Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль рН во взаимодействии фотосенсибилизатора с отдельной клеткой

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль рН во взаимодействии фотосенсибилизатора с отдельной клеткой"

РГБ ОД

Московский ордена Ленина, ордена Трудобого 'Красного Знамени и ордена Октябрьской Революции Государственный университет им. М.В.Ломоносова

Физический факультет

На правах рукописи УДК 535.21:535.333.: 621.373.826:53.001.57

Яоршш Лариса Валерьевна

"Роль.рН во взаимодействии фотосексябшггзатора с отдельной клеткой"

03.00.02 - биофизика

Автореферат.

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 1994 г.

Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель

доктор физ.-мат. наук, профессор Ю.М.Романовский

Официальные оппоненты

доктор физ.-мат. наук, ведущий научный сотрудник А.Н.Тихонов

кандидат биологических наук старший научный сотрудник руководитель лаборатории .А.В.Иванов

Ведущая организация

- Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г. Москва

Защита состоится " & " ИЮНЯ 1994 г. в аудитории ОРР на заседании специализированного Совета т ОФГТ (К. 053.05.77) в МГУ им. М.В.Ломоносова

часов в Ученого по

адресу: 119899, ГСП, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет. •

С диссертацией можно ознакомиться в. библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан "¿9" 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат физ.-мат. наук . [, Т.М»Козлова

Р Р

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Фотодинамическая терапия (ФДХ) злокачественных новообразований эффективно используется в клинической практике последние два десятилетия. В основе метода лежит способность некоторых красителей - фотосенсибилизаторов (5С) - преимущественно накапливаться в опухолевых тканях. При облучении опухоли светом определенного спектрального состава молекулы ФС переходят в возбужденное синглетноэ состояние, безызлучательно релаксируюцее в долгокивущвв триплэтнов состояние, которое далее участвует в фотохимической реакции с образованием скотлетного кислорода или радикалов. Последние являются цитотоксичэскими агентами, вызывающими гибель опухолевых клеток.

Одной из актуальных проблем в изучении фотодинамического воздействия (ФДВ) на живые клетки является исследование механизмов накопления и локализации' ФС в клетках, а также развития процесса гибели клетки,, вызванной фотоданамическим воздействием.

В качестве ФС наиболее широко используется производная ге-матопорфирина (ПГП) и/или ее фракции. Однако, ПГП имеет ряд недостатков, таких как неопределенный химический состав, нестабильность в темноте и на свету, слабое поглощение в красной области оптического спектра, где наблюдается наилучшее проникновение света в ткани, длительное невыведение из кожных покровов, недостаточность Избирательности накопления в опухолях, и т.д.

В связи с этим активно ведется поиск новых, более эффективных для целей ФДТ, фотосенсибилизаторов. Исследования последних лет показали, что фталоцианинн (Фц) обладают интенсивным поглощением в области 650 + 700 нм, высокой химической и фотохимической стабильностью, они не.токсичны в темноте и хорошо накапливаются в опухолевых тканях. Большинство фталоцианинов нерастворимы в воде но могут быть доставлены в опухолевые ткани путем заключения в липосомы или после их химической перестройки в водорастворимую производную, например, с помощью сульфирования. Наличие, водорастворимых соединений Фц упрощает их использование для це- ' лей ФДТ.

Показано, что эффективность фотодинамического повреждения ■ клеток и внутриклеточное накопление фталоцианинов сильно зависят от числа сульфогруш и .даже от взаимного расположения сульфо-групп в молекуле. Брлвэ гидрофильные высоко сульфированные про-

изводные Фц проникают в клетку путем эндоцитоза. Повышенная прадрасполокэнкость опухолевых клеток к эвдоцитозу, а также присутствующие в - опухоли макрофаги могут быть причинами высокого накопления четырежды сульфированной производной фталоциашша с Al в качестве центрального иона металла (А1БдФц) !n vivo. В целом, однако, биофизический и биохимический механизмы взаимодействия А1БдФц с клетками и тканями и картина процессов при последующем фотодинамическом воздействии на клетки полностью не установлены. Получение новой информации в этой области позволило бы предложить пути повышения эффективности метода ФДТ,

При внутривенном введении ФС его концентрация в крови пациента, как показывают оценки, составляет Ю-5 + Ю-4 М, В силу того, что гидрофильный А1БдФц проникает в клетки путем эндоцитоза, его локальная внутриклеточная концентрация может быть близка по порядку к внеклеточной концентрации. С другой стороны, возможно различие в микроокружении молекул ФС в крови и .внутри клетки, которое, как и локальная концентрация, способно влиять на его фотодинамическую эффективность. Таким образом, несомненный интерес представляет исследование А1БдФц в концентрированных водных растворах и в различных модельных средах, а также изучение его взаимодействия с клетками при их инкубации в среде о высокой концентрацией А1БдФц.

Гидрофобный гематопорфирин (ГП) проникает в клетку путем пассивной диффузии и накапливается в местах расположения липидов в клетке. Одной из причин преимущественного накопления ГП в опухолевых тканях может быть повышенное по сравнению с нормальным содержание липидов в опухолевых клетках.

Важным параметром жизнедеятельности клетки является концентрация ионов водорода во внутриклеточной среде. О одной стороны, от внутриклеточного рН зависит распределение молекул фотосенси-билиэатора по ионным формам, степень его агрегации, фотохимическая активность, взаимодействие с клеточными органеллами и т.д. С другой стороны, различные компартмвнгы клетки имеют различный рН, и от того, в какое микроокружение в клетке попадет ФО, может зависеть выгывёемое им фотодинамическое повреждение клетки. После облучение светом процесс гибели клетки может сопровождаться изменением рН ее компвртментов. Кроме того, вначение как внутри-, так и внеклеточного рН могут оказывать влияние на эффективность фотодинамического повреждения клетки. В литературе на сегодняш-

ний день имеются скудные' Данные в этой области, в.- частности, данные о влияний внеклеточного рН на эффективность., фотодинамической инактивации культивируемых клеток с участием Фц и'на процессы накопления ГП в клетках. В виду этого представляется актуальной задача исследования, роли рН в процессах взаимодействия АПЗ^Фц и ГП с клетками.

Основной целью работы являлось экспериментальное и теоретическое исследование роли рН при взаимодействии гидрофобного и гидрофильного фотосенсибиди'заторо'в' с культивируемыми клетками и при последуещем фотодинамическом воздействии.

Непосредственными задачами работы являлись:

1) изучение динамики рН цитоплазмы и лизосом, вызванной накоплением АХЭдФц и последующим облучением клеток светом;

2) исследование зависимости эффективности ФД повреждения от рН цитоплазмы клеток;

3) изучение спектральных и кинетических характеристик флуоресценции и поглощения А1Б41ц в концентрированных водных растворах различной кислотности; рассмотрение возможности использования А154Фц как рН-чувствителыюго флуоресцентного зонда;

4) построение математической модели накопления в клетках гидрофобного фотосенсиСилизаторэ с учетом различия рН вне- и внутриклеточной сред.

Для решения поставленных задач были использованы оптические микрофото- и микрофлуориметрические методики, методы стационарной и время-разрешенной лазерной пикосекундной спектроскопии в сочетании с оригинальными алгоритмами обработки информации, а также методы математического моделирования.

Научная новизна.

Построена первая математическая модель для исследования влияния вне- и внутриклеточного рН на уровень накопления гидрофобного ФС гематопорфирина IX в клетках. Предложенные системы уравнений описывают распределение молекул ГП по ионным формам внутри и вне клетки, а также проникновение путем пассивной диффузии различных ионных форм этого красителя через цитоплазмати- ■ ческую мембрану с учетом существующих на мембране энергетических барьеров.

Впервые показано влияние цитоплазматического рН на эффективность ФДВ с участием А13дФц. С помощью методов микроспектро-фотометрии и мккрофдуориметрии с использованием флуоресцентного

зонда даацетата флуореецеина и абсорбционного зонда нейтрального красного обнаружено изменение рН цитоплазмы и лизосом при проникновении, накоплении А1БдФц и ФДВ с его участием.

На основе проведенных исследований рН-завнсимости поглощения и флуоресценции А15^Фц в растворах высокс : концентрации (КГ^М) предложен двухеолновой флуориметрический метод использования самого А1БдФц как рН-чувствительного флуоресцентного зонда.

С помощью полученных методами стационарной и лазерной пико-секундной спектроскопии с временным разрешением зависимостей спектральных и кинетических характеристик -А1БдФц от рН его водного раствора и состава раствора высказаны предположения о значении рН и характере микроокружения молекул АХБ^Фц в клетке.

Научная и практическая ценность.

Экспериментально пою. ;ано, что повысить эффективность фотодинамического повреждения клетки с участием гидрофильного ФС монно путем дополнительного закисления внутриклеточной среды. Теоретически показано, что повысить накопление в клетке гидрофобного ®С мокно путем дополнительного понижения рН внутриклеточной м внеклеточной среда. Такие закисления можно реализовать в клинической практике известными методами, например, введением глюкозы.

Предложен флуориметрический метод использования А1Б4Фц в качестве рН-чувствительного флуоресцентного зонда, который дает возможность определить рН микроокрукашш красителя без использования дополнительных зондов, т.е. без внесения погрешностей, связанных с взаимодействием молекул зонда и ФС.

Полученные результаты представляют интерес с точки зрения оптимизации режима и эффективности фотодинамичвского воздействия на сенсибилизированные клетки и опухолевые ткани. Они могут быть использованы в научно-исследовательских организациях и медицинских учреждениях, где проводятся исследования в области ФДТ опухолей (Институт лазерной медицины, МНИОИ им. А.П.Герцена, Всероссийский: онкологический центр и Др.).

Основные результаты диссертации доложены на - семинаре "Лазеры в народном хозяйстве" (Москва, 1992 г.); -симпозиума "Физические методы в диагностике и терапии" Российской молодежной ассамблеи "Молодежь и здоровье" (Саратов, 1992 г.); .

- четвертой международной конференции "Laser Applications In Life Sciences" (Ювяскиля, Финляндия, 1992 г.);

- конференции "Cell and biotissua optics: application in laser diagnostics and therapy (CBO'93) ("Volga Laser Tour" 1993r.);

- международном симпозиуме "Biomedical Optica Еигоре'93и (Будапешт, Венгрия, 1993 г.)

я опубликованы в 9 печатных работах.

СОДЕКШШ РАБОМ.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения я списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на _ страницах, содержит _ рисунков, _ таблиц. Список литературы

включает _наименований.

• Во введении дана краткая характеристика исследуемых проблем, сформулированы цели и задачи работы.

Первая глава содержит описание принципов метода ®ДТ я свойств ФС. Особое внимание уделено структурным* спектральккм ж фотофизическим свойствам таких фотосенсибилизатороз как гекато-порфирин и A1S4<&i, а также обзору литературных данных о их проникновении, накоплении и локализации в клетке, включая эффентгяз-ность ФДВ с их участием.

В §1 описаны: общий принцип метода ФДТ злокачественных новообразований „ требования, предъявляемые к оптимальному ®С, а также основные виды и общие свойства ФС. В числе требований, предъявляемых к оптимальному ФС необходимо назвать:

1) преимущественное накопление ФС в опухоли, сравнительно быстрое выведение из организма, особенно из кокных покровов;

2) интенсивное поглощение в красной области спектра (650 + 900 нм), где ткани наиболее прозрачны для проникновения света (длины волн излучения существующих типов лазеров перекрывают весь диапазон видимого и ИК спектра и могут быть использованы для инициирования фотохимических реакций, на которых основан механизм ФДТ);

3) высокая фотохимическая активность, т.е. высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода 102 и/или свободных радикалов;

4) отсутствие темновой токсичности при терапевтических дозах.'

Свойства накопления и удержания в опухолевых тканях имеют

красители с макроцикличэской химической структурой, среди них -гематопорфярин и его производные и фталоцианида.

В §2 обсуждаются основные свойства гемзтопорфирина IX (ГП) как фотосонсибилизатора для ФДТ. Молекулы ГП довольно гидрофобии и практически не переходят в водный раствор при I*.биологических значениях рН. В водном окружении ГП и его производные имеют сильную тенденцию к агрегации, что снижает их фотохимическую активность. ?Лолекула ГП может существовать в пяти ионных формах: в зависимости' от рН среда образуются анионы, дианионы, катионы, даквтионы и нейтральная форма молекулы.

Совпадение сдвига спектра флуоресценции ГП в лшшдаом окружении и в клетках в длинноволновую сторону свидетельствует в пользу связывания молекул гвматопорфирина с липвдами. Это предположение подтверждается исследованиями внутриклеточной локализации и накопления ГП в культурах клеток с помощью методов флуоресцентной микроскопии. Показано, что ГЛ проникает в клетку путем пассивной диффузии и накапливается в лшшдосодержащих структурах. Накопление ГП в клетке незначительно влияет на значение рН ее цитоплазмы, а уровень накопления зависит от рН окружающей среды: при нейтральных рН (от 7 до 7.5) накопление ПГП минимально, резко повышается с уменьшением рН среды в диапазоне от 7 до 5.8; немного большее, чем при рН 7.5, накопление наблюдалось при рН 8.0. Несмотря на многочисленность данных о роли рН, до сих пор на изучено влияние рН цитоплазмы на уровень накопления ГП в клетке как экспериментальными методами, так и методами математического моделирования.

В §3 рассматриваются свойства фталоциашшов (Фц) как фэто-сшскбшшзаторов для ФДТ. Фц химически и термически необычайно стабильны, имеют сильное поглощения в дальней красной и ближней ИК области спектра (670-680 нм), практически на токсичны в темноте при терапевтических дозах. Высокосульфированныо производные Фц водорастворимы. Фц обладают также достаточно высоким квантовал! выходом генерации синглетного кислорода и высоким уровнем накопления в опухолевых тканях по сравнению с нормальными. Положение полос поглощения и флуоресценции разбавленных растворов А134Фц зависит от рН раствора. Для раствора этого ФС низкой концентрации рассчитаны константы равновесия для различных протони-рованных форм: 6.7 и 9.7 ед. в диапазоне изменения рН от 3.0 до 11.0 ед.

Сведения о зависимости времен кизни флуоресценции АЗБ^Фц от рН водного раствора противоречием, а данных о времени жизни его флуоресценции в растворах бедка и клетках не имеется.

Большинство авторов считают, что А15дФц проникает в клетку путем эндоцитозв и накапливается в лизосомах клетки. Для несуль-фированного С1А1ФЦ показано, что ФДВ с его участием на культуру клеток китайского хомячка усиливается на 20-30% при Изменении значения рН окружающей среды от 8.0 до 6.0 ед. Однако, данных о влиянии внутриклеточного рИ на накопление и ФДВ с участием фта-лоцианинов нет, так же как и не изучено влияние накопления Фц на рН клеток.

Известен ряд работ, в которых изучено взаимодействие Фц с различными биомолекулами, в том число показано, что фталоцианизш связываются с сывороточными белками неспецифическим образом. Связывание А1БдФц с бычим сывороточным альбумином вызывает сдвиг в спектре флуоресценции в длинноволновую сторону на 2-3 ям.

В §4 клетка рассматривается как объект исследования ФДВ. С целью обоснования математической модели, предложенной в главе 4 диссертации, описаны состав и свойства мембраны клетки и работа внутриклеточного рН буфера. Рассмотрены энергетические барьеры, которые необходимо преодолеть иону при пересечении мембраны, в частности барьер термодинамического происхождения и барьер, связанный с наличием трансмембранной разности электрических потенциалов. Эти энергетические барьеры необходимо учитывать при моделировании процессов проникновения и накопления фотосенсибилизатора в клетках.

В работах ряда авторов показано, что опухолевые клетки обладают повышенной склонностью к эндоцитозу, имеют повышенное по сравнению с нормальными содержание линидов и, кроме того, значение рН опухолевых тканей носколько ниже, чем рН нормальных. Все эти факторы могут рассматриваться как причины преимущественного накопления фотосенсиОилизаторов в опухолях.

В §5 на основе анализа данных, изложенных в предылущих параграфах главы обосновываются цель и задачи диссертационной работы.

Вторая глава содержит экспериментальные результаты измерения динамики рН цитоплазмы и ллзосом клетки при накоплении в них А15дФц и песледуамем. фотодкнамйческом воздействии, э т.пкжо результата изучения згшсскмостк эффективности фотодинамичоской

инактивации ¡слеток от внутриклеточного рН.

В §1 изложена методика измерения рН цитоплазмы и лизосом клеток с помощью прижизненных красителей диацетата флуоресцеина и нейтрального красного (НК). Приведены данные о влиянии взаимодействия двух красителей (НК и А1БлФц) на калибровочную кривую для определения рН лизосом клеток.

Для измерения рН цитоплазмы и лизосом использовались установки, включающие флуоресцентный микроскоп с двухканалъной фотометрической насадкой и позволяющие регистрировать интенсивность поглощения или флуоресценции рН-зондов на двух различных длинах волн. Использовалась культура клоток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в виде монослоя на покровном стекле. Облучение препаратов производилось Нэ-Не лазером (\=632.8 нм, 1.2 мВт). Доза облучения 70 Дж/см2 была выбрана из расчета дозы, приводящей к гибели 50$ клеток при данных ycj- .виях инкубации. В результате измерения рН цитоплазмы и лизосом при темновом накоплении А18дФц выявлено, что в течение первых 20-30 минут после помещения клеток в среду с А13дФц наблюдается закисление цитоплазмы клеток в среднем на 0.25t0.04 од. рН (рис.1), а лизосом - на 0.54+0.08 ед., а затем восстановление значение рН до первоначального значения с характерным временем около часа; облучение светом вызывало закисление цитоплазмы клеток на 0.22±0.02 ед. рН (рис.1) и.исчезновение лизосом, наблюдавшееся как отсутствие везикул, окрашенных НК.

В §2 описан способ изменения цитоллазматического рН с помощью хлористого аммония (NH 01). При добавл&щш в среду, омывающую клетки, КНДС1 рН цитоплазмы клеток в течение минуты увеличивается на 0.2-0.3 ед. и остается выше нормы 5-10 ктанут, а затем в течении 40-минут понижается до значения ниже исходного. С использованием описанной кинетики рН била смоделирована эффективность фотодинамического повреждения трех груш образцов с различным рН цитоплазмы, но одинаковой исходной концентрацией красителя внутри клеток. Для облучения клеток использовалось излучение квазинепрерывного лазера на алшинате иттрия с неодимом на длине волны второй гармоники 0.67 мкм. Данная длина волны попадает в максимум поглощения AISдФц. Длительность импульса излучения - 300 не, частота повторения импульсов 5 кГц, средняя мощность излучения Р=0.40-0.65 мВт. Дозовые зависимости выживания клеток после облучения светом измерялись в диапазоне 10*100 Дк/смг.

Показано, что присутствие в клетке А15дФц не' влияет на кинетику изменения рН при добавлении ННДС1. Обнаружено, что зогце-лачивание цитоплазмы клеток уменьшает эффективность фотодинамического повреждения клеток, а закисление - увеличивает (рис.2).

В §3 на основе приведенных в §1 и §2 экспериментальных результатов и данных, имеодихся в литературе, предлагается физико-химическая картина процессов, происходящих при фотодинамическом воздействии с участием Л15дФц. Фталоцишшн попадает в клетку путем эндоцитоза и локализуется в лизосомах, при этом уменьшение значения рН лизосом наблюдается уже через 10 минут после начала накопления CIAISдФц. Наименьшее значение рН лизосом и цитоплазмы наблюдается через 20-30 минут после начала инкубации клеток. Облучение клеток светом приводит к уменьшению рН цитоплазмы и отсутствию лизосом в'облучаемой области клеток. Это может быть связано с тем, что при освещении клетки возбужденные молекулы фталоцианина инициируют фотохимические реакции с участием синг-летного кислорода или радикалов, приводящие к разрушению мембраны лизосом. При повреадешпш мембраны лизосом их содержимое выходит в цитоплазму, что может вызвать понижение величины ее рН.

Третья глава содержит результаты изучения спектральных и спектрально-кинетических характеристик А1БлФц в различном микроокружении и при различных рН водного раствора с помощью стационарной и время-разрешенной флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии в сочетании с методами численного разложения спектров на компоненты; оценена возможность использования А1Э4Фц как рН-чувствительного флуоресцентного зонда.

В §1 описана методика и приведены результаты измерений стационарных спектров флуоресценции и поглощения А1БдФц в модельных средах и клетках. Показано отсутствие агрегации красит&ля в водном растворе и в ДМСО вплоть до концентрации 5>IÓ~5 М. Спектры возбуждения флуоресценции AIS Фц. в водном буфере для различных концентраций красителя (от Ю~т до 10_ДМ) не различаются между собой по положению максимумов для одной и той же длины волны регистрации, однако, при увеличении концентрации А15дФц интенсивность полосы в области 610 - 630 нм, соответствующей предполагаемой области возбуждения флуоресценции агрегатов молекул AIS Фц, растет. Наличие в растворе А13дФц концентрации I0~7-I0~A М человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в молекулярном соотношении от 1:1 до 1:1000 вызывает сдвиг спектра флуоресценции на 3-4

нм в длинноволновую сторону. Сравнение спектров флуоресценции А1БдФц в модельных средах- (водном буфере, ДМСО и ЧОА) со спектрами флуоресценции из клеток позволяет предположить, что Фц находится л клетках в водном окружении.

В §2 описана методика измерения зависимости спектральных характеристик А^Фц высокой концентрации (Ю~4М) от рН. Наличие такой зависимости свидетельствует о присутствии в спектрах нескольких индивидуальных полос с различными вкладами. Для выделения этих составляющих в спектре флуоресценции использовался метод Аленцева разложения слоаашх спектров на индивидуальные полосы. Основными результатами измерений, описанных в этом параграфе, являются:

В спектре поглощения обнаружены три изобестические точка (374, Б81 и 635 нм). Положение максимумов спектров поглощения и флуоресценции А15дФц высокой концентрации зависит от рН раствора: сдвиг максимума спектров составляет около 10 нм в длинноволновую сторону при уменьшении рН от 11,5 до 3.5 ед. Показана близость хода кривых титрования для раствора А13дфц высокой концентрации и полученных ранее для растворов низкой концентрации (Ю_8М).

Показана возможность определения рН микроокрукэния А1БдФц с использованием спектральных характеристик самого красителя, т.е. методика использования Фц как рН-чувствительного зонда. Калибровочная кривая, построенная по зависимости отношения интенсивнос-тей флуоресценции А1БдФц на 669 и. 69-4 нм, соответствующих длинам волн полуширины максимума флуоресценции при рН 7.4, от значения рН раствора позволяет определять рН микроокруиения красителя в диапазоне от 5.5 до 8.0 и от 9.3 до 11.5 ед. рН с точностью О.«, ед. (рис.3). Показано, что ионная сила раствора и наличие в нем сывороточного белка альбумина влияют на ход калибровочной кривой. Использование А1Б4Фц как рН-чувствитэль- ного флуоресцентного зонда позволит избежать возможных ошибок, возникающих в случае одновременного использования двух красителей из-за их взаимодействия.

Положение максимумов в спектре возбуждения флуоресценции А13дФц не зависит от длины волны регистрации (^рег) и рН раствора, поэтому, по-видимому, возбужденное состояние молекулы А1Б по степени основности не отличается от основного. В то же время относительный вклад полос в спектре возбуждения флуоресценции

A1S4®u зависит от *рег- Так, форма спектра возбуждения-флуоресценции А1Б4Фц для Л.рег=682 нм близка к спектру поглощения, т.е. основная полоса спектра флуоресценции соответствует области флуоресценции мономеров. В спектре возбуждения для А,рег= 710 и 740 нм вклад Q полосы много меньше, чем для Хрег= 682 нм, a относительный вклад полосы в районе 610 - 630 нм растет при увеличении концентрации ФС.

С помощью метода Аленцева разложения сложных спектров на составляющие полосы в спектре флуоресценции А154Фц в области 650 - 700 нм выделено три полосы: на 675 нм, 683 нм и 691 нм. С уменьшением рН раствора относительный вклад коротковолновой полосы уменьшается, а вклад длинноволновой полосы увеличивается. Таким образом, полоса в области 691 нм соответствует, по видимому, флуоресценции протонированных форм молекул А1Б4Фц. Поведение вклада полосы на 683 нм немонотонно: он достигает максимума при нейтральных рН раствора (рис.4). Если осуществляется следующая схема диссоциации, предлагаемая некотошми авторами:

б.Т 9.7

HgO-AlS^u-tLjO ^ НО -AlS^-HgO HO'-AIS^-HO , то можно предположить, что полоса 691 нм соответствует флуоресценции нейтральной формы молекулы AlS^On, полоса 683 ш - флуоресценции аниона АДБ^Фц, а полоса 675 нм - флуоресценции дианиона данной молекулы.

В §3 описана методика лазерной пикосекундной флуоресцентной спектроскопии А13дФц а растворах и клетках и изложены результаты измерений времени жизни флуоресценции Фц различной концентрации в модельных растворах, в растворах с различным рН и в клетках. Для измерения времени жизни флуоресценции' А1Б4Фц в различных средах использовалась автоматизированная лазерная установка с пикосекундным временным разрешением, включающая лазерный флуоресцентный микроскоп и позволяющая проводить измерения' как в микроскопическом варианте, так и кюветше измерения в режиме счета одиночных фотонов. В качестве возбуждающего использовалось излучение перестраиваемого лазера на красителе с Х=603 нм. В качестве источника накачки лазера на красителе использовалось излучение аргонового лазера с синхронизацией мод. Флуоресценция образцов регистрировалась в области Я=680±2 нм. Длительность импульсов - 3+5 пс, частота повторения импульсов - 380 кГц, ширина аппаратной функции на голувнсоте - 120 пс, спектральное разрешение - 2 нм. Для обработки результатов использовалась оригиналь-

над программа, осуществляется .- нахождение' параметров затухания флуоресценции но основе-метода наименьших квадратов в предположении квазинепрерывного расположения времен затухания флуоресценции в заданном диапазоне.

Показано, что время хизни флуоресценции А13дФц не зависит от рН раствора в диапазоне 4.0 * 10.5 ед. и от концентрации красителя в диапазоне Ю~б М до Ю~д М и составляет 4.90*0. V-/ не. Уделено внимание исследованию и обсуждению различных артефактов, возникающих при измерении времени жизни флуоресценции А1БдФц, в частности, вида схемы измерения-и эффекта торепоглощения. В водном растворе бычьего сывороточного белка альбумина и А1БдФц в соотношении 7:1., 1:1, 1:20 и 1:40 время жизни флуоресценции А1Б4Фц не изменяется и составляет 4.84¿0.-/V не, которое с учетом ошибки измерений можно считать практически совпадающим с Бременом жизни флуоресценции А15дфд в водных растворах. При увеличении количества молекул белка на одну молекулу А18дФц происходит тушение флуоресценции красителя, что при неизменности времени жизни флуоресценции свидетельствует, по-видимому, об образовании нефлуоресцирувдих комплексов А1Б4Фц-белок.

Время жизни флуоресценции AlS^Gu в клетках составляет 5.15 ± 0 .-<7 не, что может быть связано со спецификой микроокружения этих молекул в клетке.

В четвертой главе рассматривается один из вероятных механизмов проникновения гидрофобного фотосэнсибилизатора (гемато-порфирина-IX - ГП) через плазматическую мембрану и его накопления в клетке и предлагается соответствующая математическая модель накопления ГП, учитывашая различие рН внутри и вне клетки, а также наличие на мембране энергетических барьеров термодинамического и электрического происхождения.

В §1 изложены имеющиеся в литературе экспериментальные данные с накоплении гидрофобного ФС гематопорфирина (ГП) в опухолв-вых клетках и тканях In vivo и in vitro, данные по влиянию рН внеклеточной среды на скорость и уровень накопления ГП в клетках. Рассмотрены существующие модели накопления ГП в клетках, которые, однако, либо не принимают во внимание существующие различия внутриклеточного и внеклеточного значений рН, либо носят лишь качественнный характер.

В §2 рассчитано распределение ГП по ионным формам в зависимости от рН в соответствии с реакциями протонирования-депротони-

рования. Отмечено преобладание анионов и нейтральной формы ГП при рН * 7.0.

Сформулирована математическая модель, описывающая накопление ГП ь клетке, с учетом I) диффузии ионных форм ГП через клеточную мембрану в предположении полного перемешивания в пределах объемов клетки и среды; 2) кинетики распределения молекул ГП по ионным формам внутри клетки: 3) различия рН внутри и вне клетки: 4) трансмембранного электрического потенциала, препятствующего проникновению через клеточную мембрану заряженных форм, который отрицателен и постоянен; 5) постоянства внеклеточной концентрации ГП.

Показано, что характер накопления ГП зависит от учета проникновения через мембрану клетки всех ионных форм ГП или только нейтральной формы (рис.5), от величины трансмембрвнной разности потенциалов и значения рН внутри (рН1П) и вне (рНех) клетки. Увеличение уровня накопления получено при увеличении значения электрического мембранного потенциала и при низких значениях рН111 и рН®х. Так, увеличение значения электрического мембранного потенциала в два раза приводит к увеличению уровня внутриклеточного накопления в 20 раз. При учете проникновения через клеточную мембрану всех ионных форм молекул ГП концентрация красителя внутри клетки превосходит его концентрацию в окружагадей среде в 2^6 раз при рН1" и рН0* 4.0 + 8.0 ад. Если через клеточную мембрану проникает только нейтральная форма молекул ГП, то в том же диапазоне рН отношение' внутри и внеклеточной концентраций достигает 5 4 20. Экспериментальным данным более соответствует модель, учитывающая проникновение через клеточную мембрану всех ионных форм молекул ГП.

На основе предложенной математической модели была также оценена селективность накопления ГП в опухолевой и нормальных тканях как отношение концентраций в клетках с рН*11 мёньаим 7.0 (рНт) ("опухолевые") и в клетках с рН1п равным 7.0 ("нормальные"). Результаты таких оценок показаны в таблице I. Отметим, что полученная величина "селективности" не зависит от рН8*. Кроме того, как видно из таблицы, при рН 6.0 - 7.0 ед. преимущественного накопления при условии проникновения только нейтральной формы молекулы ГП не получено.

Показано также, что рассчитанное время накопления красителя в клетках близко к экспериментально наблюдаемому времени появле-

ния его во 'внутриклеточных структурах, пропорционально количеству накопленного красителя в зависит только от величины рН1П и не зависит от рН6*.

Таблица I. Отношение внутриклеточной концентраций ТО при внутриклеточных рН (рН1п), отличных от 7.0 (рНт), к внутриклеточной концентрации ГП при рН1п 7.0.

рнт проникают все ионные формы молекул ГП проникает только нейтральная форма молекул ГП

4 6.22 4.55

5 2.58 0.58

б К15 0.26

7 1.0 1.0

8 0.997 3.75 ,

В §3 обсуждается возможность использования представленных моделей для других гидрофобных ФС и предложены пути построения аналогичных математических моделей для гидрофильных ФС другого типа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ВЫВОДЫ.

1) Методами микрофлуо- и микрофотометрии показано, что накопление гидрофильного фотосенсибилизатора А1Б4Фц в культивируемых клетках вызывает закисление цитоплазмы и лизосом клеток через 20-30 минут в среднем на 0.25 и 0.54 ед. рН, соответственно, с дальнейшим восстановлением исходного значения рН в течение часа. Последующее облучение светом приводит к закислению цитоплазмы клеток на 0.22 ед. рНр что может быть связано с фотодинамическим повреждением мембран лизосом и выходом их содержимого б цитоплазму.

2) Эффективность фотодинамического повреждения клеток, обусловленного А134Фц максимальна при пониженном рН цитоплазмы. Предложена -картина физико-химических процессов, происходящих при фотодинамическом воздействии с участием А1Б,Фц.

3) Методами стационарной и время-разрешенной спектроскопии поглощения и флуоресценции показано, что

а) взаимодействие с лшгадаш бисяоем приводит к изменению относительных вкладов полос спектра флуоресценции МБ^Фц без изменения их положения;

б) взаимодействие о сывороточными альбуминами приводит к длинноволновому сдвигу полос спектра флуоресценции А13дФц на 3-4 нм, сопровождающееся, по-видимому, образованием нефлуоресцирующих комплексов A1S4®u с молекулами белка.

4) На основе рН-заЕягамости спектра флуоресценции А1ВдФц показана возможность его использования в качества двухволнового рН-чувствителыгого флуоресцентного зонда.

5) Время зшзни флуоресценции АП^Фц в водном раствора составляет 4.9 не и не зависит от его концентрации, рН водного окружения и взаимодействия с белком в диапазоне концентраций Ю-6 + Ю-4 .4. Время жизни флуоресценции находящегося в клетка А1Б4Фц составляет 5.15 не, что можаг быть обусловлено спецификой микроокружения этих молекул в метке.

6) Построена математическая модель влияния рН внутри и вне клетки на процесс внутриклеточного накопления гидрофобного фотосенсибилизатора гематопорфярина IX, учитывающая наличие па мембране энергетических барьеров термодшзамичэского и электрического происхождения. Анализ математической модели показал, что близкое к экспериментально наблюдаемому превышение концентрации гематопор-фярташ в клетках по сравнению о внеклеточной средой возможно при условии, что через клэточную мембрану проникают все ионные формы молекулы гематопоррирггаа, а также если внутри- и внеклеточные среда имеют пониженное значение рН (4.5 < рН < 7.0).

Основные материалы диссертации опубликованы в следующее печатных работах:

1. Л.В.Жорина, IÍ.В.Степанова "Накопление фотосенсибилизатора в клэткэ с учетом проникновения его заряженных форм через мембрану "//Вестн. Моск. ун-та, сар.З, Физика, Астрономия, т.33, JSI, стр.23-29, 1992 г.

2. А.В.Агронская, Л.В.Жорина, М.Ю.Порошина, Т.И.Рокицкая "Изме-нв1шя рН клеток и лизосом при темновой инкубации и фотодинамическом воздействии с участием С1А1Рс"//Материалн семинара "Лазеры в народном хозяйстве", стр.73-77, Ыосква, 1992 г.

3. E.B.Chernyaeva, J.Grève, в. de Grooth, A.M. van Leeuwen, H.Yu.Poroaíilna, L.V.Zhorlna "Phthalocyanine Interaction with celia: kinetics of the photodynaniic damage and intracellular lo-

callzationB//Proc. SPIE, y.1921, p.285-294, 1992.

4. M.Yu.Poroshlna, L.V.Zhorlna» T.A.Oglobltna, E.B.ChernyaeYa, A.V.AgronskaySc T.I.Hokitskaya "Accumulation and photodynamic action raaciianisfflS of tetrasulfonatei aluminum phthalocyanine"// Proc. SHE, T.1S81, p. 198-203, 1992.

5. L.V.Ziiorina». A.Yu.OMkishev» M.G.Galpem, M.Yu.Poroshlna, E.B.Cherayaeva "Time-resolved, fluorescence spectroscopy of tet-rasuLfonated aluminum phthalocyanine in solution and cells"// Froc. SPIE, Vo2078a 1993.

6. I.V.2horîna, â.Yu.CliiltiBîiev, H.G.Galpern, M.Yu.Poroshlna, E.B.Chernyaevâ "ïiaë-reeolTed fluorescence spectroscopy of tet-raEuliomated aluminum phthalocyaniiiB in solution and cells"// Abstract Boolt, International Symposlua on Biomedical Optics Europa'93,'p. 24» 1993 .

7. LiV.ZÎiorim, ' B.B.Ciierayaeya, A.V.Agronskaya, M.G.Galpera - "Phthalocyanines as second generation photosensitizers for the

photodynsoio therapy of cancer: fluorescence and absorption spe-ctroscopy"//Proc. SPIE, 1993.

8. T.rKasïîK, $.fêaoapjBiDBa> ^.B.JKbpsska, M.B.Kopomsa, E.B.^epaHe-Ba "KsmÈeiim UBzanmscmx h BJieKtpmeamx napaiwerpos Oxcjîo&ujx jktdïîkhx mnÔp&B npa BaaKMOfleficraSH c reMaTonop^HpjSHOMV/Becra. Mock. yH-xa, cep.3, ferauxa» AcTpoHCMfl» t.33, JSI, cTp.59-64, 1992 r.

9. ï.Biaaik, 'P.Masarykova,. L.V.&hcrrina, M.Yu.Poroshlna, E.B.Ofternyaera "Haesiatoporpftyrin changes the mechanical properties of lipid• bilayer iserobranesV/Gen. Physiol, Biophys.» v.11, p.32T-336„ 1992.

8.8

Я

Я 6.4 Й

«в «

И о

^62

й

И

К О..

6.0

5.8

> ♦ *_ ♦ ^ _ а. „ч- - - ~

-о « + »-о— — я Г< Л в Г у -- /

п ♦

й| §г

о К я 0 0)

Э 0 1 3

50

йтеЛ. Типичная кривая изменения рН цитоплазмы клеток в процессе накопления А1Б .Фц и при осве-

Л "

щении. Концентрация АДБ 4Фц во внешней среде 10~4М.

Рис.2. Зависимость выживаемо сти клеток культуры СПЭВ при различном внутриклеточном рН от дозы облучения (670 нм, плотность мощности 350 * 700 мВг/сма). Клетки перед добавлением ННДС1 инкубировались в а1б4фц (ю~*м) в течение часа.

Рйс.З; Калибровочная кривая . для определения рН-шкрбокрукения молекулы А134Фц по отношению интенсивности флуоресценции на 669 и 694 нм. Флуоресценция возбуждалась в области 374 нм.

Рис.4. Результат разложения спектра флуорес ценции А1Б4Фц (1СГ4 М) методом Аленцева. I -спектр флуоресценции АЬЗ^Фц в PBS (рН 7.53); 2.-3, 4 - индивидуальные составляющие спектра.

Рис,Б. Зависимость отношения стационарной внутриклеточной концентрации Ш к его знвхле-■ точной концентрации от рН внешней среда рНех при различных внутриклеточных рН (рН1"): а)' при условии проникновения через плазматическую мембрану всех ионных форм ГП, 0) при условии проникновения только нейтральной формы. Номер кривой соответствует значению внутриклеточного рН.