОПСИСА В ТЕМНОТЕ

И НА СИНЕМ СВЕТУ

Гормональный баланс прорастающих семян. Добавление в питательную среду, используемую для выращивания проростков арабидопсиса, экзогенного БС в физиологически активной концентрации 1(ГМ вызывало изменение гормонального баланса набухших семян. В семенах Ler значительно повышалось содержание свободных ГАт.з (на 50 %), 3 в 1,8 раза и РЗ в 2,3 раза, по сравнению с контролем. У ky4 присутствие БС не влияло на уровень эндогенных ГА и ЦТК в семенах. Однако, в семенах обоих генотипов, обработанных БС, наблюдалось увеличение содержания свободной ИУК (в 1,8 раза у Ler и в 3,6 раза у 'пу4) и свободной АБК (в 4 раза).

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что БС значительно влияет на гормональный баланс прорястяюцшх семян ?рябидопсиса. Неоднозначность влияния экзогенного БС на гормональный баланс семян Ler и hy4 вероятно, обусловлена двумя причинами. Во-первых, различным исходным уровнем гормонов у Ler и hy4. Во-вторых, нельзя исключать влияние мутации cryl на процесс передачи световых сигналов, в котором может принимать участие БС. Как было показано Poppe et al. (1998), фоторецептор CRY1 принимает участие з прорастании. Семена, согласно методике, были обработаны белым светом.

Рост проростков. При выращивании в темноте в присутствии БС у 7-суточных проростков Ler рост гипокотилей подавлялся в 1,5 раза по сравнению с вариантом без БС (рис. 2). У hy4 в темноте обработка БС приводила также к значительному (в 1,5 раза) уменьшению длины гипокотиля по сравнению с проростками контрольного варианта, выращенными на стандартной питательной среде (рис 2).

При освещении проростков синим светом на фоне экзогенного БС у Ler наб/аодапось ингибирование роста гипокотиля в 1,5 раза по сравнению с тем-новым вариантом, и в 1,9 раза по сравнению со стандартным выращиванием на синем свету (рис. 2). Таким образом, совместный эффект двух факторов - синего света и БС на ингибирование роста Ler был больше, чем при воздействии факторов по отдельности. Это позволяет предполагать синергизм действия синего света и БС в подавлении роста гипокотиля у Ler. Освещение синим светом проростков Иу4 на фоне экзогенного БС не повлияло на их длину по сравнению с темновым вариантом (рис. 2Б).

Результат совместного действия БС и синего света на ингибированке роста гипокотиля Ler, вероятно, можно рассматривать с точки зрения участия БС в передаче сигнала фоторецептора CRY1. Это позволяет предполагать, что БС может быть звеном в цепи передачи сигнала синего света в регуляторном контуре. Возможно, что экзогенный БС в отсутствие световых сигналов действовал у растений обоих генотипов одинаковым образом, вызывая ингибирование роста. Совместное воздействие синего света и БС на hy4 давало выраженный эффект укорочения гипокотиля, который, очевидно, обусловлен только действием БС, поскольку рост hy4 ингибировался в той же самой степени, что и в темноте. Можно предположить, что это эффект компенсации ослабленной чувствительности hy4 к синему свету. Эффект достигается за счет воздействия экзогенного БС на мутант, которое делает его реакцию подобной отклику нормального растения. Возможно, отсутствие работы фоторецептора CRY1 приводит к блокированию одной из стадий биосинтеза БС. Введение экзогенного БС компенсирует генетический дефект, в результате чего гипокотиль растет в темноте как на свету. Действие БС также может быть сопряжено с изменением уровня эндогенных гормонов.

Эндогенные гормоны. При выращивании проростков Ler в темноте экзогенный БС способствовал повышению содержания свободной ИУК, связанных ГА4.7, небольшому повышению уровней 3 и ИПА и значительному росту уровня РЗ и АБК (рис. 3, 4). У hy4 в темноте БС вызывал снижение содержания свободных ГА—, повышение содержания свободной ИУК как и у Ler, однако уровни свободной АБК и ЦТК у мутанта не изменялись (рис. 3,4).

При освещении проростков синим светом как у Ler, так и у hy4 на фоне экзогенного БС наблюдалось еще большее увеличение содержания свободной ИУК (рис. ЗБ). Очевидно, в данном случае регуляция уровня ИУК синим светом осуществляется через фоторецепторы, отличные от CRY1. В основном же результирующий эффект, вероятно, связан с действием БС. Эти данные также указывают на возможность того, что работа фоторецептора CRY1 сопряжена с функционированием механизма биосинтеза БС. Нарушения в биосинтезе БС, обусловленные генетическим дефектом, могут быть компенсированы влиянием экзогенного гормона. В литературе есть сообщения, свидетельствующие о взаимосвязи эндогенных ауксинов и БС - мутанты, с нарушением биосинтеза БС имеют пониженный уровень эндогенных ауксинов (McKay et ai., 1994).

На синем свету в присутствии БС у проростков Ler наблюдалось значительное снижение содержания свободных ГА4.7 и резко возрастало количество связанных форм этого гормона (рис. ЗБ). Освещение синим светом проростков hy4, выращиваемых на среде с БС, способствовало понижению уровня связанных ГА4.7, но не влияло на уровень свободных ГА4.7, по сравнению с контролем в темноте (рис. ЗБ). Можно предположить, что в регуляции уровня ГА4.7 при участии БС на синем свету имеет значение функционирование как CRY1, так и других фоторецепторов синего света.

Синий свет на фоне экзогенного БС способствовал еще большему увеличению содержания РЗ в проростках дикого типа, чем при действии БС в темноте (рис. 4Б). Такой синергический эффект реализуется, очевидно, при уча-

стии и других фоторецепторов синего света, для передачи сигнала которых необходимо определенное содержание БС. У мутанта 1гу4, у которого не функционирует один из фоторецепторов синего света (С11У1), в аналогичных условиях наблюдается очень незначительное увеличение уровня этого гормона (рис. 4Б). Вероятно, что в регуляции уровня РЗ принимает участие СЯУ1. Но т.к. небольшая реакция на синий свет у мутанта все же имеет место, можно говорить о том, что здесь играют роль сигналы и от других фоторецепторов синего света, которые у ку4 в норме. При наличии БС в регуляции уровня 3 также, вероятно, участвуют другие фоторецепторы синего света, поскольку содержание этого гормона на синем свету увеличивается как у Ьег, так и у ку4 (рис. 4Б).

Экзогенный БС в темноте и на синем свету незначительно влиял на уровень свободной АБК у ку4. Взаимодействие синего света и БС наблюдалось только у Ьег, в проростках которых количество свободной АБК было в 2,8 раза выше по сравнению со стандартным выращиванием на синем свету (рис. 3). При этом у Ьег выявлена отрицательная взаимосвязь между длиной гипокоти-лей и уровнем свободной АБК как в темноте, так и на синем свету (соответственно, г = -0,59 и -0,55). Можно предположить, что в регуляции сигналами БС уровня АБК в проростках играет роль наличие функционально активного фоторецептора СКЛТ.

Илгибирование роста гипокотилей под действием экзогенного БС как у дикого типа, так и у ку4 на фоне повышения уровня физиологически активных ауксинов и ГА, вероятно, может также быть объяснено чрезмерным накоплением этилена. В литературе есть сообщения о том, что обработка экзогенными БС может стимулировать биосинтез этилена, путем активации синтеза его предшественника - 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (ЗсИ^паиГег й а1., 1984; Апесае1а1., 1988).

Таким образом, полученные результаты позволили заключить, что в темноте БС значительно влияет на гормональный баланс проростков как дикого типа, так и Иу4. Эта регуляция не однозначна у I_ег и ку4 в отношении ГАд -, АБК и РЗ. Показано, что в регуляции уровня АБК действие БС сопряжено с трансляцией светового сигнала от фоторецептора СИП. В регуляции уровня ЦТК и ГА4.7 при взаимодействии с БС участвуют СЯУ1 и другие фоторецепторы синего света.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментов вносят вклад в развитие представлений о механизмах фоторегуляции, с помощью которых растения оптимизируют рост и развитие, приспосабливаясь к изменяющимся световым условиям среды. На примере мутанта Иу4 арабидопсиса продемонстрировано значение синего света в регуляции роста и развития растений на разных стадиях жизненного цикла.

Наличие мутации сгу! приводит к изменению гормонального баланса арабидопсиса на разных стадиях жизненного цикла, от прорастания семян до фазы зрелости. Показано, что при выращивании в обычных условиях на белом

свету дефект в восприятии синей области спектра у арабидопсиса отражается на изменении гормонального баланса листьев. Следствием изменения гормонального баланса у мутантных растений являются изменения скорости и характера роста вегетативных органов, задержка наступления репродуктивного периода, снижение урожая семян.

Мутация cryl сказывается и на характере роста hy4 проростков в темноте, что выражается в значительном ингибировании роста гипокотилей hy4 по сравнению с диким типом. Причиной таких морфологических изменений также являются нарушения в гормональном балансе Ну4. Показано значительное влияние мутации cryl на баланс ГА4.7. Кроме того, взаимосвязь биосинтетических путей ГА и АБК приводит к значительному изменению баланса АБК у мутантных проростков, что выражается в ингибировании роста гипокотиля hy4 в темноте.

Действие синего света вызывает ингибирование роста гипокотилей у проростков дикого типа и способствует распрямлению верхушечной петли. При этом существенно изменяется и гормональный баланс. Освещение синим светом ку4 приводит, напротив, к формированию выраженного темнового фенотипа проростков — удлиненный гипокотиль, не распрямленная верхушечная петля. Повышение уровня определяемых ЦТК при освещении синим светом у проростков дикого типа и отсутствие этой реакции у hy4 позволяет предполагать, что сигналы фоторецептора CRY1 контролируют уровень этой группы гормонов. Эти результаты согласуются с предположениями Chory et al., (1994) о взаимодействии света и ЦТК через общие промежуточные звенья передачи сигналов (белков типа DET и СОР) в регуляции ответов растений, контролируемых светом.

В регуляции роста гипокотиля синим светом принимают участие и другие фотсрепепторы, воспринимающие этот участок спектра, возможно это CRY2, NPH1, фитохромы (Poppe et al., 1998; Parks et al., 1998).

Контроль роста гипокотиля синим светом сопряжен с изменением эндогенных ГА, ИУК и АБК, однако уровень этих гормонов значительно зависит и от работы других фоторецепторов синего света, отличных от CRY1. Кроме того, по всей видимости, имеет место взаимодействие между путями передачи сигналов от разных фоторецепторов синего света, и это сказывается на формировании баланса основных эндогенных фитогормонов.

Экзогенный БС оказывает значительное влияние на рост проростков обоих генотипов, которое выражается в ингибировании удлинения гипокотиля как в темноте, так и на синем свету. Однако, реакция ингибирования роста на синем свету у дикого типа и у Иу4 не идентична. Кроме того, присутствие экзогенного БС значительно изменяло гормональный баланс как прорастающих семян, так и проростков, выращенных в темноте и на синем свету. Сделано предположение, что в отсутствие сигналов синего света экзогенный БС действует одинаковым образом и у проростков дикого типа и у Ъу4, вызывая ингибирование растяжения гипокотиля. При выращивании hy4 на синем свету эффект присутствия экзогенного БС подобен компенсации ослабленной чувствительности hy4 к синему свету. Возможно, что сигналы фоторецептора CRY1 играют роль в биосин-

тезе эндогенных БС, и отсутствие работы этого фоторецептора у hy4 приводит к блокированию биосинтеза. Введение экзогеного БС компенсирует генетический дефект.

Таким образом, использование удачной модели - мутанта hy4, утратившего функцию фоторецептора синего света CRY1, позволило продемонстрировать участие эндогенных фитогормонов в трансляции сигналов синего света, регулирующих рост и морфогенез арабидопсиса.

ВЫВОДЫ

1. Мутант hy4, имеющий дефект фоторецептора синего света CRY1, при выращивании на белом свету отличается от растений дикого типа по характеру роста и морфологии вегетативных органов, времени протекания стадий жизненного цикла, уровню фотосинтетических пигментов и урожаю семян.

2. Впервые показано, что утрата функции фоторецептора синего света CRY1 влияет на баланс эндогенных фитогормонов арабидопсиса. Изменение характера и скорости роста листьев hy4 на белом свету связано со снижением уровня ГА47, зеатина и рибозида зеатина и повышением уровней ИУК и АБК.

3. Показано, что причиной ингибирования роста гипокотиля hy4 проростков в темноте является изменение гормонального баланса - существенное снижение содержания свободной ИУК и зеатина, и повышение содержания свободной АБК и связанных Г А4 -

4. Синий свет вызывает удлинение гипокотилей hy4, которое сопряжено с изменением баланса эндогенных гормонов - снижением уровня ГА и АБК, повышением уровня ИУК. Изменение уровня цитокининов на синем свету связано с работой фоторецептора CRY1.

5. Рост гипокотиля арабидопсиса контролируется и другими фоторецепторами синего света, отличными от CRY1. Эта регуляция сопряжена с изменением баланса ГА4.7, ИУК и АБК.

6. Действие экзогенного брассинолида, как в темноте так и на синем свету, изменяет баланс эндогенных гормонов. При этом уровень АБК зависит от работы фоторецептора CRY1, а уровень ГА4.7 и цитокининов - от работы CRY1 и других фоторецеаторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тишенко С.Ю., Карначук P.A. Особенности роста и уровень эндогенных ИУК и АБК Arabidopsis thaliana (L.) Heynh дикого тип и hy4 // Физиология и биотехнология растений. Мат-лы Всероссийского совещания, посвященного 120-летию Томского госуниверситета и 75-летию кафедры физиологии и биотехнологии растений. Томск, 11-12 сентября 1998 г. - Томск: ТГУ, 1998. - С. 20-21.

2. Карначук P.A., Тищенко С.Ю., Головацкая И.Ф. Фитогормоны и Морфогенез арабидопсиса дикого типа и hy4 /7 Мат-лы V Межд. конф. "Регуля-

торы роста и развития растений". Москва, 29 июня - 1 июля 1999 г. - М.: РАСХН, 1999. - С. 32.

3. Карначук P.A., Тищенко С.Ю., Головацкая И.Ф. Рост и эндогенные гормоны у световых мутантов арабидопсиса в онтогенезе // Мат-лы межд. конф. IV Съезда физиологов растений России. Москва, 4-9 октября 1999 г. - М., 1999. -С. 593-594.

4. Карначук P.A., Тищенко С.Ю., Хрипач В.А., Елисеев A.A. Роль брассинолида в регуляции роста и баланса эндогенных гормонов у дикого типа и светового мутанта hy4 арабидопсиса // Мат-лы межд. конф. "Регуляция роста, развития и продуктивности растений". Минск, 9-11 ноября 1999г. — Минск, 1999.-С. 58.

5. Тищенко С.Ю. Эндогенные гормоны и морфогенез мутантных проростков арабидопсиса, дефектных в восприятии синего света // Мат-лы XXXVIII межд. конф. "Студент и научно-технический прогресс", посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 10-14 апреля 2000 г. - Новосибирск: НГУ, 2000. С. 137.

6. Карначук P.A., Тищенко С.Ю., Головацкая И.Ф. Эндогенные фито-гормоны и регуляция морфогенеза проростков Arabidopsis thaliana (L.) Heynh синим светом // Физиология растений. - 2000 (в печати).